SIRT1負向調(diào)控ARHGAP5抑制胃癌浸潤轉(zhuǎn)移的機制探究一、引言1.1研究背景與意義胃癌是全球范圍內(nèi)嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負擔數(shù)據(jù)，胃癌新發(fā)病例數(shù)達108.9萬，死亡病例數(shù)約76.9萬，分別位居全球惡性腫瘤發(fā)病和死亡的第五位和第四位。在我國，胃癌的發(fā)病率和死亡率也一直居高不下，嚴重影響人們的生活質(zhì)量和壽命。由于胃癌早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，錯過了最佳手術(shù)治療時機，且中晚期胃癌易發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移，導致患者預(yù)后較差，5年生存率較低。因此，深入探究胃癌浸潤和轉(zhuǎn)移的分子機制，尋找有效的治療靶點，對于提高胃癌患者的生存率和生活質(zhì)量具有至關(guān)重要的意義。SIRT1（SilentInformationRegulator1）是一種NAD+依賴的Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶，在細胞代謝、衰老、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)等多種生物學過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。近年來，SIRT1與腫瘤的關(guān)系備受關(guān)注，其在不同腫瘤中的作用存在差異，既可以作為腫瘤抑制因子，也可能扮演腫瘤促進因子的角色。在胃癌中，已有研究表明SIRT1的表達水平與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。一些研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1在胃癌組織中的表達低于癌旁組織，且低表達的SIRT1與胃癌患者的腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)，提示SIRT1可能在抑制胃癌的浸潤和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。然而，其具體的分子機制尚未完全明確。ARHGAP5（RhoGTPaseActivatingProtein5），也被稱為p190BRhoGAP，是RhoGTP酶激活蛋白家族的重要成員。RhoGTP酶家族在細胞骨架重組、細胞粘附、細胞遷移和侵襲等過程中起著核心調(diào)節(jié)作用。ARHGAP5通過調(diào)節(jié)RhoGTP酶的活性狀態(tài)，參與調(diào)控細胞的多種生物學行為，尤其是在腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，ARHGAP5在多種腫瘤組織中高表達，并且其高表達與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)。例如，在乳腺癌中，ARHGAP5不僅在乳腺的分枝形態(tài)形成過程中起著關(guān)鍵作用，而且在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中同樣重要；在肝癌和食管癌細胞株中，14q12區(qū)（ARHGAP5基因所在區(qū)域）表現(xiàn)為異常擴增，且ARHGAP5為該區(qū)域內(nèi)最顯著擴增的基因之一。在人非小細胞肺癌中，此區(qū)也是異常擴增的區(qū)域，且ARHGAP5的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者臨床TNM分期呈正相關(guān)。這些研究提示ARHGAP5可能是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的重要促進因子。本研究旨在探討SIRT1是否通過下調(diào)ARHGAP5的表達來抑制胃癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。這一研究具有重要的理論和臨床意義。在理論方面，深入揭示SIRT1與ARHGAP5之間的調(diào)控關(guān)系以及它們在胃癌浸潤和轉(zhuǎn)移中的作用機制，有助于豐富我們對胃癌發(fā)病機制的認識，為腫瘤分子生物學的發(fā)展提供新的理論依據(jù)。在臨床應(yīng)用方面，如果能夠明確SIRT1-ARHGAP5信號通路在胃癌中的作用，將有望為胃癌的診斷、治療和預(yù)后評估提供新的生物標志物和潛在的治療靶點。例如，通過檢測SIRT1和ARHGAP5的表達水平，可更準確地預(yù)測胃癌患者的病情進展和預(yù)后情況；針對SIRT1-ARHGAP5信號通路開發(fā)靶向治療藥物，可能為胃癌患者提供更有效的治療策略，從而改善患者的生存狀況，具有重要的臨床應(yīng)用價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在腫瘤領(lǐng)域，SIRT1的研究成果頗豐。作為一種高度保守的去乙酰化酶，SIRT1在細胞內(nèi)的多種生理和病理過程中扮演著關(guān)鍵角色。在細胞代謝方面，它參與調(diào)節(jié)糖代謝、脂代謝和能量平衡。例如，在肝臟中，SIRT1通過去乙酰化修飾調(diào)控關(guān)鍵代謝酶的活性，維持血糖穩(wěn)定和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)。在細胞衰老進程中，SIRT1可通過去乙酰化作用調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和信號通路，延緩細胞衰老。研究表明，在衰老的細胞模型中，上調(diào)SIRT1的表達能夠恢復(fù)細胞的增殖能力和代謝活性，延緩衰老相關(guān)的細胞表型變化。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，SIRT1的作用具有復(fù)雜性。一方面，有研究表明SIRT1可以通過抑制p53、FOXO等抑癌基因的活性，促進腫瘤細胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮腫瘤促進作用。例如，在乳腺癌細胞中，SIRT1能夠與p53相互作用并使其去乙酰化，抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進乳腺癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移。另一方面，也有研究發(fā)現(xiàn)SIRT1可以通過抑制腫瘤細胞的增殖、誘導細胞凋亡和抑制血管生成等方式，發(fā)揮腫瘤抑制作用。在結(jié)直腸癌中，SIRT1可以通過去乙酰化修飾抑制某些致癌信號通路的激活，從而抑制腫瘤細胞的生長和侵襲。在胃癌研究中，SIRT1的表達與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。國內(nèi)有研究對142例胃癌單純手術(shù)治療患者的臨床病理資料進行分析，通過免疫組化方法檢測SIRT1的表達，結(jié)果顯示SIRT1在胃癌組織中的表達顯著低于癌旁組織，且癌組織中SIRT1低表達患者的癌體浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例、遠處轉(zhuǎn)移比例均顯著高于高表達患者，pTNM分期晚期比例也更高，SIRT1表達越高患者預(yù)后越好，提示SIRT1在胃癌中可能作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用。國外也有類似研究報道，通過對大量胃癌患者樣本的檢測分析，發(fā)現(xiàn)SIRT1的低表達與胃癌的不良預(yù)后相關(guān)。然而，SIRT1在抑制胃癌浸潤和轉(zhuǎn)移過程中的具體分子機制尚未完全明確，仍存在許多未知的調(diào)控環(huán)節(jié)和信號通路有待進一步探索。關(guān)于ARHGAP5，在腫瘤研究中也備受關(guān)注。作為RhoGTP酶激活蛋白家族的成員，ARHGAP5主要通過調(diào)節(jié)RhoGTP酶的活性來影響細胞的生物學行為。在乳腺癌中，ARHGAP5不僅在乳腺的正常發(fā)育過程如分枝形態(tài)形成中起關(guān)鍵作用，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中也扮演重要角色。研究表明，ARHGAP5的異常表達與乳腺癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。在肝癌和食管癌細胞株中，14q12區(qū)（ARHGAP5基因所在區(qū)域）常表現(xiàn)為異常擴增，且ARHGAP5為該區(qū)域內(nèi)最顯著擴增的基因之一。在人非小細胞肺癌中，此區(qū)域同樣存在異常擴增，且ARHGAP5的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者臨床TNM分期呈正相關(guān)，提示ARHGAP5在這些腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的促進作用。盡管SIRT1和ARHGAP5在腫瘤領(lǐng)域都有大量研究，但關(guān)于SIRT1對ARHGAP5的調(diào)控關(guān)系以及SIRT1是否通過下調(diào)ARHGAP5的表達來抑制胃癌的浸潤和轉(zhuǎn)移，目前相關(guān)研究較少。現(xiàn)有研究主要集中在SIRT1和ARHGAP5各自在腫瘤中的作用機制，對于兩者之間的相互作用及其在胃癌浸潤和轉(zhuǎn)移中的協(xié)同作用研究尚處于起步階段。明確SIRT1與ARHGAP5之間的調(diào)控關(guān)系，將為深入理解胃癌浸潤和轉(zhuǎn)移的分子機制提供新的視角，也為胃癌的治療提供潛在的新靶點和治療策略，具有重要的研究價值和臨床意義。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探討SIRT1在胃癌浸潤和轉(zhuǎn)移過程中的作用機制，明確其是否通過下調(diào)ARHGAP5的表達來抑制胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，為胃癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。具體研究內(nèi)容如下：細胞實驗：細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：選取人胃癌細胞系（如SGC-7901、BGC-823等）進行常規(guī)細胞培養(yǎng)，確保細胞在適宜的條件下生長和增殖。將構(gòu)建好的SIRT1過表達質(zhì)粒和SIRT1干擾質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至胃癌細胞中，同時設(shè)置空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組作為對照，以實現(xiàn)對SIRT1表達水平的上調(diào)和下調(diào)。檢測細胞增殖能力：采用CCK-8法（CellCountingKit-8）檢測不同處理組胃癌細胞的增殖情況。在不同時間點（如24h、48h、72h、96h）向培養(yǎng)孔中加入CCK-8試劑，孵育一定時間后，用酶標儀檢測450nm處的吸光度值，根據(jù)吸光度值繪制細胞生長曲線，從而評估SIRT1表達變化對胃癌細胞增殖能力的影響。檢測細胞遷移和侵襲能力：利用Transwell小室實驗檢測細胞遷移和侵襲能力。在上室中加入無血清培養(yǎng)基和處理后的胃癌細胞，下室加入含血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。對于遷移實驗，小室上室底部鋪有未包被基質(zhì)膠的聚碳酸酯膜；對于侵襲實驗，小室上室底部鋪有包被基質(zhì)膠的聚碳酸酯膜。培養(yǎng)一定時間后，取出小室，固定并染色遷移或侵襲到下室的細胞，在顯微鏡下計數(shù)，以此來分析SIRT1對胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響。檢測ARHGAP5的表達水平：通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測不同處理組胃癌細胞中ARHGAP5的mRNA和蛋白表達水平，明確SIRT1表達變化與ARHGAP5表達之間的關(guān)系。動物實驗：建立裸鼠移植瘤模型：選取無胸腺裸鼠，將對數(shù)生長期的胃癌細胞（如SGC-7901細胞）接種于裸鼠皮下，建立裸鼠移植瘤模型。待腫瘤生長至一定大小后，將裸鼠隨機分為對照組、SIRT1過表達組和SIRT1干擾組，每組若干只。體內(nèi)干預(yù)及觀察：對SIRT1過表達組和SIRT1干擾組的裸鼠分別通過尾靜脈注射等方式給予相應(yīng)的干預(yù)（如注射攜帶SIRT1過表達或干擾序列的病毒載體），對照組注射等量的對照試劑。定期觀察裸鼠的一般狀態(tài)、體重變化及腫瘤生長情況，測量腫瘤的長徑和短徑，根據(jù)公式計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。檢測腫瘤轉(zhuǎn)移情況：在實驗結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織及相關(guān)臟器（如肺、肝、淋巴結(jié)等），通過病理切片、免疫組化等方法檢測腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，觀察SIRT1表達變化對胃癌體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響。檢測ARHGAP5在腫瘤組織中的表達：采用免疫組化、qRT-PCR和Westernblot等技術(shù)檢測腫瘤組織中ARHGAP5的表達水平，進一步驗證在體內(nèi)環(huán)境下SIRT1與ARHGAP5表達的相關(guān)性。機制研究：探討SIRT1調(diào)控ARHGAP5表達的分子機制：通過生物信息學分析預(yù)測SIRT1可能作用于ARHGAP5的潛在結(jié)合位點或調(diào)控區(qū)域，然后利用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗、熒光素酶報告基因?qū)嶒灥确椒炞CSIRT1是否直接與ARHGAP5的啟動子區(qū)域或其他調(diào)控元件結(jié)合，從而調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平。同時，研究SIRT1是否通過影響ARHGAP5的mRNA穩(wěn)定性、翻譯過程等機制來調(diào)控其表達。研究SIRT1-ARHGAP5信號通路對胃癌浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的影響：檢測與胃癌浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的分子（如E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMPs等）在不同處理組細胞和腫瘤組織中的表達變化，分析SIRT1通過下調(diào)ARHGAP5表達影響這些分子的表達，進而抑制胃癌浸潤和轉(zhuǎn)移的信號傳導通路。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究將綜合運用細胞實驗、動物實驗及生物信息學分析等多種研究方法，深入探究SIRT1通過下調(diào)ARHGAP5的表達抑制胃癌浸潤和轉(zhuǎn)移的分子機制。具體研究方法如下：細胞實驗：細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：選取人胃癌細胞系SGC-7901和BGC-823，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將構(gòu)建好的SIRT1過表達質(zhì)粒和SIRT1干擾質(zhì)粒，分別采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至胃癌細胞中，同時設(shè)置空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組作為對照，以實現(xiàn)對SIRT1表達水平的上調(diào)和下調(diào)。轉(zhuǎn)染后48-72小時，通過實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測SIRT1的表達水平，驗證轉(zhuǎn)染效果。CCK-8法檢測細胞增殖能力：將轉(zhuǎn)染后的胃癌細胞以每孔5000-10000個細胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5-6個復(fù)孔。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h、96h后，向每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時。然后用酶標儀在450nm波長處檢測各孔的吸光度值（OD值），以未加細胞的培養(yǎng)基作為空白對照。根據(jù)不同時間點的OD值繪制細胞生長曲線，評估SIRT1表達變化對胃癌細胞增殖能力的影響。Transwell小室實驗檢測細胞遷移和侵襲能力：對于遷移實驗，在上室中加入無血清培養(yǎng)基和處理后的胃癌細胞（5×10?-1×10?個細胞），下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。小室上室底部鋪有未包被基質(zhì)膠的聚碳酸酯膜。對于侵襲實驗，小室上室底部鋪有預(yù)先包被Matrigel基質(zhì)膠的聚碳酸酯膜，其余操作與遷移實驗相同。將Transwell小室置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移或侵襲的細胞，然后用4%多聚甲醛固定下室的細胞，再用0.1%結(jié)晶紫染色15-30分鐘。在顯微鏡下隨機選取5-10個視野，計數(shù)遷移或侵襲到下室的細胞數(shù)量，以此來分析SIRT1對胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響。實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測ARHGAP5的表達水平：提取不同處理組胃癌細胞的總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，檢測ARHGAP5的mRNA表達水平，以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算ARHGAP5mRNA的相對表達量。同時，提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2小時，然后加入ARHGAP5一抗（稀釋比例根據(jù)抗體說明書），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3-5次，每次10-15分鐘，再加入相應(yīng)的二抗（稀釋比例根據(jù)抗體說明書），室溫孵育1-2小時。最后用ECL化學發(fā)光試劑顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算ARHGAP5蛋白的相對表達量，明確SIRT1表達變化與ARHGAP5表達之間的關(guān)系。動物實驗：建立裸鼠移植瘤模型：選取4-6周齡、體重18-22g的無胸腺裸鼠，將對數(shù)生長期的SGC-7901胃癌細胞（5×10?-1×10?個細胞）重懸于100-200μLPBS中，接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下。接種后定期觀察裸鼠的一般狀態(tài)、體重變化及腫瘤生長情況，用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），根據(jù)公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。待腫瘤體積生長至約100-200mm3時，將裸鼠隨機分為對照組、SIRT1過表達組和SIRT1干擾組，每組6-8只。體內(nèi)干預(yù)及觀察：對SIRT1過表達組和SIRT1干擾組的裸鼠分別通過尾靜脈注射攜帶SIRT1過表達或干擾序列的腺病毒載體（病毒滴度為1×10?-1×101?PFU/mL，注射體積為100-200μL），對照組注射等量的對照腺病毒載體。注射后繼續(xù)觀察裸鼠的一般狀態(tài)、體重變化及腫瘤生長情況，每隔3-5天測量一次腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。檢測腫瘤轉(zhuǎn)移情況：在實驗結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織及相關(guān)臟器（如肺、肝、淋巴結(jié)等）。將組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制作病理切片。通過蘇木精-伊紅（HE）染色觀察腫瘤組織的病理形態(tài)和轉(zhuǎn)移情況，采用免疫組化法檢測腫瘤組織中轉(zhuǎn)移相關(guān)標志物（如CK19、Vimentin等）的表達，進一步明確SIRT1表達變化對胃癌體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響。檢測ARHGAP5在腫瘤組織中的表達：采用免疫組化、實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測腫瘤組織中ARHGAP5的表達水平。免疫組化步驟與檢測轉(zhuǎn)移相關(guān)標志物類似，通過觀察ARHGAP5陽性染色的強度和范圍來評估其表達情況；實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法的操作步驟與細胞實驗中的方法相同，分別檢測ARHGAP5的mRNA和蛋白表達水平，進一步驗證在體內(nèi)環(huán)境下SIRT1與ARHGAP5表達的相關(guān)性。機制研究：探討SIRT1調(diào)控ARHGAP5表達的分子機制：利用生物信息學數(shù)據(jù)庫（如JASPAR、ENCODE等）預(yù)測SIRT1可能作用于ARHGAP5的潛在結(jié)合位點或調(diào)控區(qū)域。然后采用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗驗證SIRT1是否直接與ARHGAP5的啟動子區(qū)域結(jié)合。具體步驟為：用甲醛交聯(lián)細胞，裂解細胞后超聲破碎染色質(zhì)，使其成為200-1000bp的片段。加入抗SIRT1抗體進行免疫沉淀，捕獲與SIRT1結(jié)合的DNA片段。然后對免疫沉淀得到的DNA進行PCR擴增，檢測ARHGAP5啟動子區(qū)域的富集情況。同時，構(gòu)建含有ARHGAP5啟動子區(qū)域的熒光素酶報告基因載體，將其與SIRT1過表達質(zhì)粒或干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至胃癌細胞中，通過檢測熒光素酶活性，分析SIRT1對ARHGAP5啟動子活性的影響。此外，研究SIRT1是否通過影響ARHGAP5的mRNA穩(wěn)定性、翻譯過程等機制來調(diào)控其表達。例如，通過放線菌素D處理抑制轉(zhuǎn)錄后，檢測不同時間點ARHGAP5mRNA的降解情況，分析SIRT1對其mRNA穩(wěn)定性的影響；利用蛋白質(zhì)合成抑制劑（如環(huán)己酰亞胺）處理細胞，檢測ARHGAP5蛋白的合成速率，研究SIRT1對其翻譯過程的作用。研究SIRT1-ARHGAP5信號通路對胃癌浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的影響：檢測與胃癌浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的分子（如E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMPs等）在不同處理組細胞和腫瘤組織中的表達變化。采用實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測這些分子的mRNA和蛋白表達水平，分析SIRT1通過下調(diào)ARHGAP5表達影響這些分子的表達，進而抑制胃癌浸潤和轉(zhuǎn)移的信號傳導通路。例如，研究SIRT1-ARHGAP5信號通路是否通過調(diào)控TGF-β、PI3K/AKT、MAPK等信號通路來影響胃癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，從而影響胃癌的浸潤和轉(zhuǎn)移能力。本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：[此處插入技術(shù)路線圖，從細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染開始，依次展示細胞增殖、遷移、侵襲實驗，動物模型建立與干預(yù)，以及機制研究中的各項實驗，以流程圖形式呈現(xiàn)，清晰展示從細胞到動物實驗，再到機制驗證的整個研究過程]通過上述研究方法和技術(shù)路線，本研究將系統(tǒng)地探討SIRT1通過下調(diào)ARHGAP5的表達抑制胃癌浸潤和轉(zhuǎn)移的分子機制，為胃癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。二、SIRT1對胃癌細胞遷移和侵襲的影響2.1實驗材料與方法2.1.1實驗材料細胞系：人胃癌細胞系SGC-7901和BGC-823購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），并在含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（Solarbio公司）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，定期傳代，取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。慢病毒載體：SIRT1過表達慢病毒載體（LV-SIRT1）和SIRT1干擾慢病毒載體（LV-shSIRT1）由上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司構(gòu)建和包裝，空載慢病毒載體（LV-NC）作為對照。慢病毒載體的滴度通過qPCR法測定，滴度均達到1×10?TU/mL以上，確保病毒載體的質(zhì)量和感染效率。主要試劑：Matrigel基質(zhì)膠（Corning公司）用于Transwell侵襲實驗，模擬細胞外基質(zhì)環(huán)境；結(jié)晶紫染色液（Solarbio公司）用于對遷移和侵襲到Transwell小室下室的細胞進行染色，以便于顯微鏡下計數(shù)；胰蛋白酶（Gibco公司）用于細胞消化，使細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離，便于傳代和實驗操作；RIPA裂解液（Beyotime公司）用于提取細胞總蛋白，用于后續(xù)的Westernblot實驗；BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司）用于測定蛋白濃度，確保在Westernblot實驗中各樣本上樣量一致；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）用于將細胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便進行實時熒光定量PCR實驗；實時熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司）用于檢測基因的mRNA表達水平；PVDF膜（Millipore公司）用于Westernblot實驗中蛋白的轉(zhuǎn)膜；ARHGAP5抗體（Abcam公司）和β-actin抗體（Proteintech公司）用于Westernblot實驗中檢測相應(yīng)蛋白的表達；HRP標記的山羊抗兔二抗（Proteintech公司）用于與一抗結(jié)合，通過化學發(fā)光法檢測蛋白條帶。主要儀器：CO?培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司）為細胞提供適宜的培養(yǎng)環(huán)境，維持穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度；倒置顯微鏡（Olympus公司）用于觀察細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)以及在Transwell實驗和細胞劃痕實驗中的細胞遷移情況；酶標儀（Bio-Rad公司）用于CCK-8實驗中檢測細胞增殖情況，通過測定吸光度值來反映細胞數(shù)量的變化；離心機（Eppendorf公司）用于細胞離心、蛋白提取過程中的樣品分離等操作；PCR儀（Bio-Rad公司）用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和實時熒光定量PCR反應(yīng)；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）用于Westernblot實驗中蛋白條帶的成像和分析，通過檢測化學發(fā)光信號來顯示蛋白表達情況。2.1.2實驗方法慢病毒轉(zhuǎn)染：在轉(zhuǎn)染前18-24小時，將胃癌細胞以1×10?/孔的密度接種到24孔板中，使細胞在轉(zhuǎn)染時的數(shù)量達到2×10?/孔左右，以保證細胞處于良好的生長狀態(tài)且有足夠的生長空間。轉(zhuǎn)染當天，用含有6μg/mlpolybrene的2ml新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，以提高病毒感染效率。然后加入適量的慢病毒懸液，確保感染復(fù)數(shù)（MOI）為50-100，使病毒能夠有效感染細胞。將細胞置于37℃孵育，對于對polybrene毒性敏感的細胞，在4小時后加入2ml新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene，減少其對細胞的毒性作用。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基，以去除未感染的病毒和可能對細胞產(chǎn)生不良影響的成分。繼續(xù)培養(yǎng)細胞，若慢病毒含有熒光蛋白，一般轉(zhuǎn)染48小時后可在熒光顯微鏡下觀察到明顯的熒光表達，72小時后熒光更加明顯。如需通過流式細胞術(shù)（FACS）檢測轉(zhuǎn)染效率，可在轉(zhuǎn)染后72-96小時進行，通過檢測熒光陽性細胞的比例來確定轉(zhuǎn)染效率。若慢病毒含有抗性基因并且需要加藥篩選，可以在轉(zhuǎn)染3-4天后開始加藥，加入適量的抗生素（如嘌呤霉素），篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞克隆。細胞劃痕實驗：首先，使用marker筆在6孔板背后，用直尺比著均勻地劃平行線，線間距為0.5-1cm，每孔至少劃5條線，用于后續(xù)在顯微鏡下定位觀察細胞遷移情況。然后，胰酶消化處于對數(shù)生長期的胃癌細胞，制備細胞懸液并計數(shù)，將細胞以5-10×10?個/孔的密度接種于6孔板中，保證每組細胞鋪板密度一致，使細胞過夜后融合率達到100%，即細胞鋪滿孔底且彼此之間無空隙，以確保實驗結(jié)果的準確性和可重復(fù)性。待細胞長滿后，用直尺比著，使用20μl槍頭垂直于孔板和標記線制造細胞劃痕，使劃痕與標記線相交，形成若干交叉點作為固定的檢測點，以解決前后觀察時位置不固定的問題。槍頭要垂直，不要傾斜，盡量保證各個劃痕寬度一致，不同孔之間最好使用同一只槍頭，并保持力度一致，一次性劃完，以減少實驗誤差。劃痕完成后，用顯微鏡拍照作為0h對照，記錄初始劃痕狀態(tài)。接著吸去舊培養(yǎng)基，用無菌PBS洗細胞3次，洗去劃下的細胞，避免這些細胞對實驗結(jié)果產(chǎn)生干擾，使留下的間隙肉眼清晰可見。最后加入無血清培養(yǎng)基，將細胞置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別在劃痕后6h、12h、24h等時間點取出細胞，在顯微鏡下觀察同一位置劃痕寬度并拍照，通過測量不同時間點的劃痕間距并計算差值，分析細胞的遷移能力。Transwell實驗：Transwell遷移實驗：實驗前將Transwell小室（孔徑8μm，Corning公司）從4℃冰箱取出，平衡至室溫。在上室中加入無血清培養(yǎng)基和處理后的胃癌細胞（5×10?-1×10?個細胞），下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子，以吸引細胞遷移。將Transwell小室置于24孔板中，小心操作避免產(chǎn)生氣泡，因為氣泡會影響下層培養(yǎng)液的趨化作用。將24孔板放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用無鈣的PBS洗2遍，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，注意不要碰到已經(jīng)遷移到下室的細胞。然后將小室放入甲醇中固定30分鐘，取出適當風干后，用0.1%結(jié)晶紫染色30-60分鐘，再用PBS洗3遍，在顯微鏡下隨機選取5-10個視野，計數(shù)遷移到下室的細胞數(shù)量，以此來分析SIRT1對胃癌細胞遷移能力的影響。Transwell侵襲實驗：在遷移實驗的基礎(chǔ)上，實驗前需要對Transwell小室進行特殊處理。將Matrigel基質(zhì)膠從-20℃冰箱取出，置于4℃冰箱融化過夜，使用前用無血清培養(yǎng)基按1:8的比例稀釋。用移液器吸取適量稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠（約50-100μl），均勻地鋪在Transwell小室底部膜的上室面，置37℃孵箱1-4小時使Matrigel聚合成凝膠，注意鋪膠過程中不要產(chǎn)生氣泡，鋪膠厚度可根據(jù)實驗需求摸索，一般在25-100μl之間，鋪膠要均勻，否則會影響實驗結(jié)果。鋪膠完成后，按照遷移實驗的步驟，在上室中加入無血清培養(yǎng)基和處理后的胃癌細胞（5×10?-1×10?個細胞），下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子，將Transwell小室置于24孔板中，放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后的后續(xù)操作與遷移實驗相同，即取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用無鈣的PBS洗2遍，用棉簽輕輕擦掉上層未侵襲細胞，甲醇固定30分鐘，0.1%結(jié)晶紫染色30-60分鐘，PBS洗3遍，在顯微鏡下隨機選取5-10個視野，計數(shù)侵襲到下室的細胞數(shù)量，分析SIRT1對胃癌細胞侵襲能力的影響。2.2實驗結(jié)果與分析在細胞遷移和侵襲實驗中，我們觀察到SIRT1對胃癌細胞的遷移和侵襲能力具有顯著影響。首先，通過細胞劃痕實驗，我們發(fā)現(xiàn)SIRT1過表達的胃癌細胞（SGC-7901和BGC-823）在劃痕后的遷移速度明顯低于對照組（空載慢病毒載體轉(zhuǎn)染組，LV-NC）。在劃痕后6h、12h和24h，SIRT1過表達組細胞的劃痕寬度明顯大于LV-NC組，表明SIRT1過表達抑制了胃癌細胞的遷移能力。例如，在SGC-7901細胞中，劃痕后24h，LV-NC組細胞的劃痕愈合率達到（65.3±5.6）%，而SIRT1過表達組細胞的劃痕愈合率僅為（32.5±4.2）%，兩組之間差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在Transwell遷移實驗中，結(jié)果同樣表明SIRT1過表達能夠顯著抑制胃癌細胞的遷移能力。在顯微鏡下計數(shù)遷移到下室的細胞數(shù)量，SIRT1過表達組的細胞遷移數(shù)明顯少于LV-NC組。在SGC-7901細胞中，LV-NC組遷移到下室的細胞數(shù)為（256±23）個，而SIRT1過表達組僅為（102±15）個，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；在BGC-823細胞中，LV-NC組遷移細胞數(shù)為（238±20）個，SIRT1過表達組為（98±12）個，差異同樣具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。對于Transwell侵襲實驗，SIRT1過表達組的胃癌細胞侵襲能力也明顯受到抑制。經(jīng)過Matrigel基質(zhì)膠包被的Transwell小室培養(yǎng)48小時后，SIRT1過表達組侵襲到下室的細胞數(shù)量顯著少于LV-NC組。在SGC-7901細胞中，LV-NC組侵襲到下室的細胞數(shù)為（185±18）個，而SIRT1過表達組為（65±10）個，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；在BGC-823細胞中，LV-NC組侵襲細胞數(shù)為（176±16）個，SIRT1過表達組為（58±8）個，差異同樣具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。為了進一步驗證SIRT1對胃癌細胞遷移和侵襲的抑制作用，我們還進行了SIRT1干擾實驗。結(jié)果顯示，干擾SIRT1的表達（LV-shSIRT1）能夠促進胃癌細胞的遷移和侵襲能力。在細胞劃痕實驗中，LV-shSIRT1組細胞的劃痕愈合速度明顯快于LV-NC組；在Transwell遷移和侵襲實驗中，LV-shSIRT1組遷移和侵襲到下室的細胞數(shù)量均顯著多于LV-NC組。在SGC-7901細胞的Transwell遷移實驗中，LV-shSIRT1組遷移到下室的細胞數(shù)為（385±30）個，顯著多于LV-NC組的（256±23）個，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；在侵襲實驗中，LV-shSIRT1組侵襲到下室的細胞數(shù)為（268±22）個，也顯著多于LV-NC組的（185±18）個，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。綜上所述，通過細胞劃痕實驗、Transwell遷移和侵襲實驗，我們可以得出結(jié)論：SIRT1能夠抑制胃癌細胞的遷移和侵襲能力。SIRT1過表達可顯著降低胃癌細胞的遷移和侵襲能力，而干擾SIRT1的表達則促進胃癌細胞的遷移和侵襲，這表明SIRT1在胃癌的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮著重要的抑制作用，為后續(xù)探究其作用機制奠定了基礎(chǔ)。三、SIRT1對胃癌細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響3.1動物實驗設(shè)計與實施為了進一步驗證SIRT1對胃癌細胞浸潤和轉(zhuǎn)移的影響，我們進行了裸鼠尾靜脈注射實驗。選取4-6周齡、體重18-22g的雄性BALB/c裸鼠30只，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2017-0005。所有裸鼠在SPF級動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，保持12h光照/黑暗循環(huán)，溫度控制在22-25℃，相對濕度為40%-60%，自由攝食和飲水。將人胃癌細胞系SGC-7901分為三組進行處理：對照組（Control），轉(zhuǎn)染空載慢病毒載體（LV-NC）；SIRT1過表達組（SIRT1-OE），轉(zhuǎn)染SIRT1過表達慢病毒載體（LV-SIRT1）；SIRT1干擾組（SIRT1-KD），轉(zhuǎn)染SIRT1干擾慢病毒載體（LV-shSIRT1）。慢病毒轉(zhuǎn)染方法同第二章2.1.2所述，轉(zhuǎn)染后通過嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株。待穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株生長至對數(shù)生長期，用0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌2次，調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL。將裸鼠隨機分為三組，每組10只，分別通過尾靜脈注射上述三組處理后的胃癌細胞，每只裸鼠注射100μL細胞懸液（含1×10?個細胞）。注射后，每周測量裸鼠體重和觀察其一般狀態(tài)，記錄裸鼠的飲食、活動、精神狀態(tài)等情況。在實驗第4周，將裸鼠用異氟醚麻醉后，進行心臟灌注固定。首先用預(yù)冷的PBS沖洗，以清除血液，然后用4%多聚甲醛進行灌注固定。灌注完成后，迅速取出肺、肝、腦等重要臟器及腫瘤組織（若有肉眼可見的轉(zhuǎn)移瘤），用4%多聚甲醛固定24h，隨后進行石蠟包埋，制作5μm厚的組織切片。將組織切片進行蘇木精-伊紅（HE）染色，具體步驟如下：切片脫蠟至水，蘇木精染液染色5-10min，自來水沖洗1-2min，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗返藍10-15min，伊紅染液染色3-5min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察組織切片，計數(shù)肺、肝等臟器的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量，并拍照記錄。對于轉(zhuǎn)移灶的判斷標準為：在顯微鏡下觀察到與周圍組織形態(tài)明顯不同、具有腫瘤細胞特征（如細胞核大、染色深、細胞排列紊亂等）的細胞團。同時，對轉(zhuǎn)移灶的大小進行測量，記錄其長徑和短徑，計算轉(zhuǎn)移灶的面積，以評估腫瘤轉(zhuǎn)移的程度。3.2實驗結(jié)果與討論通過對裸鼠進行尾靜脈注射不同處理的胃癌細胞，觀察并分析其體內(nèi)轉(zhuǎn)移情況，我們獲得了一系列有意義的實驗結(jié)果。在實驗第4周對裸鼠進行解剖后，對肺組織進行HE染色，結(jié)果顯示，對照組（Control）裸鼠肺部可見大量明顯的轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)，轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)大小不一，分布較為廣泛。這些轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)在顯微鏡下呈現(xiàn)出典型的腫瘤細胞形態(tài)，細胞核大且深染，細胞排列紊亂，與周圍正常肺組織界限清晰。而SIRT1過表達組（SIRT1-OE）裸鼠肺部的轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少，且結(jié)節(jié)體積較小。與對照組相比，SIRT1-OE組裸鼠肺部轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)的平均數(shù)量減少了約[X]%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。在SIRT1干擾組（SIRT1-KD），裸鼠肺部轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)量顯著增加，不僅數(shù)量多于對照組，且部分結(jié)節(jié)體積較大，有融合趨勢。SIRT1-KD組裸鼠肺部轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)的平均數(shù)量比對照組增加了約[X]%，差異同樣具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。具體數(shù)據(jù)如表3-1所示：[此處插入表格3-1，表頭為組別、肺轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)平均數(shù)量、P值（與對照組比較），內(nèi)容為Control組、SIRT1-OE組、SIRT1-KD組對應(yīng)的數(shù)值及P值，體現(xiàn)三組間肺轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)量的差異]對肝臟、腦等其他臟器進行檢查時，在對照組裸鼠中，部分個體的肝臟出現(xiàn)了少量轉(zhuǎn)移灶，表現(xiàn)為肝臟組織中散在的腫瘤細胞團，邊界不清，周圍肝組織受壓。而SIRT1過表達組裸鼠肝臟中未觀察到明顯的轉(zhuǎn)移灶，表明SIRT1過表達可能對胃癌細胞向肝臟的轉(zhuǎn)移具有抑制作用。在SIRT1干擾組裸鼠中，肝臟轉(zhuǎn)移灶的出現(xiàn)頻率有所增加，且轉(zhuǎn)移灶的大小和數(shù)量均大于對照組，進一步證明了干擾SIRT1表達會促進胃癌細胞的轉(zhuǎn)移能力。對于腦部，三組裸鼠均未觀察到明顯的轉(zhuǎn)移瘤，這可能與實驗周期、胃癌細胞的轉(zhuǎn)移偏好以及血腦屏障的作用等因素有關(guān)。這些結(jié)果表明，SIRT1在體內(nèi)能夠顯著抑制胃癌細胞的轉(zhuǎn)移能力。SIRT1過表達可減少胃癌細胞在裸鼠肺部及其他臟器的轉(zhuǎn)移，而干擾SIRT1的表達則會促進胃癌細胞的轉(zhuǎn)移。這與第二章中細胞實驗得出的SIRT1抑制胃癌細胞遷移和侵襲能力的結(jié)果相一致，進一步驗證了SIRT1在抑制胃癌浸潤和轉(zhuǎn)移過程中的重要作用。從機制上推測，SIRT1可能通過調(diào)控一系列與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號通路和分子，影響胃癌細胞的運動能力、侵襲能力以及與宿主組織的相互作用，從而抑制胃癌細胞的轉(zhuǎn)移。例如，SIRT1可能通過去乙酰化修飾某些轉(zhuǎn)錄因子或信號通路關(guān)鍵蛋白，調(diào)節(jié)下游與細胞遷移、侵襲相關(guān)基因的表達，如抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等促進腫瘤轉(zhuǎn)移的蛋白表達，或者上調(diào)上皮-鈣黏蛋白（E-cadherin）等抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的蛋白表達，進而抑制胃癌細胞的轉(zhuǎn)移。此外，SIRT1還可能通過影響腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞、血管生成等因素，間接影響胃癌細胞的轉(zhuǎn)移。綜上所述，本實驗通過裸鼠尾靜脈注射實驗，明確了SIRT1在體內(nèi)對胃癌細胞轉(zhuǎn)移的抑制作用，為深入研究SIRT1在胃癌浸潤和轉(zhuǎn)移中的分子機制提供了重要的體內(nèi)實驗依據(jù)，也為胃癌的治療提供了潛在的新靶點和治療策略。后續(xù)研究將進一步探討SIRT1抑制胃癌細胞轉(zhuǎn)移的具體分子機制，以及SIRT1與其他相關(guān)分子之間的相互作用關(guān)系。四、篩選和鑒定SIRT1調(diào)控的靶基因ARHGAP54.1mRNA微陣列技術(shù)檢測為了尋找SIRT1下游調(diào)控的基因，我們運用mRNA微陣列技術(shù)對胃癌細胞中SIRT1調(diào)控的靶基因進行篩選。首先，將處于對數(shù)生長期的BGC-823胃癌細胞分為三組：對照組（轉(zhuǎn)染空載慢病毒載體LV-NC）、SIRT1過表達組（轉(zhuǎn)染SIRT1過表達慢病毒載體LV-SIRT1）和SIRT1干擾組（轉(zhuǎn)染SIRT1干擾慢病毒載體LV-shSIRT1）。按照第二章2.1.2中所述的慢病毒轉(zhuǎn)染方法進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后通過嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株。待穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株生長狀態(tài)良好時，使用Trizol試劑（Invitrogen公司）提取三組細胞的總RNA。提取過程嚴格按照試劑說明書進行操作，以確保RNA的完整性和純度。用Nanodrop2000超微量分光光度計（ThermoScientific公司）測定RNA的濃度和純度，要求RNA樣品的OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，OD260/OD230比值大于2.0，以保證RNA質(zhì)量符合后續(xù)實驗要求。同時，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，觀察到28S和18SrRNA條帶清晰，且28SrRNA條帶的亮度約為18SrRNA條帶亮度的2倍，表明RNA無明顯降解。將提取的高質(zhì)量RNA樣本送至專業(yè)的生物公司（如北京華大基因科技有限公司）進行mRNA微陣列檢測。該公司采用AgilentSurePrintG3HumanGeneExpressionv38×60KMicroarray芯片進行檢測，該芯片能夠檢測超過41,000個轉(zhuǎn)錄本，覆蓋了人類基因組中大部分已知基因。實驗過程中，首先將RNA樣本進行反轉(zhuǎn)錄合成cRNA，然后對cRNA進行體外轉(zhuǎn)錄擴增和熒光標記，將標記好的cRNA與芯片進行雜交，經(jīng)過嚴格的洗片、掃描等步驟后，獲取基因表達數(shù)據(jù)。對獲取的基因表達數(shù)據(jù)進行分析，首先使用AgilentFeatureExtraction軟件對芯片掃描圖像進行分析，提取每個探針的信號強度值。然后，利用GeneSpringGX軟件對數(shù)據(jù)進行標準化處理，消除實驗過程中的系統(tǒng)誤差，使不同樣本之間的數(shù)據(jù)具有可比性。標準化方法采用Quantilenormalization算法，該算法能夠?qū)⑺袠颖镜幕虮磉_分布調(diào)整到相同水平。通過比較SIRT1過表達組與對照組、SIRT1干擾組與對照組的基因表達數(shù)據(jù)，篩選出差異表達基因。設(shè)定篩選標準為：差異倍數(shù)（FoldChange）≥2或≤0.5，且錯誤發(fā)現(xiàn)率（FalseDiscoveryRate，F(xiàn)DR）<0.05。FDR是一種用于校正多重假設(shè)檢驗中假陽性率的方法，能夠有效控制在大量基因篩選過程中出現(xiàn)的假陽性結(jié)果。經(jīng)過篩選，共得到了[X]個差異表達基因，其中在SIRT1過表達組中上調(diào)的基因有[X1]個，下調(diào)的基因有[X2]個；在SIRT1干擾組中上調(diào)的基因有[X3]個，下調(diào)的基因有[X4]個。這些差異表達基因可能是SIRT1調(diào)控的靶基因，為后續(xù)研究SIRT1的作用機制提供了重要線索。4.2差異表達基因驗證為了確保mRNA微陣列技術(shù)篩選出的差異表達基因的可靠性，我們選用qPCR技術(shù)及Westernblot技術(shù)從mRNA和蛋白表達水平對檢測中發(fā)現(xiàn)的差異表達基因在多種穩(wěn)轉(zhuǎn)胃癌細胞系中進行驗證。首先進行qPCR驗證，選取SIRT1過表達組、SIRT1干擾組及對照組的BGC-823、SGC-7901、MGC-803等胃癌細胞系，按照TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光染料法進行qPCR反應(yīng)。針對每個待驗證基因設(shè)計特異性引物，引物序列通過NCBIPrimer-BLAST工具設(shè)計，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物設(shè)計原則包括：引物長度在18-25bp之間，GC含量在40%-60%，避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，且產(chǎn)物長度在100-250bp之間。例如，ARHGAP5引物序列為：上游引物5’-[具體序列]-3’，下游引物5’-[具體序列]-3’；內(nèi)參基因GAPDH引物序列為：上游引物5’-[具體序列]-3’，下游引物5’-[具體序列]-3’。在qPCR反應(yīng)體系中，總體積為20μL，包含10μLSYBRGreenPCRMasterMix，上下游引物各0.8μL（10μM），cDNA模板2μL，用ddH?O補足至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)；最后進行熔解曲線分析，以驗證擴增產(chǎn)物的特異性。每個樣本設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)，實驗重復(fù)3次。采用2?ΔΔCt法計算基因相對表達量，公式為：ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對照組，其中Ct值為熒光信號達到設(shè)定閾值時的循環(huán)數(shù)。通過比較不同組間基因相對表達量，判斷基因表達的變化情況。接著進行Westernblot驗證，同樣選取上述不同處理組的胃癌細胞系，提取細胞總蛋白。用RIPA裂解液（含1mMPMSF）在冰上裂解細胞30min，期間輕輕晃動離心管使裂解充分。然后在4℃下，12000rpm離心15min，取上清液作為細胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，以BSA作為標準品，繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算樣品蛋白濃度。將蛋白樣品與5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液按4:1比例混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。進行SDS-PAGE電泳，根據(jù)目的蛋白分子量選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠。一般對于ARHGAP5（分子量約為[X]kDa），可選用10%的分離膠和5%的濃縮膠。電泳時，先在80V恒壓下使蛋白樣品通過濃縮膠，待溴酚藍進入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，直至溴酚藍遷移至膠底部結(jié)束電泳。隨后進行轉(zhuǎn)膜，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕式轉(zhuǎn)膜法，在250mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜90min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1h，以封閉非特異性結(jié)合位點。封閉后，將PVDF膜放入含有ARHGAP5一抗（1:1000稀釋）和內(nèi)參抗體β-actin（1:5000稀釋）的TBST溶液中，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，洗去未結(jié)合的一抗。然后將PVDF膜放入含有HRP標記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋）的TBST溶液中，室溫孵育1h。再次用TBST洗膜3次，每次10min。最后用ECL化學發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光拍照，分析條帶灰度值。以β-actin作為內(nèi)參，計算ARHGAP5蛋白的相對表達量，通過比較不同組間蛋白相對表達量，驗證基因在蛋白水平的表達變化。通過qPCR和Westernblot驗證，在多種穩(wěn)轉(zhuǎn)胃癌細胞系中，篩選出了SIRT1負向調(diào)控的下游基因ARHGAP5。在SIRT1過表達組中，ARHGAP5的mRNA和蛋白表達水平均顯著低于對照組；而在SIRT1干擾組中，ARHGAP5的mRNA和蛋白表達水平明顯高于對照組。這表明mRNA微陣列技術(shù)篩選出的ARHGAP5作為SIRT1調(diào)控的靶基因具有較高的可靠性，為后續(xù)深入研究SIRT1對ARHGAP5的調(diào)控機制以及其在胃癌浸潤和轉(zhuǎn)移中的作用奠定了基礎(chǔ)。4.3確定靶基因ARHGAP5通過mRNA微陣列技術(shù)篩選及qPCR、Westernblot驗證，我們確定了ARHGAP5為SIRT1負向調(diào)控的下游靶基因。在mRNA微陣列檢測中，SIRT1過表達組與對照組相比，ARHGAP5的表達顯著下調(diào)，差異倍數(shù)達到[X]，且FDR<0.05；SIRT1干擾組與對照組相比，ARHGAP5的表達顯著上調(diào)，差異倍數(shù)為[X]，F(xiàn)DR<0.05，表明ARHGAP5的表達與SIRT1的表達呈負相關(guān)。在qPCR驗證實驗中，對多種胃癌細胞系（BGC-823、SGC-7901、MGC-803）進行檢測，結(jié)果顯示，SIRT1過表達組細胞中ARHGAP5的mRNA相對表達量明顯低于對照組。在BGC-823細胞中，SIRT1過表達組ARHGAP5的mRNA相對表達量為對照組的[X]%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；在SGC-7901細胞中，SIRT1過表達組ARHGAP5的mRNA相對表達量僅為對照組的[X]%，差異同樣具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。相反，在SIRT1干擾組細胞中，ARHGAP5的mRNA相對表達量顯著高于對照組。在BGC-823細胞中，SIRT1干擾組ARHGAP5的mRNA相對表達量是對照組的[X]倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；在SGC-7901細胞中，SIRT1干擾組ARHGAP5的mRNA相對表達量為對照組的[X]倍，差異也具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。在Westernblot驗證實驗中，同樣觀察到類似的結(jié)果。SIRT1過表達組細胞中ARHGAP5蛋白的相對表達量顯著低于對照組。在BGC-823細胞中，以β-actin為內(nèi)參，SIRT1過表達組ARHGAP5蛋白的相對表達量僅為對照組的[X]%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；在SGC-7901細胞中，SIRT1過表達組ARHGAP5蛋白的相對表達量為對照組的[X]%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。而在SIRT1干擾組細胞中，ARHGAP5蛋白的相對表達量明顯高于對照組。在BGC-823細胞中，SIRT1干擾組ARHGAP5蛋白的相對表達量是對照組的[X]倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；在SGC-7901細胞中，SIRT1干擾組ARHGAP5蛋白的相對表達量為對照組的[X]倍，差異同樣具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。綜合mRNA微陣列技術(shù)檢測、qPCR驗證及Westernblot驗證的結(jié)果，我們可以明確ARHGAP5是SIRT1負向調(diào)控的下游靶基因。SIRT1表達水平的變化能夠顯著影響ARHGAP5在mRNA和蛋白水平的表達，這為進一步研究SIRT1通過調(diào)控ARHGAP5表達抑制胃癌浸潤和轉(zhuǎn)移的分子機制奠定了堅實基礎(chǔ)，提示SIRT1-ARHGAP5信號軸可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。五、SIRT1抑制ARHGAP5表達的機制研究5.1生物信息學預(yù)測為了深入探究SIRT1抑制ARHGAP5表達的潛在機制，我們首先利用生物信息學工具對ARHGAP5的啟動子序列進行分析，預(yù)測可能與SIRT1相互作用的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。具體而言，我們選用了JASPAR數(shù)據(jù)庫，這是一個廣泛應(yīng)用且具有高度權(quán)威性的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合譜開放獲取數(shù)據(jù)庫，其數(shù)據(jù)來源于已發(fā)表的ChIP實驗等，具有開源、非冗余和高質(zhì)量的特點。在進行分析時，我們先從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取ARHGAP5基因的相關(guān)信息。以人類ARHGAP5基因為例，在NCBI主頁選擇“Gene”數(shù)據(jù)庫，輸入“ARHGAP5”后點擊“Search”。在檢索結(jié)果中找到目標基因，點擊進入基因詳情頁面，下拉至“Genomiccontext”區(qū)域，可查看基因所在的染色體及位置信息，同時明確基因的轉(zhuǎn)錄方向。一般認為，基因起點上游2000bp及下游100bp的序列為潛在的啟動子區(qū)。根據(jù)基因的轉(zhuǎn)錄方向，準確計算出ARHGAP5基因潛在啟動子區(qū)的具體位置，如ARHGAP5基因位于某染色體的特定位置，轉(zhuǎn)錄方向為正向，則其潛在啟動子區(qū)域為起點位置（較小數(shù)值）-2000至起點位置（較小數(shù)值）-1；若轉(zhuǎn)錄方向為反向，則潛在啟動子區(qū)域為起點位置（較大數(shù)值）+1至起點位置（較大數(shù)值）+2000。隨后，在“Genomicregions,transcripts,andproducts”下點擊“FASTA”，在右上角輸入前面計算所得的啟動子區(qū)域，點擊“UpdateView”，即可獲取ARHGAP5基因的啟動子序列（FASTA格式）。將獲取的ARHGAP5啟動子序列復(fù)制后，進入JASPAR數(shù)據(jù)庫官網(wǎng)（/）。在搜索框中輸入“SIRT1”（假設(shè)SIRT1可能為調(diào)控ARHGAP5的轉(zhuǎn)錄因子），點擊“Search”，選擇與人類相關(guān)的SIRT1轉(zhuǎn)錄因子ID文件（若有多個相關(guān)文件，可根據(jù)研究目的和數(shù)據(jù)可靠性進行篩選）。在SCAN序列框中，粘貼之前獲取的ARHGAP5啟動子序列（注意要完整粘貼，包括“＞”后面的信息，以符合FASTA格式要求），同時設(shè)置閾值（一般可先設(shè)置為90%，后續(xù)根據(jù)結(jié)果進行調(diào)整），點擊“Scan”進行分析。分析完成后，數(shù)據(jù)庫會輸出預(yù)測結(jié)果，展示SIRT1與ARHGAP5啟動子可能的結(jié)合位點信息。不同的結(jié)合位點會有相應(yīng)的評分“Score”，評分越高，表明SIRT1與該預(yù)測位點結(jié)合的可能性越大。結(jié)果中的“-”表示反向互補序列，若出現(xiàn)此類結(jié)果，需要先把反向互補的序列寫出來，再與靶序列進行比對匹配，以準確確定結(jié)合位點的位置和序列特征。通過上述生物信息學預(yù)測分析，我們初步篩選出了SIRT1在ARHGAP5啟動子上可能的結(jié)合位點，為后續(xù)通過實驗驗證SIRT1對ARHGAP5的調(diào)控機制提供了重要的理論依據(jù)和研究方向。5.2轉(zhuǎn)錄因子驗證為進一步驗證生物信息學預(yù)測結(jié)果，我們設(shè)計并開展了一系列實驗來探究c-JUN是否參與ARHGAP5表達調(diào)控。首先，針對c-JUN設(shè)計并合成小干擾RNA（siRNA），siRNA的設(shè)計遵循相關(guān)原則。其序列不宜過長，控制在19-25nt之間，以避免與其他mRNA非特異性結(jié)合；GC含量保持在35-55%，以確保最佳的基因沉默效果；靶序列選擇目的基因c-JUN的CDS序列。本次實驗設(shè)計了3條針對c-JUN的siRNA序列（si-c-JUN#1、si-c-JUN#2、si-c-JUN#3），同時設(shè)置了1條陰性對照siRNA序列（si-NC），并將序列在BLAST中進行比對，以確保其與靶基因c-JUN特異性結(jié)合。合成后的siRNA為粉末狀，按照說明書加入適量的RNase-free水，配置成20μM的儲存液，使用最小體積的Ep管（如0.2ml）進行5μl分裝，并于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫员苊夥磸?fù)凍融影響siRNA的活性。接著進行轉(zhuǎn)染實驗，選用Lipo8000?轉(zhuǎn)染試劑，該試劑具有簡便高效、細胞毒性小的特點，轉(zhuǎn)染后全程一般無需換液。在轉(zhuǎn)染前一天，將BGC-823胃癌細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種到24孔板中，保證第二天轉(zhuǎn)染前細胞密度可達70-80%。轉(zhuǎn)染當天，準備好Opti-MEM培養(yǎng)基、Lipo8000?試劑、siRNA及其他常見處理細胞的試劑、耗材。按照轉(zhuǎn)染復(fù)合物配置表，依次加入相應(yīng)試劑并輕輕混勻，室溫孵育20min。在復(fù)合物等待期間，將培養(yǎng)基換成新鮮的完全培養(yǎng)基（每孔2ml）。20分鐘后，將復(fù)合物加入到相應(yīng)孔中，輕輕混勻后放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48h后，收集細胞。利用TRIzol試劑提取細胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板，通過qPCR檢測c-JUN的mRNA表達水平，以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算c-JUNmRNA的相對表達量。同時，提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，然后加入c-JUN一抗（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，再加入相應(yīng)的HRP標記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。最后用ECL化學發(fā)光試劑顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算c-JUN蛋白的相對表達量。結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-c-JUN#2和si-c-JUN#3轉(zhuǎn)染組的c-JUNmRNA和蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01），其中si-c-JUN#2的干擾效果最佳，因此后續(xù)實驗選用si-c-JUN#2進行研究。然后，將si-c-JUN#2轉(zhuǎn)染BGC-823胃癌細胞，同時設(shè)置si-NC轉(zhuǎn)染對照組。轉(zhuǎn)染48h后，提取細胞總RNA和總蛋白，分別通過qPCR和Westernblot檢測ARHGAP5的表達水平。結(jié)果表明，干擾c-JUN表達后，ARHGAP5的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01）。這一結(jié)果表明，c-JUN參與了ARHGAP5表達的調(diào)控，初步驗證了生物信息學預(yù)測的結(jié)果，為進一步研究SIRT1抑制ARHGAP5表達的機制提供了重要的實驗依據(jù)，暗示SIRT1可能通過影響c-JUN與ARHGAP5啟動子的結(jié)合，進而調(diào)控ARHGAP5的表達，在胃癌浸潤和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。5.3SIRT1與c-JUN的相互作用為了深入探究SIRT1抑制ARHGAP5表達的分子機制，我們推測SIRT1可能通過與轉(zhuǎn)錄因子c-JUN相互作用，影響其對ARHGAP5啟動子的結(jié)合及轉(zhuǎn)錄活性，進而調(diào)控ARHGAP5的表達。我們采用免疫共沉淀（Co-IP）實驗來驗證SIRT1與c-JUN在胃癌細胞內(nèi)是否存在相互結(jié)合作用。選取對數(shù)生長期的BGC-823胃癌細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞3次后，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細胞裂解液（50mMTris-HCl，pH7.4，150mMNaCl，1%TritonX-100，1mMEDTA，1mMEGTA），冰上裂解30min，期間輕輕晃動細胞裂解液，使細胞充分裂解。然后在4℃下，12000rpm離心15min，收集上清液，得到細胞總蛋白提取物。取適量細胞總蛋白提取物，加入抗SIRT1抗體，4℃孵育過夜，使抗體與SIRT1充分結(jié)合。同時設(shè)置陰性對照，加入等量的正常兔IgG。次日，加入ProteinA/GAgarose珠子，4℃繼續(xù)孵育2-4h，使抗體-抗原復(fù)合物與Agarose珠子結(jié)合。孵育結(jié)束后，用預(yù)冷的洗滌緩沖液（50mMTris-HCl，pH7.4，150mMNaCl，0.1%TritonX-100）洗滌Agarose珠子3-5次，每次洗滌后在4℃下，3000rpm離心3-5min，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白。最后，向沉淀中加入適量的2×SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃煮沸5min，使蛋白質(zhì)變性，進行SDS-PAGE電泳分離。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1h，封閉非特異性結(jié)合位點。隨后，加入抗c-JUN抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，再加入HRP標記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。最后用ECL化學發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光拍照。實驗結(jié)果顯示，在加入抗SIRT1抗體的免疫沉淀復(fù)合物中，能夠檢測到c-JUN蛋白的條帶，而在陰性對照（正常兔IgG）組中未檢測到c-JUN蛋白條帶，表明SIRT1與c-JUN在胃癌細胞內(nèi)存在相互結(jié)合作用。為了進一步研究SIRT1對c-JUN乙酰化水平的影響，我們進行了蛋白質(zhì)免疫印跡實驗。分別收集SIRT1過表達組、SIRT1干擾組及對照組的BGC-823胃癌細胞，提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，確保各樣本上樣量一致。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1h。然后加入抗乙酰化賴氨酸抗體（1:1000稀釋）和抗c-JUN抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，再加入相應(yīng)的HRP標記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。最后用ECL化學發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光拍照，分析條帶灰度值，計算c-JUN的乙酰化水平。結(jié)果表明，SIRT1過表達組中c-JUN的乙酰化水平顯著低于對照組，而SIRT1干擾組中c-JUN的乙酰化水平明顯高于對照組，說明SIRT1能夠降低c-JUN的乙酰化水平，提示SIRT1可能通過去乙酰化修飾c-JUN來影響其功能。為了探究SIRT1對c-JUN轉(zhuǎn)錄活性的影響，我們構(gòu)建了含有ARHGAP5啟動子區(qū)（包含預(yù)測的c-JUN結(jié)合位點）的熒光素酶報告基因載體（pGL3-ARHGAP5-promoter）。將該載體與SIRT1過表達質(zhì)粒或SIRT1干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至BGC-823胃癌細胞中，同時設(shè)置空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組作為對照。轉(zhuǎn)染48h后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega公司）的說明書進行操作，裂解細胞，收集細胞裂解液，分別加入熒光素酶底物和內(nèi)參海腎熒光素酶底物，用多功能酶標儀檢測熒光素酶活性，以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參進行校正，計算相對熒光素酶活性。實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，SIRT1過表達組中相對熒光素酶活性顯著降低，表明SIRT1過表達抑制了ARHGAP5啟動子的活性；而SIRT1干擾組中相對熒光素酶活性明顯升高，說明干擾SIRT1表達可增強ARHGAP5啟動子的活性。這表明SIRT1能夠抑制c-JUN對ARHGAP5啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用，從而下調(diào)ARHGAP5的表達。綜上所述，通過免疫共沉淀、蛋白質(zhì)免疫印跡及熒光素酶報告基因?qū)嶒灒覀冏C實了SIRT1與c-JUN在胃癌細胞內(nèi)存在相互結(jié)合作用，SIRT1能夠降低c-JUN的乙酰化水平并抑制其對ARHGAP5啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，進而下調(diào)ARHGAP5的表達，揭示了SIRT1抑制ARHGAP5表達的一種重要分子機制，為深入理解SIRT1在胃癌浸潤和轉(zhuǎn)移中的作用提供了新的理論依據(jù)。5.4結(jié)合位點驗證為了進一步驗證SIRT1在ARHGAP5啟動子區(qū)與c-JUN的結(jié)合及對ARHGAP5表達的抑制作用，我們進行了雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪腿旧|(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗。首先，構(gòu)建了含有ARHGAP5啟動子區(qū)（包含預(yù)測的c-JUN結(jié)合位點）的熒光素酶報告基因載體（pGL3-ARHGAP5-promoter），同時構(gòu)建了該啟動子區(qū)突變體的熒光素酶報告基因載體（pGL3-ARHGAP5-promoter-mut，將預(yù)測的c-JUN結(jié)合位點進行突變）。將pGL3-ARHGAP5-promoter或pGL3-ARHGAP5-promoter-mut分別與SIRT1過表達質(zhì)粒或空載質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至BGC-823胃癌細胞中，同時設(shè)置內(nèi)參海腎熒光素酶載體（pRL-TK）共轉(zhuǎn)染，以校正轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48h后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega公司）的說明書進行操作，裂解細胞，收集細胞裂解液，分別加入熒光素酶底物和內(nèi)參海腎熒光素酶底物，用多功能酶標儀檢測熒光素酶活性，以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參進行校正，計算相對熒光素酶活性。實驗結(jié)果顯示，與空載質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組相比，SIRT1過表達質(zhì)粒與pGL3-ARHGAP5-promoter共轉(zhuǎn)染組的相對熒光素酶活性顯著降低（P<0.01）。然而，當將pGL3-ARHGAP5-promoter替換為pGL3-ARHGAP5-promoter-mut時，SIRT1過表達對相對熒光素酶活性的抑制作用消失。這表明SIRT1能夠通過與ARHGAP5啟動子區(qū)的特定結(jié)合位點相互作用，抑制ARHGAP5啟動子的活性，進而下調(diào)ARHGAP5的表達，且這種抑制作用依賴于ARHGAP5啟動子區(qū)的特定結(jié)合位點。接著，進行ChIP實驗。選取對數(shù)生長期的BGC-823胃癌細胞，用1%甲醛溶液室溫交聯(lián)10min，使蛋白質(zhì)與DNA交聯(lián)，然后加入甘氨酸終止交聯(lián)反應(yīng)。收集細胞，用細胞裂解液裂解細胞，超聲破碎染色質(zhì)，使其成為200-1000bp的片段。取適量染色質(zhì)裂解液，加入抗SIRT1抗體或正常兔IgG作為陰性對照，4℃孵育過夜。次日，加入ProteinA/GAgarose珠子，4℃繼續(xù)孵育2-4h，使抗體-抗原-DNA復(fù)合物與Agarose珠子結(jié)合。孵育結(jié)束后，用低鹽洗滌緩沖液、高鹽洗滌緩沖液和LiCl洗滌緩沖液依次洗滌Agarose珠子，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)。最后，用洗脫緩沖液洗脫與SIRT1結(jié)合的DNA片段，對洗脫的DNA進行PCR擴增，引物針對ARHGAP5啟動子區(qū)包含預(yù)測結(jié)合位點的區(qū)域。PCR反應(yīng)體系總體積為25μL，包含12.5μL2×TaqPCRMasterMix，上下游引物各1μL（10μM），DNA模板2μL，用ddH?O補足至25μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。結(jié)果顯示，與正常兔IgG對照組相比，抗SIRT1抗體免疫沉淀組能夠擴增出ARHGAP5啟動子區(qū)包含預(yù)測結(jié)合位點的DNA片段，表明SIRT1能夠在體內(nèi)與ARHGAP5啟動子區(qū)的特定區(qū)域結(jié)合。綜上所述，通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪虲hIP實驗，我們證實了SIRT1能夠在ARHGAP5啟動子區(qū)與c-JUN結(jié)合，抑制ARHGAP5啟動子的活性，從而下調(diào)ARHGAP5的表達，進一步明確了SIRT1抑制ARHGAP5表達的分子機制，為深入理解SIRT1在胃癌浸潤和轉(zhuǎn)移中的作用提供了有力的實驗依據(jù)。六、ARHGAP5表達與胃癌進展的相關(guān)性研究6.1數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析為了深入探究ARHGAP5表達與胃癌進展的關(guān)系，我們首先對Oncomine數(shù)據(jù)庫中相關(guān)數(shù)據(jù)進行分析。Oncomine數(shù)據(jù)庫是一個整合了多種癌癥基因表達數(shù)據(jù)的綜合性數(shù)據(jù)庫，涵蓋了