2型糖尿病患者與健康個體之間腸道雙歧桿菌的差異研究摘要近年來，研究發現2型糖尿病患病率的增高，不能僅僅歸因于人類基因、飲食結構、營養狀況的改變，平均壽命的延長，或是平日運動的減少，腸道菌群是控制體重和能量代謝的一個重要環境因素，并且與肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病密切相關。目前已有研究表明，腸道菌群是參與脂代謝、促進肥胖和2型糖尿病等代謝性疾病發生的一個重要因素。2型糖尿病患者存在腸道菌群的失調，表現為腸桿菌科細菌含量增加，類桿菌含量減少等。腸道菌群可以顯著增加宿主能量的攝取、增加脂肪的儲存，可以通過增加腸道中單糖的吸收和肝臟甘油三酯的合成等途徑來促進胰島素抵抗的發生發展，從而引起2型糖尿病的發生。雙歧桿菌是人體腸道菌群中的優勢菌屬，也是常見的的益生菌之一，在維持腸道菌群與宿主之間相互作用的穩定、保證宿主正常的新陳代謝等方面發揮著重要的作用。雙歧桿菌數量的減少可導致整個腸道菌群失調和腸道微生態失衡，從而導致許多代謝性疾病的發生。有研究表明，雙歧桿菌可以有效改善糖耐量和葡萄糖誘發的胰島素分泌功能，降低高脂飲食誘導的糖尿病小鼠內毒素血癥和血漿脂肪組織的促炎癥因子水平，使小鼠的低濃度炎癥好轉，從而改善糖尿病代謝紊亂的狀態。還有研究發現，青春雙歧桿菌可以有效改善2型糖尿病大鼠腸道菌群的失調和脂質代謝紊亂等癥狀。同時，雙歧桿菌已被廣泛用于腸道相關疾病的預防和治療，并表現出很好的功效。許多雙歧桿菌及含雙歧桿菌的制劑可以通過口服途徑來促進腸道有益菌的生長，在腸道菌群相關疾病的治療方面具有廣闊的應用前景。因此，研究2型糖尿病患者腸道雙歧桿菌的變化規律有著十分重要的意義。目前關于2型糖尿病患者與健康個體之間腸道雙歧桿菌差異的研究仍較少，并且國內外對于雙歧桿菌的不同菌種在2型糖尿病患者腸道中如何變化的研究尚屬空白。本課題根據不同細菌的16SrRNA序列設計屬種特異性引物，應用實時熒光定量PCR技術對2型糖尿病患者和健康個體的腸道雙歧桿菌（包括雙歧桿菌總菌及其常見的4個菌種：長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌）進行定量分析，并分析這些腸道細菌與2型糖尿病患者臨床特征的相關性，從而為進一步研究腸道雙歧桿菌與2型糖尿病的關系提供依據。關鍵詞2型糖尿病；腸道雙歧桿菌；實時熒光定量PCR一、引言糖尿病是一種常見的代謝性疾病，近年來其患病率在全球范圍內呈顯著上升趨勢。2型糖尿病作為糖尿病的主要類型，約占糖尿病患者總數的90%以上。傳統觀點認為，2型糖尿病的發病與遺傳因素、生活方式（如飲食、運動）以及年齡等因素密切相關。然而，越來越多的研究表明，腸道菌群在2型糖尿病的發生發展過程中扮演著至關重要的角色，成為了糖尿病研究領域的新熱點。腸道菌群是寄生于人體腸道內微生物群落的總稱，包含了細菌、真菌、病毒等多種微生物，其中細菌數量最為龐大且研究最為廣泛。正常情況下，腸道菌群與宿主之間形成了一種互利共生的關系，對宿主的營養物質消化吸收、免疫調節以及維持腸道屏障功能等方面發揮著不可或缺的作用。當腸道菌群的組成和結構發生改變，即出現腸道菌群失調時，可能會引發一系列代謝性疾病，2型糖尿病便是其中之一。已有研究報道，2型糖尿病患者存在明顯的腸道菌群失調，表現為腸道內某些有益菌數量減少，有害菌數量增加，這種菌群失衡狀態可能通過多種途徑影響機體的代謝功能，進而促進2型糖尿病的發生發展。雙歧桿菌作為人體腸道菌群中的優勢菌屬，是一類重要的益生菌。雙歧桿菌具有多種重要的生理功能，例如調節腸道菌群平衡、增強腸道屏障功能、促進營養物質的消化吸收以及調節機體免疫功能等。在維持腸道微生態穩定以及宿主健康方面，雙歧桿菌發揮著關鍵作用。眾多研究顯示，雙歧桿菌數量的減少與腸道微生態失衡以及多種代謝性疾病的發生密切相關。近年來，關于雙歧桿菌與2型糖尿病關系的研究逐漸增多，一些研究表明雙歧桿菌可能通過改善機體的糖脂代謝、減輕炎癥反應以及調節腸道內分泌功能等途徑，對2型糖尿病的發生發展產生有益影響。然而，目前對于2型糖尿病患者與健康個體之間腸道雙歧桿菌的差異研究仍相對較少，尤其是針對雙歧桿菌不同菌種在2型糖尿病患者腸道中的變化情況，國內外相關研究尚屬空白。深入探究2型糖尿病患者與健康個體之間腸道雙歧桿菌的差異，不僅有助于進一步揭示腸道菌群與2型糖尿病之間的內在聯系，還可能為2型糖尿病的預防、診斷和治療提供新的靶點和思路。二、腸道菌群與2型糖尿病的關系2.1腸道菌群在人體代謝中的作用腸道菌群參與人體多種代謝過程，對維持機體正常生理功能至關重要。在營養物質代謝方面，腸道菌群能夠協助宿主消化和吸收一些難以被自身消化酶分解的多糖、蛋白質和脂肪等大分子物質。例如，腸道中的某些細菌可以產生特定的酶，將膳食纖維分解為短鏈脂肪酸（如乙酸、丙酸和丁酸），這些短鏈脂肪酸不僅可以為腸道上皮細胞提供能量，還能通過血液循環進入肝臟等組織器官，參與脂質、糖和能量代謝的調節。腸道菌群還參與維生素的合成，如雙歧桿菌和乳酸桿菌等可以合成維生素B族和維生素K等，為宿主提供必要的營養物質。在免疫調節方面，腸道菌群對宿主免疫系統的發育和功能維持起著關鍵作用。腸道黏膜是人體最大的免疫器官，腸道菌群與腸道黏膜免疫系統相互作用，促進免疫細胞的分化和成熟，調節免疫應答的強度和類型。正常的腸道菌群可以通過刺激腸道黏膜免疫系統產生分泌型免疫球蛋白A（sIgA）等免疫物質，增強腸道黏膜的免疫屏障功能，抵御病原體的入侵。同時，腸道菌群還可以調節免疫細胞的活性，維持免疫平衡，防止過度免疫反應的發生。2.22型糖尿病患者腸道菌群的特征大量研究通過高通量測序等技術手段，對2型糖尿病患者和健康個體的腸道菌群進行了比較分析，發現2型糖尿病患者的腸道菌群存在明顯的失調現象。在菌群組成方面，2型糖尿病患者腸道中厚壁菌門與擬桿菌門的比例發生改變，通常表現為厚壁菌門相對豐度增加，擬桿菌門相對豐度降低。這種菌群比例的變化可能影響腸道對能量的攝取和儲存，進而促進肥胖和2型糖尿病的發生發展。腸桿菌科細菌在2型糖尿病患者腸道中的含量顯著增加，而類桿菌、雙歧桿菌等有益菌的數量則明顯減少。腸桿菌科細菌中的一些菌株可以產生內毒素，如脂多糖（LPS），當腸道屏障功能受損時，內毒素可能進入血液循環，激活免疫系統，引發慢性炎癥反應，而慢性炎癥是2型糖尿病發病的重要病理生理基礎之一。2型糖尿病患者腸道菌群的多樣性和均勻度也顯著降低，菌群結構穩定性變差，這可能導致腸道菌群功能失調，影響機體的代謝和免疫功能。2.3腸道菌群失調促進2型糖尿病發生發展的機制腸道菌群失調促進2型糖尿病發生發展的機制較為復雜，涉及多個方面。腸道菌群失調可能影響腸道屏障功能。正常情況下，腸道黏膜屏障由腸道上皮細胞、緊密連接蛋白以及黏液層等組成，能夠有效阻止腸道內有害物質（如細菌、內毒素等）進入血液循環。當腸道菌群失調時，腸道上皮細胞的結構和功能可能受到影響，緊密連接蛋白表達減少，黏液層變薄，導致腸道通透性增加，內毒素等有害物質容易進入血液，引發全身慢性炎癥反應，進而損傷胰島素靶細胞，導致胰島素抵抗的發生。腸道菌群失調可能干擾機體的能量代謝和糖脂代謝。一方面，腸道菌群組成的改變可能影響腸道對營養物質的消化吸收，導致能量攝取增加，脂肪儲存增多，從而促進肥胖的發生，而肥胖是2型糖尿病的重要危險因素。另一方面，腸道菌群代謝產物的改變也可能影響機體的糖脂代謝。例如，短鏈脂肪酸的產生減少可能影響肝臟對脂質的代謝和儲存，導致血脂異常；同時，短鏈脂肪酸還可以通過作用于腸道內分泌細胞，調節腸道激素（如胰高血糖素樣肽-1，GLP-1）的分泌，進而影響胰島素的分泌和作用，導致血糖調節異常。腸道菌群失調還可能影響腸道內分泌功能。腸道內分泌細胞可以分泌多種腸道激素，如GLP-1、葡萄糖依賴性促胰島素多肽（GIP）等，這些腸道激素在調節血糖水平、促進胰島素分泌以及抑制食欲等方面發揮著重要作用。腸道菌群失調可能干擾腸道內分泌細胞的功能，導致腸道激素分泌異常，進而影響血糖的正常調節。三、雙歧桿菌的生物學特性及功能3.1雙歧桿菌的分類與分布雙歧桿菌屬于放線菌門雙歧桿菌科雙歧桿菌屬，是一類革蘭氏陽性、不抗酸、不形成孢子、不運動的專性厭氧細菌。雙歧桿菌具有多種亞型，目前已發現32個亞型。雙歧桿菌廣泛存在于人和其他溫血動物的腸道中，在反芻動物的瘤胃、人的陰道、口腔以及母乳中也有少量存在。在人體腸道中，雙歧桿菌是重要的優勢菌屬之一，其含量和分布因個體年齡、飲食結構以及健康狀況等因素而異。母乳喂養的嬰兒腸道中雙歧桿菌含量最為豐富，其最初來源于母體，可占嬰兒總腸道細菌的60%。隨著年齡的增長，人體腸道中雙歧桿菌的種類和數量都會發生改變，一般60歲以上老人腸道中雙歧桿菌的數量僅占腸道細菌總量的8%左右。3.2雙歧桿菌的生理功能雙歧桿菌在維持腸道微生態平衡以及宿主健康方面具有多種重要的生理功能。雙歧桿菌能夠調節腸道菌群平衡。雙歧桿菌通過與腸道內其他微生物競爭營養物質和黏附位點，抑制有害菌的生長繁殖，同時促進有益菌的生長，維持腸道菌群的生態平衡。雙歧桿菌可以產生有機酸（如乙酸、乳酸等），降低腸道環境的pH值，這種酸性環境不利于有害菌的生存，從而有助于調節腸道菌群結構。雙歧桿菌能夠增強腸道屏障功能。雙歧桿菌可以黏附在腸道上皮細胞表面，形成一層生物膜，阻止病原體的入侵。雙歧桿菌還可以促進腸道上皮細胞的增殖和分化，增強腸道上皮細胞之間的緊密連接，提高腸道黏膜的屏障功能。此外，雙歧桿菌能夠刺激腸道黏液細胞分泌黏液，增加黏液層的厚度，進一步增強腸道的物理屏障功能。雙歧桿菌在營養物質消化吸收方面也發揮著重要作用。雙歧桿菌可以產生多種酶類，如β-半乳糖苷酶、淀粉酶等，幫助宿主消化吸收乳糖、淀粉等營養物質。雙歧桿菌還參與維生素的合成，能夠合成維生素B1、B2、B6、葉酸、泛酸和B12等，為宿主提供必要的維生素營養。雙歧桿菌對機體免疫功能具有調節作用。雙歧桿菌可以通過與腸道黏膜免疫系統相互作用，促進免疫細胞的分化和成熟，調節免疫應答的強度和類型。雙歧桿菌能夠刺激腸道黏膜免疫系統產生sIgA等免疫物質，增強腸道黏膜的免疫屏障功能。雙歧桿菌還可以調節免疫細胞的活性，抑制炎癥細胞因子的產生，維持免疫平衡，防止過度免疫反應的發生。3.3雙歧桿菌與代謝性疾病的關系越來越多的研究表明，雙歧桿菌與代謝性疾病（如肥胖、2型糖尿病、高血脂等）密切相關。在肥胖方面，一些研究發現，肥胖個體腸道中雙歧桿菌的數量明顯低于正常體重個體。補充雙歧桿菌可以通過調節腸道菌群結構、改善腸道屏障功能、抑制脂肪吸收以及調節能量代謝等途徑，減輕體重和改善肥胖相關代謝紊亂。在2型糖尿病方面，已有研究證實，2型糖尿病患者腸道中雙歧桿菌的數量顯著減少。雙歧桿菌可能通過多種機制對2型糖尿病產生有益影響。雙歧桿菌可以改善機體的糖脂代謝，通過調節腸道內分泌功能，促進GLP-1等腸道激素的分泌，進而刺激胰島素的分泌和提高胰島素敏感性，降低血糖水平。雙歧桿菌還可以減輕炎癥反應，降低體內炎癥因子水平，改善胰島素抵抗。此外，雙歧桿菌能夠調節腸道菌群平衡，改善腸道微生態環境，間接影響機體的代謝功能。在高血脂方面，雙歧桿菌可以通過降低血清膽固醇、甘油三酯等血脂指標，改善脂質代謝紊亂。雙歧桿菌可能通過結合膽汁酸，促進膽汁酸的排泄，減少膽固醇的重吸收，從而降低血清膽固醇水平。四、2型糖尿病患者與健康個體腸道雙歧桿菌的差異研究4.1研究對象與方法4.1.1研究對象選取符合納入標準的2型糖尿病患者和健康個體作為研究對象。2型糖尿病患者均根據世界衛生組織（WHO）制定的糖尿病診斷標準確診，且排除患有其他嚴重慢性疾病（如嚴重肝腎功能不全、惡性腫瘤等）、近期使用過抗生素或益生菌制劑以及妊娠或哺乳期婦女。健康個體則經過全面體檢，排除患有糖尿病及其他慢性疾病，近期未使用過抗生素或益生菌制劑。詳細記錄研究對象的一般臨床資料，包括年齡、性別、體重、身高、體重指數（BMI）等。4.1.2樣本采集在保證符合倫理道德的前提下，收集研究對象的新鮮糞便樣本。要求研究對象在采集糞便樣本前3天內避免食用辛辣、油膩等刺激性食物，避免劇烈運動。采用無菌便盒收集糞便樣本，采集后立即放入便攜式低溫保存箱中，在2小時內運送至實驗室，并于-80℃冰箱中保存待測。4.1.3腸道雙歧桿菌定量分析采用實時熒光定量PCR技術對糞便樣本中的腸道雙歧桿菌進行定量分析。根據不同細菌的16SrRNA序列設計屬種特異性引物，分別用于擴增雙歧桿菌總菌及其常見的4個菌種（長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌）的16SrRNA基因片段。提取糞便樣本中的細菌基因組DNA，以提取的DNA為模板，進行實時熒光定量PCR擴增反應。反應體系和反應條件根據所使用的PCR試劑盒說明書進行優化和設置。通過標準曲線法對擴增結果進行定量分析，計算出每克糞便樣本中雙歧桿菌總菌及各菌種的拷貝數。4.2研究結果4.2.1兩組人群腸道雙歧桿菌總菌及各菌種數量的比較2型糖尿病組腸道雙歧桿菌總菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌的定量結果分別為10.97(10.25～11.26)、3.49(3.26～3.81)、3.94(3.76～4.13)、3.44(3.34～3.57)、3.80(3.23～4.66)，健康對照組分別為11.56(10.97～11.92)、3.68(3.30～4.48)、4.02(3.52～4.12)、4.01(3.72～4.28)、4.23(2.92～4.72)。與健康對照組相比，2型糖尿病組腸道雙歧桿菌總菌和青春雙歧桿菌的數量均顯著減少，差異均具有統計學意義（兩者均P=0.000），而長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌的數量兩組間無顯著性差異(P=0.101，0.676，0.964)。4.2.22型糖尿病患者腸道雙歧桿菌與臨床指標的相關性分析相關分析發現2型糖尿病患者腸道雙歧桿菌總菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌拷貝數與空腹血糖（FPG）、餐后2小時血