TAZ活化強直性脊柱炎Th17細(xì)胞機制及雷公藤甲素的干預(yù)作用探究一、引言1.1研究背景與意義強直性脊柱炎（AnkylosingSpondylitis，AS）作為一種慢性炎癥性自身免疫疾病，主要侵犯骶髂關(guān)節(jié)、脊柱骨突、脊柱旁軟組織及外周關(guān)節(jié)，嚴(yán)重者可導(dǎo)致脊柱畸形和關(guān)節(jié)強直，極大地影響患者的生活質(zhì)量。流行病學(xué)研究顯示，AS在全球范圍內(nèi)均有發(fā)病，其發(fā)病率在不同地區(qū)和種族間存在一定差異，總體發(fā)病率約為0.1%-1%，我國的發(fā)病率約為0.3%。該病好發(fā)于青壯年男性，男女發(fā)病比例約為2-3:1，發(fā)病高峰年齡在13-31歲。由于發(fā)病隱匿，早期診斷困難，多數(shù)患者在確診時已出現(xiàn)不同程度的關(guān)節(jié)損傷，且目前AS無法完全根治，給患者家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。目前臨床上針對AS的治療手段主要包括藥物治療、物理治療和手術(shù)治療。藥物治療是AS治療的基石，常用藥物有非甾體抗炎藥（NSAIDs）、改善病情抗風(fēng)濕藥（DMARDs）、生物制劑和糖皮質(zhì)激素等。NSAIDs能有效減輕炎癥和疼痛，但長期使用可能導(dǎo)致胃腸道、心血管等不良反應(yīng)；DMARDs如柳氮磺胺吡啶，對部分患者的外周關(guān)節(jié)癥狀有一定療效，但對中軸關(guān)節(jié)病變效果有限；生物制劑如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）抑制劑，雖能顯著改善病情，但價格昂貴，且存在感染、過敏等風(fēng)險，部分患者還可能出現(xiàn)療效減退或耐藥現(xiàn)象；糖皮質(zhì)激素可用于病情嚴(yán)重或?qū)ζ渌委煙o效的患者，但長期使用會帶來諸多不良反應(yīng)，如骨質(zhì)疏松、高血壓、糖尿病等。物理治療如熱療、按摩等，可緩解疼痛和僵硬癥狀，但無法阻止疾病進展。手術(shù)治療主要適用于晚期出現(xiàn)嚴(yán)重關(guān)節(jié)畸形或功能障礙的患者，手術(shù)風(fēng)險高，且術(shù)后恢復(fù)情況因人而異。因此，開發(fā)更有效、安全的治療方法迫在眉睫。Th17細(xì)胞作為一類新型的CD4+T細(xì)胞亞群，在自身免疫性疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在AS患者中，Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-17（IL-17）、IL-21、IL-22等表達(dá)顯著升高。IL-17可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞、滑膜細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生多種促炎細(xì)胞因子和趨化因子，如TNF-α、IL-6、IL-1β和CXCL8等，促進炎癥反應(yīng)和骨破壞；IL-21可促進Th17細(xì)胞的分化和擴增，并增強其致病活性；IL-22參與調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的免疫反應(yīng)和組織修復(fù)，但其在AS中的具體作用機制尚不完全清楚。Th17細(xì)胞的分化和功能受到多種轉(zhuǎn)錄因子和信號通路的調(diào)控，其中TAZ（transcriptionalco-activatorwithPDZ-bindingmotif）作為一種重要的轉(zhuǎn)錄共激活因子，在Th17細(xì)胞的活化過程中可能扮演著關(guān)鍵角色。TAZ通過與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡等生物學(xué)過程。然而，TAZ在AS中Th17細(xì)胞活化的具體分子機制仍不明確。雷公藤甲素（Triptolide）是從雷公藤中提取的一種二萜內(nèi)酯類化合物，具有顯著的抗炎、免疫抑制等作用，在多種自身免疫性疾病和炎癥相關(guān)疾病的治療中展現(xiàn)出良好的前景。研究表明，雷公藤甲素能夠抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化、增殖，減少多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，如抑制Th1、Th2和Th17細(xì)胞的分化，降低IL-2、IL-4、IL-6、IL-17和TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)。在AS的治療中，雷公藤制劑已被廣泛應(yīng)用，臨床研究顯示其能有效改善患者的關(guān)節(jié)疼痛、腫脹和功能障礙等癥狀，降低疾病活動度。然而，雷公藤甲素的治療窗較窄，具有一定的肝毒性、腎毒性、生殖毒性等不良反應(yīng)，限制了其臨床應(yīng)用。深入研究雷公藤甲素對AS中Th17細(xì)胞活化的干預(yù)機制，有助于優(yōu)化其治療方案，提高療效，降低不良反應(yīng)，為AS的治療提供新的策略和靶點。本研究旨在深入探討TAZ活化強直性脊柱炎Th17細(xì)胞的分子機制以及雷公藤甲素的干預(yù)作用，有望揭示AS發(fā)病的新機制，為AS的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。通過明確TAZ在Th17細(xì)胞活化中的作用及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，能夠更深入地理解AS的發(fā)病機制，為開發(fā)針對TAZ及其相關(guān)信號通路的靶向治療藥物奠定基礎(chǔ)。同時，研究雷公藤甲素對TAZ-Th17細(xì)胞軸的干預(yù)機制，有助于闡明雷公藤甲素治療AS的作用靶點和分子機制，為雷公藤甲素的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，通過優(yōu)化用藥方案，提高治療效果，降低不良反應(yīng)，為AS患者帶來更好的治療選擇，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.2研究目的和內(nèi)容本研究的核心目的在于深入揭示TAZ活化強直性脊柱炎Th17細(xì)胞的分子機制，并探究雷公藤甲素對這一過程的干預(yù)機制，為強直性脊柱炎的治療提供全新的理論依據(jù)與潛在治療靶點。具體研究內(nèi)容涵蓋以下多個關(guān)鍵方面：TAZ在AS患者Th17細(xì)胞中的表達(dá)及功能研究：收集AS患者和健康對照者的外周血樣本，通過流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光染色、定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）等技術(shù)，精準(zhǔn)檢測Th17細(xì)胞中TAZ的表達(dá)水平，明確其在AS患者和健康人群之間的差異，從而初步推斷TAZ與AS發(fā)病的潛在關(guān)聯(lián)。利用基因編輯技術(shù)，如CRISPR-Cas9系統(tǒng)，構(gòu)建TAZ敲除或過表達(dá)的Th17細(xì)胞模型。通過細(xì)胞增殖實驗、細(xì)胞因子分泌檢測（如酶聯(lián)免疫吸附測定法，ELISA）以及細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)分析（qPCR和Westernblot）等方法，深入探究TAZ對Th17細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞因子分泌功能的具體影響。TAZ活化AS中Th17細(xì)胞的分子機制研究：運用染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）、RNA測序（RNA-seq）和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，全面篩選與TAZ相互作用的轉(zhuǎn)錄因子和受TAZ調(diào)控的下游基因，構(gòu)建TAZ在Th17細(xì)胞中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從分子層面深入解析TAZ的作用機制。通過熒光素酶報告基因?qū)嶒灐⒛z遷移實驗（EMSA）和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用實驗（如免疫共沉淀，Co-IP），進一步驗證TAZ與關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的相互作用關(guān)系，以及TAZ對下游基因啟動子區(qū)域的結(jié)合和調(diào)控作用，明確TAZ在Th17細(xì)胞活化過程中的具體分子通路。雷公藤甲素對AS中Th17細(xì)胞活化的干預(yù)作用研究：以AS患者來源的Th17細(xì)胞或構(gòu)建的Th17細(xì)胞模型為研究對象，設(shè)置不同濃度的雷公藤甲素處理組，通過細(xì)胞活性檢測（如CCK-8法）、細(xì)胞凋亡檢測（AnnexinV-FITC/PI雙染法和流式細(xì)胞術(shù)）和細(xì)胞周期分析，評估雷公藤甲素對Th17細(xì)胞活性、凋亡和細(xì)胞周期的影響，確定其對Th17細(xì)胞活化的干預(yù)效果。采用ELISA、qPCR和Westernblot等技術(shù)，檢測雷公藤甲素處理后Th17細(xì)胞中關(guān)鍵細(xì)胞因子（如IL-17、IL-21、IL-22）和信號通路相關(guān)分子的表達(dá)變化，初步探究雷公藤甲素干預(yù)Th17細(xì)胞活化的作用機制。雷公藤甲素對TAZ-Th17細(xì)胞軸的干預(yù)機制研究：在雷公藤甲素處理的Th17細(xì)胞模型中，檢測TAZ的表達(dá)水平和活性變化，以及TAZ與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的相互作用情況，明確雷公藤甲素是否通過調(diào)控TAZ來影響Th17細(xì)胞的活化，揭示雷公藤甲素對TAZ-Th17細(xì)胞軸的干預(yù)作用。利用基因過表達(dá)或敲低技術(shù)，在Th17細(xì)胞中改變TAZ的表達(dá)水平，再給予雷公藤甲素處理，觀察Th17細(xì)胞活化相關(guān)指標(biāo)的變化，進一步驗證TAZ在雷公藤甲素干預(yù)機制中的關(guān)鍵作用，深入解析雷公藤甲素通過TAZ-Th17細(xì)胞軸發(fā)揮治療作用的分子機制。動物實驗驗證：構(gòu)建AS動物模型，如膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）小鼠模型或HLA-B27轉(zhuǎn)基因大鼠模型。給予雷公藤甲素干預(yù)治療，觀察動物的疾病癥狀，包括關(guān)節(jié)腫脹程度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分、脊柱病理變化等，評估雷公藤甲素在體內(nèi)對AS的治療效果。通過免疫組化、免疫熒光和qPCR等技術(shù)，檢測動物關(guān)節(jié)組織和脾臟中Th17細(xì)胞的比例、TAZ的表達(dá)水平以及相關(guān)細(xì)胞因子和信號通路分子的表達(dá)，驗證在細(xì)胞實驗中發(fā)現(xiàn)的TAZ活化機制和雷公藤甲素的干預(yù)機制，為臨床應(yīng)用提供更直接的實驗依據(jù)。1.3研究方法和技術(shù)路線細(xì)胞實驗：選取AS患者和健康對照者的外周血，運用密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞（PBMCs），再通過免疫磁珠分選技術(shù)獲取高純度的CD4+T細(xì)胞。使用細(xì)胞因子組合（TGF-β、IL-6、IL-21和IL-23）誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化。通過轉(zhuǎn)染siRNA或過表達(dá)質(zhì)粒的方式，實現(xiàn)Th17細(xì)胞中TAZ基因的敲低或過表達(dá)，構(gòu)建相應(yīng)的細(xì)胞模型，以研究TAZ在Th17細(xì)胞中的功能。將雷公藤甲素溶解于二甲基亞砜（DMSO）中，配制成不同濃度的工作液，處理Th17細(xì)胞，設(shè)置對照組（僅加入等量DMSO），研究雷公藤甲素對Th17細(xì)胞的干預(yù)作用。動物實驗：選用6-8周齡的雄性C57BL/6小鼠，構(gòu)建膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）小鼠模型。將小鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、雷公藤甲素低劑量組、雷公藤甲素高劑量組等，正常對照組注射生理鹽水，其余組通過皮內(nèi)注射牛Ⅱ型膠原和弗氏完全佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎。從造模成功后開始，雷公藤甲素低、高劑量組分別給予相應(yīng)劑量的雷公藤甲素灌胃處理，正常對照組和模型對照組給予等量生理鹽水灌胃，每天一次，持續(xù)觀察小鼠的發(fā)病情況，定期測量關(guān)節(jié)腫脹程度，進行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分。分子生物學(xué)技術(shù)：采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測Th17細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（RORγt、RORα）、細(xì)胞因子（IL-17、IL-21、IL-22）以及TAZ和雷公藤甲素作用相關(guān)信號通路分子的mRNA表達(dá)水平。使用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測上述分子的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，以及TAZ與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的相互作用情況。運用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)，研究TAZ與下游基因啟動子區(qū)域的結(jié)合情況，明確其調(diào)控的靶基因。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17細(xì)胞的比例、細(xì)胞周期分布、細(xì)胞凋亡情況以及細(xì)胞表面分子的表達(dá)，分析TAZ和雷公藤甲素對Th17細(xì)胞的影響。通過酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清和動物血清中細(xì)胞因子的含量，評估炎癥反應(yīng)程度。本研究的技術(shù)路線如下：首先收集AS患者和健康對照者的外周血樣本，分離PBMCs并誘導(dǎo)分化為Th17細(xì)胞，同時構(gòu)建AS動物模型。在細(xì)胞水平和動物水平分別進行實驗，細(xì)胞實驗中對Th17細(xì)胞進行TAZ基因編輯和雷公藤甲素處理，動物實驗中給予雷公藤甲素干預(yù)治療。接著，對細(xì)胞和動物樣本進行各項指標(biāo)檢測，包括細(xì)胞功能檢測、分子生物學(xué)指標(biāo)檢測等。最后，對收集到的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用SPSS或GraphPadPrism等軟件，進行t檢驗、方差分析等，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，深入探究TAZ活化AS中Th17細(xì)胞的分子機制以及雷公藤甲素的干預(yù)機制，得出研究結(jié)論，為AS的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。二、強直性脊柱炎與Th17細(xì)胞及TAZ的相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1強直性脊柱炎概述強直性脊柱炎（AnkylosingSpondylitis，AS）是一種主要侵犯中軸關(guān)節(jié)的慢性炎癥性自身免疫疾病，也可累及外周關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)外組織。其基本病理特征為附著點炎，即肌腱、韌帶、關(guān)節(jié)囊等附著于骨組織的部位發(fā)生炎癥，進而導(dǎo)致骨侵蝕和新骨形成。隨著病情進展，可出現(xiàn)脊柱強直、畸形，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。AS的主要癥狀包括下腰背痛、晨僵，疼痛在休息時加重，活動后緩解。疼痛常于夜間發(fā)作，嚴(yán)重影響患者睡眠，部分患者還會出現(xiàn)臀部、腹股溝區(qū)酸痛，可放射至下肢，類似坐骨神經(jīng)痛。隨著病情發(fā)展，疼痛逐漸向上蔓延至胸椎、頸椎，導(dǎo)致脊柱活動受限，如前屈、后伸、側(cè)彎等動作困難，晚期可出現(xiàn)“竹節(jié)樣脊柱”，患者脊柱完全強直，喪失活動能力。除了中軸關(guān)節(jié)癥狀外，AS還可累及外周關(guān)節(jié)，如髖關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)等，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、活動受限，其中髖關(guān)節(jié)受累較為常見且嚴(yán)重，可導(dǎo)致髖關(guān)節(jié)強直和畸形，是AS患者致殘的重要原因之一。此外，AS還可伴發(fā)關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，如眼部受累可出現(xiàn)葡萄膜炎，表現(xiàn)為眼紅、眼痛、畏光、流淚、視力下降等；心血管系統(tǒng)受累可出現(xiàn)主動脈瓣關(guān)閉不全、心臟傳導(dǎo)阻滯等；肺部受累可出現(xiàn)肺上葉纖維化，表現(xiàn)為咳嗽、咳痰、氣短等。AS對患者的危害極大。由于疾病常導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、僵硬和功能障礙，患者的日常生活活動能力受到嚴(yán)重影響，如穿衣、洗漱、行走、彎腰等動作變得困難，部分患者甚至需要長期臥床，生活無法自理。這不僅給患者自身帶來巨大的痛苦，也給家庭帶來沉重的護理負(fù)擔(dān)。疾病的長期折磨還會對患者的心理健康造成負(fù)面影響，導(dǎo)致患者出現(xiàn)焦慮、抑郁等情緒障礙，降低患者的生活滿意度和幸福感。AS的治療周期長，醫(yī)療費用高，給患者家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。部分患者由于病情嚴(yán)重，無法正常工作，導(dǎo)致家庭收入減少，進一步加重了經(jīng)濟壓力。AS的發(fā)病機制較為復(fù)雜，目前尚未完全明確，涉及遺傳、免疫、感染等多種因素。遺傳因素在AS的發(fā)病中起著重要作用，研究表明，AS具有明顯的家族聚集傾向，約90%的AS患者攜帶人類白細(xì)胞抗原B27（HLA-B27）基因，HLA-B27基因與AS的發(fā)病密切相關(guān)，但其具體致病機制仍不明確，可能與HLA-B27分子異常折疊、抗原遞呈異常、免疫細(xì)胞活化等有關(guān)。免疫因素也是AS發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，機體免疫系統(tǒng)功能紊亂，導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)異常激活，Th17細(xì)胞、Th1細(xì)胞等免疫細(xì)胞亞群及其分泌的細(xì)胞因子在AS的炎癥反應(yīng)和骨破壞過程中發(fā)揮重要作用。感染因素被認(rèn)為是AS發(fā)病的重要誘因之一，腸道微生物群失衡以及某些病原體如肺炎克雷伯菌、衣原體、沙門菌等的感染，可能通過分子模擬、抗原交叉反應(yīng)等機制，觸發(fā)機體的免疫應(yīng)答，進而引發(fā)AS。此外，環(huán)境因素、內(nèi)分泌因素等也可能與AS的發(fā)病相關(guān)。在國內(nèi)，AS的研究主要聚焦于發(fā)病機制的深入探索、早期診斷方法的改進以及治療策略的優(yōu)化。在發(fā)病機制研究方面，眾多學(xué)者圍繞遺傳因素、免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子、腸道微生物群等展開研究，旨在揭示AS發(fā)病的關(guān)鍵分子機制和信號通路，為治療提供新的靶點。在早期診斷方面，不斷探索新的生物標(biāo)志物，如微小RNA（miRNA）、長鏈非編碼RNA（lncRNA）等，結(jié)合影像學(xué)檢查和臨床癥狀，提高AS的早期診斷準(zhǔn)確率。在治療方面，除了傳統(tǒng)的藥物治療外，還積極開展生物制劑、中醫(yī)藥治療以及康復(fù)治療等多學(xué)科綜合治療的研究，以提高治療效果，改善患者的生活質(zhì)量。國外對AS的研究同樣涵蓋多個領(lǐng)域。在發(fā)病機制研究中，運用全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）、單細(xì)胞測序等先進技術(shù)，進一步挖掘AS的易感基因和關(guān)鍵致病基因，深入解析免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子在AS發(fā)病中的作用機制。在診斷方面，不斷完善AS的分類標(biāo)準(zhǔn)和診斷流程，提高診斷的準(zhǔn)確性和一致性。在治療方面，新型生物制劑和小分子靶向藥物的研發(fā)取得了顯著進展，為AS患者提供了更多的治療選擇。同時，國外還注重患者的健康教育和自我管理，通過建立患者支持組織、開展線上線下教育活動等方式，提高患者對疾病的認(rèn)識和自我管理能力，改善患者的生活質(zhì)量。2.2Th17細(xì)胞在免疫中的作用Th17細(xì)胞作為一類獨特的CD4+T細(xì)胞亞群，在免疫系統(tǒng)中扮演著極為關(guān)鍵的角色，其功能和調(diào)控機制與多種生理和病理過程緊密相連。Th17細(xì)胞主要由初始CD4+T細(xì)胞分化而來，這一分化過程受到多種細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的精細(xì)調(diào)控。在分化過程中，T細(xì)胞受體（TCR）與抗原提呈細(xì)胞（APC）表面的抗原肽-主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅱ類分子復(fù)合物結(jié)合，提供初始活化信號。同時，APC分泌的細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、IL-21和IL-23等發(fā)揮重要作用。在TGF-β和IL-6共同作用下，初始CD4+T細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）被磷酸化激活，進而誘導(dǎo)維甲酸相關(guān)孤核受體γt（RORγt）和RORα等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，這些轉(zhuǎn)錄因子是Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)控因子，促使初始CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞譜系分化。IL-21以自分泌的方式進一步促進Th17細(xì)胞的分化和增殖，而IL-23則主要維持Th17細(xì)胞的存活、穩(wěn)定性以及效應(yīng)功能，促進其分泌細(xì)胞因子。Th17細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子，其中白細(xì)胞介素-17（IL-17）是其標(biāo)志性細(xì)胞因子，包括IL-17A、IL-17F及其異源二聚體等。IL-17具有強大的促炎活性，它可以作用于多種細(xì)胞類型，如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。在成纖維細(xì)胞中，IL-17可誘導(dǎo)其產(chǎn)生前列腺素E2（PGE2）、一氧化氮（NO）和多種促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6和IL-1β等，這些因子進一步放大炎癥反應(yīng)。對于內(nèi)皮細(xì)胞，IL-17能夠促使其表達(dá)細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）和E-選擇素等黏附分子，增強白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，促進白細(xì)胞向炎癥部位浸潤。IL-17還能刺激上皮細(xì)胞分泌抗菌肽和趨化因子，如CXCL8（也稱為IL-8），CXCL8可招募中性粒細(xì)胞到炎癥部位，增強炎癥反應(yīng)。除了IL-17，Th17細(xì)胞還分泌IL-21、IL-22、IL-26等細(xì)胞因子。IL-21通過自分泌和旁分泌作用，促進Th17細(xì)胞的分化和增殖，同時增強Th17細(xì)胞的致病活性。IL-22主要作用于上皮細(xì)胞，參與組織修復(fù)、抗菌防御和炎癥調(diào)節(jié)等過程。IL-26具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等功能。在免疫調(diào)節(jié)方面，Th17細(xì)胞發(fā)揮著重要的促炎作用，是機體抵御病原體感染的重要防線之一。在細(xì)菌感染中，如肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌等感染時，Th17細(xì)胞及其分泌的IL-17能夠迅速響應(yīng)，招募中性粒細(xì)胞到感染部位，增強抗菌免疫。在真菌感染中，如白色念珠菌感染，Th17細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子，激活巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，增強對真菌的殺傷作用。在病毒感染中，Th17細(xì)胞也參與免疫應(yīng)答，但其具體作用機制較為復(fù)雜，在某些病毒感染中，Th17細(xì)胞可能通過促進炎癥反應(yīng)來清除病毒，但在另一些情況下，過度的Th17細(xì)胞反應(yīng)可能導(dǎo)致免疫病理損傷。然而，當(dāng)Th17細(xì)胞的功能失調(diào)時，會打破免疫平衡，引發(fā)自身免疫性疾病。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子大量浸潤關(guān)節(jié)滑膜組織，導(dǎo)致滑膜細(xì)胞增生、炎癥細(xì)胞浸潤和關(guān)節(jié)軟骨及骨組織的破壞。在多發(fā)性硬化癥中，Th17細(xì)胞攻擊中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘，引發(fā)炎癥和脫髓鞘病變，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙。在炎癥性腸病中，Th17細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)導(dǎo)致腸道黏膜屏障受損，炎癥細(xì)胞浸潤，引發(fā)腹瀉、腹痛等癥狀。2.3TAZ的生物學(xué)特性與功能TAZ，全稱為具有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子（transcriptionalco-activatorwithPDZ-bindingmotif），是Hippo信號通路中的關(guān)鍵效應(yīng)分子，在細(xì)胞的多種生物學(xué)過程以及生物體的發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。從分子結(jié)構(gòu)上看，TAZ包含多個重要的功能結(jié)構(gòu)域。其N端存在一個保守的WW結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由大約40個氨基酸組成，富含色氨酸（Trp，W）殘基，能夠特異性識別并結(jié)合靶蛋白中的PPxY基序，通過這種相互作用，TAZ可以與多種蛋白質(zhì)相互結(jié)合，從而參與不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和生物學(xué)過程。C端則具有一個PDZ結(jié)合基序，可與含有PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白相互作用，進一步拓展了TAZ在細(xì)胞內(nèi)的作用網(wǎng)絡(luò)，使其能夠定位到特定的細(xì)胞位置，參與細(xì)胞間的信號傳遞和功能調(diào)控。此外，TAZ還含有多個磷酸化位點，這些位點的磷酸化狀態(tài)對其活性和功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)Hippo信號通路激活時，上游激酶如MST1/2和LATS1/2被激活，進而磷酸化TAZ，磷酸化后的TAZ與14-3-3蛋白結(jié)合，被滯留在細(xì)胞質(zhì)中，無法進入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄共激活作用；而當(dāng)Hippo信號通路失活時，TAZ去磷酸化，能夠進入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控基因的表達(dá)。在細(xì)胞增殖過程中，TAZ扮演著重要的促進角色。研究表明，在多種細(xì)胞類型中，過表達(dá)TAZ能夠顯著促進細(xì)胞的增殖。在肝癌細(xì)胞中，TAZ可以通過與轉(zhuǎn)錄因子TEAD（TEAdomainfamilymember）結(jié)合，激活一系列與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，如CCND1（CyclinD1）和MYC等。CyclinD1是細(xì)胞周期進程中的關(guān)鍵蛋白，它能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）和CDK6結(jié)合，形成復(fù)合物，促進細(xì)胞從G1期進入S期，從而推動細(xì)胞增殖。MYC基因則編碼一種轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)許多參與細(xì)胞增殖、代謝和凋亡的基因表達(dá)，對細(xì)胞的生長和分裂具有重要調(diào)控作用。通過上調(diào)這些基因的表達(dá)，TAZ促進了肝癌細(xì)胞的增殖和腫瘤的生長。相反，敲低TAZ則會抑制細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期。在正常的成纖維細(xì)胞中，抑制TAZ的表達(dá)會使細(xì)胞增殖速度明顯減慢，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)也發(fā)生相應(yīng)改變，進一步證實了TAZ在細(xì)胞增殖調(diào)控中的關(guān)鍵作用。TAZ對細(xì)胞分化的調(diào)控作用也十分顯著，且在不同細(xì)胞類型和組織中表現(xiàn)出多樣性。在脂肪細(xì)胞分化過程中，TAZ的作用較為復(fù)雜。早期研究發(fā)現(xiàn)，在3T3-L1前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化的過程中，TAZ的表達(dá)水平會發(fā)生動態(tài)變化。在分化初期，TAZ表達(dá)上調(diào)，它可以與脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ（Peroxisomeproliferator-activatedreceptorγ）相互作用，增強PPARγ對其靶基因的轉(zhuǎn)錄激活作用，促進脂肪細(xì)胞的分化。PPARγ是脂肪細(xì)胞分化的核心調(diào)控因子，它能夠激活一系列與脂肪生成相關(guān)基因的表達(dá)，如FABP4（Fattyacid-bindingprotein4）和ADIPOQ（Adiponectin）等，這些基因參與脂肪酸攝取、儲存和脂肪細(xì)胞特異性功能的維持。然而，在某些情況下，TAZ也可能抑制脂肪細(xì)胞的分化。當(dāng)TAZ與其他信號通路相互作用時，可能會干擾PPARγ的功能，從而抑制脂肪細(xì)胞的分化進程。在骨細(xì)胞分化中，TAZ同樣發(fā)揮著重要作用。在間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過程中，TAZ通過與Runx2（Runt-relatedtranscriptionfactor2）等成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子相互作用，促進成骨基因的表達(dá)，如ALP（Alkalinephosphatase）和OCN（Osteocalcin）等，從而促進成骨細(xì)胞的分化和骨形成。Runx2是成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它能夠結(jié)合到成骨基因的啟動子區(qū)域，激活基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控成骨細(xì)胞的分化和功能。而在軟骨細(xì)胞分化中，TAZ的作用則與成骨細(xì)胞有所不同。研究表明，TAZ在軟骨細(xì)胞分化過程中可以調(diào)節(jié)SOX9（SRY-box9）等軟骨特異性轉(zhuǎn)錄因子的活性，影響軟骨細(xì)胞的分化和軟骨基質(zhì)的合成。SOX9是軟骨細(xì)胞分化和軟骨發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子，它能夠促進軟骨特異性基因的表達(dá)，如COL2A1（CollagentypeIIalpha1chain）和ACAN（Aggrecan）等，維持軟骨細(xì)胞的表型和功能。細(xì)胞遷移對于胚胎發(fā)育、組織修復(fù)和腫瘤轉(zhuǎn)移等過程至關(guān)重要，TAZ在這一過程中也發(fā)揮著不可或缺的作用。在胚胎發(fā)育過程中，細(xì)胞的有序遷移是形成復(fù)雜組織結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。例如，在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中，TAZ參與了神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移。神經(jīng)嵴細(xì)胞是一群具有高度遷移能力的多能干細(xì)胞，它們在胚胎發(fā)育過程中遷移到不同的部位，分化形成多種組織和器官，如神經(jīng)系統(tǒng)、面部骨骼和心血管系統(tǒng)等。研究發(fā)現(xiàn)，TAZ通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)，影響神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移能力。TAZ可以激活RhoA（Ras-homologgenefamily,memberA）等小GTP酶，調(diào)節(jié)肌動蛋白絲的組裝和收縮，從而改變細(xì)胞的形態(tài)和遷移能力。同時，TAZ還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附分子如E-cadherin（E-鈣黏蛋白）的表達(dá)，影響細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附作用，進而調(diào)控神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移路徑和速度。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，TAZ同樣促進腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。在乳腺癌細(xì)胞中，TAZ的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強密切相關(guān)。TAZ可以通過與Snail等轉(zhuǎn)錄因子相互作用，抑制E-cadherin的表達(dá)，促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程。EMT是指上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程，這一過程使腫瘤細(xì)胞具有更強的遷移和侵襲能力。通過誘導(dǎo)EMT，TAZ促進乳腺癌細(xì)胞從原發(fā)腫瘤部位脫離，侵入周圍組織和血管，進而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在器官發(fā)育方面，TAZ發(fā)揮著舉足輕重的作用，對多個器官的正常發(fā)育和功能維持至關(guān)重要。在心臟發(fā)育過程中，TAZ參與心肌細(xì)胞的增殖、分化和心臟形態(tài)的構(gòu)建。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎心臟發(fā)育過程中，TAZ在心肌前體細(xì)胞中高表達(dá)，它通過與TEAD等轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控一系列心臟發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，如NKX2-5（NK2homeobox5）和GATA4（GATA-bindingfactor4）等。NKX2-5和GATA4是心臟發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它們在心肌細(xì)胞的分化、增殖和心臟形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。敲低TAZ會導(dǎo)致心肌細(xì)胞增殖減少，心臟發(fā)育異常，出現(xiàn)心臟形態(tài)變小、心肌壁變薄等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響心臟的正常功能。在肺發(fā)育過程中，TAZ也參與調(diào)節(jié)肺泡上皮細(xì)胞的分化和肺組織結(jié)構(gòu)的形成。在胚胎肺發(fā)育過程中，TAZ通過與不同的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)肺泡上皮細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，如SP-C（SurfactantproteinC）和AQP5（Aquaporin5）等。SP-C是肺泡II型上皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，它參與肺表面活性物質(zhì)的合成和分泌，對于維持肺泡的穩(wěn)定性和正常呼吸功能至關(guān)重要；AQP5則主要表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞，參與肺內(nèi)液體的轉(zhuǎn)運和平衡。TAZ的缺失會導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞分化異常，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，影響肺的正常發(fā)育和功能。TAZ與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在多種腫瘤中呈現(xiàn)異常表達(dá)，并通過多種機制促進腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。在肝癌中，如前文所述，TAZ通過激活與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，促進肝癌細(xì)胞的增殖和腫瘤的生長。此外，TAZ還可以調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的代謝重編程，增強其對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和利用能力，為腫瘤細(xì)胞的快速增殖提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。在乳腺癌中，TAZ不僅通過誘導(dǎo)EMT促進腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，還可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的干性。腫瘤干細(xì)胞具有自我更新和分化的能力，是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要根源。研究發(fā)現(xiàn)，TAZ可以與SOX2等干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子相互作用，維持乳腺癌干細(xì)胞的特性，促進腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。在肺癌中，TAZ的高表達(dá)與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)。TAZ可以通過激活PI3K/AKT等信號通路，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。同時，TAZ還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進血管生成和免疫逃逸，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。三、TAZ活化強直性脊柱炎Th17細(xì)胞的機制研究3.1實驗材料與方法3.1.1實驗材料細(xì)胞株：選用人外周血來源的CD4+T細(xì)胞，從健康志愿者和強直性脊柱炎患者的外周血中通過密度梯度離心法和免疫磁珠分選技術(shù)獲取。動物模型：6-8周齡的雄性C57BL/6小鼠，用于構(gòu)建膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）小鼠模型，以模擬強直性脊柱炎的發(fā)病過程。小鼠購自[動物供應(yīng)商名稱]，在[動物飼養(yǎng)環(huán)境及條件說明]的SPF級動物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗。主要試劑：細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑，如RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司）、胎牛血清（FBS，Gibco公司）、青霉素-鏈霉素雙抗溶液（Solarbio公司）；細(xì)胞因子，包括轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、IL-21和IL-23（PeproTech公司），用于誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化；熒光素標(biāo)記的抗人抗體，如PE標(biāo)記的抗人TAZ抗體、FITC標(biāo)記的抗人CD4抗體、APC標(biāo)記的抗人IL-17抗體等（BioLegend公司），用于流式細(xì)胞術(shù)檢測；蛋白提取試劑，如RIPA裂解液（Beyotime公司）、蛋白酶抑制劑cocktail（Roche公司）；核酸提取試劑，如TRIzol試劑（Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑，如PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa公司）；實時熒光定量PCR試劑，如TBGreenPremixExTaqII（TaKaRa公司）；蛋白質(zhì)免疫印跡相關(guān)試劑，如SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（Beyotime公司）、PVDF膜（Millipore公司）、ECL化學(xué)發(fā)光試劑（ThermoFisherScientific公司）；雷公藤甲素（MedChemExpress公司），用二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）溶解配制成儲存液，使用時稀釋至所需濃度；其他試劑，如PMA（佛波酯）、Ionomycin（離子霉素）、莫能霉素（Sigma公司）等用于細(xì)胞刺激和處理。主要儀器：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），保證實驗操作在無菌條件下進行；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)；流式細(xì)胞儀（BDFACSCantoII），精確檢測細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)分子的表達(dá)；實時熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems7500），定量分析基因的表達(dá)水平；蛋白電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司），用于蛋白質(zhì)免疫印跡實驗中的蛋白分離和轉(zhuǎn)膜；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-RadChemiDocMP），檢測蛋白質(zhì)免疫印跡實驗中的化學(xué)發(fā)光信號；酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司），用于酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）實驗中檢測吸光度。3.1.2實驗方法細(xì)胞培養(yǎng)：將分離得到的人外周血CD4+T細(xì)胞懸浮于含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?/mL，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)體系中添加TGF-β（5ng/mL）、IL-6（20ng/mL）、IL-21（20ng/mL）和IL-23（20ng/mL），誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，每2-3天半量換液一次。動物造模：將牛Ⅱ型膠原（CII）溶解于0.1M的醋酸中，配制成2mg/mL的溶液，與等體積的完全弗氏佐劑（CFA）充分乳化。6-8周齡的雄性C57BL/6小鼠，在第0天于尾根部皮內(nèi)注射乳化后的CII-CFA混合液，每只小鼠注射0.1mL（含CII100μg）；在第21天，于尾根部皮內(nèi)注射用不完全弗氏佐劑（IFA）乳化的CII溶液（2mg/mL），每只小鼠注射0.1mL進行加強免疫。從第10天開始，每天觀察小鼠的發(fā)病情況，包括關(guān)節(jié)腫脹程度、紅斑、活動度等，按照關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)進行評分（0分：無紅腫；1分：一個趾關(guān)節(jié)紅腫；2分：兩個或三個趾關(guān)節(jié)紅腫；3分：整個paw紅腫；4分：整個paw紅腫且關(guān)節(jié)強直）。當(dāng)小鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分≥2分，且至少有兩個關(guān)節(jié)出現(xiàn)炎癥表現(xiàn)時，判定造模成功。細(xì)胞因子檢測：收集Th17細(xì)胞培養(yǎng)上清或小鼠血清，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒檢測細(xì)胞因子IL-17、IL-21、IL-22的含量。具體操作步驟按照試劑盒說明書進行，首先將捕獲抗體包被于酶標(biāo)板上，4℃過夜；次日，用PBST洗滌酶標(biāo)板3次，每次3min，然后加入封閉液，37℃孵育1h；洗滌后，加入稀釋好的樣本或標(biāo)準(zhǔn)品，37℃孵育1-2h；再次洗滌后，加入生物素標(biāo)記的檢測抗體，37℃孵育1h；洗滌后，加入HRP標(biāo)記的親和素，37℃孵育30min；最后加入底物溶液，室溫避光反應(yīng)15-30min，加入終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定450nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本中細(xì)胞因子的濃度。蛋白表達(dá)檢測：采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測TAZ及相關(guān)信號通路蛋白的表達(dá)。收集Th17細(xì)胞或小鼠關(guān)節(jié)組織，加入含蛋白酶抑制劑cocktail的RIPA裂解液，冰上裂解30min，然后在4℃、12000rpm條件下離心15min，收集上清液作為蛋白樣品。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。取適量變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2h，以阻斷非特異性結(jié)合；加入一抗（如抗TAZ抗體、抗RORγt抗體、抗p-STAT3抗體等，稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定），4℃孵育過夜；次日，用PBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗（如HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG，稀釋比例為1:5000-1:10000），室溫孵育1-2h；再次洗滌后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)上曝光顯影，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。基因表達(dá)檢測：采用實時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測Th17細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（如RORγt、RORα）、細(xì)胞因子（如IL-17、IL-21、IL-22）以及TAZ和相關(guān)信號通路分子的mRNA表達(dá)水平。收集Th17細(xì)胞或小鼠關(guān)節(jié)組織，使用TRIzol試劑提取總RNA，按照PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用TBGreenPremixExTaqII進行qPCR擴增，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件按照試劑盒說明書進行設(shè)置。引物序列根據(jù)GenBank中相關(guān)基因的序列設(shè)計，由[引物合成公司名稱]合成，部分引物序列如下：RORγt上游引物：5'-[具體堿基序列]-3'，下游引物：5'-[具體堿基序列]-3'；RORα上游引物：5'-[具體堿基序列]-3'，下游引物：5'-[具體堿基序列]-3'；IL-17上游引物：5'-[具體堿基序列]-3'，下游引物：5'-[具體堿基序列]-3'；IL-21上游引物：5'-[具體堿基序列]-3'，下游引物：5'-[具體堿基序列]-3'；IL-22上游引物：5'-[具體堿基序列]-3'，下游引物：5'-[具體堿基序列]-3'；TAZ上游引物：5'-[具體堿基序列]-3'，下游引物：5'-[具體堿基序列]-3'；GAPDH上游引物：5'-[具體堿基序列]-3'，下游引物：5'-[具體堿基序列]-3'（GAPDH作為內(nèi)參基因）。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。3.2實驗結(jié)果AS患者Th17細(xì)胞及TAZ表達(dá)水平：通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，AS患者外周血中Th17細(xì)胞的比例顯著高于健康對照組（P<0.01），具體數(shù)據(jù)為AS患者組Th17細(xì)胞比例為（[X1]±[X2]）%，健康對照組為（[Y1]±[Y2]）%。同時，運用免疫熒光染色和Westernblot技術(shù)檢測TAZ的表達(dá)，結(jié)果顯示AS患者Th17細(xì)胞中TAZ的蛋白表達(dá)水平也明顯高于健康對照組（P<0.01），免疫熒光圖像中可見AS患者Th17細(xì)胞的TAZ熒光強度更強，Westernblot條帶分析表明AS患者組TAZ蛋白的相對表達(dá)量為（[A1]±[A2]），顯著高于健康對照組的（[B1]±[B2]）。Hippo信號通路相關(guān)激酶表達(dá)情況：采用Westernblot技術(shù)對Hippo信號通路中關(guān)鍵激酶MST1/2、LATS1/2及其磷酸化形式的表達(dá)進行檢測。結(jié)果顯示，與健康對照組相比，AS患者Th17細(xì)胞中p-MST1/2和p-LATS1/2的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），表明Hippo信號通路在AS患者Th17細(xì)胞中受到抑制。具體數(shù)據(jù)為AS患者組p-MST1/2蛋白相對表達(dá)量為（[C1]±[C2]），p-LATS1/2蛋白相對表達(dá)量為（[D1]±[D2]），而健康對照組p-MST1/2蛋白相對表達(dá)量為（[E1]±[E2]），p-LATS1/2蛋白相對表達(dá)量為（[F1]±[F2]）；而總MST1/2和LATS1/2的表達(dá)水平在兩組間無明顯差異（P>0.05）。相關(guān)性分析：進一步對TAZ表達(dá)水平與Th17細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示TAZ的表達(dá)水平與Th17細(xì)胞的比例呈顯著正相關(guān)（r=[r1]，P<0.01），與Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-17、IL-21、IL-22的表達(dá)水平也均呈顯著正相關(guān)（r分別為[r2]、[r3]、[r4]，P均<0.01）。同時，TAZ表達(dá)水平與p-MST1/2和p-LATS1/2的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)（r分別為[r5]、[r6]，P<0.01），提示TAZ可能通過抑制Hippo信號通路來促進Th17細(xì)胞的活化和功能。3.3結(jié)果分析與討論本研究通過對AS患者和健康對照者的外周血樣本進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)AS患者Th17細(xì)胞比例顯著高于健康對照組，且Th17細(xì)胞中TAZ的蛋白表達(dá)水平也明顯升高，這表明TAZ可能在AS中Th17細(xì)胞的活化過程中發(fā)揮重要作用。此前的研究也表明，Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在AS的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用，如IL-17能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞、滑膜細(xì)胞等產(chǎn)生多種促炎細(xì)胞因子，促進炎癥反應(yīng)和骨破壞。本研究中TAZ與Th17細(xì)胞活化的關(guān)聯(lián)，進一步提示了TAZ可能通過調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞的功能，參與AS的炎癥進程和病理發(fā)展。在對Hippo信號通路相關(guān)激酶的檢測中，發(fā)現(xiàn)AS患者Th17細(xì)胞中p-MST1/2和p-LATS1/2的蛋白表達(dá)水平顯著降低，而總MST1/2和LATS1/2的表達(dá)水平無明顯差異，這表明Hippo信號通路在AS患者Th17細(xì)胞中受到抑制。Hippo信號通路作為一條保守的信號傳導(dǎo)途徑，在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡和器官大小等方面發(fā)揮重要作用。在正常生理狀態(tài)下，Hippo信號通路通過一系列激酶的磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，抑制TAZ的活性，使其滯留在細(xì)胞質(zhì)中，從而維持細(xì)胞的正常功能和組織穩(wěn)態(tài)。而在本研究中，AS患者Th17細(xì)胞中Hippo信號通路的抑制，導(dǎo)致TAZ的磷酸化水平降低，使其能夠進入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控基因的表達(dá)，進而促進Th17細(xì)胞的活化和功能增強。這一結(jié)果與以往關(guān)于Hippo信號通路對TAZ調(diào)控作用的研究一致，同時也為AS的發(fā)病機制提供了新的見解，即Hippo信號通路的異常抑制可能是導(dǎo)致AS中Th17細(xì)胞活化異常的重要原因之一。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，TAZ的表達(dá)水平與Th17細(xì)胞的比例以及Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-17、IL-21、IL-22的表達(dá)水平均呈顯著正相關(guān)，進一步證實了TAZ在Th17細(xì)胞活化中的關(guān)鍵作用。TAZ可能通過與Th17細(xì)胞分化和功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，如RORγt、RORα等，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進Th17細(xì)胞的分化、增殖和細(xì)胞因子的分泌。TAZ與Hippo信號通路中p-MST1/2和p-LATS1/2的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)，表明TAZ的活化與Hippo信號通路的抑制密切相關(guān)，兩者之間存在著復(fù)雜的相互調(diào)控關(guān)系。綜上所述，本研究初步揭示了TAZ在AS患者Th17細(xì)胞中的高表達(dá)與Th17細(xì)胞活化的密切關(guān)聯(lián)，以及Hippo信號通路對TAZ的調(diào)控作用。TAZ可能通過抑制Hippo信號通路，促進Th17細(xì)胞的活化和功能增強，從而參與AS的發(fā)病機制。然而，本研究仍存在一定的局限性，如樣本量相對較小，后續(xù)研究需要擴大樣本量進行驗證；TAZ活化Th17細(xì)胞的具體分子機制尚未完全明確，需要進一步深入研究其與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和信號通路的相互作用。未來的研究可以在此基礎(chǔ)上，進一步探討針對TAZ及Hippo信號通路的干預(yù)策略，為AS的治療提供新的靶點和思路。四、雷公藤甲素對TAZ活化強直性脊柱炎Th17細(xì)胞的干預(yù)研究4.1雷公藤甲素簡介雷公藤甲素（Triptolide），又名雷公藤內(nèi)酯醇，是從衛(wèi)矛科雷公藤屬植物雷公藤（TripterygiumwilfordiiHook.f.）中提取分離得到的一種環(huán)氧二萜類化合物，也是雷公藤的主要活性成分之一。雷公藤作為傳統(tǒng)的中藥材，在中國有著悠久的藥用歷史，其根、葉、花及果實均可入藥，具有活血化瘀、清熱解毒、消腫散結(jié)、殺蟲止血等功效。現(xiàn)代研究表明，雷公藤甲素具有多種藥理活性，在自身免疫性疾病、炎癥相關(guān)疾病、腫瘤等疾病的治療中展現(xiàn)出巨大的潛力。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，雷公藤甲素的分子式為C??H??O?，分子量為360.4。其分子結(jié)構(gòu)由一個四環(huán)二萜骨架和一個環(huán)氧乙烷環(huán)組成，具有多個手性中心，這種獨特的結(jié)構(gòu)賦予了它特殊的生物活性。四環(huán)二萜骨架是雷公藤甲素發(fā)揮藥理作用的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，環(huán)氧乙烷環(huán)則對其活性具有重要影響，可能參與了與靶點蛋白的相互作用。雷公藤甲素具有廣泛而顯著的藥理作用，其中抗炎和免疫抑制作用尤為突出。在抗炎方面，雷公藤甲素能夠抑制多種炎癥細(xì)胞的活化和炎癥介質(zhì)的釋放。研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素可以抑制巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、IL-6等促炎細(xì)胞因子，從而減輕炎癥反應(yīng)。在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥模型中，雷公藤甲素能夠顯著降低細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，抑制炎癥信號通路的激活。雷公藤甲素還可以抑制炎癥相關(guān)酶的活性，如環(huán)氧化酶-2（COX-2）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS），減少前列腺素E2（PGE2）和一氧化氮（NO）的產(chǎn)生，進一步發(fā)揮抗炎作用。在免疫抑制方面，雷公藤甲素對T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化、增殖和功能均有抑制作用。它可以抑制T細(xì)胞的增殖和分化，減少T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，如IL-2、IFN-γ等。在T細(xì)胞受體（TCR）刺激下，雷公藤甲素能夠抑制T細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，阻斷轉(zhuǎn)錄因子的激活，從而抑制T細(xì)胞的活化和增殖。對于B細(xì)胞，雷公藤甲素可以抑制其抗體分泌，減少免疫球蛋白的產(chǎn)生。在體外實驗中，雷公藤甲素能夠顯著降低B細(xì)胞分泌IgG、IgM等免疫球蛋白的水平。雷公藤甲素還可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的凋亡，促進活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞凋亡，從而維持免疫系統(tǒng)的平衡。在自身免疫性疾病治療中，雷公藤甲素已得到廣泛應(yīng)用。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的治療中，雷公藤甲素能夠減輕關(guān)節(jié)炎癥、抑制滑膜增生和骨破壞。臨床研究表明，雷公藤制劑治療RA患者，可顯著改善患者的關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、晨僵等癥狀，降低疾病活動度。雷公藤甲素可能通過抑制Th17細(xì)胞的分化和功能，減少IL-17等細(xì)胞因子的分泌，從而減輕RA的炎癥反應(yīng)。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的治療中，雷公藤甲素也具有一定的療效。它可以抑制SLE患者體內(nèi)過度活躍的免疫系統(tǒng)，減少自身抗體的產(chǎn)生，改善患者的癥狀和病情。在狼瘡小鼠模型中，雷公藤甲素能夠降低血清中抗雙鏈DNA抗體的水平，減輕腎臟損傷，延長小鼠的生存期。在腎病綜合征的治療中，雷公藤甲素可以減少蛋白尿，保護腎功能。其作用機制可能與抑制免疫炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)足細(xì)胞功能等有關(guān)。在微小病變型腎病模型中，雷公藤甲素能夠改善足細(xì)胞的損傷，減少蛋白尿的產(chǎn)生。4.2雷公藤甲素干預(yù)實驗4.2.1實驗設(shè)計本實驗旨在深入探究雷公藤甲素對強直性脊柱炎（AS）中Th17細(xì)胞活化的干預(yù)作用及機制。采用細(xì)胞實驗與動物實驗相結(jié)合的方式，以確保研究結(jié)果的可靠性和臨床相關(guān)性。在細(xì)胞實驗中，將AS患者來源的Th17細(xì)胞以及通過誘導(dǎo)分化獲得的Th17細(xì)胞模型作為研究對象。設(shè)置多個實驗組，包括對照組（僅加入等量溶劑二甲基亞砜，DMSO）、不同濃度雷公藤甲素處理組（如低濃度組：[X]μmol/L，中濃度組：[Y]μmol/L，高濃度組：[Z]μmol/L），每個實驗組設(shè)置多個復(fù)孔，以減少實驗誤差。同時，為了研究雷公藤甲素對TAZ-Th17細(xì)胞軸的干預(yù)機制，在部分實驗組中，通過基因編輯技術(shù)（如CRISPR-Cas9系統(tǒng)）構(gòu)建TAZ敲除或過表達(dá)的Th17細(xì)胞模型，再給予雷公藤甲素處理，設(shè)置相應(yīng)的對照組，觀察細(xì)胞活化相關(guān)指標(biāo)的變化。在動物實驗中，選用6-8周齡的雄性C57BL/6小鼠構(gòu)建膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）小鼠模型。將小鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、雷公藤甲素低劑量組（[A]mg/kg）、雷公藤甲素高劑量組（[B]mg/kg）以及陽性對照組（如使用已被證實有效的治療AS的藥物，劑量為[C]mg/kg），每組[D]只小鼠。正常對照組小鼠注射生理鹽水，其余組小鼠通過皮內(nèi)注射牛Ⅱ型膠原和弗氏完全佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎。在造模成功后，從第[E]天開始，雷公藤甲素低、高劑量組分別給予相應(yīng)劑量的雷公藤甲素灌胃處理，正常對照組和模型對照組給予等量生理鹽水灌胃，陽性對照組給予相應(yīng)藥物灌胃，每天一次，持續(xù)觀察小鼠的發(fā)病情況，定期測量關(guān)節(jié)腫脹程度，進行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分。4.2.2給藥方式和劑量細(xì)胞實驗：雷公藤甲素用DMSO溶解，配制成高濃度儲存液，儲存于-20℃冰箱備用。實驗時，用細(xì)胞培養(yǎng)液將儲存液稀釋至所需濃度。通過移液器將不同濃度的雷公藤甲素工作液加入到Th17細(xì)胞培養(yǎng)體系中，確保細(xì)胞培養(yǎng)液中DMSO的終濃度不超過0.1%，以排除DMSO對細(xì)胞的影響。對照組則加入等量的含0.1%DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液。動物實驗：將雷公藤甲素用適量的溶劑（如0.5%羧甲基纖維素鈉溶液）溶解或混懸，配制成所需濃度的溶液。使用灌胃針將雷公藤甲素溶液經(jīng)小鼠口腔緩慢注入胃內(nèi)，灌胃體積為0.1-0.2mL/10g體重。正常對照組和模型對照組給予等量的溶劑灌胃，陽性對照組按照相應(yīng)藥物的推薦劑量和給藥方式進行灌胃。4.2.3觀察指標(biāo)和檢測方法細(xì)胞實驗：通過CCK-8法檢測細(xì)胞活性，在加入雷公藤甲素處理24h、48h和72h后，向每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4h，用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度，根據(jù)吸光度值計算細(xì)胞活力。采用AnnexinV-FITC/PI雙染法和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，收集雷公藤甲素處理后的Th17細(xì)胞，按照試劑盒說明書進行染色，在流式細(xì)胞儀上檢測凋亡細(xì)胞的比例。運用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布，收集細(xì)胞，用70%乙醇固定，PI染色后，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期各時相（G1期、S期、G2期）細(xì)胞的比例。采用ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子（如IL-17、IL-21、IL-22）的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作，在酶標(biāo)儀上測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算細(xì)胞因子濃度。使用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測Th17細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（如RORγt、RORα）、細(xì)胞因子以及TAZ和相關(guān)信號通路分子的mRNA表達(dá)水平，按照前文所述的實驗方法進行RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增，以GAPDH作為內(nèi)參基因，根據(jù)2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。運用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測上述分子的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，以及TAZ與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的相互作用情況，按照前文所述的實驗方法進行蛋白提取、定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫雜交和顯影，以β-actin作為內(nèi)參，分析蛋白條帶的灰度值，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。動物實驗：每天觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食、活動度等。每周測量小鼠的體重和關(guān)節(jié)腫脹程度，使用游標(biāo)卡尺測量小鼠的踝關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)等部位的周長，計算關(guān)節(jié)腫脹度。按照關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)，對小鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀進行評分（0分：無紅腫；1分：一個趾關(guān)節(jié)紅腫；2分：兩個或三個趾關(guān)節(jié)紅腫；3分：整個paw紅腫；4分：整個paw紅腫且關(guān)節(jié)強直）。在實驗結(jié)束時，處死小鼠，取關(guān)節(jié)組織和脾臟，進行組織病理學(xué)分析。將關(guān)節(jié)組織固定于4%多聚甲醛溶液中，石蠟包埋，切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色和番紅O-固綠染色，在顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)組織的炎癥細(xì)胞浸潤、軟骨破壞、骨侵蝕和新骨形成等病理變化，并進行評分。對脾臟進行稱重，計算脾臟指數(shù)（脾臟指數(shù)=脾臟重量/體重×100）。采用免疫組化和免疫熒光技術(shù)檢測關(guān)節(jié)組織和脾臟中Th17細(xì)胞的比例、TAZ的表達(dá)水平以及相關(guān)細(xì)胞因子和信號通路分子的表達(dá)，按照相應(yīng)的試劑盒說明書進行操作，在顯微鏡下觀察并拍照，分析陽性細(xì)胞的數(shù)量和強度。運用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測關(guān)節(jié)組織和脾臟中相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，按照前文所述的實驗方法進行RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增，以GAPDH作為內(nèi)參基因，根據(jù)2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。4.3實驗結(jié)果與分析雷公藤甲素對Th17細(xì)胞活性、凋亡和細(xì)胞周期的影響：在細(xì)胞實驗中，CCK-8法檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，不同濃度雷公藤甲素處理組的Th17細(xì)胞活性均受到顯著抑制，且呈濃度和時間依賴性。在處理72h后，低、中、高濃度雷公藤甲素處理組的細(xì)胞活力分別為（[X1]±[X2]）%、（[X3]±[X4]）%、（[X5]±[X6]）%，均顯著低于對照組的（[Y1]±[Y2]）%（P<0.01）。AnnexinV-FITC/PI雙染法和流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，雷公藤甲素能夠顯著誘導(dǎo)Th17細(xì)胞凋亡，高濃度雷公藤甲素處理組的凋亡細(xì)胞比例為（[Z1]±[Z2]）%，明顯高于對照組的（[W1]±[W2]）%（P<0.01）。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，雷公藤甲素處理后，Th17細(xì)胞的G1期細(xì)胞比例顯著增加，S期和G2期細(xì)胞比例明顯減少，表明雷公藤甲素可將Th17細(xì)胞周期阻滯在G1期。雷公藤甲素對Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子和基因表達(dá)的影響：ELISA檢測結(jié)果顯示，雷公藤甲素處理后，Th17細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17、IL-21、IL-22的含量均顯著降低。高濃度雷公藤甲素處理組的IL-17含量為（[A1]±[A2]）pg/mL，顯著低于對照組的（[B1]±[B2]）pg/mL（P<0.01）；IL-21含量為（[C1]±[C2]）pg/mL，顯著低于對照組的（[D1]±[D2]）pg/mL（P<0.01）；IL-22含量為（[E1]±[E2]）pg/mL，顯著低于對照組的（[F1]±[F2]）pg/mL（P<0.01）。實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果表明，雷公藤甲素能夠顯著下調(diào)Th17細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子RORγt、RORα以及細(xì)胞因子IL-17、IL-21、IL-22的mRNA和蛋白表達(dá)水平，同時抑制TAZ和相關(guān)信號通路分子的表達(dá)。雷公藤甲素對TAZ-Th17細(xì)胞軸的干預(yù)作用：在雷公藤甲素處理的Th17細(xì)胞中，TAZ的蛋白表達(dá)水平顯著降低，且TAZ與轉(zhuǎn)錄因子RORγt的相互作用減弱。在TAZ敲低的Th17細(xì)胞模型中，雷公藤甲素對Th17細(xì)胞活化相關(guān)指標(biāo)的影響減弱，如細(xì)胞因子分泌的減少和細(xì)胞周期阻滯的效果不如正常Th17細(xì)胞顯著；而在TAZ過表達(dá)的Th17細(xì)胞模型中，雷公藤甲素對Th17細(xì)胞活化的抑制作用部分被逆轉(zhuǎn)，表明雷公藤甲素可能通過抑制TAZ的表達(dá)和活性，進而干預(yù)TAZ-Th17細(xì)胞軸，抑制Th17細(xì)胞的活化。動物實驗結(jié)果：在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）小鼠模型中，與模型對照組相比，雷公藤甲素低、高劑量組小鼠的關(guān)節(jié)腫脹程度明顯減輕，關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分顯著降低。在實驗第[X]天，雷公藤甲素高劑量組小鼠的關(guān)節(jié)腫脹度為（[G1]±[G2]）mm，顯著低于模型對照組的（[H1]±[H2]）mm（P<0.01）；關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分為（[I1]±[I2]）分，顯著低于模型對照組的（[J1]±[J2]）分（P<0.01）。組織病理學(xué)分析顯示，雷公藤甲素處理組小鼠關(guān)節(jié)組織的炎癥細(xì)胞浸潤、軟骨破壞、骨侵蝕和新骨形成等病理變化明顯減輕，關(guān)節(jié)組織評分顯著降低。免疫組化和免疫熒光結(jié)果表明，雷公藤甲素能夠降低關(guān)節(jié)組織和脾臟中Th17細(xì)胞的比例，抑制TAZ的表達(dá)以及相關(guān)細(xì)胞因子和信號通路分子的表達(dá)。實時熒光定量PCR結(jié)果也證實，雷公藤甲素處理后，關(guān)節(jié)組織和脾臟中相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)。綜合細(xì)胞實驗和動物實驗結(jié)果，雷公藤甲素能夠顯著抑制強直性脊柱炎中Th17細(xì)胞的活化，其作用機制可能與抑制TAZ的表達(dá)和活性，阻斷TAZ-Th17細(xì)胞軸，進而減少Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的分泌、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期等有關(guān)。這為雷公藤甲素治療強直性脊柱炎提供了有力的實驗依據(jù)，也為進一步開發(fā)基于TAZ-Th17細(xì)胞軸的靶向治療藥物奠定了基礎(chǔ)。4.4雷公藤甲素的干預(yù)機制探討雷公藤甲素對強直性脊柱炎中Th17細(xì)胞活化的干預(yù)機制是一個復(fù)雜且多維度的過程，涉及多個細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)層面的調(diào)節(jié)。在抑制TAZ活化和Th17細(xì)胞分化方面，雷公藤甲素發(fā)揮了關(guān)鍵作用。通過實驗結(jié)果可知，雷公藤甲素處理Th17細(xì)胞后，TAZ的蛋白表達(dá)水平顯著降低。這可能是因為雷公藤甲素作用于細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)信號通路，抑制了TAZ基因的轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)的合成。TAZ作為Th17細(xì)胞活化的重要調(diào)控因子，其表達(dá)降低直接影響了Th17細(xì)胞的分化過程。研究表明，TAZ可以與轉(zhuǎn)錄因子RORγt相互作用，促進Th17細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，從而推動Th17細(xì)胞的分化。雷公藤甲素能夠減弱TAZ與RORγt的相互作用，使得RORγt對Th17細(xì)胞相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活作用受到抑制，進而減少Th17細(xì)胞的分化。在RA的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制TAZ的活性可以降低Th17細(xì)胞的比例和功能，提示了TAZ-Th17細(xì)胞軸在自身免疫性疾病中的重要性，也進一步說明了雷公藤甲素通過抑制TAZ活化來干預(yù)Th17細(xì)胞分化的合理性。調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)也是雷公藤甲素干預(yù)Th17細(xì)胞活化的重要機制之一。Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-17、IL-21、IL-22在AS的炎癥反應(yīng)和病理進程中起著關(guān)鍵作用。IL-17可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞、滑膜細(xì)胞等產(chǎn)生多種促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-6和IL-1β等，進一步放大炎癥反應(yīng)，促進骨破壞；IL-21促進Th17細(xì)胞的分化和擴增，并增強其致病活性；IL-22參與調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的免疫反應(yīng)和組織修復(fù)，但在AS中其過度表達(dá)也可能加重炎癥。雷公藤甲素處理后，Th17細(xì)胞培養(yǎng)上清中這些細(xì)胞因子的含量均顯著降低。這可能是由于雷公藤甲素抑制了Th17細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，或者影響了細(xì)胞因子的合成、加工和分泌過程。在體外細(xì)胞實驗中，雷公藤甲素能夠顯著降低Th17細(xì)胞中IL-17、IL-21、IL-22的mRNA和蛋白表達(dá)水平，表明雷公藤甲素通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，有效抑制了Th17細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。雷公藤甲素還可能通過影響Hippo信號通路來干預(yù)Th17細(xì)胞的活化。在正常生理狀態(tài)下，Hippo信號通路通過一系列激酶的磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，抑制TAZ的活性，使其滯留在細(xì)胞質(zhì)中，從而維持細(xì)胞的正常功能和組織穩(wěn)態(tài)。在AS患者Th17細(xì)胞中，Hippo信號通路受到抑制，導(dǎo)致TAZ活化，促進Th17細(xì)胞的異常活化。研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素可能通過調(diào)節(jié)Hippo信號通路中關(guān)鍵激酶MST1/2和LATS1/2的活性或表達(dá)，恢復(fù)Hippo信號通路的正常功能。具體來說，雷公藤甲素可能促進MST1/2和LATS1/2的磷酸化，增強其激酶活性，進而使TAZ磷酸化水平升高，與14-3-3蛋白結(jié)合，被滯留在細(xì)胞質(zhì)中，無法進入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄共激活作用，從而抑制Th17細(xì)胞的活化。在其他自身免疫性疾病模型中，調(diào)節(jié)Hippo信號通路可以影響免疫細(xì)胞的功能和炎癥反應(yīng)，為雷公藤甲素通過Hippo信號通路干預(yù)AS中Th17細(xì)胞活化提供了理論支持。五、研究結(jié)果總結(jié)與展望5.1研究成果總結(jié)本研究深入探究了TAZ活化強直性脊柱炎Th17細(xì)胞的機制以及雷公藤甲素的干預(yù)作用，取得了一系列具有重要意義的研究成果。在TAZ活化AS患者Th17細(xì)胞的機制方面，研究明確了AS患者外周血中Th17細(xì)胞比例顯著高于健康對照組，且Th17細(xì)胞中TAZ的蛋白表達(dá)水平明顯升高，這一發(fā)現(xiàn)首次揭示了TAZ在AS患者Th17細(xì)胞中的高表達(dá)與Th17細(xì)胞活化的密切關(guān)聯(lián)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，AS患者Th17細(xì)胞中Hippo信號通路受到抑制，表現(xiàn)為p-MST1/2和p-LATS1/2的蛋白表達(dá)水平顯著降低，而總MST1/2和LATS1/2的表達(dá)水平無明顯差異。相關(guān)性分析表明，TAZ的表達(dá)水平與Th17細(xì)胞的比例以及Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-17、IL-21、IL-22的表達(dá)水平均呈顯著正相關(guān)，與p-MST1/2和p-LATS1/2的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)。這一系列結(jié)果揭示了TAZ可能通過抑制Hippo信號通路，促進Th17細(xì)胞的活化和功能增強，從而參與AS的發(fā)病機制，為深入理解AS的發(fā)病機制提供了新的視角和理論依據(jù)。在雷公藤甲素對TAZ活化AS中Th17細(xì)胞的干預(yù)研究中，細(xì)胞實驗和動物實驗均表明雷公藤甲素能夠顯著抑制Th17細(xì)胞的活化。在細(xì)胞實驗中，雷公藤甲素呈濃度和時間依賴性地抑制Th17細(xì)胞活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，將細(xì)胞周期阻滯在G1期。它還能顯著下調(diào)