Treg細(xì)胞在小鼠過敏性哮喘中的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制與治療潛能探究一、引言1.1研究背景與意義過敏性哮喘作為一種常見的慢性炎癥性氣道疾病，影響著全球大量人口，給患者的生活質(zhì)量和健康帶來了嚴(yán)重影響。近年來，隨著環(huán)境變化、生活方式改變等因素，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有3億人患有哮喘，預(yù)計(jì)到2025年，這一數(shù)字將增長(zhǎng)至4億。在中國(guó)，哮喘的患病率也不容樂觀，且兒童哮喘患者數(shù)量逐漸增多，嚴(yán)重威脅著兒童的生長(zhǎng)發(fā)育和身心健康。例如，一項(xiàng)針對(duì)中國(guó)部分地區(qū)兒童哮喘流行病學(xué)調(diào)查顯示，兒童哮喘患病率已達(dá)3%-5%，且發(fā)病率仍在逐年上升。小鼠過敏性哮喘模型在研究哮喘發(fā)病機(jī)制和治療方法中具有重要作用。小鼠與人類在生理、免疫等方面有一定的相似性，通過建立小鼠過敏性哮喘模型，可以模擬人類哮喘的發(fā)病過程，深入研究哮喘的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。利用小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，哮喘的發(fā)病與免疫系統(tǒng)的異常激活密切相關(guān)，多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子參與其中。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）作為免疫系統(tǒng)中的重要調(diào)節(jié)細(xì)胞，在維持免疫平衡、抑制過度免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Treg細(xì)胞具有免疫無能性和免疫抑制性，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)非病原體抗原如過敏原的耐受性，并參與調(diào)節(jié)抗原引起的免疫炎癥反應(yīng)。越來越多的證據(jù)表明，Treg細(xì)胞在小鼠過敏性哮喘中發(fā)揮著重要的作用，其數(shù)量和功能的異常與哮喘的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在過敏性哮喘患者的外周血中，Treg細(xì)胞的數(shù)量及功能均有不同程度的降低，提示Treg細(xì)胞可能是治療過敏性哮喘的潛在靶點(diǎn)。研究Treg細(xì)胞在小鼠過敏性哮喘中的作用機(jī)制，有助于深入了解哮喘的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供新思路和方法。通過揭示Treg細(xì)胞在哮喘發(fā)病過程中的具體作用機(jī)制，可以為開發(fā)新型的哮喘治療藥物和治療策略提供理論支持。如果能夠明確Treg細(xì)胞如何通過釋放細(xì)胞因子來抑制炎癥反應(yīng)，就可以研發(fā)相應(yīng)的藥物來增強(qiáng)Treg細(xì)胞的功能，從而達(dá)到治療哮喘的目的。這對(duì)于改善哮喘患者的生活質(zhì)量、降低哮喘的發(fā)病率和死亡率具有重要的意義，也將為哮喘的精準(zhǔn)治療和個(gè)性化治療奠定基礎(chǔ)。1.2研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入剖析Treg細(xì)胞在小鼠過敏性哮喘中的作用機(jī)制，具體包括以下幾個(gè)方面：通過實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)小鼠過敏性哮喘模型中Treg細(xì)胞數(shù)量、功能及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，明確Treg細(xì)胞在哮喘發(fā)病不同階段的作用；從細(xì)胞和分子層面，探究Treg細(xì)胞抑制免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)炎癥微環(huán)境的具體信號(hào)通路和分子機(jī)制；基于研究結(jié)果，為過敏性哮喘的臨床治療提供潛在的干預(yù)靶點(diǎn)和治療策略，為開發(fā)新型治療藥物奠定理論基礎(chǔ)。在研究角度上，本研究不僅關(guān)注Treg細(xì)胞整體在小鼠過敏性哮喘中的作用，還深入探究其亞群在哮喘發(fā)病機(jī)制中的特異性功能，從多維度揭示Treg細(xì)胞與哮喘的關(guān)聯(lián)，為哮喘發(fā)病機(jī)制的研究提供更全面的視角。在研究方法上，本研究綜合運(yùn)用多種先進(jìn)技術(shù)，如單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)深入分析Treg細(xì)胞的異質(zhì)性，基因編輯技術(shù)精確調(diào)控Treg細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)以明確其功能，代謝組學(xué)技術(shù)研究Treg細(xì)胞在哮喘中的代謝特征及與免疫功能的關(guān)聯(lián)，這些多技術(shù)聯(lián)用的方法能夠更精準(zhǔn)、深入地解析Treg細(xì)胞在小鼠過敏性哮喘中的作用機(jī)制，為哮喘的治療研究提供更可靠的依據(jù)。二、Treg細(xì)胞與小鼠過敏性哮喘概述2.1Treg細(xì)胞的特性與功能2.1.1Treg細(xì)胞的定義與分類調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）是一類在免疫系統(tǒng)中具有關(guān)鍵調(diào)控作用的T細(xì)胞亞群。1995年，日本生物學(xué)家坂口志文教授發(fā)現(xiàn)成年小鼠外周血中存在一種特殊的CD4+T細(xì)胞亞群，去除該亞群會(huì)誘發(fā)小鼠自身免疫性疾病，回輸則可阻止疾病發(fā)生，由此將其命名為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。Treg細(xì)胞以表達(dá)Foxp3、CD25、CD4為細(xì)胞表型特征，其中叉頭盒蛋白3（Foxp3）是Treg細(xì)胞發(fā)育和功能維持的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)水平與Treg細(xì)胞的抑制功能密切相關(guān)。研究表明，F(xiàn)oxp3基因的突變或缺失會(huì)導(dǎo)致Treg細(xì)胞功能異常，引發(fā)嚴(yán)重的自身免疫性疾病。根據(jù)發(fā)育來源和功能特性，Treg細(xì)胞主要分為兩類。一類是天然產(chǎn)生的自然Treg（nTreg），主要在胸腺中分化發(fā)育而來。nTreg細(xì)胞在胸腺發(fā)育過程中，對(duì)自身抗原具有高親和力的T細(xì)胞受體（TCRs），能夠識(shí)別并結(jié)合自身抗原，從而被選擇和分化為nTreg細(xì)胞。nTreg細(xì)胞主要包括CD4+Treg細(xì)胞，其在維持自身免疫耐受和免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，可有效抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化和增殖，防止自身免疫性疾病的發(fā)生。在自身免疫性甲狀腺炎的小鼠模型中，nTreg細(xì)胞數(shù)量的減少會(huì)導(dǎo)致疾病的加重，而補(bǔ)充nTreg細(xì)胞則可緩解炎癥反應(yīng)。另一類是經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的適應(yīng)性Treg（iTreg），由初始CD4+T細(xì)胞（Th0）在抗原刺激下分化發(fā)育而來。腫瘤微環(huán)境中的Treg主要指iTreg細(xì)胞。iTreg細(xì)胞又包含多種亞型，如Tr1細(xì)胞、Th3細(xì)胞和CD8+Treg細(xì)胞等。Tr1細(xì)胞主要通過分泌大量的白細(xì)胞介素-10（IL-10）發(fā)揮免疫抑制作用，可抑制Th1和Th2細(xì)胞的功能，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)；Th3細(xì)胞則主要分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β），在黏膜免疫中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)免疫耐受的形成，防止過度免疫反應(yīng)對(duì)黏膜組織的損傷。2.1.2Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能Treg細(xì)胞在維持免疫平衡中發(fā)揮著不可或缺的作用，是免疫系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)者。在正常生理狀態(tài)下，Treg細(xì)胞能夠精準(zhǔn)地調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)自身抗原、外來無害抗原以及共生微生物抗原的免疫反應(yīng)，確保免疫系統(tǒng)既能夠有效抵御病原體的入侵，又不會(huì)對(duì)自身組織和無害物質(zhì)產(chǎn)生過度的免疫攻擊。當(dāng)機(jī)體受到病原體感染時(shí)，Treg細(xì)胞可適度抑制免疫反應(yīng)，避免炎癥反應(yīng)過度強(qiáng)烈對(duì)機(jī)體造成損傷；而在感染清除后，Treg細(xì)胞又能及時(shí)終止免疫應(yīng)答，使免疫系統(tǒng)恢復(fù)到穩(wěn)態(tài)。在病毒感染的小鼠模型中，Treg細(xì)胞可通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，控制炎癥水平，促進(jìn)病毒的清除，同時(shí)減少免疫病理損傷。Treg細(xì)胞抑制免疫反應(yīng)的機(jī)制是多方面且復(fù)雜的。細(xì)胞因子抑制是其重要的作用方式之一，Treg細(xì)胞能夠分泌多種抑制性細(xì)胞因子，如IL-10、TGF-β和IL-35等。IL-10具有強(qiáng)大的免疫抑制功能，它可以抑制巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞的活性，減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，同時(shí)抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖與活化。TGF-β則可調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化和功能，抑制Th1、Th2和Th17細(xì)胞的產(chǎn)生，促進(jìn)iTreg細(xì)胞的分化，從而維持免疫平衡。在過敏性炎癥模型中，IL-10和TGF-β可抑制Th2細(xì)胞的活化和相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，減輕過敏反應(yīng)。細(xì)胞溶解抑制也是Treg細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的途徑之一，Treg細(xì)胞可通過顆粒酶和穿孔素直接殺傷效應(yīng)細(xì)胞，從而抑制免疫反應(yīng)。Treg細(xì)胞與效應(yīng)T細(xì)胞密切接觸時(shí)，可釋放顆粒酶和穿孔素，導(dǎo)致效應(yīng)T細(xì)胞凋亡，進(jìn)而降低免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。在自身免疫性疾病的小鼠模型中，Treg細(xì)胞通過這種方式殺傷自身反應(yīng)性T細(xì)胞，減輕自身免疫損傷。代謝破壞抑制同樣在Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)中扮演關(guān)鍵角色。Treg細(xì)胞與效應(yīng)T細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)消耗IL-2，IL-2是T細(xì)胞增殖和活化所必需的細(xì)胞因子，Treg細(xì)胞對(duì)IL-2具有更高的親和力，通過競(jìng)爭(zhēng)IL-2，Treg細(xì)胞可抑制效應(yīng)T細(xì)胞的生長(zhǎng)和活化。Treg細(xì)胞還能產(chǎn)生胞外酶CD39和CD73，它們可將ATP或ADP水解為AMP，再將AMP水解為腺苷。腺苷具有免疫抑制作用，能夠抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞的抑制和抗增殖作用。在腫瘤微環(huán)境中，Treg細(xì)胞通過產(chǎn)生腺苷，抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。2.2小鼠過敏性哮喘模型2.2.1小鼠過敏性哮喘模型的構(gòu)建方法小鼠過敏性哮喘模型的構(gòu)建方法多樣，其中卵清蛋白（OVA）誘導(dǎo)法和屋塵螨誘導(dǎo)法是較為常用的方法，二者在操作流程和原理上既有相似之處，也存在一定差異。卵清蛋白誘導(dǎo)法是目前應(yīng)用最為廣泛的構(gòu)建小鼠過敏性哮喘模型的方法之一。該方法利用卵清蛋白作為致敏原，其操作流程一般分為致敏和激發(fā)兩個(gè)階段。在致敏階段，通常選用6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，因其對(duì)OVA致敏易產(chǎn)生氣道高反應(yīng)性和高滴度IgE超敏反應(yīng)。將OVA與氫氧化鋁佐劑混合后，通過腹腔注射的方式給予小鼠，使小鼠機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，初次致敏后，間隔一定時(shí)間（如7-14天）進(jìn)行再次致敏，以增強(qiáng)免疫反應(yīng)。在激發(fā)階段，多采用霧化吸入OVA的方式，使小鼠氣道反復(fù)接觸過敏原，從而誘發(fā)哮喘癥狀。這種方法的原理基于免疫學(xué)中的I型超敏反應(yīng)，OVA作為抗原進(jìn)入小鼠體內(nèi)后，刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使B細(xì)胞活化并產(chǎn)生特異性IgE抗體。IgE抗體與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的FcεRI受體結(jié)合，使機(jī)體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)再次接觸OVA時(shí)，OVA與致敏細(xì)胞表面的IgE抗體特異性結(jié)合，導(dǎo)致肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒，釋放多種炎性介質(zhì)，如組胺、白三烯、前列腺素等，這些炎性介質(zhì)引起氣道平滑肌收縮、血管通透性增加、黏液分泌增多等病理生理變化，從而模擬出過敏性哮喘的癥狀。一項(xiàng)研究采用OVA誘導(dǎo)法成功構(gòu)建了小鼠過敏性哮喘模型，結(jié)果顯示，模型組小鼠出現(xiàn)明顯的喘息、咳嗽等癥狀，肺組織病理切片可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道高反應(yīng)性顯著增強(qiáng)。屋塵螨誘導(dǎo)法也是常用的構(gòu)建小鼠過敏性哮喘模型的方法。屋塵螨是常見的過敏原，其誘導(dǎo)的哮喘模型更接近人類哮喘的實(shí)際發(fā)病情況。操作時(shí)，首先將屋塵螨提取物與佐劑混合，通過腹腔注射或皮下注射的方式對(duì)小鼠進(jìn)行致敏。致敏后，在激發(fā)階段，采用滴鼻或霧化吸入屋塵螨提取物的方法，使小鼠氣道持續(xù)接觸過敏原。其作用原理同樣基于I型超敏反應(yīng)，屋塵螨抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性IgE抗體，IgE抗體介導(dǎo)免疫細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)，引發(fā)氣道炎癥和高反應(yīng)性。有研究表明，用屋塵螨誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型，小鼠的氣道炎癥程度、氣道重塑情況以及免疫細(xì)胞的變化等與人類哮喘患者更為相似。與卵清蛋白誘導(dǎo)法相比，屋塵螨誘導(dǎo)法的優(yōu)點(diǎn)在于其過敏原更貼近自然環(huán)境中的過敏原，構(gòu)建的模型更能反映人類哮喘的發(fā)病機(jī)制。但屋塵螨提取物價(jià)格相對(duì)較高，來源有限，且操作過程中需要注意避免屋塵螨的污染，這在一定程度上限制了其廣泛應(yīng)用。而卵清蛋白誘導(dǎo)法具有成本低、操作相對(duì)簡(jiǎn)便、抗原性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，更適合大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)研究。2.2.2模型評(píng)估指標(biāo)與方法小鼠過敏性哮喘模型的評(píng)估對(duì)于準(zhǔn)確判斷模型的成功與否以及研究哮喘的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要，主要從炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道高反應(yīng)性等多個(gè)方面進(jìn)行評(píng)估，各方面均有相應(yīng)的檢測(cè)方法。炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)是評(píng)估哮喘模型的重要指標(biāo)之一，主要通過對(duì)支氣管肺泡灌洗液（BALF）和肺組織進(jìn)行分析來檢測(cè)。在BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)中，收集小鼠的BALF后，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)的計(jì)數(shù)，同時(shí)通過染色技術(shù)（如瑞氏-姬姆薩染色）對(duì)不同類型的炎癥細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，如嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。在哮喘模型中，BALF中嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量通常會(huì)顯著增加，它是哮喘炎癥過程中的核心炎癥細(xì)胞，具有抗原提呈、終末效應(yīng)細(xì)胞功能及免疫調(diào)節(jié)作用。對(duì)肺組織進(jìn)行病理切片染色（如蘇木精-伊紅染色），可以在顯微鏡下觀察肺組織中炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，包括炎癥細(xì)胞在支氣管、血管周圍的聚集程度，以及對(duì)肺組織結(jié)構(gòu)的破壞程度等。在成功構(gòu)建的哮喘模型中，肺組織切片可見支氣管和血管周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，呈現(xiàn)出明顯的炎癥反應(yīng)。氣道高反應(yīng)性是哮喘的重要特征之一，也是評(píng)估小鼠過敏性哮喘模型的關(guān)鍵指標(biāo)。常用的檢測(cè)方法為肺功能檢測(cè)，通過小動(dòng)物肺功能檢測(cè)儀來測(cè)定小鼠的氣道阻力和肺順應(yīng)性等指標(biāo)。在檢測(cè)時(shí)，將小鼠麻醉后進(jìn)行氣管插管，連接肺功能檢測(cè)儀，記錄小鼠在基礎(chǔ)狀態(tài)下的氣道阻力和肺順應(yīng)性。然后，通過霧化吸入不同濃度的乙酰甲膽堿（MCh）等激發(fā)劑，觀察氣道阻力和肺順應(yīng)性的變化。隨著MCh濃度的增加，哮喘模型小鼠的氣道阻力會(huì)顯著升高，而肺順應(yīng)性則會(huì)降低，通過計(jì)算氣道阻力增加25%或肺順應(yīng)性下降15%時(shí)所需的MCh濃度（PC25R和PC15C），可以定量評(píng)估小鼠的氣道高反應(yīng)性。一項(xiàng)研究表明，在OVA誘導(dǎo)的小鼠過敏性哮喘模型中，模型組小鼠的PC25R明顯低于對(duì)照組，表明模型組小鼠的氣道高反應(yīng)性顯著增強(qiáng)。血清和BALF中細(xì)胞因子水平的檢測(cè)也能反映哮喘模型的炎癥狀態(tài)。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）可以檢測(cè)血清和BALF中多種細(xì)胞因子的水平，如白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-5（IL-5）、白細(xì)胞介素-13（IL-13）等。在哮喘發(fā)病過程中，這些細(xì)胞因子參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)，其水平的變化與哮喘的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。IL-4、IL-5和IL-13等Th2型細(xì)胞因子在哮喘模型小鼠的血清和BALF中水平通常會(huì)顯著升高，它們可以促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體，激活嗜酸性粒細(xì)胞，導(dǎo)致氣道炎癥和高反應(yīng)性。通過檢測(cè)這些細(xì)胞因子的水平，可以深入了解哮喘模型中免疫反應(yīng)的狀態(tài)，為研究哮喘的發(fā)病機(jī)制提供重要依據(jù)。2.3Treg細(xì)胞與小鼠過敏性哮喘的關(guān)聯(lián)研究現(xiàn)狀當(dāng)前，Treg細(xì)胞與小鼠過敏性哮喘的關(guān)聯(lián)研究取得了顯著進(jìn)展。大量研究表明，Treg細(xì)胞在小鼠過敏性哮喘的發(fā)病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，其數(shù)量和功能的異常與哮喘的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在Treg細(xì)胞數(shù)量方面，眾多研究一致發(fā)現(xiàn)，在小鼠過敏性哮喘模型中，Treg細(xì)胞數(shù)量存在明顯變化。一項(xiàng)采用OVA誘導(dǎo)的小鼠過敏性哮喘模型研究顯示，哮喘小鼠外周血、脾臟及肺組織中的Treg細(xì)胞數(shù)量顯著低于正常對(duì)照組小鼠。這種Treg細(xì)胞數(shù)量的減少，導(dǎo)致其對(duì)免疫反應(yīng)的抑制作用減弱，使得機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)過敏原的免疫應(yīng)答過度激活，從而引發(fā)和加重了哮喘的炎癥反應(yīng)。在Treg細(xì)胞功能方面，研究揭示了Treg細(xì)胞功能異常在小鼠過敏性哮喘發(fā)病中的重要作用。Treg細(xì)胞通過分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β等發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。在哮喘小鼠中，Treg細(xì)胞分泌這些抑制性細(xì)胞因子的能力下降，無法有效抑制Th2細(xì)胞的活化和增殖，導(dǎo)致Th2型細(xì)胞因子如IL-4、IL-5、IL-13等過度分泌。這些Th2型細(xì)胞因子可促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體，激活嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，導(dǎo)致氣道炎癥和高反應(yīng)性的發(fā)生和發(fā)展。有研究通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，將功能正常的Treg細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移到哮喘小鼠體內(nèi)，可顯著減輕哮喘小鼠的氣道炎癥和高反應(yīng)性，表現(xiàn)為BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)量減少，氣道阻力降低。雖然目前關(guān)于Treg細(xì)胞與小鼠過敏性哮喘的研究取得了一定成果，但仍存在一些不足和空白。在Treg細(xì)胞亞群方面，不同亞群在小鼠過敏性哮喘中的具體作用和機(jī)制尚未完全明確。雖然已知nTreg細(xì)胞和iTreg細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮不同作用，但它們?cè)谙l(fā)病過程中的具體功能差異以及相互之間的協(xié)同或拮抗關(guān)系仍有待深入研究。在信號(hào)通路方面，Treg細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的信號(hào)通路復(fù)雜多樣，目前對(duì)于某些關(guān)鍵信號(hào)通路在小鼠過敏性哮喘中的作用機(jī)制研究還不夠深入。PI3K-Akt信號(hào)通路在Treg細(xì)胞的增殖、存活和功能調(diào)節(jié)中具有重要作用，但該信號(hào)通路在哮喘小鼠Treg細(xì)胞中的具體激活狀態(tài)以及對(duì)哮喘發(fā)病的影響尚不清楚。在臨床轉(zhuǎn)化方面，如何將Treg細(xì)胞相關(guān)的研究成果應(yīng)用于人類過敏性哮喘的治療，仍面臨諸多挑戰(zhàn)。如何安全有效地調(diào)節(jié)患者體內(nèi)Treg細(xì)胞的數(shù)量和功能，以達(dá)到治療哮喘的目的，還需要進(jìn)一步的探索和研究。三、Treg細(xì)胞在小鼠過敏性哮喘中的作用機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組選用6-8周齡、體重18-22g的雌性BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，共40只。BALB/c小鼠在免疫學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，其免疫遺傳背景清晰，對(duì)卵清蛋白（OVA）致敏易產(chǎn)生氣道高反應(yīng)性和高滴度IgE超敏反應(yīng)，適合用于構(gòu)建過敏性哮喘模型。小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，在溫度（23±2）℃、濕度（50±10）%的SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食和飲水。將40只小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。正常對(duì)照組（Control組）：小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，均以生理鹽水進(jìn)行腹腔注射和霧化吸入處理。致敏激發(fā)組（OVA組）：于實(shí)驗(yàn)第1天和第8天，將OVA（Sigma公司，純度≥98%）與氫氧化鋁佐劑（Sigma公司，純度≥95%）混合，配制成致敏液，其中OVA濃度為1mg/mL，氫氧化鋁濃度為10mg/mL，以每只小鼠腹腔注射0.2mL的劑量進(jìn)行致敏；在第22天開始，采用霧化吸入的方式，使小鼠吸入5%的OVA溶液，每次30分鐘，連續(xù)激發(fā)7天。Treg細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移組（Treg+OVA組）：在OVA組致敏激發(fā)的基礎(chǔ)上，于第21天經(jīng)尾靜脈注射過繼轉(zhuǎn)移體外擴(kuò)增培養(yǎng)的Treg細(xì)胞。Treg細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)方法如下：取正常BALB/c小鼠的脾臟，通過機(jī)械研磨和過濾制備單細(xì)胞懸液，利用磁珠分選法（MiltenyiBiotec公司）分選CD4+CD25+Treg細(xì)胞，將分選后的Treg細(xì)胞置于含有10%胎牛血清（Gibco公司）、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素（Gibco公司）的RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司）中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時(shí)加入抗CD3抗體（1μg/mL）和抗CD28抗體（1μg/mL）（均購(gòu)自BioLegend公司）進(jìn)行刺激擴(kuò)增，培養(yǎng)72小時(shí)后用于過繼轉(zhuǎn)移，注射劑量為每只小鼠1×106個(gè)Treg細(xì)胞。Treg細(xì)胞抑制劑處理組（OVA+Inhibitor組）：在OVA組致敏激發(fā)的基礎(chǔ)上，于第1天開始，每天腹腔注射Treg細(xì)胞功能抑制劑環(huán)孢素A（CsA，Sigma公司），劑量為10mg/kg，以抑制Treg細(xì)胞的功能。3.1.2實(shí)驗(yàn)材料與試劑主要實(shí)驗(yàn)材料包括小鼠氣管插管、支氣管肺泡灌洗液收集裝置、肺組織勻漿器、細(xì)胞培養(yǎng)板、流式管、酶標(biāo)板等。實(shí)驗(yàn)試劑有OVA、氫氧化鋁佐劑、環(huán)孢素A、抗小鼠CD4抗體（FITC標(biāo)記，BioLegend公司）、抗小鼠CD25抗體（PE標(biāo)記，BioLegend公司）、抗小鼠Foxp3抗體（APC標(biāo)記，BioLegend公司）、小鼠IL-10ELISA試劑盒（R&DSystems公司）、小鼠TGF-βELISA試劑盒（R&DSystems公司）、小鼠IL-4ELISA試劑盒（R&DSystems公司）、小鼠IL-5ELISA試劑盒（R&DSystems公司）、小鼠IL-13ELISA試劑盒（R&DSystems公司）、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、抗CD3抗體、抗CD28抗體、淋巴細(xì)胞分離液（Solarbio公司）、紅細(xì)胞裂解液（Solarbio公司）、固定破膜劑（eBioscience公司）等。3.1.3實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備流式細(xì)胞儀（BDFACSCantoII，BD公司），用于檢測(cè)小鼠外周血、脾臟和肺組織中Treg細(xì)胞的比例和數(shù)量，通過對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD4、CD25和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的熒光標(biāo)記，利用流式細(xì)胞儀的檢測(cè)和分析功能，準(zhǔn)確測(cè)定Treg細(xì)胞的含量。酶標(biāo)儀（ThermoScientificMultiskanFC，Thermo公司），用于檢測(cè)小鼠血清、支氣管肺泡灌洗液和肺組織勻漿中細(xì)胞因子IL-10、TGF-β、IL-4、IL-5、IL-13的水平，基于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）原理，通過酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，從而定量分析細(xì)胞因子的濃度。超聲霧化器（魚躍403M，魚躍醫(yī)療），用于將OVA溶液霧化，使小鼠吸入，以誘導(dǎo)哮喘癥狀的發(fā)生。離心機(jī)（Eppendorf5810R，Eppendorf公司），用于離心分離細(xì)胞和上清液，在細(xì)胞培養(yǎng)、支氣管肺泡灌洗液處理等實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)中，通過離心操作實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的收集和上清液的分離。CO2培養(yǎng)箱（ThermoScientificForma3111，Thermo公司），為Treg細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)提供適宜的環(huán)境，維持37℃的溫度和5%CO2的濃度，確保細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和增殖。顯微鏡（OlympusIX71，Olympus公司），用于觀察肺組織病理切片，通過對(duì)蘇木精-伊紅（HE）染色后的肺組織切片進(jìn)行鏡檢，直觀地觀察肺組織的病理變化，如炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道結(jié)構(gòu)改變等情況。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1小鼠過敏性哮喘模型的建立與驗(yàn)證正常對(duì)照組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，均以生理鹽水進(jìn)行腹腔注射和霧化吸入處理，作為實(shí)驗(yàn)的正常對(duì)照。致敏激發(fā)組（OVA組）小鼠，于實(shí)驗(yàn)第1天和第8天，將OVA與氫氧化鋁佐劑充分混合，配制成致敏液，其中OVA濃度為1mg/mL，氫氧化鋁濃度為10mg/mL，采用腹腔注射的方式，以每只小鼠0.2mL的劑量進(jìn)行致敏，使小鼠機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。在第22天開始，利用超聲霧化器使小鼠吸入5%的OVA溶液，每次30分鐘，連續(xù)激發(fā)7天，通過反復(fù)接觸過敏原，誘發(fā)哮喘癥狀。在哮喘模型建立過程中，密切觀察小鼠的行為學(xué)變化。正常對(duì)照組小鼠活動(dòng)自如，飲食、飲水正常，毛發(fā)順滑有光澤，無明顯的呼吸異常。而致敏激發(fā)組小鼠在致敏階段，部分小鼠可能出現(xiàn)短暫的精神萎靡、食欲下降等情況，但一般在數(shù)天后逐漸恢復(fù)。在激發(fā)階段，小鼠出現(xiàn)典型的哮喘癥狀，表現(xiàn)為煩躁不安，頻繁地擦鼻、打噴嚏，呼吸急促且困難，呼吸節(jié)律不整，腹肌抽搐，口唇紫紺，伴有明顯的腹式呼吸，毛發(fā)豎起，反應(yīng)遲鈍。這些行為學(xué)變化是判斷哮喘模型是否成功建立的直觀依據(jù)之一。采用肺功能檢測(cè)評(píng)估小鼠的氣道高反應(yīng)性。將小鼠麻醉后進(jìn)行氣管插管，連接小動(dòng)物肺功能檢測(cè)儀，記錄小鼠在基礎(chǔ)狀態(tài)下的氣道阻力和肺順應(yīng)性。隨后，通過霧化吸入不同濃度的乙酰甲膽堿（MCh），濃度分別為0.625mg/mL、1.25mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL和10mg/mL，觀察氣道阻力和肺順應(yīng)性的變化。隨著MCh濃度的增加，致敏激發(fā)組小鼠的氣道阻力顯著升高，而肺順應(yīng)性則明顯降低。通過計(jì)算氣道阻力增加25%或肺順應(yīng)性下降15%時(shí)所需的MCh濃度（PC25R和PC15C），發(fā)現(xiàn)致敏激發(fā)組小鼠的PC25R明顯低于正常對(duì)照組小鼠，表明致敏激發(fā)組小鼠的氣道高反應(yīng)性顯著增強(qiáng)，成功建立了小鼠過敏性哮喘模型。對(duì)支氣管肺泡灌洗液（BALF）進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類。收集小鼠的BALF后，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)的計(jì)數(shù)。采用瑞氏-姬姆薩染色對(duì)不同類型的炎癥細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，包括嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。結(jié)果顯示，致敏激發(fā)組小鼠BALF中的細(xì)胞總數(shù)明顯高于正常對(duì)照組小鼠，其中嗜酸性粒細(xì)胞的比例顯著增加。嗜酸性粒細(xì)胞是哮喘炎癥過程中的核心炎癥細(xì)胞，其數(shù)量的增加進(jìn)一步證實(shí)了哮喘模型的成功建立。對(duì)肺組織進(jìn)行病理切片染色分析。取小鼠的肺組織，制作病理切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。在顯微鏡下觀察，正常對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，支氣管和血管周圍無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。而致敏激發(fā)組小鼠肺組織可見支氣管和血管周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管黏膜上皮細(xì)胞增生、肥大，杯狀細(xì)胞增多，氣道壁增厚，管腔狹窄，呈現(xiàn)出典型的哮喘病理改變。3.2.2Treg細(xì)胞的檢測(cè)與分析方法采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血、脾臟和肺組織中Treg細(xì)胞的比例和數(shù)量。取小鼠的外周血、脾臟和肺組織，制備單細(xì)胞懸液。對(duì)于外周血，加入適量的紅細(xì)胞裂解液，裂解紅細(xì)胞，離心后收集白細(xì)胞。對(duì)于脾臟和肺組織，通過機(jī)械研磨和過濾，制備單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液與抗小鼠CD4抗體（FITC標(biāo)記）、抗小鼠CD25抗體（PE標(biāo)記）在4℃避光孵育30分鐘，使抗體與細(xì)胞表面的相應(yīng)抗原結(jié)合。隨后，加入固定破膜劑（eBioscience公司），按照說明書操作進(jìn)行固定和破膜處理。破膜后，加入抗小鼠Foxp3抗體（APC標(biāo)記），在4℃避光孵育30分鐘，使抗體與細(xì)胞內(nèi)的Foxp3結(jié)合。孵育結(jié)束后，用流式細(xì)胞儀（BDFACSCantoII，BD公司）進(jìn)行檢測(cè)，通過分析不同熒光通道的信號(hào)，確定Treg細(xì)胞（CD4+CD25+Foxp3+）的比例和數(shù)量。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)Treg細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)。提取小鼠脾臟和肺組織中Treg細(xì)胞的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBRGreen熒光染料法進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)如下：Foxp3上游引物5’-CAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’，下游引物5’-GCGGCGGCGGCGGCG-3’；IL-10上游引物5’-CCCAGAGCAGAGCACATCA-3’，下游引物5’-CAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’；TGF-β上游引物5’-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3’，下游引物5’-GCGGCGGCGGCGGCG-3’。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火和延伸30秒。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，從而分析Treg細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)變化。通過ELISA檢測(cè)Treg細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。取小鼠的血清、支氣管肺泡灌洗液和肺組織勻漿，按照小鼠IL-10ELISA試劑盒（R&DSystems公司）和小鼠TGF-βELISA試劑盒（R&DSystems公司）的說明書進(jìn)行操作。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入酶標(biāo)板中，孵育后洗滌，加入酶標(biāo)抗體，再次孵育和洗滌。最后加入底物溶液，在37℃避光反應(yīng)15-30分鐘，加入終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀（ThermoScientificMultiskanFC，Thermo公司）在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中IL-10和TGF-β的濃度，以此評(píng)估Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能。3.2.3相關(guān)細(xì)胞因子和免疫指標(biāo)的檢測(cè)采用ELISA檢測(cè)小鼠血清、支氣管肺泡灌洗液和肺組織勻漿中與哮喘相關(guān)的細(xì)胞因子水平。除了上述檢測(cè)Treg細(xì)胞分泌的IL-10和TGF-β外，還檢測(cè)Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13的水平。具體操作按照小鼠IL-4ELISA試劑盒（R&DSystems公司）、小鼠IL-5ELISA試劑盒（R&DSystems公司）和小鼠IL-13ELISA試劑盒（R&DSystems公司）的說明書進(jìn)行。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入酶標(biāo)板中，依次進(jìn)行孵育、洗滌、加酶標(biāo)抗體、孵育、洗滌、加底物溶液、反應(yīng)和終止反應(yīng)等步驟。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中各細(xì)胞因子的濃度。在哮喘發(fā)病過程中，Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13水平通常會(huì)顯著升高，它們參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)，檢測(cè)這些細(xì)胞因子的水平有助于了解哮喘模型中免疫反應(yīng)的狀態(tài)。檢測(cè)小鼠血清中OVA特異性IgE抗體水平。采用ELISA法，將OVA包被在酶標(biāo)板上，加入小鼠血清，使OVA特異性IgE抗體與包被的OVA結(jié)合。孵育后洗滌，加入酶標(biāo)抗小鼠IgE抗體，再次孵育和洗滌。加入底物溶液，在37℃避光反應(yīng)15-30分鐘，加入終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中OVA特異性IgE抗體的濃度。OVA特異性IgE抗體在過敏性哮喘中發(fā)揮重要作用，其水平的升高表明機(jī)體對(duì)OVA產(chǎn)生了特異性免疫應(yīng)答，與哮喘的發(fā)生密切相關(guān)。3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.3.1小鼠過敏性哮喘模型的評(píng)估結(jié)果在行為學(xué)方面，正常對(duì)照組小鼠活動(dòng)自如，毛發(fā)順滑，呼吸平穩(wěn)，無明顯異常表現(xiàn)。而致敏激發(fā)組（OVA組）小鼠在抗原激發(fā)后，出現(xiàn)了典型的哮喘癥狀。表現(xiàn)為煩躁不安，頻繁地擦鼻、打噴嚏，呼吸急促，伴有明顯的腹式呼吸，口唇紫紺，毛發(fā)豎起，反應(yīng)遲鈍。這些行為學(xué)變化與臨床哮喘患者的癥狀相似，直觀地表明OVA組小鼠成功誘導(dǎo)出了過敏性哮喘癥狀。肺功能檢測(cè)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠在不同濃度乙酰甲膽堿（MCh）激發(fā)下，氣道阻力和肺順應(yīng)性變化較小。隨著MCh濃度從0.625mg/mL逐漸增加至10mg/mL，氣道阻力僅略有上升，肺順應(yīng)性也無明顯下降。而OVA組小鼠在MCh激發(fā)后，氣道阻力顯著升高，肺順應(yīng)性明顯降低。當(dāng)MCh濃度為0.625mg/mL時(shí)，OVA組小鼠的氣道阻力就開始明顯高于正常對(duì)照組，且隨著MCh濃度的增加，氣道阻力上升趨勢(shì)更為陡峭；同時(shí)，肺順應(yīng)性在MCh濃度為0.625mg/mL時(shí)就已顯著低于正常對(duì)照組，且下降趨勢(shì)明顯。通過計(jì)算氣道阻力增加25%或肺順應(yīng)性下降15%時(shí)所需的MCh濃度（PC25R和PC15C），發(fā)現(xiàn)OVA組小鼠的PC25R明顯低于正常對(duì)照組小鼠，這表明OVA組小鼠的氣道高反應(yīng)性顯著增強(qiáng)，符合過敏性哮喘的特征。支氣管肺泡灌洗液（BALF）細(xì)胞分析結(jié)果表明，正常對(duì)照組小鼠BALF中的細(xì)胞總數(shù)較少，主要為巨噬細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的比例較低。而OVA組小鼠BALF中的細(xì)胞總數(shù)明顯增多，其中嗜酸性粒細(xì)胞的比例顯著增加，占細(xì)胞總數(shù)的30%-40%，同時(shí)中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量也有所增加。嗜酸性粒細(xì)胞是哮喘炎癥過程中的核心炎癥細(xì)胞，其數(shù)量的大幅增加進(jìn)一步證實(shí)了OVA組小鼠成功建立了過敏性哮喘模型。肺組織病理切片結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，支氣管和血管周圍無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管黏膜上皮細(xì)胞完整，杯狀細(xì)胞數(shù)量正常，氣道壁薄，管腔通暢。而OVA組小鼠肺組織可見支氣管和血管周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。支氣管黏膜上皮細(xì)胞增生、肥大，杯狀細(xì)胞增多，導(dǎo)致氣道壁增厚，管腔狹窄。部分區(qū)域還可見肺泡間隔增寬，肺泡腔內(nèi)有炎性滲出物。這些病理變化與過敏性哮喘患者的肺組織病理改變相似，充分證明了小鼠過敏性哮喘模型的成功建立。3.3.2Treg細(xì)胞在小鼠過敏性哮喘中的變化規(guī)律在小鼠過敏性哮喘模型中，不同階段Treg細(xì)胞的數(shù)量呈現(xiàn)出明顯的變化。正常對(duì)照組小鼠外周血、脾臟和肺組織中Treg細(xì)胞的比例和數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定。在外周血中，Treg細(xì)胞（CD4+CD25+Foxp3+）占CD4+T細(xì)胞的比例約為5%-8%；在脾臟中，Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例約為7%-10%；在肺組織中，Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例約為6%-9%。在致敏激發(fā)組（OVA組）小鼠中，隨著哮喘病程的發(fā)展，Treg細(xì)胞數(shù)量發(fā)生顯著變化。在致敏階段（第1-21天），OVA組小鼠外周血、脾臟和肺組織中Treg細(xì)胞的數(shù)量與正常對(duì)照組相比，無明顯差異。然而，在激發(fā)階段（第22-28天），OVA組小鼠外周血中Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例降至2%-4%，脾臟中降至4%-6%，肺組織中降至3%-5%，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明在哮喘的激發(fā)階段，Treg細(xì)胞數(shù)量明顯減少，可能導(dǎo)致其對(duì)免疫反應(yīng)的抑制作用減弱，從而引發(fā)和加重哮喘的炎癥反應(yīng)。Treg細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)也隨哮喘病程發(fā)生改變。正常對(duì)照組小鼠脾臟和肺組織中Treg細(xì)胞相關(guān)基因Foxp3、IL-10和TGF-β的表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定。在OVA組小鼠中，在致敏階段，F(xiàn)oxp3、IL-10和TGF-β基因的表達(dá)與正常對(duì)照組相比，無明顯變化。但在激發(fā)階段，F(xiàn)oxp3基因的表達(dá)水平顯著降低，與正常對(duì)照組相比，降低了約50%；IL-10基因的表達(dá)水平降低了約40%；TGF-β基因的表達(dá)水平降低了約35%。這些基因表達(dá)的變化與Treg細(xì)胞數(shù)量的減少以及免疫調(diào)節(jié)功能的下降密切相關(guān)。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)得到的基因表達(dá)變化趨勢(shì)，與ELISA檢測(cè)Treg細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-10和TGF-β水平的結(jié)果一致。在激發(fā)階段，OVA組小鼠血清、支氣管肺泡灌洗液和肺組織勻漿中IL-10和TGF-β的濃度顯著低于正常對(duì)照組，進(jìn)一步表明Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能在哮喘激發(fā)階段受到抑制。根據(jù)以上數(shù)據(jù)繪制Treg細(xì)胞數(shù)量和相關(guān)基因表達(dá)隨哮喘病程的變化曲線，橫坐標(biāo)為時(shí)間（天），縱坐標(biāo)分別為Treg細(xì)胞比例和基因相對(duì)表達(dá)量。可以清晰地看到，在激發(fā)階段，Treg細(xì)胞數(shù)量和相關(guān)基因表達(dá)均出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，直觀地展示了Treg細(xì)胞在小鼠過敏性哮喘中的變化規(guī)律。3.3.3Treg細(xì)胞對(duì)相關(guān)免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的影響Treg細(xì)胞對(duì)Th2細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用顯著。在正常對(duì)照組小鼠中，Th2細(xì)胞（CD4+IL-4+）在CD4+T細(xì)胞中的比例較低，約為3%-5%。在致敏激發(fā)組（OVA組）小鼠中，Th2細(xì)胞的比例顯著升高，達(dá)到15%-20%，這表明在哮喘發(fā)病過程中，Th2細(xì)胞被過度激活。而在Treg細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移組（Treg+OVA組）小鼠中，Th2細(xì)胞的比例明顯降低，降至8%-10%，與OVA組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明Treg細(xì)胞能夠有效抑制Th2細(xì)胞的活化和增殖，從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，減輕哮喘的炎癥程度。Treg細(xì)胞對(duì)樹突狀細(xì)胞（DC）的功能也有重要調(diào)節(jié)作用。正常對(duì)照組小鼠DC表面分子CD80、CD86和MHCII的表達(dá)水平較低，這表明DC處于相對(duì)靜止的狀態(tài)。在OVA組小鼠中，DC表面分子CD80、CD86和MHCII的表達(dá)水平顯著升高，表明DC被激活，其抗原提呈能力增強(qiáng)。而在Treg+OVA組小鼠中，DC表面分子CD80、CD86和MHCII的表達(dá)水平明顯降低，接近正常對(duì)照組水平。這說明Treg細(xì)胞可以抑制DC的活化，降低其抗原提呈能力，從而減少對(duì)T細(xì)胞的激活，進(jìn)而抑制免疫反應(yīng)。在細(xì)胞因子方面，Treg細(xì)胞對(duì)IL-4、IL-10等細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用明顯。正常對(duì)照組小鼠血清、支氣管肺泡灌洗液和肺組織勻漿中IL-4的濃度較低，約為10-20pg/mL。在OVA組小鼠中，IL-4的濃度顯著升高，達(dá)到80-100pg/mL，這與Th2細(xì)胞的活化和增殖密切相關(guān)，IL-4是Th2細(xì)胞分泌的關(guān)鍵細(xì)胞因子，其濃度的升高會(huì)加重哮喘的炎癥反應(yīng)。而在Treg+OVA組小鼠中，IL-4的濃度明顯降低，降至30-40pg/mL，表明Treg細(xì)胞能夠抑制IL-4的分泌，從而減輕炎癥反應(yīng)。正常對(duì)照組小鼠血清、支氣管肺泡灌洗液和肺組織勻漿中IL-10的濃度相對(duì)穩(wěn)定，約為30-40pg/mL。在OVA組小鼠中，由于Treg細(xì)胞數(shù)量減少和功能下降，IL-10的濃度降低至10-20pg/mL。而在Treg+OVA組小鼠中，IL-10的濃度顯著升高，達(dá)到50-60pg/mL，這表明過繼轉(zhuǎn)移的Treg細(xì)胞能夠分泌更多的IL-10，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，抑制炎癥反應(yīng)。Treg細(xì)胞對(duì)其他細(xì)胞因子如IL-5、IL-13和TGF-β等也有類似的調(diào)節(jié)作用。在OVA組小鼠中，IL-5和IL-13的濃度顯著升高，而在Treg+OVA組小鼠中，其濃度明顯降低。TGF-β在OVA組小鼠中濃度降低，在Treg+OVA組小鼠中濃度升高。這些結(jié)果表明，Treg細(xì)胞通過調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的分泌，維持免疫平衡，抑制哮喘的炎癥反應(yīng)。四、Treg細(xì)胞作用機(jī)制的深入探討4.1Treg細(xì)胞對(duì)Th2型細(xì)胞的抑制作用4.1.1通過細(xì)胞因子抑制Th2型細(xì)胞活化Treg細(xì)胞可通過分泌白細(xì)胞介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等細(xì)胞因子，對(duì)Th2型細(xì)胞的活化發(fā)揮抑制作用。IL-10是一種具有強(qiáng)大免疫抑制功能的細(xì)胞因子，其抑制Th2型細(xì)胞活化的機(jī)制較為復(fù)雜。IL-10能夠與Th2細(xì)胞表面的IL-10受體（IL-10R）特異性結(jié)合，IL-10R是由IL-10Rα和IL-10Rβ兩個(gè)亞基組成的異二聚體。結(jié)合后，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）發(fā)生磷酸化。磷酸化的STAT3形成二聚體并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制Th2型細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，如IL-4、IL-5和IL-13等。IL-4是Th2細(xì)胞活化和增殖的關(guān)鍵細(xì)胞因子，它能夠促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體，激活嗜酸性粒細(xì)胞，加重哮喘的炎癥反應(yīng)。IL-10通過抑制IL-4等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而有效抑制Th2型細(xì)胞的活化和增殖，減輕炎癥反應(yīng)。IL-10還可以作用于抗原呈遞細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞（DC）和巨噬細(xì)胞，抑制它們的活性。DC是一種重要的抗原呈遞細(xì)胞，能夠攝取、加工和呈遞抗原，激活T細(xì)胞。IL-10可降低DC表面共刺激分子CD80、CD86和MHCII的表達(dá)，使其抗原呈遞能力下降。DC表面共刺激分子的表達(dá)降低，無法有效地向Th2細(xì)胞提供共刺激信號(hào)，從而抑制Th2細(xì)胞的活化。巨噬細(xì)胞在哮喘炎癥中也發(fā)揮著重要作用，它可以釋放多種炎性介質(zhì)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。IL-10能夠抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，減少炎癥介質(zhì)的釋放，間接抑制Th2型細(xì)胞的活化。TGF-β同樣在抑制Th2型細(xì)胞活化中發(fā)揮著重要作用。TGF-β可以與Th2細(xì)胞表面的TGF-β受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的Smad信號(hào)通路。TGF-β受體是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，包括TGF-βRI和TGF-βRII。TGF-β首先與TGF-βRII結(jié)合，使TGF-βRI磷酸化，進(jìn)而激活下游的Smad蛋白。活化的Smad蛋白形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。在Th2細(xì)胞中，TGF-β通過Smad信號(hào)通路抑制Th2型細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GATA-3的表達(dá)。GATA-3是Th2細(xì)胞分化和功能維持的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它能夠促進(jìn)Th2型細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。TGF-β抑制GATA-3的表達(dá)，從而抑制Th2型細(xì)胞的分化和活化，減少Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生。TGF-β還可以促進(jìn)初始T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）分化，增加Treg細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)Th2型細(xì)胞的抑制作用。4.1.2細(xì)胞間相互作用對(duì)Th2型細(xì)胞的影響Treg細(xì)胞與Th2細(xì)胞直接接觸時(shí)，會(huì)發(fā)生一系列復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)過程，對(duì)Th2細(xì)胞的功能產(chǎn)生重要影響。Treg細(xì)胞表面表達(dá)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）在這一過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CTLA-4與Th2細(xì)胞表面的共刺激分子CD80和CD86具有高度親和力。當(dāng)Treg細(xì)胞與Th2細(xì)胞接觸時(shí)，CTLA-4與CD80和CD86結(jié)合，阻斷了Th2細(xì)胞活化所必需的共刺激信號(hào)。在正常情況下，Th2細(xì)胞的活化需要T細(xì)胞受體（TCR）識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞呈遞的抗原肽-MHC復(fù)合物，同時(shí)還需要共刺激分子提供的第二信號(hào)。CD80和CD86是重要的共刺激分子，它們與Th2細(xì)胞表面的CD28分子結(jié)合，提供共刺激信號(hào)，促進(jìn)Th2細(xì)胞的活化和增殖。而CTLA-4與CD80和CD86的結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制了CD28與CD80和CD86的相互作用，使Th2細(xì)胞無法獲得足夠的共刺激信號(hào)，從而抑制了Th2細(xì)胞的活化。Treg細(xì)胞表面的程序性死亡受體1（PD-1）與Th2細(xì)胞表面的程序性死亡配體1（PD-L1）之間的相互作用也在調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞功能中發(fā)揮作用。PD-1與PD-L1結(jié)合后，通過抑制Th2細(xì)胞內(nèi)的磷酸肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路，影響Th2細(xì)胞的活化和增殖。PI3K-Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和存活中具有重要作用。PD-1與PD-L1結(jié)合后，抑制了PI3K的活性，使Akt無法被磷酸化激活，從而阻斷了下游信號(hào)的傳導(dǎo)。這導(dǎo)致Th2細(xì)胞的增殖受到抑制，細(xì)胞周期停滯，同時(shí)也影響了Th2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌。研究表明，在小鼠過敏性哮喘模型中，阻斷PD-1與PD-L1的相互作用，會(huì)導(dǎo)致Th2細(xì)胞的活化和增殖增強(qiáng)，哮喘炎癥加重，這進(jìn)一步證明了PD-1與PD-L1相互作用對(duì)Th2細(xì)胞功能的抑制作用。Treg細(xì)胞與Th2細(xì)胞直接接觸時(shí)，還可能通過細(xì)胞間的縫隙連接傳遞信號(hào)分子，影響Th2細(xì)胞的功能。縫隙連接是由連接蛋白組成的通道，允許小分子物質(zhì)如離子、代謝產(chǎn)物和信號(hào)分子在細(xì)胞間直接傳遞。研究發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞與Th2細(xì)胞之間存在縫隙連接，Treg細(xì)胞可以通過縫隙連接將一些抑制性信號(hào)分子傳遞給Th2細(xì)胞，抑制Th2細(xì)胞的功能。具體的信號(hào)分子和作用機(jī)制尚不完全清楚，但這為Treg細(xì)胞與Th2細(xì)胞之間的相互作用提供了新的研究方向。4.2Treg細(xì)胞對(duì)其他免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用4.2.1對(duì)DC細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制Treg細(xì)胞對(duì)樹突狀細(xì)胞（DC）的成熟和抗原遞呈功能具有重要的調(diào)節(jié)作用，這種調(diào)節(jié)主要通過細(xì)胞間接觸和細(xì)胞因子分泌兩種方式實(shí)現(xiàn)。在細(xì)胞間接觸方面，Treg細(xì)胞表面的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）與DC表面的共刺激分子CD80和CD86相互作用，對(duì)DC的成熟和功能產(chǎn)生顯著影響。CTLA-4與CD80和CD86具有高度親和力，當(dāng)Treg細(xì)胞與DC接觸時(shí)，CTLA-4可與CD80和CD86結(jié)合，阻斷DC向T細(xì)胞提供共刺激信號(hào)。共刺激信號(hào)對(duì)于T細(xì)胞的活化至關(guān)重要，正常情況下，DC通過表面的CD80和CD86與T細(xì)胞表面的CD28分子結(jié)合，提供共刺激信號(hào)，促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖。而CTLA-4與CD80和CD86的結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制了CD28與CD80和CD86的相互作用，使得T細(xì)胞無法獲得足夠的共刺激信號(hào)，從而抑制了T細(xì)胞的活化。這種抑制作用間接影響了DC的成熟過程，因?yàn)镈C的成熟需要與活化的T細(xì)胞相互作用來維持其功能狀態(tài)。當(dāng)T細(xì)胞活化受到抑制時(shí)，DC的成熟也會(huì)受到阻礙，表現(xiàn)為DC表面分子CD80、CD86和MHCII的表達(dá)水平降低，其抗原呈遞能力下降。研究表明，在小鼠過敏性哮喘模型中，阻斷CTLA-4與CD80和CD86的相互作用，會(huì)導(dǎo)致DC的活化和T細(xì)胞的增殖增強(qiáng)，哮喘炎癥加重，這進(jìn)一步證明了CTLA-4在調(diào)節(jié)DC功能中的重要作用。Treg細(xì)胞表面的程序性死亡受體1（PD-1）與DC表面的程序性死亡配體1（PD-L1）之間的相互作用也在調(diào)節(jié)DC功能中發(fā)揮作用。PD-1與PD-L1結(jié)合后，通過抑制DC內(nèi)的磷酸肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路，影響DC的成熟和抗原遞呈功能。PI3K-Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和存活中具有重要作用。PD-1與PD-L1結(jié)合后，抑制了PI3K的活性，使Akt無法被磷酸化激活，從而阻斷了下游信號(hào)的傳導(dǎo)。這導(dǎo)致DC的成熟受到抑制，其表面分子的表達(dá)和功能發(fā)生改變。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤微環(huán)境中，Treg細(xì)胞通過PD-1與PD-L1的相互作用，抑制DC的功能，從而逃避免疫監(jiān)視。在過敏性哮喘中，這種相互作用可能同樣影響DC的功能，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。在細(xì)胞因子分泌方面，Treg細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素-10（IL-10）對(duì)DC的功能調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵作用。IL-10是一種具有強(qiáng)大免疫抑制功能的細(xì)胞因子，它可以與DC表面的IL-10受體（IL-10R）特異性結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）發(fā)生磷酸化。磷酸化的STAT3形成二聚體并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制DC中促炎細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些促炎細(xì)胞因子在DC的活化和成熟過程中起著重要作用，它們的產(chǎn)生減少會(huì)導(dǎo)致DC的活化受到抑制。IL-10還可以降低DC表面共刺激分子CD80、CD86和MHCII的表達(dá)，使其抗原呈遞能力下降。DC表面共刺激分子的表達(dá)降低，無法有效地向T細(xì)胞提供共刺激信號(hào)，從而抑制T細(xì)胞的活化。研究表明，在小鼠過敏性哮喘模型中，給予外源性IL-10可以抑制DC的活化，減輕哮喘的炎癥反應(yīng)。Treg細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）也參與對(duì)DC的調(diào)節(jié)。TGF-β可以與DC表面的TGF-β受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的Smad信號(hào)通路。TGF-β受體是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，包括TGF-βRI和TGF-βRII。TGF-β首先與TGF-βRII結(jié)合，使TGF-βRI磷酸化，進(jìn)而激活下游的Smad蛋白。活化的Smad蛋白形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。在DC中，TGF-β通過Smad信號(hào)通路抑制DC的成熟相關(guān)基因的表達(dá)，使DC維持在相對(duì)未成熟的狀態(tài)，從而降低其抗原呈遞能力。TGF-β還可以促進(jìn)DC分泌一些抑制性細(xì)胞因子，如IL-10等，進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)免疫反應(yīng)的抑制作用。4.2.2對(duì)B細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及意義Treg細(xì)胞對(duì)B細(xì)胞的抗體分泌具有重要的調(diào)節(jié)作用，這一調(diào)節(jié)過程在小鼠過敏性哮喘的發(fā)病機(jī)制中具有關(guān)鍵意義。Treg細(xì)胞主要通過細(xì)胞間接觸和細(xì)胞因子分泌兩種方式來調(diào)節(jié)B細(xì)胞的抗體分泌。在細(xì)胞間接觸方面，Treg細(xì)胞表面表達(dá)的程序性死亡受體1（PD-1）與B細(xì)胞表面的程序性死亡配體1（PD-L1）相互作用，對(duì)B細(xì)胞的活化和抗體分泌產(chǎn)生影響。PD-1與PD-L1結(jié)合后，抑制了B細(xì)胞內(nèi)的磷酸肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路。PI3K-Akt信號(hào)通路在B細(xì)胞的活化、增殖和抗體分泌中起著重要作用。當(dāng)該信號(hào)通路被抑制時(shí)，B細(xì)胞的活化受到阻礙，其增殖能力下降，抗體分泌也隨之減少。研究表明，在小鼠實(shí)驗(yàn)中，阻斷PD-1與PD-L1的相互作用，會(huì)導(dǎo)致B細(xì)胞的活化和抗體分泌增加。在過敏性哮喘中，Treg細(xì)胞通過PD-1與PD-L1的相互作用，抑制B細(xì)胞產(chǎn)生過多的特異性IgE抗體，從而減輕過敏反應(yīng)。Treg細(xì)胞表面的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）與B細(xì)胞表面的共刺激分子CD80和CD86相互作用，也參與對(duì)B細(xì)胞的調(diào)節(jié)。CTLA-4與CD80和CD86具有高度親和力，當(dāng)Treg細(xì)胞與B細(xì)胞接觸時(shí)，CTLA-4與CD80和CD86結(jié)合，阻斷了B細(xì)胞活化所必需的共刺激信號(hào)。共刺激信號(hào)對(duì)于B細(xì)胞的活化和抗體分泌至關(guān)重要，正常情況下，B細(xì)胞通過表面的CD80和CD86與T細(xì)胞表面的CD28分子結(jié)合，獲得共刺激信號(hào)，促進(jìn)B細(xì)胞的活化和抗體分泌。而CTLA-4與CD80和CD86的結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制了CD28與CD80和CD86的相互作用，使得B細(xì)胞無法獲得足夠的共刺激信號(hào)，從而抑制了B細(xì)胞的活化和抗體分泌。在細(xì)胞因子分泌方面，Treg細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素-10（IL-10）對(duì)B細(xì)胞的抗體分泌具有顯著的調(diào)節(jié)作用。IL-10可以與B細(xì)胞表面的IL-10受體（IL-10R）特異性結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）發(fā)生磷酸化。磷酸化的STAT3形成二聚體并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制B細(xì)胞中與抗體分泌相關(guān)基因的表達(dá)，從而減少抗體的分泌。IL-10還可以抑制B細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步降低抗體的產(chǎn)生。研究表明，在小鼠過敏性哮喘模型中，給予外源性IL-10可以抑制B細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體，減輕哮喘的炎癥反應(yīng)。Treg細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）也參與對(duì)B細(xì)胞抗體分泌的調(diào)節(jié)。TGF-β可以與B細(xì)胞表面的TGF-β受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的Smad信號(hào)通路。TGF-β受體是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，包括TGF-βRI和TGF-βRII。TGF-β首先與TGF-βRII結(jié)合，使TGF-βRI磷酸化，進(jìn)而激活下游的Smad蛋白。活化的Smad蛋白形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。在B細(xì)胞中，TGF-β通過Smad信號(hào)通路抑制B細(xì)胞向分泌IgE抗體的漿細(xì)胞分化，促進(jìn)B細(xì)胞向分泌IgG4抗體的漿細(xì)胞分化。IgG4抗體具有較弱的致敏性，它的增加可以競(jìng)爭(zhēng)性地抑制IgE抗體與過敏原的結(jié)合，從而減輕過敏反應(yīng)。在小鼠過敏性哮喘發(fā)病中，Treg細(xì)胞對(duì)B細(xì)胞抗體分泌的調(diào)節(jié)具有重要意義。過敏性哮喘的發(fā)病與B細(xì)胞產(chǎn)生過多的特異性IgE抗體密切相關(guān)，IgE抗體與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的FcεRI受體結(jié)合，使機(jī)體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)再次接觸過敏原時(shí)，IgE抗體與過敏原特異性結(jié)合，導(dǎo)致肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒，釋放多種炎性介質(zhì)，引起氣道平滑肌收縮、血管通透性增加、黏液分泌增多等病理生理變化，從而引發(fā)哮喘癥狀。Treg細(xì)胞通過調(diào)節(jié)B細(xì)胞的抗體分泌，減少IgE抗體的產(chǎn)生，增加IgG4抗體的分泌，打破了這種過敏反應(yīng)的惡性循環(huán)，從而減輕哮喘的炎癥反應(yīng)和癥狀。如果Treg細(xì)胞對(duì)B細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能異常，導(dǎo)致IgE抗體過度產(chǎn)生，就會(huì)加重哮喘的發(fā)病程度。4.3Treg細(xì)胞在抗原遞呈過程中的作用4.3.1促進(jìn)APC轉(zhuǎn)換的機(jī)制Treg細(xì)胞在促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞（APC）轉(zhuǎn)換中發(fā)揮著重要作用，其機(jī)制涉及多個(gè)方面，包括細(xì)胞間接觸和細(xì)胞因子的分泌。Treg細(xì)胞與APC之間存在著密切的細(xì)胞間接觸，這種接觸能夠傳遞關(guān)鍵的信號(hào)，影響APC的轉(zhuǎn)換過程。研究表明，Treg細(xì)胞表面的一些分子，如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4），在這一過程中起著關(guān)鍵作用。CTLA-4與APC表面的共刺激分子CD80和CD86具有高度親和力，當(dāng)Treg細(xì)胞與APC接觸時(shí)，CTLA-4與CD80和CD86結(jié)合，阻斷了APC向T細(xì)胞提供共刺激信號(hào)。共刺激信號(hào)對(duì)于T細(xì)胞的活化至關(guān)重要，正常情況下，APC通過表面的CD80和CD86與T細(xì)胞表面的CD28分子結(jié)合，提供共刺激信號(hào)，促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖。而CTLA-4與CD80和CD86的結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制了CD28與CD80和CD86的相互作用，使得T細(xì)胞無法獲得足夠的共刺激信號(hào)，從而抑制了T細(xì)胞的活化。這種抑制作用間接影響了APC的轉(zhuǎn)換過程，因?yàn)锳PC的轉(zhuǎn)換需要與活化的T細(xì)胞相互作用來維持其功能狀態(tài)。當(dāng)T細(xì)胞活化受到抑制時(shí)，APC的轉(zhuǎn)換也會(huì)受到阻礙，表現(xiàn)為APC表面分子CD80、CD86和MHCII的表達(dá)水平降低，其抗原遞呈能力下降。研究表明，在小鼠過敏性哮喘模型中，阻斷CTLA-4與CD80和CD86的相互作用，會(huì)導(dǎo)致APC的活化和T細(xì)胞的增殖增強(qiáng)，哮喘炎癥加重，這進(jìn)一步證明了CTLA-4在調(diào)節(jié)APC功能中的重要作用。Treg細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子在促進(jìn)APC轉(zhuǎn)換中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。白細(xì)胞介素-10（IL-10）是Treg細(xì)胞分泌的一種重要的免疫抑制性細(xì)胞因子。IL-10可以與APC表面的IL-10受體（IL-10R）特異性結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）發(fā)生磷酸化。磷酸化的STAT3形成二聚體并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制APC中促炎細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些促炎細(xì)胞因子在APC的活化和轉(zhuǎn)換過程中起著重要作用，它們的產(chǎn)生減少會(huì)導(dǎo)致APC的活化受到抑制。IL-10還可以降低APC表面共刺激分子CD80、CD86和MHCII的表達(dá)，使其抗原遞呈能力下降。APC表面共刺激分子的表達(dá)降低，無法有效地向T細(xì)胞提供共刺激信號(hào)，從而抑制T細(xì)胞的活化。研究表明，在小鼠過敏性哮喘模型中，給予外源性IL-10可以抑制APC的活化，減輕哮喘的炎癥反應(yīng)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）也是Treg細(xì)胞分泌的一種重要細(xì)胞因子，它參與對(duì)APC轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)。TGF-β可以與APC表面的TGF-β受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的Smad信號(hào)通路。TGF-β受體是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，包括TGF-βRI和TGF-βRII。TGF-β首先與TGF-βRII結(jié)合，使TGF-βRI磷酸化，進(jìn)而激活下游的Smad蛋白。活化的Smad蛋白形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。在APC中，TGF-β通過Smad信號(hào)通路抑制APC的成熟相關(guān)基因的表達(dá)，使APC維持在相對(duì)未成熟的狀態(tài)，從而降低其抗原遞呈能力。TGF-β還可以促進(jìn)APC分泌一些抑制性細(xì)胞因子，如IL-10等，進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)免疫反應(yīng)的抑制作用。4.3.2對(duì)免疫反應(yīng)平衡的影響Treg細(xì)胞在抗原遞呈過程中對(duì)免疫反應(yīng)平衡的維持起著至關(guān)重要的作用，其通過多種方式精細(xì)調(diào)控免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和方向，確保免疫系統(tǒng)在抵御病原體入侵的同時(shí)，避免過度免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成損傷。在抗原遞呈初期，Treg細(xì)胞能夠抑制初始T細(xì)胞的過度活化，從而維持免疫反應(yīng)的適度啟動(dòng)。當(dāng)APC攝取抗原后，會(huì)將抗原肽呈遞給初始T細(xì)胞，啟動(dòng)免疫反應(yīng)。然而，如果初始T細(xì)胞過度活化，可能導(dǎo)致免疫反應(yīng)失控，引發(fā)炎癥和組織損傷。Treg細(xì)胞通過與APC和初始T細(xì)胞的相互作用，能夠有效抑制初始T細(xì)胞的活化。Treg細(xì)胞表面的CTLA-4與APC表面的CD80和CD86結(jié)合，阻斷了APC向初始T細(xì)胞提供共刺激信號(hào)，使初始T細(xì)胞無法獲得足夠的活化信號(hào)，從而抑制其增殖和分化。Treg細(xì)胞分泌的IL-10和TGF-β等抑制性細(xì)胞因子，也能夠抑制初始T細(xì)胞的活化，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的起始強(qiáng)度。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)去除Treg細(xì)胞后，初始T細(xì)胞的活化明顯增強(qiáng)，免疫反應(yīng)過度啟動(dòng)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加劇，這充分說明了Treg細(xì)胞在抗原遞呈初期對(duì)免疫反應(yīng)平衡的重要調(diào)節(jié)作用。在免疫反應(yīng)過程中，Treg細(xì)胞持續(xù)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性，維持Th1/Th2平衡。Th1和Th2細(xì)胞是輔助性T細(xì)胞的兩個(gè)主要亞群，它們分泌不同的細(xì)胞因子，介導(dǎo)不同的免疫反應(yīng)。Th1細(xì)胞主要分泌干擾素-γ（IFN-γ）等細(xì)胞因子，介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，參與抗病毒、抗胞內(nèi)菌感染等；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5和IL-13等細(xì)胞因子，介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，在過敏性疾病中發(fā)揮重要作用。正常情況下，Th1和Th2細(xì)胞處于平衡狀態(tài)，以維持機(jī)體的免疫平衡。然而，在過敏性哮喘等疾病中，Th2細(xì)胞功能亢進(jìn)，Th1/Th2平衡失調(diào)，導(dǎo)致過度的過敏反應(yīng)。Treg細(xì)胞通過抑制Th2細(xì)胞的活化和增殖，促進(jìn)Th1細(xì)胞的功能，從而恢復(fù)Th1/Th2平衡。Treg細(xì)胞分泌的IL-10可以抑制Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5和IL-13等細(xì)胞因子，抑制Th2細(xì)胞的功能；同時(shí)，IL-10還可以促進(jìn)Th1細(xì)胞分泌IFN-γ，增強(qiáng)Th1細(xì)胞的功能。Treg細(xì)胞通過細(xì)胞間接觸抑制Th2細(xì)胞的活化，也有助于維持Th1/Th2平衡。研究表明，在小鼠過敏性哮喘模型中，過繼轉(zhuǎn)移Treg細(xì)胞可以顯著降低Th2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的水平，提高Th1細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的水平，恢復(fù)Th1/Th2平衡，減輕哮喘的炎癥癥狀。Treg細(xì)胞還能夠調(diào)節(jié)免疫記憶的形成，對(duì)免疫反應(yīng)平衡產(chǎn)生長(zhǎng)期影響。免疫記憶是免疫系統(tǒng)在接觸抗原后形成的一種記憶能力，使得機(jī)體在再次接觸相同抗原時(shí)能夠快速、有效地啟動(dòng)免疫反應(yīng)。然而，如果免疫記憶過度增強(qiáng)，可能導(dǎo)致再次接觸抗原時(shí)免疫反應(yīng)過激，引發(fā)炎癥和組織損傷。Treg細(xì)胞可以通過抑制免疫記憶細(xì)胞的活化和增殖，調(diào)節(jié)免疫記憶的強(qiáng)度。Treg細(xì)胞分泌的抑制性細(xì)胞因子能夠抑制免疫記憶細(xì)胞的活性，減少其產(chǎn)生的細(xì)胞因子，從而降低免疫記憶的強(qiáng)度。Treg細(xì)胞與免疫記憶細(xì)胞的直接接觸也可以抑制其活化，維持免疫記憶的平衡。在疫苗接種的研究中發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞可以調(diào)節(jié)疫苗誘導(dǎo)的免疫記憶，使機(jī)體在獲得有效免疫保護(hù)的同時(shí)，避免過度的免疫反應(yīng)，這表明Treg細(xì)胞在免疫記憶調(diào)節(jié)中對(duì)維持免疫反應(yīng)平衡具有重要意義。五、基于Treg細(xì)胞的治療策略與展望5.1以Treg細(xì)胞為靶點(diǎn)的治療策略探討5.1.1增強(qiáng)Treg細(xì)胞功能的治療方法在藥物治療方面，小分子化合物和細(xì)胞因子類藥物展現(xiàn)出獨(dú)特的作用機(jī)制和應(yīng)用潛力。甲磺酸貝舒地爾片是一種具有創(chuàng)新性的治療慢性移植物抗宿主病的藥物，其通過下調(diào)STAT3減少Th17細(xì)胞的過度活化，上調(diào)STAT5增強(qiáng)Treg細(xì)胞的功能，從調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)平衡，減少炎癥和纖維化反應(yīng)。在自身免疫性疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，該藥物能夠有效增強(qiáng)Treg細(xì)胞的抑制功能，降低炎癥水平，為哮喘等免疫相關(guān)疾病的治療提供了新的思路。白介素-2（IL-2）在調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞功能中具有重要作用，可特異性結(jié)合IL-2Rα亞基，促進(jìn)Treg的增殖。然而，IL-2除調(diào)節(jié)Tregs功能外，還可激活I(lǐng)L2-Rβ/γ復(fù)合體信號(hào)通路，引發(fā)炎癥或非Treg特異性免疫反應(yīng)。為解決這一問題，研究人員基于mRNA-納米脂質(zhì)體（LNP）平臺(tái)，合成編碼IL-2突變體的mRNA，可在小鼠或非人靈長(zhǎng)類體內(nèi)特異性激活Treg，在動(dòng)物疾病模型中顯示出預(yù)防同種異體排斥反應(yīng)及治療自身免疫性疾病的潛力。這種通過mRNA技術(shù)對(duì)IL-2進(jìn)行改造，增強(qiáng)其對(duì)Treg細(xì)胞的特異性，為哮喘治療中增強(qiáng)Treg細(xì)胞功能提供了新的策略。細(xì)胞療法方面，Treg細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移和基因修飾Treg細(xì)胞治療為哮喘治療帶來了新的希望。Treg細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移是將體外擴(kuò)增培養(yǎng)的Treg細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，以增強(qiáng)Treg細(xì)胞的數(shù)量和功能。在小鼠過敏性哮喘模型中，通過尾靜脈注射過繼轉(zhuǎn)移體外擴(kuò)增培養(yǎng)的Treg細(xì)胞，可顯著減輕哮喘小鼠的氣道炎癥和高反應(yīng)性，表現(xiàn)為BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)量減少，氣道阻力降低。基因修飾Treg細(xì)胞治療則是利用基因編輯技術(shù)對(duì)Treg細(xì)胞進(jìn)行修飾，使其表達(dá)特定的基因或蛋白，以增強(qiáng)其免疫調(diào)節(jié)功能。研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)Treg細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，使其過表達(dá)IL-10，增強(qiáng)了Treg細(xì)胞的免疫抑制能力，在小鼠哮喘模型中取得了良好的治療效果。這種基因修飾的Treg細(xì)胞能夠更有效地抑制炎癥反應(yīng)，為哮喘的治療提供了更精準(zhǔn)、更有效的手段。5.1.2調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞數(shù)量的途徑與意義調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞數(shù)量對(duì)于哮喘治療具有重要意義，其主要通過細(xì)胞因子調(diào)節(jié)和小分子化合物調(diào)節(jié)等途徑實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞數(shù)量中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。白細(xì)胞介素-2（IL-2）是一種重要的細(xì)胞因子，它能夠與Treg細(xì)胞表面的IL-2受體結(jié)合，促進(jìn)Treg細(xì)胞的增殖。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，給予外源性IL-2可以顯著增加Treg細(xì)胞的數(shù)量。IL-2還可以增強(qiáng)Treg細(xì)胞的功能，提高其免疫抑制能力。然而，IL-2的使用需要謹(jǐn)慎，因?yàn)楦邉┝康腎L-2可能會(huì)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的過度激活，引發(fā)不良反應(yīng)。在一些研究中，通過調(diào)節(jié)IL-2的劑量和給藥方式，在增加Treg細(xì)胞數(shù)量的同時(shí)，盡量減少其對(duì)其他免疫細(xì)胞的影響。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）也參與調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的數(shù)量。TGF-β可以促進(jìn)初始T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化，從而增加Treg細(xì)胞的數(shù)量。在體外實(shí)驗(yàn)中，添加TGF-β可以誘導(dǎo)初始T細(xì)胞表達(dá)Foxp3，分化為Treg細(xì)胞。在小鼠過敏性哮喘模型中，給予TGF-β可以增加肺組織中Treg細(xì)胞的數(shù)量，減輕氣道炎癥。TGF-β還可以與其他細(xì)胞因子協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的數(shù)量和功能。小分子化合物在調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞數(shù)量方面也具有重要作用。雷帕霉素作為一種新型免疫抑制劑，能夠抑制傳統(tǒng)T細(xì)胞（Tconv）的增殖和效應(yīng)功能，同時(shí)逆轉(zhuǎn)Treg細(xì)胞的無能狀態(tài)并促進(jìn)其擴(kuò)增。在自身免疫性疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可以增加Treg細(xì)胞的數(shù)量，調(diào)節(jié)免疫平衡。二甲雙胍是一種常用的降糖藥物，近年來研究發(fā)現(xiàn)它還具有免疫調(diào)節(jié)作用。二甲雙胍可以誘導(dǎo)Treg細(xì)胞持續(xù)擴(kuò)張，增加Treg細(xì)胞的數(shù)量。在糖尿病合并哮喘的小鼠模型中，使用二甲雙胍治療后，Treg細(xì)胞數(shù)量增加，哮喘癥狀得到改善。調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞數(shù)量對(duì)哮喘治療具有重要作用。在哮喘發(fā)病過程中，Treg細(xì)胞數(shù)量減少，導(dǎo)致其對(duì)免疫反應(yīng)的抑制作用減弱，從而引發(fā)和加重哮喘的炎癥反應(yīng)。通過調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞數(shù)量，可以增強(qiáng)其對(duì)免疫反應(yīng)的抑制作用，減輕哮喘的炎癥程度。增加Treg細(xì)胞數(shù)量可以抑制Th2細(xì)胞的活化和增殖，減少Th2型細(xì)胞因子如IL-4、IL-5和IL-13的分泌，從而減輕氣道炎癥和高反應(yīng)性。調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞數(shù)量還可以調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能，如抑制樹突狀細(xì)胞的活化，減少B細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體，從而進(jìn)一步減輕哮喘的炎癥反應(yīng)。在小鼠過敏性哮喘模型中，通過調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞數(shù)量，使哮喘小鼠的氣道炎癥和高反應(yīng)性得到明顯改善，肺功能得到