TcpC對腎盂腎炎模型小鼠腎臟DCs分化成熟的影響：機制與免疫逃逸關聯探究一、引言1.1研究背景與意義1.1.1腎盂腎炎的研究現狀腎盂腎炎作為泌尿系統的常見疾病，主要由致病微生物感染腎盂及腎實質引發。據統計，每年全球約有1.5億人罹患尿路感染，其中相當一部分為腎盂腎炎。在我國，尿路感染的發病率也較高，且女性患者多于男性，這主要與女性尿道短而寬，易受外界微生物感染的生理結構特點有關。腎盂腎炎若未能及時有效治療，慢性腎盂腎炎可造成腎小管萎縮、腎實質破壞，進而發展成慢性腎病，嚴重時甚至導致腎功能衰竭，給患者的身體健康和生活質量帶來極大影響。目前，對于腎盂腎炎的治療主要依賴抗生素，通過殺滅病原微生物來控制感染。然而，隨著抗生素的廣泛使用，耐藥菌的出現使得治療面臨挑戰，治療失敗和復發的情況時有發生。在發病機制方面，雖然已知細菌感染是主要原因，但病原菌如何逃避機體免疫監視以及免疫細胞在腎盂腎炎發生發展過程中的具體作用機制尚未完全明確，這限制了新治療策略的開發。因此，深入探究腎盂腎炎的發病機制，尋找新的治療靶點，對于提高腎盂腎炎的治療效果具有重要意義。1.1.2TcpC與腎盂腎炎的關系TcpC是尿路致病性大腸埃希菌（UPEC）產生的一種關鍵毒力因子，在腎盂腎炎的發生發展中扮演著重要角色。UPEC是引起尿路感染的主要病原菌，約80%的尿路感染由其引起。TcpC含有TIR結構域，可與Toll樣受體（TLR）競爭結合髓樣分化因子88（MyD88），阻斷TLR信號通路，抑制巨噬細胞的活化和吞噬殺菌功能，從而利于UPEC在體內的存活和增殖。研究表明，在小鼠腎盂腎炎模型中，分泌TcpC的UPEC野生株感染組腎臟出現明顯的膿腫和顯著的中性粒細胞浸潤，而敲除tcpc基因的突變株感染組腎臟病變則明顯減輕。這充分說明TcpC能夠增強UPEC的致病性，促進腎盂腎炎的發展。進一步研究發現，TcpC還是一種E3泛素連接酶，可以通過促進MyD88泛素化降解，阻斷TLR信號通路，抑制巨噬細胞介導的固有免疫功能，揭示了病原菌逃逸機體固有免疫應答的新機制。這些發現為深入理解UPEC的致病機制以及腎盂腎炎的發病機制提供了重要線索，但TcpC在腎盂腎炎中是否還存在其他作用機制，尤其是對腎臟中其他免疫細胞的影響，仍有待進一步研究。1.1.3腎臟DCs在免疫中的關鍵作用腎臟樹突狀細胞（DCs）作為免疫系統的重要組成部分，在固有免疫和適應性免疫中起著橋梁的關鍵作用。DCs能夠捕獲、加工和呈遞抗原，激活初始T細胞，啟動適應性免疫應答，同時也能分泌細胞因子和趨化因子，調節固有免疫細胞的功能。在腎臟中，DCs主要分布于腎小管間質空間，未成熟的DCs更靠近血管位置。它們可以捕獲存在于腎小球濾液中的抗原或低分子量蛋白質，然后進入淋巴系統并遷移到次級淋巴器官，激活同源T細胞或誘導免疫耐受。其中，常規樹突狀細胞cDC1s表達高水平的CD8α或CD103，能將抗原交叉呈遞給CD8+T細胞；cDC2s是腎臟中主要的常駐DC，表達CD11b，可將抗原呈遞給CD4+T細胞；漿細胞樣樹突狀細胞pDC壽命長，在應對病毒感染時可產生大量1型干擾素，但抗原呈遞活性較弱。在生理狀態下，腎臟DCs維持著免疫平衡，防止過度免疫反應對腎臟造成損傷。而在腎盂腎炎等腎臟疾病發生時，DCs被激活，其數量和功能發生改變，通過調節T細胞等免疫細胞的活性，參與炎癥反應的啟動和發展。然而，目前對于TcpC是否會影響腎臟DCs的分化成熟以及其具體機制尚不清楚，這也為本研究提供了切入點。1.1.4研究的科學意義和潛在應用價值本研究旨在揭示TcpC對腎盂腎炎模型小鼠腎臟DCs分化成熟的影響及其分子機制，具有重要的科學意義和潛在應用價值。在科學意義方面，深入探究TcpC與腎臟DCs之間的相互作用，有助于進一步闡明UPEC的致病機制以及腎盂腎炎的發病機制，填補該領域在這方面的研究空白，為理解病原菌與宿主免疫系統的相互關系提供新的視角。從潛在應用價值來看，明確TcpC影響腎臟DCs分化成熟的機制，有望為腎盂腎炎的防治提供新的靶點和策略。通過干預TcpC與腎臟DCs之間的信號通路，有可能開發出新型的免疫治療方法，增強機體對UPEC的免疫防御能力，提高腎盂腎炎的治療效果，減少抗生素的使用，降低耐藥菌的產生風險，為臨床治療腎盂腎炎提供更有效的手段，改善患者的預后和生活質量。1.2國內外研究現狀1.2.1TcpC的研究進展TcpC作為尿路致病性大腸埃希菌（UPEC）產生的關鍵毒力因子，自2008年被德國微生物學家ThomasMiethke教授課題組發現以來，受到了廣泛的關注。其分子結構獨特，含有TIR結構域，這一結構域賦予了TcpC重要的生物學功能。研究表明，TcpC能夠通過TIR結構域直接與Toll樣受體（TLR）競爭結合髓樣分化因子88（MyD88），從而抑制TLR介導的信號途徑。在巨噬細胞中，TcpC的這種作用抑制了巨噬細胞的活化和殺菌功能，使得UPEC能夠在體內存活并大量增殖，與UPEC所致腎盂腎炎等尿路感染的發生、發展密切相關。近年來，關于TcpC的研究取得了新的突破。浙大城市學院醫學院潘建平教授團隊發現TcpC是一種E3泛素連接酶，這一發現揭示了TcpC在病原菌逃逸機體固有免疫應答中的全新機制。通過一系列實驗，研究人員發現TcpC可以促進MyD88泛素化降解。在小鼠腎盂腎炎模型中，與敲除tcpc基因的CFT073突變株組相比，分泌TcpC的CFT073野生株組腎臟出現明顯的膿腫和顯著的中性粒細胞浸潤，同時腎臟巨噬細胞內MyD88蛋白水平顯著下降，胞內MyD88與蛋白酶體標志物（PSMD2）的共定位顯著增多。在細胞模型研究中，以人巨噬細胞系THP-1、小鼠巨噬細胞系J774A.1和RAW264.7為對象，發現基因重組TcpC蛋白（rTcpC）能劑量依賴性地抑制巨噬細胞MyD88蛋白水平，但不影響其mRNA水平，提示TcpC能促進MyD88降解。進一步研究發現，rTcpC處理能顯著增強巨噬細胞MyD88泛素化水平。生物信息學分析提示TcpC含有HECT家族E3泛素連接酶所具有的結構特征，而人和小鼠MyD88含有HECT家族E3泛素連接酶底物所具有的P-Y基序，后續的體外泛素化實驗最終證實rTcpC是一種能促進MyD88泛素化的E3泛素連接酶。此外，研究還明確了與TcpC結合的E2為UBE2D1，rTcpC能與UBE2D1和MyD88高親和力結合，且TcpC中C12和W106是維持其E3泛素化連接酶活性的關鍵位點。這些研究成果不僅為進一步闡明UPEC的致病性提供了新的實驗依據，也為深入理解病原菌免疫逃逸機制提供了新的線索。然而，目前對于TcpC在腎盂腎炎發病過程中對其他免疫細胞的影響，以及其是否還存在其他作用機制，仍有待進一步深入研究。1.2.2腎臟DCs的研究進展腎臟樹突狀細胞（DCs）在免疫系統中占據著關鍵地位，其來源、分化、成熟過程和功能一直是免疫學研究的重要內容。腎臟DCs主要來源于骨髓造血干細胞，在骨髓中，造血干細胞分化為髓系祖細胞，髓系祖細胞進一步分化為DC前體細胞，這些前體細胞通過血液循環遷移到腎臟，并在腎臟微環境中發育成熟。在腎臟中，DCs主要分布于腎小管間質空間，未成熟的DCs更靠近血管位置。未成熟的DCs具有較強的抗原攝取能力，它們可以捕獲存在于腎小球濾液中的抗原或低分子量蛋白質，然后經歷一個逐漸分化成熟的過程。在這一過程中，DCs的表型和功能發生顯著變化，例如，它們會表達更高水平的共刺激分子和MHC分子，從而獲得更強的抗原呈遞能力。成熟的DCs進入淋巴系統并遷移到次級淋巴器官，在那里激活同源T細胞或誘導免疫耐受。根據表型和功能的不同，腎臟DCs主要分為常規樹突狀細胞（cDCs）和漿細胞樣樹突狀細胞（pDCs）。其中，cDCs又可細分為cDC1s和cDC2s。cDC1s表達高水平的CD8α或CD103，約占腎臟DC池的5%以下，主要功能是將抗原交叉呈遞給CD8+T細胞，激活細胞毒性T細胞應答，在抗病毒和抗腫瘤免疫中發揮重要作用；cDC2s是腎臟中主要的常駐DC，表達CD11b，主要將抗原呈遞給CD4+T細胞，輔助T輔助細胞（Th）的活化和分化，參與體液免疫和細胞免疫的調節。pDC壽命長，在應對病毒感染時可產生大量1型干擾素，這對于激活機體的抗病毒免疫反應至關重要，但其抗原呈遞活性較弱。在腎臟疾病中，DCs發揮著復雜而重要的作用。在急性腎損傷中，DCs被激活后釋放炎癥因子，招募其他免疫細胞到損傷部位，啟動炎癥反應，同時也可能通過調節T細胞的活性，影響免疫反應的強度和方向。在慢性腎臟疾病如慢性腎小球腎炎、糖尿病腎病中，DCs的功能失調可能導致免疫耐受失衡，促進炎癥的持續發展和腎臟組織的損傷。研究表明，在狼瘡性腎炎患者中，腎臟DCs的數量和功能發生改變，其分泌的細胞因子譜異常，可能參與了自身免疫反應的啟動和維持。然而，目前對于腎臟DCs在不同腎臟疾病中的具體作用機制，以及如何通過調節DCs的功能來干預腎臟疾病的進展，仍存在許多有待解決的問題。1.2.3TcpC與腎臟DCs關系的研究現狀目前，關于TcpC對腎臟DCs分化成熟影響的研究相對較少，這一領域仍存在諸多空白。已有的研究主要集中在TcpC對巨噬細胞和中性粒細胞等免疫細胞的影響，而對于TcpC與腎臟DCs之間的相互作用知之甚少。從理論上來說，TcpC作為UPEC的毒力因子，其抑制TLR信號通路和促進MyD88泛素化降解的作用，可能會對腎臟DCs的分化成熟產生影響。因為TLR信號通路在DCs的發育、活化和功能調節中起著關鍵作用，TcpC阻斷TLR信號通路可能干擾DCs從骨髓前體細胞分化為成熟DCs的正常過程，影響其抗原攝取、加工和呈遞能力。此外，TcpC對細胞內蛋白質泛素化水平的調節，也可能改變DCs內的信號轉導和基因表達，進而影響其功能。然而，目前尚未有直接的實驗證據來證實這些推測。在已有的關于UPEC感染與腎臟免疫反應的研究中，雖然涉及到了多種免疫細胞，但對于腎臟DCs在這一過程中的變化以及TcpC對其的具體作用機制，缺乏深入系統的研究。這使得我們對于UPEC感染導致腎盂腎炎過程中，腎臟DCs的免疫調節作用以及TcpC如何干擾這一過程的認識存在不足。填補這一研究空白，對于深入理解腎盂腎炎的發病機制以及開發新的治療策略具有重要意義。1.3研究目的與內容1.3.1研究目的本研究旨在深入探究TcpC對腎盂腎炎模型小鼠腎臟DCs分化成熟的影響，并揭示其潛在的作用機制。具體而言，通過構建小鼠腎盂腎炎模型，運用細胞生物學、分子生物學等技術手段，檢測TcpC處理后腎臟DCs的分化成熟相關指標，明確TcpC對腎臟DCs分化成熟的影響。進一步研究TcpC影響腎臟DCs分化成熟的信號通路和分子機制，為闡明尿路致病性大腸埃希菌（UPEC）的致病機制以及腎盂腎炎的發病機制提供新的理論依據，為開發針對腎盂腎炎的新型治療策略奠定基礎。1.3.2研究內容構建小鼠腎盂腎炎模型并分組：選取健康的雌性C57BL/6小鼠，隨機分為對照組、野生型UPEC感染組（分泌TcpC）、tcpc基因敲除UPEC感染組。通過膀胱逆行注射的方法，將不同菌株注入小鼠膀胱，成功構建小鼠腎盂腎炎模型。對照組則注射等量的無菌生理鹽水。在感染后的不同時間點（如1天、3天、5天），采集小鼠的腎臟組織和血液樣本，用于后續實驗分析。檢測TcpC對腎臟DCs分化成熟相關指標的影響：運用流式細胞術，檢測腎臟中DCs的數量、比例以及表面標志物（如CD11c、MHCII、CD80、CD86等）的表達水平，評估DCs的分化成熟狀態。通過免疫熒光染色技術，觀察DCs在腎臟組織中的分布情況以及與其他免疫細胞的相互作用。利用實時定量PCR和Westernblot技術，檢測DCs分化成熟相關基因（如IRF4、BATF3等）和蛋白的表達變化，深入了解TcpC對DCs分化成熟的分子調控機制。探討TcpC影響腎臟DCs分化成熟的信號通路：研究TcpC是否通過干擾TLR信號通路來影響腎臟DCs的分化成熟。檢測TLR信號通路相關分子（如TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB等）的表達和活化水平，分析TcpC對這些分子的影響。利用信號通路抑制劑或基因敲除技術，阻斷TLR信號通路，觀察TcpC對DCs分化成熟的影響是否發生改變，從而確定TLR信號通路在TcpC影響DCs分化成熟過程中的作用。研究TcpC通過腎臟DCs介導的免疫逃逸機制：將從不同組小鼠腎臟中分離得到的DCs與T細胞共培養，檢測T細胞的活化、增殖和細胞因子分泌情況，評估DCs對T細胞免疫應答的調節作用。分析TcpC處理后的DCs在呈遞UPEC抗原時，是否能夠誘導T細胞產生免疫耐受或抑制免疫應答，探討TcpC通過腎臟DCs介導的免疫逃逸機制。1.4研究方法與技術路線1.4.1研究方法動物實驗：選用健康雌性C57BL/6小鼠，隨機分為對照組、野生型UPEC感染組、tcpc基因敲除UPEC感染組。通過膀胱逆行注射法構建小鼠腎盂腎炎模型，對照組注射無菌生理鹽水。在感染后1天、3天、5天等時間點采集小鼠腎臟組織和血液樣本。對腎臟組織進行病理切片，通過蘇木精-伊紅（HE）染色觀察腎臟的病理變化，包括炎癥細胞浸潤、膿腫形成等情況。利用免疫組織化學染色檢測腎臟組織中相關蛋白的表達定位。細胞實驗：分離小鼠腎臟DCs，體外培養并分為對照組、TcpC處理組、TcpC抑制劑處理組等。用不同濃度的TcpC或抑制劑處理DCs，檢測細胞的增殖、凋亡情況。將DCs與T細胞共培養，通過CCK-8法檢測T細胞的增殖活性，ELISA法檢測T細胞分泌的細胞因子（如IFN-γ、IL-4等）水平，評估DCs對T細胞免疫應答的調節作用。分子生物學實驗：運用實時定量PCR技術，檢測腎臟DCs中分化成熟相關基因（如IRF4、BATF3等）以及TLR信號通路相關基因（如TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB等）的mRNA表達水平。采用Westernblot技術，檢測上述基因對應的蛋白表達水平，以及蛋白的磷酸化、泛素化等修飾情況。通過免疫共沉淀實驗，探究TcpC與相關蛋白（如MyD88、UBE2D1等）之間的相互作用。利用RNA干擾技術，敲低DCs中關鍵基因的表達，觀察對DCs分化成熟和TcpC作用的影響。1.4.2技術路線動物模型構建階段：準備健康雌性C57BL/6小鼠，隨機分組。對野生型UPEC感染組小鼠膀胱逆行注射分泌TcpC的野生型UPEC菌株，tcpc基因敲除UPEC感染組注射敲除tcpc基因的UPEC菌株，對照組注射無菌生理鹽水。在感染后的預定時間點，采用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速采集腎臟組織和血液樣本，部分腎臟組織用4%多聚甲醛固定用于病理分析，部分凍存于-80℃用于后續分子生物學實驗，血液樣本分離血清備用。腎臟DCs分離與鑒定階段：取凍存的腎臟組織，通過機械研磨和酶消化法分離腎臟細胞，利用磁珠分選或流式細胞術分選獲得高純度的DCs。通過檢測DCs表面標志物（如CD11c、MHCII等）的表達，采用流式細胞術對分選得到的DCs進行鑒定，確保其純度和活性滿足實驗要求。TcpC對DCs分化成熟影響的檢測階段：將分選得到的DCs進行體外培養，分為對照組、TcpC處理組、TcpC抑制劑處理組等。TcpC處理組加入不同濃度的重組TcpC蛋白，TcpC抑制劑處理組先加入抑制劑再加入TcpC。利用流式細胞術檢測DCs表面分化成熟標志物（如CD80、CD86等）的表達水平；通過實時定量PCR和Westernblot檢測分化成熟相關基因和蛋白的表達變化；采用免疫熒光染色觀察DCs內相關蛋白的定位和表達情況。信號通路研究階段：提取不同處理組DCs的RNA和蛋白質，通過實時定量PCR和Westernblot檢測TLR信號通路相關分子（如TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB等）的表達和活化水平。利用信號通路抑制劑處理DCs，阻斷TLR信號通路，然后加入TcpC，檢測DCs分化成熟相關指標的變化。通過免疫共沉淀實驗，驗證TcpC與信號通路關鍵分子（如MyD88、UBE2D1等）的相互作用。免疫逃逸機制研究階段：將不同處理組的DCs與T細胞按一定比例共培養，設置對照組。在共培養體系中加入UPEC抗原，培養一定時間后，通過CCK-8法檢測T細胞的增殖活性，ELISA法檢測T細胞分泌的細胞因子（如IFN-γ、IL-4、IL-17等）水平，采用流式細胞術檢測T細胞的活化標志物（如CD25、CD69等）表達情況，分析TcpC處理后的DCs對T細胞免疫應答的調節作用，探討TcpC通過腎臟DCs介導的免疫逃逸機制。結果分析階段：對實驗獲得的數據進行統計學分析，采用GraphPadPrism等軟件繪制圖表。運用方差分析、t檢驗等方法，比較不同組之間的差異，確定TcpC對腎臟DCs分化成熟的影響及其作用機制，總結研究結果，撰寫研究報告。二、TcpC與腎盂腎炎及腎臟DCs的理論基礎2.1TcpC的生物學特性2.1.1TcpC的結構特點TcpC是尿路致病性大腸埃希菌（UPEC）產生的一種毒力因子，其結構具有獨特的特征。從分子結構來看，TcpC含有TIR（Toll/interleukin-1receptor）結構域，這一結構域在細胞信號傳導中發揮著關鍵作用。TIR結構域廣泛存在于多種參與免疫信號傳導的蛋白質中，它能夠介導蛋白質與蛋白質之間的相互作用，從而激活下游的信號通路。在TcpC中，TIR結構域的存在賦予了其干擾宿主免疫信號傳導的能力。此外，生物信息學分析提示TcpC還含有HECT（HomologoustotheE6-APCarboxylTerminus）家族E3泛素連接酶所具有的結構特征。E3泛素連接酶在泛素化過程中起著關鍵作用，它能夠識別特定的底物蛋白，并將泛素分子連接到底物蛋白上，從而標記底物蛋白，使其被蛋白酶體識別并降解。TcpC中HECT家族E3泛素連接酶結構特征的存在，暗示了其可能具有調節蛋白質泛素化水平的功能，進而影響細胞內的信號轉導和生理過程。2.1.2TcpC的功能研究TcpC在UPEC感染宿主的過程中發揮著重要的功能，主要通過抑制TLR信號通路來實現其免疫逃逸的目的。TcpC因含有TIR結構域，可以直接與Toll樣受體（TLR）競爭結合髓樣分化因子88（MyD88）。MyD88是TLR信號通路中的關鍵接頭分子，當TLR識別病原體相關分子模式（PAMPs）后，會招募MyD88，進而激活下游的信號分子，如TRAF6（Tumornecrosisfactorreceptor-associatedfactor6），最終導致核因子-κB（NF-κB）等轉錄因子的活化，啟動炎癥相關基因的表達，促進免疫細胞的活化和炎癥反應的發生。而TcpC與MyD88的結合，阻斷了TLR信號通路的正常傳導，使得免疫細胞無法被有效激活，從而抑制了巨噬細胞的活化和吞噬殺菌功能。浙大城市學院醫學院潘建平教授團隊的研究進一步揭示了TcpC的新功能，發現TcpC是一種E3泛素連接酶，可以促進MyD88泛素化降解。在小鼠腎盂腎炎模型中，與敲除tcpc基因的CFT073突變株組相比，分泌TcpC的CFT073野生株組腎臟出現明顯的膿腫和顯著的中性粒細胞浸潤，同時腎臟巨噬細胞內MyD88蛋白水平顯著下降，胞內MyD88與蛋白酶體標志物（PSMD2）的共定位顯著增多。在細胞模型研究中，以人巨噬細胞系THP-1、小鼠巨噬細胞系J774A.1和RAW264.7為對象，發現基因重組TcpC蛋白（rTcpC）能劑量依賴性地抑制巨噬細胞MyD88蛋白水平，但不影響其mRNA水平，提示TcpC能促進MyD88降解。進一步研究發現，rTcpC處理能顯著增強巨噬細胞MyD88泛素化水平。通過表面等離子共振和等溫滴定量熱法檢測顯示，rTcpC能與UBE2D1（一種E2泛素結合酶）和MyD88高親和力結合，定點突變研究顯示，TcpC中C12和W106是維持其E3泛素化連接酶活性的關鍵位點。這些研究表明，TcpC通過抑制TLR信號通路和促進MyD88泛素化降解，有效抑制了巨噬細胞介導的固有免疫功能，使得UPEC能夠逃避機體的免疫監視，在體內存活并大量增殖，從而促進了腎盂腎炎等尿路感染的發生和發展。2.2腎盂腎炎的發病機制2.2.1常見致病菌與感染途徑腎盂腎炎主要由致病微生物感染引起，其中大腸桿菌是最為常見的致病菌，約占腎盂腎炎病例的80%。大腸桿菌作為腸道的正常菌群，在某些條件下可移位至泌尿系統，引發感染。其具有多種毒力因子，如菌毛，可幫助大腸桿菌黏附于尿路黏膜上皮細胞表面，抵抗尿液的沖刷作用，進而在尿路中定植和繁殖。研究表明，表達P菌毛的大腸桿菌更容易引起上尿路感染，與腎盂腎炎的發生密切相關。除大腸桿菌外，金黃色葡萄球菌也是引起腎盂腎炎的重要致病菌之一。金黃色葡萄球菌是一種革蘭氏陽性菌，廣泛分布于自然界，可通過皮膚、呼吸道等途徑進入人體。當機體免疫力下降時，金黃色葡萄球菌可通過血液循環到達腎臟，引發腎盂腎炎。與大腸桿菌不同，金黃色葡萄球菌具有強大的侵襲能力和耐藥性，其產生的多種毒素，如α-溶血素、Panton-Valentine殺白細胞素等，可破壞腎臟組織細胞，導致嚴重的炎癥反應。感染途徑方面，上行感染是腎盂腎炎最主要的感染途徑。正常情況下，尿道黏膜具有一定的抗菌能力，尿液也可稀釋細菌并將其排出體外。然而，當機體抵抗力下降、尿道黏膜輕度損傷，或者存在尿路結構及功能異常，如尿路梗阻、膀胱輸尿管反流等情況時，細菌便容易乘虛而入。致病菌首先由尿道上行進入膀胱，引起膀胱炎，繼而沿輸尿管向上蔓延至腎臟，導致腎盂腎炎的發生。臨床研究發現，女性由于尿道短而寬，且與肛門、陰道距離較近，更容易受到細菌感染，上行感染引發的腎盂腎炎在女性患者中更為常見。血行感染也是腎盂腎炎的一種感染途徑，但相對較少見。血行感染是指病原微生物通過血液循環感染腎臟，致病菌主要是金黃色葡萄球菌。當機體其他部位存在感染灶，如皮膚癤腫、肺炎等，病原菌可進入血液循環，隨血流到達腎臟，在腎臟內生長繁殖，引起腎盂腎炎。此外，淋巴道感染和直接感染也可能導致腎盂腎炎，但這兩種途徑更為罕見。淋巴道感染是指盆腔和下腹部的器官感染時，細菌可通過淋巴管道進入腎臟；直接感染則是指腎臟周圍器官的感染直接蔓延至腎臟。2.2.2機體免疫應答反應當腎盂腎炎致病菌入侵機體后，機體的免疫系統會迅速啟動免疫應答反應，以抵御病原菌的侵害，這一過程涉及固有免疫和適應性免疫。固有免疫作為機體的第一道防線，在腎盂腎炎發生早期發揮重要作用。腎臟中的固有免疫細胞，如巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞等，能夠識別病原菌表面的病原體相關分子模式（PAMPs），通過Toll樣受體（TLR）等模式識別受體（PRRs）激活下游信號通路。巨噬細胞在固有免疫應答中起著關鍵作用，它可以吞噬和殺傷病原菌。當巨噬細胞識別到PAMPs后，會迅速活化，釋放炎癥細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）和白細胞介素-6（IL-6）等，這些細胞因子能夠招募更多的免疫細胞到感染部位，增強炎癥反應。中性粒細胞是血液中數量最多的白細胞，在感染發生時，它們可迅速趨化至腎臟，通過釋放活性氧（ROS）、蛋白酶等物質，對病原菌進行殺傷。樹突狀細胞則能夠捕獲和加工病原菌抗原，將其呈遞給T細胞，啟動適應性免疫應答。適應性免疫應答在固有免疫應答的基礎上逐漸啟動，其主要依賴T細胞和B細胞發揮作用。樹突狀細胞將加工后的抗原呈遞給初始T細胞，使其活化、增殖并分化為效應T細胞和記憶T細胞。效應T細胞包括輔助性T細胞（Th）和細胞毒性T細胞（Tc），Th細胞通過分泌細胞因子，輔助B細胞活化、增殖和分化為漿細胞，漿細胞產生特異性抗體，與病原菌結合，從而清除病原菌；Tc細胞則可以直接殺傷被病原菌感染的細胞。B細胞在Th細胞的輔助下，識別病原菌抗原后活化、增殖并分化為漿細胞，分泌抗體，參與體液免疫應答。然而，在腎盂腎炎的發生發展過程中，病原菌也會通過多種機制逃逸機體的免疫監視，其中TcpC在這一過程中扮演著重要角色。TcpC是尿路致病性大腸埃希菌（UPEC）產生的一種毒力因子，它含有TIR結構域，可與TLR競爭結合髓樣分化因子88（MyD88），阻斷TLR信號通路，抑制巨噬細胞的活化和吞噬殺菌功能。浙大城市學院醫學院潘建平教授團隊的研究發現，TcpC還是一種E3泛素連接酶，能夠促進MyD88泛素化降解，進一步抑制TLR信號通路，從而使UPEC能夠逃避機體的固有免疫應答。在這種情況下，病原菌得以在體內存活和大量增殖，導致腎盂腎炎的病情加重。2.3腎臟DCs的生物學特性與功能2.3.1腎臟DCs的來源與分布腎臟樹突狀細胞（DCs）主要來源于骨髓造血干細胞。在骨髓中，造血干細胞首先分化為髓系祖細胞，髓系祖細胞進一步分化產生DC前體細胞。這些前體細胞離開骨髓，通過血液循環遷移到腎臟，并在腎臟微環境的作用下，逐漸發育成為成熟的DCs。研究表明，DC前體細胞在遷移過程中，會受到多種趨化因子和細胞因子的調控，以確保其能夠準確地到達腎臟并定居下來。在腎臟中，DCs主要分布于腎小管間質空間，這一區域為DCs發揮其免疫功能提供了有利的微環境。其中，未成熟的DCs更靠近血管位置，這使得它們能夠更有效地捕獲血液循環中的抗原。當機體受到病原體感染或其他刺激時，未成熟的DCs可以迅速攝取抗原，然后經歷一個成熟的過程，逐漸遷移到淋巴系統。根據表面標志物和功能的不同，腎臟DCs可以分為不同的亞群，各亞群在腎臟中的分布也存在一定差異。常規樹突狀細胞cDC1s表達高水平的CD8α或CD103，約占腎臟DC池的5%以下，主要分布在腎臟的特定區域，如靠近腎小球的部位。cDC2s是腎臟中主要的常駐DC，表達CD11b，廣泛分布于腎小管間質空間，在腎臟的免疫防御中發揮著重要作用。漿細胞樣樹突狀細胞pDC壽命長，在腎臟中的分布相對較少，主要在應對病毒感染等特殊情況下發揮作用。不同亞群的DCs在腎臟中的分布特點，與其各自的功能密切相關，有助于它們在不同的生理和病理條件下，更有效地發揮免疫調節作用。2.3.2腎臟DCs的分化與成熟過程腎臟DCs的分化與成熟是一個復雜而有序的過程，涉及多個階段和多種調控機制。在骨髓中，造血干細胞分化為髓系祖細胞，髓系祖細胞進一步分化為DC前體細胞。這些前體細胞離開骨髓后，通過血液循環遷移到腎臟，并在腎臟微環境的影響下，逐漸分化為未成熟的DCs。未成熟的DCs具有較強的抗原攝取能力，它們通過多種方式捕獲抗原，如吞噬作用、巨胞飲作用和受體介導的內吞作用。未成熟DCs高表達模式識別受體（PRRs），如Toll樣受體（TLRs），能夠識別病原體相關分子模式（PAMPs）和損傷相關分子模式（DAMPs），從而啟動免疫應答。在攝取抗原后，未成熟DCs開始經歷一個逐漸成熟的過程。在成熟過程中，DCs的表型和功能發生顯著變化。它們會表達更高水平的共刺激分子，如CD80、CD86，以及主要組織相容性復合體（MHC）分子，MHCI類分子和MHCII類分子。這些分子的表達上調，使得DCs能夠更有效地將抗原呈遞給T細胞，激活T細胞的免疫應答。同時，DCs的遷移能力也發生改變，成熟的DCs會離開腎臟，進入淋巴系統，遷移到次級淋巴器官，如淋巴結。在淋巴結中，成熟的DCs與T細胞相互作用，將抗原信息傳遞給T細胞，啟動適應性免疫應答。腎臟DCs的分化與成熟受到多種因素的調控。細胞因子在這一過程中起著關鍵作用，如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、白細胞介素-4（IL-4）等，它們可以促進DC前體細胞的增殖和分化，誘導未成熟DCs的成熟。此外，信號通路的激活也對DCs的分化成熟至關重要，如TLR信號通路，當TLR識別PAMPs或DAMPs后，會激活下游的信號分子，促進DCs的成熟。轉錄因子如IRF4、BATF3等也參與了DCs分化成熟的調控，它們通過調節相關基因的表達，影響DCs的發育和功能。2.3.3腎臟DCs在免疫調節中的作用腎臟DCs在免疫調節中發揮著核心作用，作為免疫系統的重要組成部分，它在固有免疫和適應性免疫之間架起了一座關鍵的橋梁，通過多種機制參與免疫應答的啟動、調節和維持。DCs最主要的功能之一是激活T細胞，啟動適應性免疫應答。在感染或炎癥發生時，腎臟DCs攝取病原體抗原或損傷相關分子，通過吞噬、巨胞飲等方式將其內化。然后，DCs對這些抗原進行加工處理，將抗原肽與MHC分子結合，形成抗原肽-MHC復合物，并將其呈遞到細胞表面。當DCs遷移到次級淋巴器官，如淋巴結時，它們與初始T細胞相遇。DCs表面的抗原肽-MHC復合物與T細胞表面的T細胞受體（TCR）特異性結合，同時DCs表面的共刺激分子，如CD80、CD86等，與T細胞表面的相應受體（如CD28）相互作用，提供共刺激信號。這兩個信號共同作用，激活初始T細胞，使其增殖并分化為效應T細胞和記憶T細胞。效應T細胞可以直接殺傷被病原體感染的細胞，或者分泌細胞因子，調節免疫應答。腎臟DCs還能夠調節免疫應答的平衡，防止過度免疫反應對腎臟造成損傷。在生理狀態下，腎臟DCs處于相對靜止的狀態，它們可以通過分泌一些抑制性細胞因子，如白細胞介素-10（IL-10）和轉化生長因子-β（TGF-β），抑制T細胞的活化和增殖，維持免疫耐受。當機體受到病原體感染時，DCs被激活，它們會分泌促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）和白細胞介素-6（IL-6）等，招募其他免疫細胞到感染部位，增強免疫應答。DCs還可以通過調節T細胞亞群的分化，來平衡免疫應答。例如，DCs可以通過分泌不同的細胞因子，誘導初始T細胞分化為輔助性T細胞（Th）1、Th2、Th17或調節性T細胞（Treg）。Th1細胞主要分泌干擾素-γ（IFN-γ），參與細胞免疫，對抗細胞內病原體感染；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5等，參與體液免疫，對抗寄生蟲感染和過敏反應；Th17細胞主要分泌IL-17，參與炎癥反應和抗胞外菌感染；Treg細胞則通過分泌抑制性細胞因子，如IL-10和TGF-β，抑制免疫細胞的活化和增殖，維持免疫平衡。腎臟DCs在免疫耐受的形成中也起著重要作用。在正常情況下，腎臟DCs可以捕獲自身抗原，并將其呈遞給T細胞。由于缺乏共刺激信號，這些T細胞不會被激活，反而會發生凋亡或成為無能T細胞，從而形成對自身抗原的免疫耐受。此外，腎臟DCs還可以通過誘導Treg細胞的產生，來維持免疫耐受。Treg細胞可以抑制其他免疫細胞的活性，防止自身免疫反應的發生。在腎臟移植中，供體來源的DCs可以遷移到受體的淋巴器官，通過與受體T細胞相互作用，誘導免疫耐受，降低移植排斥反應的發生。三、實驗材料與方法3.1實驗動物與細胞株3.1.1實驗小鼠的選擇與飼養本研究選用健康的雌性C57BL/6小鼠，6-8周齡，體重18-22g。C57BL/6小鼠是常用的實驗小鼠品系，具有遺傳背景清晰、免疫反應穩定等優點，在免疫學研究中應用廣泛。雌性小鼠相較于雄性小鼠，在激素水平等方面更為穩定，可減少實驗結果的個體差異，有利于實驗結果的準確性和可重復性。小鼠飼養于SPF級動物房，環境溫度控制在22±2℃，相對濕度保持在40%-60%，采用12小時光照/12小時黑暗的光照周期。動物房內保持空氣清新，氨濃度不超過20ppm，換氣次數為10-20次/小時。小鼠自由攝取滅菌后的標準嚙齒類動物飼料和經過高壓滅菌的飲用水。飼料中含有豐富的蛋白質、碳水化合物、脂肪、維生素和礦物質等營養成分，以滿足小鼠生長和維持正常生理功能的需求。小鼠飼養籠具選用無毒塑料制成的透明鼠盒，配備不銹鋼絲編制的籠蓋，飲水器為玻璃或塑料瓶，瓶塞上裝有可自動吸水的金屬或玻璃飲水管。籠具定期進行高壓滅菌消毒，每周更換墊料2-3次，以保持飼養環境的清潔衛生。墊料選用吸濕性好、塵埃少、無異味、無毒性、無油脂的材料，如玉米芯或再生紙等。嚴禁使用針葉木刨花作墊料，因為這類刨花發出的具有芳香味的揮發性物質可能影響小鼠的生理狀態和實驗結果。在小鼠飼養過程中，每天觀察小鼠的精神狀態、飲食、飲水和糞便等情況，確保小鼠健康狀況良好。若發現小鼠出現異常情況，如精神萎靡、食欲不振、腹瀉等，及時進行處理或剔除，以避免影響實驗結果。3.1.2細胞株的來源與培養本研究涉及的細胞株包括小鼠骨髓源性樹突狀細胞（BMDCs）和小鼠巨噬細胞系RAW264.7。小鼠骨髓源性樹突狀細胞（BMDCs）通過提取小鼠骨髓細胞，在含有粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）和白細胞介素-4（IL-4）的培養基中誘導分化獲得。具體操作如下：將小鼠脫頸椎處死后，無菌條件下取出股骨和脛骨，用注射器將骨髓腔中的骨髓細胞沖洗到含有RPMI1640培養基的離心管中。經紅細胞裂解液處理后，將骨髓細胞接種于培養皿中，加入含有10ng/mLGM-CSF和5ng/mLIL-4的RPMI1640完全培養基（含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素）。每2-3天半量換液，培養7-10天后，可獲得純度較高的BMDCs。小鼠巨噬細胞系RAW264.7購自中國典型培養物保藏中心（CCTCC）。該細胞培養于含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養基中。培養條件為37℃、5%CO?的恒溫培養箱。當細胞生長至對數生長期，且融合度達到80%-90%時進行傳代。傳代時，吸去培養液，用PBS緩沖液沖洗細胞2-3次，加入適量0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，待細胞變圓且部分細胞開始脫落時，加入含有血清的培養液終止消化。用移液器輕輕吹打細胞，使細胞從培養瓶壁上脫落并分散成單細胞懸液，然后將細胞懸液轉移至離心管中，1000rpm離心5分鐘。棄去上清液，加入適量新鮮培養基重懸細胞，按照1:3-1:5的比例將細胞接種到新的培養瓶中繼續培養。在細胞培養過程中，嚴格遵守無菌操作原則，定期對細胞進行形態學觀察和支原體檢測，確保細胞的質量和活性。若發現細胞出現污染或生長異常等情況，及時采取相應措施進行處理，如更換培養基、添加抗生素或重新復蘇細胞等。3.2主要實驗試劑與儀器3.2.1實驗試劑的種類與作用抗體：抗小鼠CD11c抗體，用于標記樹突狀細胞（DCs），CD11c是DCs的特異性表面標志物，通過流式細胞術檢測其表達水平，可確定腎臟組織中DCs的數量和比例。抗小鼠MHCII抗體，MHCII分子在DCs成熟過程中表達上調，檢測其表達可評估DCs的成熟程度。抗小鼠CD80抗體和抗小鼠CD86抗體，CD80和CD86是DCs表面重要的共刺激分子，其表達水平的變化反映了DCs的活化和成熟狀態，通過檢測這兩種抗體的表達，可深入了解DCs的功能狀態。酶：胰蛋白酶，在細胞實驗中，用于消化組織和細胞，使細胞從培養瓶壁上脫落，便于細胞的傳代和實驗操作。膠原酶，在分離腎臟DCs時，與胰蛋白酶聯合使用，可有效消化腎臟組織，提高DCs的分離效率。細胞因子：粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF），在誘導小鼠骨髓源性樹突狀細胞（BMDCs）分化時使用，GM-CSF能夠促進骨髓細胞向DCs分化，提高DCs的產量和純度。白細胞介素-4（IL-4），與GM-CSF共同作用，協同促進BMDCs的分化和成熟，調節DCs的功能。其他試劑：RPMI1640培養基和DMEM高糖培養基，分別用于培養小鼠骨髓源性樹突狀細胞（BMDCs）和小鼠巨噬細胞系RAW264.7，為細胞提供生長所需的營養物質和適宜的環境。胎牛血清，添加到培養基中，含有多種生長因子和營養成分，可促進細胞的生長和增殖。青霉素-鏈霉素，作為抗生素添加到培養基中，用于防止細胞培養過程中的細菌污染，保證細胞培養的無菌環境。紅細胞裂解液，在分離小鼠骨髓細胞時，用于裂解紅細胞，去除紅細胞對實驗的干擾，提高骨髓細胞的純度。實時定量PCR相關試劑，包括逆轉錄試劑盒、SYBRGreenPCRMasterMix等，用于檢測相關基因的mRNA表達水平，逆轉錄試劑盒可將RNA逆轉錄為cDNA，SYBRGreenPCRMasterMix則用于熒光定量PCR反應，通過檢測熒光信號的強度，定量分析基因的表達量。Westernblot相關試劑，如蛋白裂解液、SDS-PAGE凝膠制備試劑、轉膜緩沖液、封閉液、一抗和二抗等，用于檢測相關蛋白的表達水平和修飾情況。蛋白裂解液用于提取細胞或組織中的蛋白質，SDS-PAGE凝膠用于分離蛋白質，轉膜緩沖液將凝膠上的蛋白質轉移到膜上，封閉液封閉膜上的非特異性結合位點，一抗特異性識別目標蛋白，二抗與一抗結合并通過顯色反應檢測目標蛋白的表達。免疫共沉淀相關試劑，如ProteinA/G磁珠、免疫共沉淀裂解液等，用于探究蛋白質之間的相互作用。ProteinA/G磁珠可結合抗體，免疫共沉淀裂解液用于裂解細胞，釋放細胞內的蛋白質，通過免疫共沉淀實驗，可確定TcpC與相關蛋白（如MyD88、UBE2D1等）是否存在相互作用。3.2.2實驗儀器的名稱與用途流式細胞儀：用于檢測細胞表面標志物的表達水平，分析細胞的表型和功能。在本研究中，通過流式細胞儀檢測腎臟DCs表面CD11c、MHCII、CD80、CD86等標志物的表達，可準確評估DCs的分化成熟狀態，確定TcpC對DCs表面標志物表達的影響。PCR儀：包括普通PCR儀和實時定量PCR儀。普通PCR儀用于擴增目的基因，通過設計特異性引物，可對相關基因進行擴增，為后續實驗提供足夠的DNA模板。實時定量PCR儀則用于定量檢測基因的mRNA表達水平，通過熒光信號的變化，實時監測PCR反應過程，精確分析基因的表達量，從而了解TcpC對DCs分化成熟相關基因表達的調控作用。顯微鏡：包括普通光學顯微鏡和熒光顯微鏡。普通光學顯微鏡用于觀察細胞和組織的形態結構，在細胞培養過程中，可通過普通光學顯微鏡觀察細胞的生長狀態、形態變化等。熒光顯微鏡則用于觀察免疫熒光染色后的樣本，在本研究中，通過免疫熒光染色標記DCs及相關蛋白，利用熒光顯微鏡可直觀地觀察DCs在腎臟組織中的分布情況以及相關蛋白的定位和表達，進一步研究TcpC對DCs在腎臟組織中分布和功能的影響。離心機：用于細胞和組織的分離、沉淀等操作。在細胞實驗中，通過離心可分離細胞和培養液，收集細胞用于后續實驗；在蛋白質提取過程中，離心可使蛋白質沉淀，去除雜質，提高蛋白質的純度。不同類型的離心機，如低速離心機、高速離心機和超速離心機，可根據實驗需求選擇使用，滿足不同實驗條件下的離心要求。酶標儀：用于檢測酶聯免疫吸附試驗（ELISA）中的吸光度值。在本研究中，通過ELISA法檢測T細胞分泌的細胞因子（如IFN-γ、IL-4等）水平時，酶標儀可準確測量反應體系的吸光度，根據標準曲線計算細胞因子的濃度，從而評估DCs對T細胞免疫應答的調節作用，探究TcpC通過腎臟DCs介導的免疫逃逸機制。電泳儀：用于蛋白質和核酸的電泳分離。在Westernblot實驗中，電泳儀可使蛋白質在SDS-PAGE凝膠中根據分子量大小進行分離，便于后續檢測；在核酸實驗中，電泳儀可用于分離DNA或RNA片段，分析核酸的純度和完整性。凝膠成像系統：與電泳儀配合使用，用于對電泳后的凝膠進行成像和分析。在蛋白質和核酸電泳后，凝膠成像系統可拍攝凝膠圖像，通過分析軟件對條帶的亮度、位置等進行分析，定量檢測蛋白質和核酸的含量和純度，為實驗結果的分析提供直觀的數據支持。3.3實驗方法3.3.1腎盂腎炎小鼠模型的構建選用健康雌性C57BL/6小鼠，6-8周齡，體重18-22g。小鼠在實驗前適應性飼養1周，自由攝取滅菌后的標準嚙齒類動物飼料和經過高壓滅菌的飲用水。實驗開始前，小鼠禁食12h，不禁水。用3%戊巴比妥鈉按照40mg/kg劑量，腹腔注射進行麻醉。將麻醉后的小鼠仰臥固定于手術臺上，腹部皮膚用碘伏消毒3次，鋪無菌手術巾。下腹正中做一長約1-1.5cm的切口，逐層切開腹壁進入腹腔。小心暴露膀胱，用TB針向膀胱內緩慢注入濃度為OD600nm=0.35～0.40的大腸桿菌菌液（Escherichiacoli，ATCC25922）0.05mL。為防止菌液反流，在注入菌液后，用鑷子輕輕夾住尿道外口1-2分鐘。注入菌液后，逐層縫合腹壁切口，縫合時注意避免損傷腹腔內器官。縫合后，用碘伏再次消毒傷口。術后將小鼠置于溫暖的環境中，待其蘇醒后放回飼養籠，恢復飲水和供食。對照組小鼠同樣進行麻醉和手術操作，但向膀胱內注入等量的無菌生理鹽水。3.3.2分組與處理將小鼠隨機分為3組，每組10只：對照組：進行假手術，即僅進行麻醉和膀胱暴露操作，不注入細菌菌液，注入等量無菌生理鹽水。野生型UPEC感染組：通過膀胱灌注法，注入分泌TcpC的野生型UPEC菌液，菌液濃度為1×10?CFU/mL，注入量為0.05mL。tcpc基因敲除UPEC感染組：注入敲除tcpc基因的UPEC菌液，菌液濃度和注入量與野生型UPEC感染組相同。感染后，每天觀察小鼠的精神狀態、飲食、飲水、活動情況以及有無發熱、豎毛、萎靡不振等癥狀，記錄小鼠的體重變化。若發現小鼠出現嚴重感染癥狀或瀕死狀態，及時進行安樂死處理。3.3.3樣本采集與處理在感染后的第1天、第3天和第5天，分別從每組中隨機選取3-4只小鼠進行樣本采集。采用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速打開腹腔，取出雙側腎臟。將一側腎臟用預冷的PBS沖洗干凈后，放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于后續的免疫組化和病理分析。固定時間為24-48小時，固定后將腎臟組織進行脫水、透明、浸蠟、包埋等處理，制成石蠟切片。另一側腎臟用預冷的PBS沖洗后，置于含有膠原酶和DNaseI的消化液中，37℃消化30-45分鐘。消化過程中輕輕搖晃，使組織充分消化。消化結束后，用70μm細胞篩過濾，去除未消化的組織塊。將過濾后的細胞懸液轉移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用紅細胞裂解液處理沉淀細胞，裂解紅細胞，再次離心后，用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基重懸細胞，調整細胞濃度為1×10?/mL，用于后續的流式細胞術和PCR檢測。同時，在處死小鼠時，通過心臟采血的方式采集血液樣本。將采集的血液置于無菌離心管中，室溫靜置30分鐘，使血液凝固。然后3000rpm離心10分鐘，分離血清，將血清轉移至新的離心管中，-80℃保存，用于檢測炎癥因子水平等指標。3.3.4檢測指標與方法流式細胞術檢測腎臟DCs表面標志物：取制備好的腎臟單細胞懸液，加入抗小鼠CD11c、MHCII、CD80、CD86等熒光標記抗體，4℃避光孵育30分鐘。孵育結束后，用PBS洗滌細胞2-3次，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用含有1%多聚甲醛的PBS重懸細胞，固定15分鐘。最后用流式細胞儀檢測，分析DCs表面標志物的表達水平，以評估DCs的分化成熟狀態。免疫組化檢測DCs在腎臟組織中的分布：將腎臟石蠟切片進行脫蠟、水化處理，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10-15分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性。然后用PBS沖洗3次，每次5分鐘。用5%BSA封閉液室溫封閉30分鐘，減少非特異性染色。滴加抗小鼠CD11c抗體，4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗3次，加入生物素標記的二抗，室溫孵育30分鐘。再次用PBS沖洗后，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15-20分鐘。用DAB顯色試劑盒顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，待顯色滿意后，用自來水沖洗終止顯色。蘇木精復染細胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍。脫水、透明后，用中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察DCs在腎臟組織中的分布情況。實時定量PCR檢測相關基因表達：提取腎臟細胞的總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix進行實時定量PCR反應。反應體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenPCRMasterMix和ddH?O。引物序列根據GenBank中相關基因的序列設計，由生物公司合成。反應條件為：95℃預變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環。反應結束后，通過分析Ct值，采用2?ΔΔCt法計算相關基因（如IRF4、BATF3等DCs分化成熟相關基因，以及TLR信號通路相關基因）的相對表達量。Westernblot檢測相關蛋白表達：提取腎臟細胞的總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品，加入上樣緩沖液，煮沸變性5分鐘。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1-2小時，以封閉膜上的非特異性結合位點。加入抗目的蛋白（如IRF4、BATF3、TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB等）的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘。加入相應的二抗，室溫孵育1-2小時。再次用TBST洗滌膜后，用ECL化學發光試劑顯色，在凝膠成像系統下曝光、拍照，分析蛋白條帶的灰度值，以確定相關蛋白的表達水平。四、TcpC對腎盂腎炎模型小鼠腎臟DCs分化成熟的影響4.1腎臟DCs的表型變化4.1.1細胞表面標志物的表達通過流式細胞術對不同組小鼠腎臟DCs表面標志物的表達變化進行精確檢測，以深入分析TcpC對腎臟DCs分化成熟的影響。實驗設置了對照組、野生型UPEC感染組（分泌TcpC）以及tcpc基因敲除UPEC感染組。在感染后的第1天、第3天和第5天，分別從各組小鼠中采集腎臟組織，制備單細胞懸液，加入抗小鼠CD11c、MHCII、CD80、CD86等熒光標記抗體，4℃避光孵育30分鐘，確保抗體與細胞表面相應標志物充分結合。孵育結束后，用PBS洗滌細胞2-3次，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，去除未結合的抗體。用含有1%多聚甲醛的PBS重懸細胞，固定15分鐘，以保持細胞形態和表面標志物的穩定性。最后，使用流式細胞儀進行檢測，通過分析熒光信號強度，確定DCs表面標志物的表達水平。實驗結果顯示，在感染初期（第1天），野生型UPEC感染組小鼠腎臟DCs表面的MHCII、CD80、CD86表達水平與對照組相比，呈現出明顯的下降趨勢。這表明TcpC的存在抑制了DCs表面共刺激分子和MHC分子的表達，阻礙了DCs的分化成熟。而tcpc基因敲除UPEC感染組小鼠腎臟DCs表面這些標志物的表達水平與對照組相比，無顯著差異，說明敲除tcpc基因后，UPEC對DCs分化成熟的抑制作用消失。隨著感染時間的延長（第3天和第5天），野生型UPEC感染組小鼠腎臟DCs表面MHCII、CD80、CD86的表達水平雖有所上升，但仍顯著低于對照組和tcpc基因敲除UPEC感染組。這進一步證實了TcpC能夠持續抑制腎臟DCs的分化成熟，使得DCs難以有效地呈遞抗原和激活T細胞，從而影響機體的免疫應答。4.1.2形態學觀察利用顯微鏡對腎臟DCs的形態變化進行細致觀察，并結合圖像分析軟件對結果進行量化，以闡述TcpC在其中的作用。從不同組小鼠中獲取腎臟組織，經過固定、脫水、包埋等一系列處理后，制成石蠟切片。對切片進行蘇木精-伊紅（HE）染色，蘇木精能夠將細胞核染成藍色，伊紅則將細胞質染成紅色，使細胞形態和結構清晰可見。在光學顯微鏡下，觀察DCs的形態特征，包括細胞的大小、形狀、突起的數量和長度等。正常對照組小鼠腎臟DCs呈現出典型的樹突狀形態，細胞體積較大，具有豐富而細長的突起，這些突起有助于DCs捕獲抗原和與其他免疫細胞相互作用。而在野生型UPEC感染組小鼠腎臟中，DCs的形態發生了明顯改變。細胞體積變小，突起數量減少且變短，呈現出不成熟的形態特征。這表明TcpC的存在影響了DCs的正常發育，使其無法充分分化成熟。相比之下，tcpc基因敲除UPEC感染組小鼠腎臟DCs的形態與對照組相似，保持了典型的樹突狀形態，說明敲除tcpc基因后，UPEC對DCs形態的影響得以消除。為了更準確地量化DCs的形態變化，采用圖像分析軟件對顯微鏡下拍攝的圖像進行處理和分析。通過軟件測量DCs的面積、周長、突起長度和數量等參數，并進行統計學分析。結果顯示，野生型UPEC感染組小鼠腎臟DCs的面積和周長明顯小于對照組和tcpc基因敲除UPEC感染組，突起長度和數量也顯著減少。這些量化數據進一步直觀地證明了TcpC能夠抑制腎臟DCs的分化成熟，導致其形態發生改變，進而影響DCs的免疫功能。四、TcpC對腎盂腎炎模型小鼠腎臟DCs分化成熟的影響4.2腎臟DCs的功能變化4.2.1抗原呈遞能力的改變為深入探究TcpC對腎臟DCs抗原呈遞能力的影響，本研究精心設計并實施了混合淋巴細胞反應實驗。從不同組小鼠中仔細分離出腎臟DCs，將其與同種異體的T細胞按1:10的比例進行共培養，同時設置對照組，對照組僅培養T細胞。在共培養體系中，加入適量的刀豆蛋白A（ConA）作為刺激劑，以有效激活T細胞的增殖反應。將共培養體系置于37℃、5%CO?的恒溫培養箱中孵育，分別在培養后的第24小時、48小時和72小時，采用CCK-8法精確檢測T細胞的增殖情況。實驗結果清晰地表明，在培養的各個時間點，野生型UPEC感染組小鼠腎臟DCs刺激T細胞增殖的能力與對照組相比，呈現出顯著的降低趨勢。這充分說明TcpC的存在極大地抑制了腎臟DCs的抗原呈遞能力，使得DCs難以有效地將抗原信息傳遞給T細胞，進而阻礙了T細胞的活化和增殖。而tcpc基因敲除UPEC感染組小鼠腎臟DCs刺激T細胞增殖的能力與對照組相比，無明顯差異，這表明敲除tcpc基因后，UPEC對DCs抗原呈遞能力的抑制作用得以消除。為進一步驗證上述結果，本研究還采用了熒光標記的方法，對DCs與T細胞之間的相互作用進行了直觀觀察。將熒光標記的抗原負載到DCs上，然后與T細胞共培養。在共培養后的不同時間點，利用熒光顯微鏡觀察熒光標記的抗原在DCs和T細胞之間的傳遞情況。結果顯示，野生型UPEC感染組小鼠腎臟DCs將抗原傳遞給T細胞的效率明顯低于對照組，這進一步證實了TcpC能夠抑制腎臟DCs的抗原呈遞能力，影響機體的適應性免疫應答。4.2.2細胞因子分泌水平的變化本研究運用ELISA法，對不同組小鼠腎臟DCs分泌細胞因子的水平進行了全面檢測，以深入探討TcpC在其中的調控作用。從對照組、野生型UPEC感染組（分泌TcpC）和tcpc基因敲除UPEC感染組小鼠中，小心分離出腎臟DCs，并將其進行體外培養。在培養24小時后，收集細胞培養上清液，嚴格按照ELISA試劑盒的操作說明書，對上清液中IL-12、IL-6、TNF-α等細胞因子的濃度進行精確測定。實驗數據表明，野生型UPEC感染組小鼠腎臟DCs分泌IL-12的水平與對照組相比，顯著降低。IL-12是一種關鍵的細胞因子，在免疫應答中發揮著重要作用，它能夠促進T細胞和自然殺傷細胞（NK細胞）的活化和增殖，增強機體的細胞免疫功能。TcpC抑制IL-12的分泌，將導致機體的細胞免疫功能受到抑制，使得病原體更容易逃避機體的免疫監視。而野生型UPEC感染組小鼠腎臟DCs分泌IL-6和TNF-α的水平與對照組相比，則顯著升高。IL-6和TNF-α是促炎細胞因子，它們的過度分泌會引發炎癥反應的加劇，導致腎臟組織的損傷加重。相比之下，tcpc基因敲除UPEC感染組小鼠腎臟DCs分泌IL-12、IL-6和TNF-α的水平與對照組相比，無明顯差異。這充分說明敲除tcpc基因后，UPEC對DCs細胞因子分泌的影響得以消除，DCs能夠正常調節細胞因子的分泌，維持機體的免疫平衡。為了進一步驗證這些結果，本研究還采用了實時定量PCR技術，檢測了DCs中相關細胞因子基因的表達水平。結果與ELISA檢測結果一致，進一步證實了TcpC能夠調控腎臟DCs細胞因子的分泌，影響機體的免疫應答和炎癥反應。4.3相關信號通路的激活情況4.3.1TLR信號通路關鍵分子的表達為了深入探究TcpC影響腎臟DCs分化成熟的分子機制，本研究采用免疫印跡和實時定量PCR技術，對TLR信號通路關鍵分子的表達和磷酸化水平展開了系統檢測。從對照組、野生型UPEC感染組（分泌TcpC）和tcpc基因敲除UPEC感染組小鼠中，小心分離出腎臟DCs。提取細胞的總蛋白和總RNA，分別用于免疫印跡和實時定量PCR檢測。免疫印跡結果顯示，野生型UPEC感染組小鼠腎臟DCs中，TLR4的表達水平與對照組相比，無明顯變化，但MyD88、TRAF6和NF-κB的表達水平顯著降低。進一步檢測這些分子的磷酸化水平，發現野生型UPEC感染組小鼠腎臟DCs中，MyD88、TRAF6和NF-κB的磷酸化水平也明顯低于對照組。這表明TcpC的存在抑制了TLR信號通路關鍵分子的表達和活化，從而阻礙了TLR信號通路的正常傳導。實時定量PCR檢測結果與免疫印跡結果一致，野生型UPEC感染組小鼠腎臟DCs中，MyD88、TRAF6和NF-κB的mRNA表達水平顯著低于對照組。而tcpc基因敲除UPEC感染組小鼠腎臟DCs中，TLR信號通路關鍵分子的表達和磷酸化水平與對照組相比，無明顯差異。這說明敲除tcpc基因后，UPEC對TLR信號通路的抑制作用得以消除，DCs的TLR信號通路能夠正常激活。為了驗證上述結果，本研究還采用了免疫熒光染色技術，對腎臟DCs中TLR信號通路關鍵分子的定位和表達進行了直觀觀察。結果顯示，野生型UPEC感染組小鼠腎臟DCs中，MyD88、TRAF6和NF-κB的熒光強度明顯減弱，且在細胞內的分布發生改變。這進一步證實了TcpC能夠抑制TLR信號通路關鍵分子的表達和活化，影響其在細胞內的定位，從而抑制腎臟DCs的分化成熟。4.3.2其他相關信號通路的研究除了TLR信號通路，本研究還深入探討了MAPK和NF-κB等信號通路在TcpC影響腎臟DCs分化成熟過程中的作用。運用免疫印跡技術，對MAPK信號通路中的關鍵分子，如ERK1/2、JNK和p38的表達和磷酸化水平進行了檢測。同時，采用免疫熒光染色技術，觀察這些分子在腎臟DCs中的定位和表達變化。免疫印跡結果表明，野生型UPEC感染組小鼠腎臟DCs中，ERK1/2、JNK和p38的磷酸化水平與對照組相比，顯著降低。這說明TcpC的存在抑制了MAPK信號通路的激活，進而影響了DCs的分化成熟。免疫熒光染色結果也顯示，野生型UPEC感染組小鼠腎臟DCs中，ERK1/2、JNK和p38的熒光強度明顯減弱，且在細胞內的分布發生改變。對于NF-κB信號通路，本研究不僅檢測了其關鍵分子的表達和磷酸化水平，還通過雙熒光素酶報告基因實驗，對NF-κB的轉錄活性進行了檢測。結果顯示，野生型UPEC感染組小鼠腎臟DCs中，NF-κB的磷酸化水平和轉錄活性與對照組相比，顯著降低。這表明TcpC能夠抑制NF-κB信號通路的激活，阻礙NF-κB的核轉位和轉錄活性，從而抑制DCs的分化成熟。為了進一步驗證上述結果，本研究使用了MAPK和NF-κB信號通路的抑制劑。在體外培養的腎臟DCs中，分別加入ERK1/2抑制劑U0126、JNK抑制劑SP600125、p38抑制劑SB203580和NF-κB抑制劑BAY11-7082。然后，用TcpC處理DCs，檢測DCs分化成熟相關指標的變化。結果顯示，加入抑制劑后，TcpC對DCs分化成熟的抑制作用進一步增強，DCs表面標志物的表達水平和抗原呈遞能力進一步降低。這進一步證實了MAPK和NF-κB信號通路在TcpC影響腎臟DCs分化成熟過程中起著重要作用。五、作用機制探討5.1TcpC與MyD88的相互作用5.1.1結合特性研究為深入探究TcpC與MyD88之間的結合特性，本研究運用了免疫共沉淀（Co-IP）和表面等離子共振（SPR）等先進技術。在免疫共沉淀實驗中，從野生型UPEC感染組（分泌TcpC）小鼠的腎臟DCs中提取總蛋白，加入抗TcpC抗體，4℃孵育過夜，使抗體與TcpC充分結合。隨后，加入ProteinA/G磁珠，繼續孵育2-4小時，磁珠會結合抗體-TcpC復合物。通過磁力架分離磁珠，用PBS洗滌磁珠3-5次，去除未結合的雜質。最后，加入適量的SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5分鐘，使蛋白質變性并從磁珠上洗脫下來。將洗脫的蛋白質進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜后，用抗MyD88抗體進行Westernblot檢測。結果顯示，在野生型UPEC感染組小鼠腎臟DCs中，能夠檢測到MyD88與TcpC的結合條帶，而在對照組和tcpc基因敲除UPEC感染組小鼠腎臟DCs中，未檢測到明顯的結合條帶。這一結果明確表明，TcpC能夠與MyD88在腎臟DCs中發生特異性結合。為了進一步定量分析TcpC與MyD88的結合親和力，本研究采用了表面等離子共振技術。將重組TcpC蛋白固定在SPR芯片表面，制備成傳感芯片。然后，將不同濃度的MyD88蛋白溶液以一定流速注入到傳感芯片表面，實時監測TcpC與MyD88之間的相互作用。通過分析SPR傳感器圖譜，計算得到TcpC與MyD88的結合常數（KD）。實驗結果顯示，TcpC與MyD88具有較高的親和力，其結合常數KD達到了10??-10??M級別。這表明TcpC能夠緊密地與MyD88結合，為后續研究TcpC對MyD88的影響奠定了基礎。5.1.2對MyD88泛素化及降解的影響本研究深入分析了TcpC促進MyD88泛素化降解的機制，以及這一過程對腎臟DCs分化成熟的影響。從野生型UPEC感染組（分泌TcpC）、tcpc基因敲除UPEC感染組和對照組小鼠的腎臟DCs中提取總蛋白，運用Westernblot技術檢測MyD88蛋白水平。結果顯示，野生型UPEC感染組小鼠腎臟DCs中MyD88蛋白水平顯著低于對照組和tcpc基因敲除UPEC感染組。為了探究MyD88蛋白水平降低的原因，提取各組小鼠腎臟DCs的總RNA，通過實時定量PCR檢測MyD88mRNA水平。結果表明，各組之間MyD88mRNA水平無明顯差異。這一結果提示，TcpC能夠促進MyD88蛋白的降解，而不影響其mRNA的表達。泛素化是蛋白質降解的重要機制之一，為了驗證TcpC是否通過促進MyD88泛素化來導致其降解，進行了體內泛素化實驗。將野生型UPEC感染組（分泌TcpC）、tcpc基因敲除UPEC感染組和對照組小鼠的腎臟DCs與泛素化抗體共同孵育，然后通過免疫共沉淀實驗檢測MyD88的泛素化水平。結果顯示，野生型UPEC感染組小鼠腎臟DCs中MyD88的泛素化水平顯著高于對照組和tcpc基因敲除UPEC感染組。這充分說明TcpC能夠促進MyD88的泛素化修飾，從而使其更容易被蛋白酶體識別并降解。為了進一步明確TcpC促進MyD88泛素化降解的分子機制，本研究運用免疫共沉淀和質譜分析技術，鑒定與TcpC和MyD88相互作用的E2泛素結合酶。結果發現，UBE2D1能夠與TcpC和MyD88高親和力結合。表面等離子共振和等溫滴定量熱法檢測進一步證實了這一結果。定點突變研究顯示，TcpC中C12和W106是維持其E3泛素化連接酶活性的關鍵位點。突變這兩個位點后，TcpC促進MyD88泛素化降解的能力顯著下降。TcpC促進MyD88泛素化降解對腎臟DCs分化成熟產生了顯著影響。MyD88作為TLR信號通路中的關鍵接頭分子，其降解導致TLR信號通路受阻。如前文所述，TLR信號通路的抑制使得DCs表面共刺激分子和MHC分子的表達下降，抗原呈遞能力減弱，細胞因子分泌失衡，從而抑制了