SiRNA轉(zhuǎn)染調(diào)控肝癌HepG2細胞Survivin基因表達及其凋亡機制的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義1.1.1肝癌的現(xiàn)狀與危害肝癌是全球范圍內(nèi)嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）數(shù)據(jù)顯示，2020年全球肝癌新發(fā)病例數(shù)約為90.5萬例，死亡病例數(shù)約為83萬例，肝癌在全球癌癥發(fā)病率中位居第六，在癌癥死亡率中位列第四。在中國，肝癌的形勢更為嚴峻，是第三大常見癌癥，也是第二大癌癥死亡原因，2020年新發(fā)病例數(shù)約為41.1萬例，死亡病例數(shù)約為39.1萬例。肝癌的高發(fā)病率和死亡率給社會和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟負擔和精神壓力。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，失去了手術(shù)根治的機會。而且肝癌對傳統(tǒng)的放化療敏感性較低，預(yù)后較差，患者5年總體生存率不足15%。此外，肝癌的發(fā)生與多種因素有關(guān)，如乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染、飲酒、吸煙、肥胖、黃曲霉毒素污染等，這些因素在我國及全球部分地區(qū)廣泛存在，進一步增加了肝癌的防控難度。因此，深入研究肝癌的發(fā)病機制，尋找有效的治療靶點和治療方法迫在眉睫。1.1.2Survivin基因與肝癌的關(guān)系Survivin基因是凋亡抑制蛋白（Inhibitorsofapoptosisprotein，IAP）家族成員之一，其編碼的Survivin蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。在肝癌細胞中，Survivin基因呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。研究表明，Survivin蛋白通過多種途徑促進肝癌的發(fā)展。在細胞增殖方面，Survivin可以與細胞周期調(diào)控蛋白相互作用，促進肝癌細胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，加速細胞周期進程，從而促進肝癌細胞的增殖。同時，Survivin能夠抑制肝癌細胞的凋亡。它可以直接抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3、Caspase-7等凋亡執(zhí)行蛋白的活性，阻斷細胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)；還可以通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位，抑制細胞色素C的釋放，從而抑制內(nèi)源性凋亡途徑。此外，Survivin在腫瘤血管生成中也具有重要作用，它可以上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成因子的表達，促進腫瘤血管的生成，為腫瘤細胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣，支持腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中，Survivin通過調(diào)節(jié)細胞黏附分子和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，增強肝癌細胞的遷移和侵襲能力。由于Survivin在肝癌中的關(guān)鍵作用，其成為肝癌治療的一個極具潛力的靶點。1.1.3SiRNA技術(shù)的原理與應(yīng)用前景SiRNA技術(shù)即小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）技術(shù)，其作用機制基于轉(zhuǎn)錄后基因沉默。細胞內(nèi)的雙鏈RNA（dsRNA）被核酸酶Dicer切割成21-23個核苷酸長的siRNA雙鏈體。雙鏈體由一條有義鏈（passengerstrand）和一條反義鏈（guidestrand）組成。siRNA被整合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）中，與RISC中的Argonaute2蛋白相互作用，導(dǎo)致雙鏈解旋，有義鏈降解。反義鏈引導(dǎo)RISC識別并結(jié)合與反義鏈互補的靶mRNA序列，在結(jié)合部位切割mRNA，使mRNA降解，從而實現(xiàn)對特定基因表達的沉默。SiRNA技術(shù)在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛在應(yīng)用價值。由于其能夠特異性地沉默靶基因，為腫瘤的靶向治療提供了新的策略。在肝癌治療研究中，針對肝癌相關(guān)的關(guān)鍵基因如Survivin基因，利用SiRNA技術(shù)可以有效抑制其表達，從而抑制肝癌細胞的增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移。相較于傳統(tǒng)的治療方法，SiRNA技術(shù)具有高度的特異性，能夠精準地作用于目標基因，減少對正常細胞的損傷，降低副作用。而且其研發(fā)周期相對較短，靶點選擇范圍廣，能夠針對不同的腫瘤相關(guān)基因進行設(shè)計和應(yīng)用。雖然目前SiRNA技術(shù)在臨床應(yīng)用中還面臨著一些挑戰(zhàn)，如細胞攝取效率低、體內(nèi)穩(wěn)定性差、潛在的脫靶效應(yīng)等，但隨著研究的不斷深入和技術(shù)的不斷改進，這些問題正在逐步得到解決，SiRNA技術(shù)有望成為肝癌治療的重要手段之一。1.2研究目的與問題提出本研究旨在深入探究SiRNA轉(zhuǎn)染對肝癌HepG2細胞Survivin基因表達的影響，并進一步闡明其誘導(dǎo)細胞凋亡的分子機制，為肝癌的基因治療提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。具體而言，本研究將圍繞以下幾個關(guān)鍵問題展開探討：SiRNA轉(zhuǎn)染能否有效抑制肝癌HepG2細胞中Survivin基因的表達？Survivin基因在肝癌細胞中高表達，其表達的抑制對于肝癌的治療具有重要意義。通過設(shè)計并合成針對Survivin基因的特異性SiRNA，將其轉(zhuǎn)染至肝癌HepG2細胞，檢測Survivin基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達變化，從而明確SiRNA轉(zhuǎn)染對Survivin基因表達的抑制效果。SiRNA轉(zhuǎn)染抑制Survivin基因表達后，肝癌HepG2細胞的凋亡率會發(fā)生怎樣的變化？細胞凋亡是腫瘤治療的重要靶點，Survivin基因作為凋亡抑制蛋白，其表達被抑制后可能會促進細胞凋亡。運用流式細胞術(shù)、TUNEL染色等方法檢測細胞凋亡率的變化，分析SiRNA轉(zhuǎn)染抑制Survivin基因表達與細胞凋亡之間的關(guān)聯(lián)。SiRNA轉(zhuǎn)染抑制Survivin基因表達誘導(dǎo)肝癌HepG2細胞凋亡的具體分子機制是什么？Survivin基因抑制導(dǎo)致細胞凋亡可能涉及多條信號通路和相關(guān)分子的調(diào)控。研究將深入探究線粒體凋亡途徑、死亡受體凋亡途徑以及其他相關(guān)信號通路中關(guān)鍵分子的表達和活性變化，如Caspase家族蛋白、Bcl-2家族蛋白、p53等，以揭示SiRNA轉(zhuǎn)染抑制Survivin基因表達誘導(dǎo)細胞凋亡的分子機制。1.3研究方法與創(chuàng)新點1.3.1研究方法細胞培養(yǎng)：將肝癌HepG2細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期傳代和換液，取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。通過細胞培養(yǎng)，可獲得足夠數(shù)量且狀態(tài)良好的肝癌HepG2細胞，為后續(xù)實驗提供穩(wěn)定的細胞來源。SiRNA轉(zhuǎn)染：針對Survivin基因設(shè)計并合成特異性SiRNA序列，同時設(shè)置陰性對照SiRNA。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將SiRNA轉(zhuǎn)染至肝癌HepG2細胞中。具體步驟為：將細胞接種于6孔板，待細胞融合度達到70%-80%時，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書，將SiRNA與脂質(zhì)體混合，加入無血清培養(yǎng)基中稀釋，然后加入細胞培養(yǎng)孔中，37℃孵育6h后，更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。該步驟旨在將SiRNA導(dǎo)入細胞，以實現(xiàn)對Survivin基因的沉默，從而研究其對細胞的影響。基因表達檢測：采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)檢測Survivin基因在mRNA水平的表達變化。提取轉(zhuǎn)染后細胞的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，利用Survivin基因特異性引物和熒光定量PCR試劑進行擴增，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算Survivin基因的相對表達量。此外，運用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測Survivin蛋白的表達。提取細胞總蛋白，通過SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉后，依次加入Survivin蛋白一抗、二抗，最后通過化學發(fā)光法顯影，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算Survivin蛋白的相對表達量。基因表達檢測有助于明確SiRNA轉(zhuǎn)染對Survivin基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的抑制效果。細胞凋亡檢測：利用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。將轉(zhuǎn)染后的細胞用胰酶消化收集，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15-20min，然后用流式細胞儀檢測，通過分析AnnexinV-FITC和PI雙染的細胞比例，確定細胞凋亡率。同時，采用TUNEL染色法檢測細胞凋亡。將細胞接種于玻片上，轉(zhuǎn)染后進行TUNEL染色，通過熒光顯微鏡觀察并計數(shù)凋亡細胞，計算凋亡指數(shù)。細胞凋亡檢測能直觀地反映SiRNA轉(zhuǎn)染抑制Survivin基因表達后對細胞凋亡的影響。信號通路相關(guān)分子檢測：通過Westernblot技術(shù)檢測線粒體凋亡途徑相關(guān)分子如Bcl-2、Bax、細胞色素C，死亡受體凋亡途徑相關(guān)分子如Fas、FasL、Caspase-8，以及其他相關(guān)信號通路關(guān)鍵分子如p53、p21等的表達變化。此外，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測Caspase-3、Caspase-9等凋亡相關(guān)酶的活性。這些檢測可深入探究SiRNA轉(zhuǎn)染抑制Survivin基因表達誘導(dǎo)細胞凋亡的分子機制。1.3.2創(chuàng)新點實驗設(shè)計創(chuàng)新：本研究構(gòu)建了多個針對Survivin基因不同位點的SiRNA序列，進行多靶點干擾實驗，與傳統(tǒng)的單靶點SiRNA干擾相比，能更全面地抑制Survivin基因表達，提高干擾效率，減少因單個靶點逃逸導(dǎo)致的干擾失敗情況。同時，設(shè)置了不同時間點和不同濃度的SiRNA轉(zhuǎn)染組，系統(tǒng)地研究SiRNA轉(zhuǎn)染對Survivin基因表達和細胞凋亡的時間效應(yīng)和劑量效應(yīng)，為優(yōu)化SiRNA轉(zhuǎn)染條件提供更豐富的數(shù)據(jù)支持。技術(shù)應(yīng)用創(chuàng)新：在實驗中引入了納米材料介導(dǎo)的SiRNA遞送技術(shù)。納米材料具有獨特的物理化學性質(zhì)，如良好的生物相容性、高載藥量、可修飾性等，能夠有效提高SiRNA的細胞攝取效率和體內(nèi)穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)相比，納米材料介導(dǎo)的遞送系統(tǒng)可以更精準地將SiRNA遞送至肝癌細胞，減少對正常細胞的影響，降低潛在的副作用，為SiRNA在肝癌治療中的應(yīng)用提供了新的技術(shù)思路。研究角度創(chuàng)新：以往關(guān)于Survivin基因與肝癌細胞凋亡的研究主要集中在線粒體凋亡途徑和死亡受體凋亡途徑。本研究除了深入探究這兩條經(jīng)典途徑外，還從細胞自噬與凋亡的交互作用角度進行研究。分析SiRNA轉(zhuǎn)染抑制Survivin基因表達后，細胞自噬相關(guān)蛋白如LC3、Beclin-1等的表達變化，以及自噬抑制劑或激活劑對細胞凋亡的影響，揭示細胞自噬在SiRNA轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡過程中的作用機制，為肝癌的治療提供新的理論依據(jù)和治療靶點。二、相關(guān)理論與技術(shù)基礎(chǔ)2.1SiRNA技術(shù)原理與作用機制2.1.1SiRNA的結(jié)構(gòu)與特點SiRNA即小干擾RNA（smallinterferingRNA），是一類長度約為21-23個核苷酸的雙鏈RNA分子。其結(jié)構(gòu)具有獨特的特征，兩條鏈完全互補配對，在3'端均有兩個游離的堿基突出，通常為UU或dTdT（dT代表脫氧胸苷），這種3'端突出結(jié)構(gòu)對于SiRNA的功能發(fā)揮至關(guān)重要，能夠增強其雙鏈復(fù)合體的穩(wěn)定性。5'端則帶有磷酸基團。從堿基組成來看，SiRNA沒有特定的堿基組成偏好，但一般要求G/C含量在30%-70%之間。具有均衡堿基含量的序列更有可能成為有效的SiRNA候選序列。同時，應(yīng)避免連續(xù)的單一堿基和反向重復(fù)序列。連續(xù)2個以上的G和C會降低雙鏈RNA的內(nèi)在穩(wěn)定性，從而抑制RNAi作用；連續(xù)3個以上的U和A可能終止由RNAPolymeraseIII介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。SiRNA與mRNA相互作用具有高度特異性。這種特異性源于其堿基互補配對原則。在RNA干擾過程中，SiRNA的反義鏈能夠與靶mRNA上與之互補的序列精確結(jié)合。這就要求SiRNA序列設(shè)計時，必須與靶mRNA序列高度同源，并且盡量避免與其他非靶基因的mRNA序列存在同源區(qū)域。通過美國NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）的EST或Unigene數(shù)據(jù)庫進行BLAST同源性比對，可以確保候選SiRNA序列只沉默單一的靶基因，從而實現(xiàn)對特定基因表達的精準調(diào)控。例如，針對肝癌HepG2細胞中Survivin基因設(shè)計的SiRNA，其序列會根據(jù)Survivin基因的mRNA序列特定區(qū)域進行設(shè)計，保證能特異性地識別并結(jié)合SurvivinmRNA，而不與其他基因的mRNA發(fā)生非特異性結(jié)合。2.1.2RNA干擾（RNAi）的作用過程RNA干擾（RNAi）是一種在真核生物中高度保守的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制，其核心過程圍繞著SiRNA展開。首先是SiRNA的攝取。SiRNA可以通過多種方式進入細胞，常見的方法如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔法、病毒載體介導(dǎo)等。以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染為例，脂質(zhì)體與SiRNA形成復(fù)合物，利用細胞膜的流動性和融合性，將SiRNA帶入細胞內(nèi)。進入細胞后，SiRNA會與相關(guān)蛋白形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。RISC是RNAi過程中的關(guān)鍵效應(yīng)復(fù)合物，主要由核酸酶、解旋酶以及Argonaute蛋白等組成。在形成RISC的過程中，SiRNA雙鏈被解旋，其中的反義鏈（guidestrand）與RISC緊密結(jié)合，而有義鏈（passengerstrand）則被降解。這一過程需要ATP提供能量，解旋酶發(fā)揮作用促使雙鏈解開。接著，結(jié)合了反義鏈的RISC通過堿基互補配對原則識別靶mRNA。反義鏈上的核苷酸序列與靶mRNA上的互補序列精確匹配，引導(dǎo)RISC定位到靶mRNA。一旦RISC與靶mRNA結(jié)合，RISC中的核酸酶活性被激活，在互補區(qū)域?qū)Π衜RNA進行切割，使其降解。從而阻斷了靶基因從mRNA到蛋白質(zhì)的翻譯過程，實現(xiàn)對特定基因表達的沉默。整個RNAi過程具有高效性和特異性。高效性體現(xiàn)在少量的SiRNA就能引發(fā)顯著的基因沉默效應(yīng)，因為一個SiRNA-RISC復(fù)合物可以多次作用于不同的靶mRNA分子。特異性則源于SiRNA與靶mRNA的精確堿基互補配對，只要SiRNA序列設(shè)計合理，就能準確地作用于目標基因，而對其他非靶基因的表達幾乎沒有影響。在肝癌HepG2細胞中，針對Survivin基因的SiRNA轉(zhuǎn)染后，通過RNAi作用，能夠特異性地沉默Survivin基因的表達，而對細胞內(nèi)其他正常基因的表達水平不產(chǎn)生明顯干擾，為研究Survivin基因在肝癌細胞中的功能以及探索肝癌治療新方法提供了有力的技術(shù)手段。2.2Survivin基因的生物學功能2.2.1Survivin基因的結(jié)構(gòu)與表達調(diào)控Survivin基因定位于人類染色體17q25，全長約14.7kb，包含4個外顯子和3個內(nèi)含子。其編碼的Survivin蛋白由142個氨基酸組成，分子量約為16kDa，是凋亡抑制蛋白（IAP）家族中最小的成員。Survivin蛋白的結(jié)構(gòu)獨特，僅含有一個桿狀病毒IAP重復(fù)（BIR）結(jié)構(gòu)域和一個C末端的α螺旋結(jié)構(gòu)，缺乏其他IAP家族成員所特有的環(huán)指結(jié)構(gòu)。BIR結(jié)構(gòu)域?qū)τ赟urvivin發(fā)揮抗凋亡作用至關(guān)重要，它可以與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族成員相互作用，抑制Caspase的活性，從而阻斷細胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)。C末端的α螺旋結(jié)構(gòu)則參與了Survivin與紡錘體微管的結(jié)合，在細胞有絲分裂過程中發(fā)揮重要作用。Survivin基因的表達具有明顯的組織特異性。在正常成人已分化的組織中（胸腺、生殖腺除外），Survivin基因幾乎不表達。然而，在多種腫瘤組織中，Survivin基因呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。研究表明，Survivin基因在肝癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤組織中的表達水平顯著高于正常組織。這種異常高表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Survivin基因的表達受到多種因素的調(diào)控。在轉(zhuǎn)錄水平上，多種轉(zhuǎn)錄因子參與了Survivin基因的表達調(diào)控。如核因子-κB（NF-κB）、E2F轉(zhuǎn)錄因子家族等可以與Survivin基因啟動子區(qū)域的特定序列結(jié)合，促進其轉(zhuǎn)錄。在肝癌細胞中，NF-κB的激活可以上調(diào)Survivin基因的表達，從而增強肝癌細胞的抗凋亡能力和增殖活性。一些表觀遺傳修飾也對Survivin基因的表達產(chǎn)生影響。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳調(diào)控機制，Survivin基因啟動子區(qū)域的低甲基化狀態(tài)與基因的高表達相關(guān)。在腫瘤細胞中，Survivin基因啟動子區(qū)域的甲基化水平明顯低于正常細胞，導(dǎo)致其表達上調(diào)。組蛋白修飾如乙酰化、甲基化等也可以改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性，進而影響Survivin基因的轉(zhuǎn)錄。在翻譯水平上，Survivin基因的表達也受到精細調(diào)控。微小RNA（miRNA）是一類內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，可以通過與靶mRNA的互補配對結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過程或促進其降解。已有研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA如miR-16、miR-34a等可以靶向Survivin基因的mRNA，抑制其翻譯，從而降低Survivin蛋白的表達水平。在肝癌細胞中，miR-16的過表達可以顯著降低Survivin蛋白的表達，誘導(dǎo)細胞凋亡，抑制細胞增殖。此外，一些RNA結(jié)合蛋白也可以與SurvivinmRNA相互作用，影響其穩(wěn)定性和翻譯效率。2.2.2Survivin在細胞凋亡與增殖中的作用機制Survivin在細胞凋亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的抑制作用。其主要通過以下幾種機制來抑制細胞凋亡：直接抑制Caspase活性：Caspase家族是細胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行者，Survivin可以通過其BIR結(jié)構(gòu)域與Caspase-3、Caspase-7等凋亡執(zhí)行蛋白直接結(jié)合。這種結(jié)合能夠抑制Caspase的酶活性，阻斷細胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)。在肝癌細胞中，當Survivin與Caspase-3結(jié)合后，Caspase-3無法被激活，從而不能對下游的底物進行切割，細胞凋亡過程被抑制。調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑：線粒體是細胞凋亡的重要調(diào)控中心。在細胞凋亡過程中，線粒體膜電位下降，細胞色素C從線粒體釋放到細胞質(zhì)中。細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、dATP等結(jié)合形成凋亡小體，進而激活Caspase-9，啟動內(nèi)源性凋亡途徑。Survivin可以通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位，抑制細胞色素C的釋放。研究發(fā)現(xiàn)，Survivin可以與線粒體膜上的一些蛋白相互作用，穩(wěn)定線粒體膜的結(jié)構(gòu)，防止細胞色素C的泄漏。同時，Survivin還可以抑制Apaf-1與細胞色素C的結(jié)合，從而阻斷凋亡小體的形成，抑制Caspase-9的激活，最終抑制細胞凋亡。調(diào)節(jié)其他凋亡相關(guān)蛋白：Survivin還可以與其他凋亡相關(guān)蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細胞凋亡。例如，Survivin可以與XIAP（X連鎖凋亡抑制蛋白）相互作用，增強XIAP對Caspase的抑制作用。XIAP也是IAP家族的成員，它可以直接抑制Caspase-3、Caspase-7和Caspase-9的活性。Survivin與XIAP的結(jié)合可以進一步增強XIAP對Caspase的抑制效果，從而更有效地抑制細胞凋亡。Survivin在細胞增殖過程中也發(fā)揮著重要作用。它與細胞周期的調(diào)控密切相關(guān)，在細胞周期的G2/M期選擇性表達。Survivin可以通過與紡錘體微管相互作用，參與細胞有絲分裂的調(diào)控。在有絲分裂過程中，Survivin定位于紡錘體微管上，它可以穩(wěn)定紡錘體微管的結(jié)構(gòu)，確保染色體的正確分離和細胞的正常分裂。如果Survivin的表達受到抑制，紡錘體微管的穩(wěn)定性會受到影響，導(dǎo)致染色體分離異常，細胞有絲分裂受阻，進而影響細胞的增殖。Survivin還可以通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白的表達來促進細胞增殖。它可以上調(diào)細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的活性，促進細胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化。同時，Survivin還可以抑制p21、p27等細胞周期負調(diào)控蛋白的表達，從而解除對細胞周期的抑制，促進細胞增殖。在肝癌細胞中，Survivin的高表達可以促使細胞周期進程加快，細胞增殖能力增強。Survivin在細胞凋亡與增殖中的作用并不是孤立的，而是與其他凋亡相關(guān)蛋白和信號通路相互作用。例如，在腫瘤細胞中，Survivin與p53蛋白之間存在復(fù)雜的相互關(guān)系。p53是一種重要的腫瘤抑制蛋白，它可以通過激活p21等細胞周期負調(diào)控蛋白，抑制細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡。而Survivin可以通過抑制p53的活性，削弱p53對細胞凋亡的誘導(dǎo)作用，同時促進細胞增殖。Survivin還可以與PI3K/Akt信號通路相互作用。PI3K/Akt信號通路在細胞存活、增殖和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。激活的Akt可以磷酸化Survivin，增強Survivin的抗凋亡能力和對細胞增殖的促進作用。反過來，Survivin也可以通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路中的一些關(guān)鍵蛋白，影響該信號通路的活性，從而進一步影響細胞凋亡與增殖。2.3肝癌HepG2細胞的特性與研究現(xiàn)狀2.3.1HepG2細胞的來源與生物學特性HepG2細胞來源于一名15歲白人少年的肝癌組織，屬于人肝癌細胞系。在形態(tài)學上，HepG2細胞呈現(xiàn)上皮樣形態(tài)，細胞外觀較為扁平，呈多角形，貼壁生長時可形成緊密的細胞單層。其細胞邊界清晰，具有明顯的細胞核和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)。從生長特性來看，HepG2細胞具有貼壁生長的特性。在培養(yǎng)過程中，細胞會迅速貼附于培養(yǎng)器皿表面，并開始分裂增殖。當細胞密度達到一定程度時，會發(fā)生接觸抑制現(xiàn)象，細胞生長速度減緩。HepG2細胞的生長周期相對較短，在適宜的培養(yǎng)條件下，其倍增時間約為24-36小時。這使得研究人員能夠在較短時間內(nèi)獲得大量的細胞用于實驗研究。在遺傳背景方面，HepG2細胞具有復(fù)雜的染色體異常。其染色體數(shù)目在44-52條之間，存在多種染色體畸變，如缺失、易位、擴增等。這些染色體異常與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如，一些與細胞增殖、凋亡調(diào)控相關(guān)的基因所在染色體區(qū)域發(fā)生異常改變，導(dǎo)致基因表達失調(diào)，進而影響細胞的生物學行為。同時，HepG2細胞表達多種與肝癌相關(guān)的標志物，如甲胎蛋白（AFP）。AFP是一種重要的肝癌標志物，在肝癌的診斷、病情監(jiān)測和預(yù)后評估中具有重要價值。HepG2細胞高表達AFP，這與肝癌患者體內(nèi)腫瘤細胞的特征相符。此外，HepG2細胞還表達白蛋白、α-2-巨球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等多種血漿蛋白，這些蛋白的表達與細胞的代謝和功能密切相關(guān)。HepG2細胞還表達胰島素受體和胰島素樣生長因子IGFⅡ的受體，這表明其生長和代謝可能受到胰島素和IGFⅡ等生長因子的調(diào)控。胰島素和IGFⅡ可以通過與細胞表面的受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)的信號通路，促進細胞的增殖和存活。在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中，這些生長因子信號通路的異常激活可能起到重要作用。HepG2細胞具有3-羥基-3-甲基戊二酸輔酶A還原酶和肝甘油三酯脂肪酶的活性，參與細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝過程。脂質(zhì)代謝異常在肝癌的發(fā)生發(fā)展中也具有重要意義，HepG2細胞的這些特性為研究肝癌與脂質(zhì)代謝的關(guān)系提供了良好的細胞模型。2.3.2HepG2細胞在肝癌研究中的應(yīng)用HepG2細胞在肝癌發(fā)病機制研究中發(fā)揮著重要作用。研究人員利用HepG2細胞探究肝癌細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學過程的分子機制。通過對HepG2細胞進行基因敲除、過表達等操作，研究特定基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的功能。在研究Survivin基因?qū)Ω伟┘毎鲋车挠绊憰r，可將針對Survivin基因的siRNA轉(zhuǎn)染至HepG2細胞，觀察細胞增殖能力的變化。實驗結(jié)果顯示，抑制Survivin基因表達后，HepG2細胞的增殖速度明顯減緩，表明Survivin基因在肝癌細胞增殖過程中發(fā)揮著促進作用。在肝癌的藥物篩選方面，HepG2細胞被廣泛應(yīng)用。許多研究以HepG2細胞為模型，評估各種潛在抗癌藥物的療效和安全性。通過檢測藥物對HepG2細胞增殖、凋亡、遷移等生物學行為的影響，篩選出具有潛在抗癌活性的藥物。有研究發(fā)現(xiàn)，某新型化合物作用于HepG2細胞后，能夠顯著抑制細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，且對正常細胞的毒性較小，為肝癌的藥物研發(fā)提供了新的候選藥物。在基因治療研究領(lǐng)域，HepG2細胞也為相關(guān)研究提供了重要的實驗?zāi)Ｐ汀Ｑ芯咳藛T利用HepG2細胞探索針對肝癌的基因治療策略，如通過導(dǎo)入抑癌基因、抑制癌基因表達等方式來治療肝癌。利用腺病毒載體將p53基因?qū)際epG2細胞，結(jié)果顯示p53基因的表達能夠顯著抑制HepG2細胞的生長，誘導(dǎo)細胞凋亡，為肝癌的基因治療提供了實驗依據(jù)。此外，HepG2細胞還可用于研究肝癌與其他疾病的關(guān)聯(lián)。例如，研究肝癌與代謝綜合征的關(guān)系時，可通過對HepG2細胞進行高脂、高糖等處理，模擬代謝綜合征的微環(huán)境，觀察細胞的生物學行為變化以及相關(guān)基因和蛋白的表達改變。研究發(fā)現(xiàn)，在高脂、高糖環(huán)境下，HepG2細胞的增殖能力增強，侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達上調(diào)，揭示了代謝綜合征可能促進肝癌發(fā)生發(fā)展的潛在機制。三、實驗材料與方法3.1實驗材料3.1.1細胞系與細胞培養(yǎng)實驗所使用的肝癌HepG2細胞系購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。該細胞系來源于一名15歲白人少年的肝癌組織，具有上皮樣形態(tài)，貼壁生長特性。細胞培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基為高糖DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）培養(yǎng)基，購自Gibco公司。培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS），F(xiàn)BS購自杭州四季青生物工程材料有限公司，其富含多種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠為細胞生長提供必要的支持。同時，在培養(yǎng)基中加入100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（雙抗），購自Solarbio公司，用于防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染。細胞培養(yǎng)條件為：將細胞置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)箱購自ThermoFisherScientific公司，其能夠精確控制溫度和CO?濃度，為細胞提供穩(wěn)定的生長環(huán)境。定期對細胞進行傳代和換液操作。當細胞生長至80%-90%匯合度時，進行傳代。傳代時，先用不含鈣、鎂離子的PBS（磷酸鹽緩沖液，購自Solarbio公司）潤洗細胞1-2次，去除殘留的培養(yǎng)基。然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA（購自Gibco公司）溶液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，待細胞大部分變圓并脫離培養(yǎng)瓶壁時，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細胞，使其形成單細胞懸液，然后按照1:3-1:4的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，以保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和pH值穩(wěn)定。3.1.2SiRNA的設(shè)計與合成根據(jù)Survivin基因在GenBank中的序列（登錄號：NM_001168.2），利用Ambion公司的在線設(shè)計工具（/techlib/misc/siRNA_finder.html）設(shè)計特異性SiRNA。設(shè)計原則如下：選擇從mRNA起始密碼子AUG開始的19-21個核苷酸序列，優(yōu)先選擇AA(N19)TT或NA(N21)的序列，其中N代表任意核苷酸。確保所選序列的G/C含量在30%-70%之間，以保證SiRNA的穩(wěn)定性和有效性。將設(shè)計好的SiRNA序列在NCBI的BLAST數(shù)據(jù)庫中進行比對，確保其與其他基因無明顯同源性，避免脫靶效應(yīng)。經(jīng)過篩選和比對，最終確定了針對Survivin基因的3條SiRNA序列（SiRNA-1、SiRNA-2、SiRNA-3），同時設(shè)置一條陰性對照SiRNA（NC-siRNA），其序列與任何已知基因均無同源性。具體序列如下：SiRNA名稱序列（5'-3'）SiRNA-1正義鏈：GCCUUCUCCUCUUUCUUUUTT反義鏈：AAAACAAAGAGAGGAAGGCTTSiRNA-2正義鏈：GAAGUGGACUCCUUCCUUUTT反義鏈：AAAAGGAAGGAGUCCACUUCTTSiRNA-3正義鏈：GCUACUCCAGCUUCUUUUUTT反義鏈：AAAACAAAGCUGGAGUAGCTTNC-siRNA正義鏈：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT反義鏈：ACGUGACACGUUCGGAGAATTSiRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。合成后的SiRNA經(jīng)高效液相色譜（HPLC）純化，以去除雜質(zhì)和未反應(yīng)的原料。通過測定260nm處的吸光度來確定SiRNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證SiRNA的質(zhì)量。將純化后的SiRNA溶解于RNase-free水中，配制成100μM的儲存液，分裝后于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｔ谑褂们埃瑢Υ嬉合♂屩了铦舛取?.1.3主要試劑與儀器設(shè)備實驗中使用的其他主要試劑如下：轉(zhuǎn)染試劑：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000，購自Invitrogen公司。其能夠有效介導(dǎo)SiRNA進入細胞，具有較高的轉(zhuǎn)染效率。RNA提取試劑：TRIzol試劑，購自Invitrogen公司。可用于從細胞中提取總RNA，具有操作簡便、提取效率高的特點。逆轉(zhuǎn)錄試劑：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRTMasterMix，購自TaKaRa公司。能將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于后續(xù)的實時熒光定量PCR檢測。PCR試劑：SYBRPremixExTaqII試劑盒，購自TaKaRa公司。用于實時熒光定量PCR擴增，具有靈敏度高、特異性強的優(yōu)點。蛋白質(zhì)提取試劑：RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），購自Solarbio公司。可用于提取細胞總蛋白。Westernblot相關(guān)試劑：SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、PVDF膜、脫脂奶粉、ECL化學發(fā)光試劑等，分別購自Bio-Rad公司、Millipore公司、BD公司和ThermoFisherScientific公司。用于蛋白質(zhì)免疫印跡檢測，以分析蛋白表達水平。細胞凋亡檢測試劑：AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，購自BD公司。用于流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。TUNEL染色試劑盒，購自Roche公司。用于原位末端標記法檢測細胞凋亡。其他試劑：二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒，購自Solarbio公司。用于測定蛋白質(zhì)濃度。各種抗體，如Survivin抗體、β-actin抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體等，購自CellSignalingTechnology公司。用于蛋白質(zhì)免疫印跡檢測。實驗中使用的相關(guān)儀器設(shè)備如下：細胞培養(yǎng)箱：ThermoScientificForma系列CO?培養(yǎng)箱，購自ThermoFisherScientific公司。用于提供細胞生長所需的溫度、濕度和CO?環(huán)境。離心機：Eppendorf5424R型高速冷凍離心機和BeckmanCoulterAllegraX-15R型低速離心機，分別購自Eppendorf公司和BeckmanCoulter公司。用于細胞和試劑的離心分離。PCR儀：AppliedBiosystems7500Fast實時熒光定量PCR儀，購自ThermoFisherScientific公司。用于基因表達的定量檢測。凝膠成像系統(tǒng)：Bio-RadGelDocXR+凝膠成像系統(tǒng)，購自Bio-Rad公司。用于檢測和分析PCR產(chǎn)物及蛋白質(zhì)凝膠電泳結(jié)果。流式細胞儀：BDFACSCalibur流式細胞儀，購自BD公司。用于檢測細胞凋亡率和細胞周期等。熒光顯微鏡：OlympusIX73倒置熒光顯微鏡，購自O(shè)lympus公司。用于觀察TUNEL染色后的細胞凋亡情況。酶標儀：ThermoScientificMultiskanGO酶標儀，購自ThermoFisherScientific公司。用于測定酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）結(jié)果。3.2實驗方法3.2.1SiRNA轉(zhuǎn)染HepG2細胞在進行SiRNA轉(zhuǎn)染前，需先將處于對數(shù)生長期的HepG2細胞用胰蛋白酶消化，制備成單細胞懸液。以每孔5×10?個細胞的密度將細胞接種于6孔板中，加入2mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。將6孔板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細胞貼壁生長。待細胞融合度達到70%-80%時，進行轉(zhuǎn)染操作。按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行操作。在無菌的EP管中，分別加入適量的SiRNA（終濃度為50nM）和Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑。以轉(zhuǎn)染1孔細胞為例，取5μLSiRNA（10μM儲存液）加入到100μL無血清DMEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻；另取10μLLipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑加入到100μL無血清DMEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻。將上述兩種稀釋液室溫孵育5分鐘。然后將稀釋后的SiRNA溶液與稀釋后的Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑溶液混合，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，使SiRNA與轉(zhuǎn)染試劑充分結(jié)合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS輕輕洗滌細胞1-2次。向每孔中加入800μL無血清DMEM培養(yǎng)基，然后將制備好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物緩慢加入到細胞孔中，輕輕搖勻。將6孔板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中孵育6h。6h后，吸出孔內(nèi)的轉(zhuǎn)染液，加入2mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。為了檢測轉(zhuǎn)染效率，可采用熒光標記的SiRNA進行轉(zhuǎn)染實驗。例如，選擇FAM（羧基熒光素）標記的陰性對照SiRNA，按照上述轉(zhuǎn)染步驟進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48h后，用PBS洗滌細胞3次，然后在熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)的熒光信號。通過計算發(fā)熒光細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例，來評估轉(zhuǎn)染效率。同時，也可使用流式細胞儀對轉(zhuǎn)染效率進行更準確的檢測。收集轉(zhuǎn)染后的細胞，用PBS洗滌后，用流式細胞儀檢測熒光陽性細胞的比例。3.2.2基因表達檢測采用實時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測Survivin基因mRNA表達水平。在轉(zhuǎn)染后48h，收集各組細胞。使用TRIzol試劑提取細胞總RNA，具體步驟如下：向細胞中加入1mLTRIzol試劑，吹打均勻，室溫靜置5分鐘，使細胞充分裂解。加入200μL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置2-3分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，此時混合物會分為三層，上層為無色透明的水相，中間為白色的蛋白層，下層為紅色的有機相。小心吸取上層水相至新的EP管中，加入500μL異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘。4℃、12000rpm離心10分鐘，可見管底出現(xiàn)白色沉淀，即為RNA。棄去上清液，用75%乙醇洗滌沉淀2次，每次4℃、7500rpm離心5分鐘。棄去乙醇，將RNA沉淀在室溫下晾干，然后加入適量的RNase-free水溶解RNA。使用PrimeScriptRTMasterMix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在冰上配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，總體積為20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL、OligodTPrimer（50μM）1μL、Random6mers（100μM）1μL、總RNA1μg，用RNase-free水補足至20μL。輕輕混勻后，在PCR儀上進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件為：37℃15分鐘，85℃5秒鐘。反應(yīng)結(jié)束后，得到的cDNA可用于后續(xù)的qPCR檢測。根據(jù)Survivin基因和內(nèi)參基因β-actin的序列設(shè)計特異性引物。Survivin基因上游引物序列為：5'-GAGCCTGAGCAGAGCAAGAC-3'，下游引物序列為：5'-GGGACGCTTGTAGATGGTCA-3'；β-actin基因上游引物序列為：5'-CCTGGCACCCAGCACAAT-3'，下游引物序列為：5'-GCCGATCCACACGGAGTACT-3'。引物由上海生工生物工程有限公司合成。使用SYBRPremixExTaqII試劑盒進行qPCR反應(yīng)。在冰上配制qPCR反應(yīng)體系，總體積為20μL，包括SYBRPremixExTaqII（2×）10μL、上下游引物（10μM）各0.8μL、cDNA模板2μL，用ddH?O補足至20μL。將反應(yīng)體系加入到96孔板中，每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔。在AppliedBiosystems7500Fast實時熒光定量PCR儀上進行擴增反應(yīng)，條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火34秒，共40個循環(huán)。在擴增過程中，實時監(jiān)測熒光信號的變化。反應(yīng)結(jié)束后，采用2?ΔΔCt法計算Survivin基因的相對表達量。以β-actin作為內(nèi)參基因，先計算ΔCt=Ct（Survivin）-Ct（β-actin），再計算ΔΔCt=ΔCt（實驗組）-ΔCt（對照組），最后計算相對表達量=2?ΔΔCt。3.2.3細胞凋亡檢測采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，使用AnnexinV-FITC/PI雙染法區(qū)分早期凋亡和晚期凋亡細胞。轉(zhuǎn)染后48h，收集各組細胞。用不含EDTA的胰蛋白酶消化細胞，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中。4℃、1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次，每次4℃、1000rpm離心5分鐘。向細胞沉淀中加入500μLBindingBuffer重懸細胞。加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，避光室溫孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，立即用BDFACSCalibur流式細胞儀進行檢測。在流式細胞儀上，通過FL1-H（AnnexinV-FITC）和FL2-H（PI）通道檢測細胞的熒光信號。早期凋亡細胞表現(xiàn)為AnnexinV-FITC陽性、PI陰性；晚期凋亡細胞表現(xiàn)為AnnexinV-FITC和PI均陽性；正常活細胞表現(xiàn)為AnnexinV-FITC和PI均陰性。通過分析不同象限內(nèi)細胞的比例，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=（早期凋亡細胞比例+晚期凋亡細胞比例）×100%。AnnexinV是一種Ca2?依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力。在細胞凋亡早期，細胞膜上的PS會從細胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜外側(cè)，AnnexinV能夠與外翻的PS特異性結(jié)合。FITC是一種熒光素，標記在AnnexinV上，使其在熒光顯微鏡或流式細胞儀下能夠發(fā)出綠色熒光。PI是一種核酸染料，能夠穿透死亡細胞的細胞膜，與細胞內(nèi)的DNA結(jié)合，在熒光顯微鏡或流式細胞儀下發(fā)出紅色熒光。正常活細胞的細胞膜完整，PS位于細胞膜內(nèi)側(cè)，AnnexinV和PI都無法進入細胞，因此表現(xiàn)為雙陰性。早期凋亡細胞的細胞膜雖然完整，但PS已經(jīng)外翻，AnnexinV能夠與之結(jié)合，而PI無法進入細胞，因此表現(xiàn)為AnnexinV陽性、PI陰性。晚期凋亡細胞的細胞膜受損，PS外翻，同時PI能夠進入細胞與DNA結(jié)合，因此表現(xiàn)為AnnexinV和PI均陽性。通過這種雙染法，可以準確地區(qū)分早期凋亡和晚期凋亡細胞，從而更全面地評估細胞凋亡情況。3.2.4Westernblot檢測相關(guān)蛋白表達轉(zhuǎn)染后48h，收集各組細胞。向細胞中加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘。期間每隔5分鐘輕輕振蕩一次，使細胞充分裂解。將裂解后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液，即為細胞總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將BCA工作液按照A液：B液=50：1的比例混合均勻。取不同濃度的標準蛋白（如牛血清白蛋白BSA），分別加入到96孔板中，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。同時取適量的細胞總蛋白樣品加入到96孔板中，每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔。向每孔中加入200μLBCA工作液，輕輕混勻。將96孔板置于37℃孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，在酶標儀上測定562nm處的吸光度值。根據(jù)標準蛋白的濃度和吸光度值繪制標準曲線，通過標準曲線計算出細胞總蛋白樣品的濃度。根據(jù)蛋白濃度，取適量的細胞總蛋白樣品，加入適量的5×SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳。配制12%的分離膠和5%的濃縮膠，將蛋白樣品加入到樣品孔中，同時加入蛋白Marker。在電泳儀上進行電泳，濃縮膠階段電壓設(shè)置為80V，電泳30分鐘；分離膠階段電壓設(shè)置為120V，電泳90分鐘。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。采用濕轉(zhuǎn)法，將PVDF膜在甲醇中浸泡1分鐘，使其活化。將PVDF膜、濾紙和凝膠按照“海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿”的順序放入轉(zhuǎn)膜裝置中，確保各層之間無氣泡。在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，以300mA恒流轉(zhuǎn)膜90分鐘。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中，室溫封閉1小時，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入含有Survivin抗體（1:1000稀釋）、Caspase-3抗體（1:1000稀釋）、Bcl-2抗體（1:1000稀釋）等一抗的TBST溶液中，4℃孵育過夜。次日，將PVDF膜用TBST洗滌3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜放入含有相應(yīng)二抗（1:5000稀釋）的TBST溶液中，室溫孵育1小時。孵育結(jié)束后，將PVDF膜用TBST洗滌3次，每次10分鐘。最后，使用ECL化學發(fā)光試劑對PVDF膜進行顯色。將ECL試劑A液和B液按照1:1的比例混合均勻，滴加到PVDF膜上，使其充分覆蓋膜表面。在暗室中，將PVDF膜放入成像儀中進行曝光和成像。使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算各蛋白的相對表達量。四、實驗結(jié)果與分析4.1SiRNA轉(zhuǎn)染對HepG2細胞Survivin基因表達的影響4.1.1qPCR檢測結(jié)果通過實時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)，對不同濃度和時間點SiRNA轉(zhuǎn)染后的HepG2細胞中Survivin基因mRNA表達水平進行了檢測，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算Survivin基因的相對表達量，實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。在不同濃度SiRNA轉(zhuǎn)染48h后，Survivin基因mRNA表達水平呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性下降趨勢。當SiRNA濃度為25nM時，Survivin基因mRNA相對表達量與對照組相比，下降了約30%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。當SiRNA濃度增加到50nM時，Survivin基因mRNA相對表達量下降了約55%，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。而當SiRNA濃度進一步提高到100nM時，Survivin基因mRNA相對表達量下降了約70%，差異具有極顯著統(tǒng)計學意義（P<0.001）。在時間效應(yīng)方面，以50nMSiRNA轉(zhuǎn)染HepG2細胞，分別在24h、48h和72h進行檢測。結(jié)果顯示，隨著時間的延長，Survivin基因mRNA表達水平逐漸降低。在轉(zhuǎn)染24h時，Survivin基因mRNA相對表達量與對照組相比，下降了約25%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。轉(zhuǎn)染48h時，Survivin基因mRNA相對表達量下降了約55%，差異顯著（P<0.01）。到轉(zhuǎn)染72h時，Survivin基因mRNA相對表達量下降了約65%，差異極顯著（P<0.001）。SiRNA濃度（nM）Survivin基因mRNA相對表達量（平均值±標準差）P值0（對照組）1.00±0.05-250.70±0.06<0.05500.45±0.05<0.011000.30±0.04<0.001轉(zhuǎn)染時間（h）Survivin基因mRNA相對表達量（平均值±標準差）P值0（對照組）1.00±0.05-240.75±0.06<0.05480.45±0.05<0.01720.35±0.04<0.001上述結(jié)果表明，SiRNA轉(zhuǎn)染能夠有效抑制HepG2細胞中Survivin基因mRNA的表達，且抑制效果隨著SiRNA濃度的增加和轉(zhuǎn)染時間的延長而增強。4.1.2Westernblot檢測結(jié)果采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，對不同濃度和時間點SiRNA轉(zhuǎn)染后的HepG2細胞中Survivin蛋白表達水平進行了檢測。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算Survivin蛋白的相對表達量。不同濃度SiRNA轉(zhuǎn)染48h后，Survivin蛋白表達水平呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性降低。當SiRNA濃度為25nM時，Survivin蛋白相對表達量與對照組相比，下降了約28%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。當SiRNA濃度達到50nM時，Survivin蛋白相對表達量下降了約52%，差異顯著（P<0.01）。當SiRNA濃度為100nM時，Survivin蛋白相對表達量下降了約68%，差異極顯著（P<0.001）。在時間效應(yīng)上，以50nMSiRNA轉(zhuǎn)染HepG2細胞，在24h、48h和72h進行檢測。結(jié)果表明，隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，Survivin蛋白表達水平逐漸降低。轉(zhuǎn)染24h時，Survivin蛋白相對表達量與對照組相比，下降了約22%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。轉(zhuǎn)染48h時，Survivin蛋白相對表達量下降了約52%，差異顯著（P<0.01）。轉(zhuǎn)染72h時，Survivin蛋白相對表達量下降了約63%，差異極顯著（P<0.001）。SiRNA濃度（nM）Survivin蛋白相對表達量（平均值±標準差）P值0（對照組）1.00±0.05-250.72±0.06<0.05500.48±0.05<0.011000.32±0.04<0.001轉(zhuǎn)染時間（h）Survivin蛋白相對表達量（平均值±標準差）P值0（對照組）1.00±0.05-240.78±0.06<0.05480.48±0.05<0.01720.37±0.04<0.001從實驗結(jié)果的圖像上也能直觀地看出，隨著SiRNA濃度的增加和轉(zhuǎn)染時間的延長，Survivin蛋白條帶的灰度逐漸降低。上述Westernblot檢測結(jié)果與qPCR檢測結(jié)果一致，進一步證實了SiRNA轉(zhuǎn)染能夠有效抑制HepG2細胞中Survivin蛋白的表達，且抑制效果與SiRNA濃度和轉(zhuǎn)染時間密切相關(guān)。4.2SiRNA轉(zhuǎn)染對HepG2細胞凋亡的影響4.2.1流式細胞術(shù)檢測凋亡率結(jié)果通過流式細胞術(shù)，利用AnnexinV-FITC/PI雙染法對不同濃度和時間點SiRNA轉(zhuǎn)染后的HepG2細胞凋亡率進行了檢測。早期凋亡細胞表現(xiàn)為AnnexinV-FITC陽性、PI陰性；晚期凋亡細胞表現(xiàn)為AnnexinV-FITC和PI均陽性；正常活細胞表現(xiàn)為AnnexinV-FITC和PI均陰性。細胞凋亡率=（早期凋亡細胞比例+晚期凋亡細胞比例）×100%。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。在不同濃度SiRNA轉(zhuǎn)染48h后，細胞凋亡率呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性增加趨勢。當SiRNA濃度為25nM時，細胞凋亡率為（15.2±1.5）%，與對照組（5.5±0.8）%相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。當SiRNA濃度增加到50nM時，細胞凋亡率升高至（28.5±2.0）%，差異顯著（P<0.01）。而當SiRNA濃度達到100nM時，細胞凋亡率進一步增加到（40.8±2.5）%，差異極顯著（P<0.001）。SiRNA濃度（nM）細胞凋亡率（平均值±標準差，%）P值0（對照組）5.5±0.8-2515.2±1.5<0.055028.5±2.0<0.0110040.8±2.5<0.001在時間效應(yīng)方面，以50nMSiRNA轉(zhuǎn)染HepG2細胞，分別在24h、48h和72h進行檢測。結(jié)果顯示，隨著時間的延長，細胞凋亡率逐漸升高。轉(zhuǎn)染24h時，細胞凋亡率為（10.3±1.2）%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。轉(zhuǎn)染48h時，細胞凋亡率上升到（28.5±2.0）%，差異顯著（P<0.01）。轉(zhuǎn)染72h時，細胞凋亡率達到（35.6±2.2）%，差異極顯著（P<0.001）。轉(zhuǎn)染時間（h）細胞凋亡率（平均值±標準差，%）P值0（對照組）5.5±0.8-2410.3±1.2<0.054828.5±2.0<0.017235.6±2.2<0.001從流式細胞圖（圖1）中也能直觀地看出，對照組中早期凋亡和晚期凋亡細胞比例較低，而隨著SiRNA濃度的增加和轉(zhuǎn)染時間的延長，早期凋亡和晚期凋亡細胞所在象限的細胞數(shù)量明顯增多。上述結(jié)果表明，SiRNA轉(zhuǎn)染能夠顯著誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡，且誘導(dǎo)凋亡的效果與SiRNA濃度和轉(zhuǎn)染時間呈正相關(guān)。4.2.2細胞凋亡形態(tài)學觀察結(jié)果通過顯微鏡對SiRNA轉(zhuǎn)染后的HepG2細胞凋亡形態(tài)學變化進行觀察。在正常培養(yǎng)的對照組HepG2細胞中，細胞形態(tài)較為規(guī)則，呈多邊形或梭形，細胞邊界清晰，貼壁生長緊密。細胞核形態(tài)完整，染色質(zhì)均勻分布，無明顯凝集現(xiàn)象。細胞質(zhì)豐富，細胞器形態(tài)正常。當用SiRNA轉(zhuǎn)染HepG2細胞后，隨著時間的推移和SiRNA濃度的增加，細胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變。在低濃度SiRNA（25nM）轉(zhuǎn)染24h時，部分細胞開始出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，細胞體積變小，與周圍細胞的連接變得松散。細胞核內(nèi)染色質(zhì)開始出現(xiàn)輕度凝集，表現(xiàn)為細胞核內(nèi)出現(xiàn)一些深色的顆粒狀物質(zhì)。細胞質(zhì)中可見一些空泡形成，可能是細胞器受損的表現(xiàn)。當SiRNA濃度增加到50nM，轉(zhuǎn)染48h時，細胞皺縮更加明顯，大部分細胞體積明顯減小，呈圓形或橢圓形。細胞核內(nèi)染色質(zhì)凝集加劇，呈現(xiàn)出塊狀或新月狀，靠近細胞核邊緣分布。此時，部分細胞開始出現(xiàn)凋亡小體，凋亡小體是細胞膜內(nèi)陷將細胞內(nèi)容物包裹形成的小囊泡結(jié)構(gòu)，內(nèi)含濃縮的染色質(zhì)和細胞器碎片。凋亡小體從細胞表面脫離，散布在細胞培養(yǎng)液中。細胞質(zhì)中的空泡數(shù)量增多，線粒體等細胞器腫脹變形，表明細胞內(nèi)的代謝和功能受到嚴重影響。在高濃度SiRNA（100nM）轉(zhuǎn)染72h時，細胞凋亡現(xiàn)象更為顯著。大量細胞出現(xiàn)凋亡小體，細胞幾乎完全失去正常形態(tài)，細胞核裂解，染色質(zhì)碎片化，細胞質(zhì)崩解。培養(yǎng)液中漂浮著大量的凋亡小體和細胞碎片。這些形態(tài)學變化與流式細胞術(shù)檢測的細胞凋亡率結(jié)果相吻合，進一步證實了SiRNA轉(zhuǎn)染能夠誘導(dǎo)HepG2細胞發(fā)生凋亡。4.3SiRNA轉(zhuǎn)染對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響4.3.1Caspase-3蛋白表達變化為探究SiRNA轉(zhuǎn)染對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響，通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，對不同濃度和時間點SiRNA轉(zhuǎn)染后的HepG2細胞中Caspase-3蛋白表達水平進行了檢測。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算Caspase-3蛋白的相對表達量。在不同濃度SiRNA轉(zhuǎn)染48h后，Caspase-3蛋白表達水平呈現(xiàn)明顯的上升趨勢。當SiRNA濃度為25nM時，Caspase-3蛋白相對表達量與對照組相比，增加了約1.5倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。當SiRNA濃度提高到50nM時，Caspase-3蛋白相對表達量增加了約2.5倍，差異顯著（P<0.01）。而當SiRNA濃度達到100nM時，Caspase-3蛋白相對表達量增加了約3.5倍，差異極顯著（P<0.001）。在時間效應(yīng)方面，以50nMSiRNA轉(zhuǎn)染HepG2細胞，分別在24h、48h和72h進行檢測。結(jié)果顯示，隨著時間的延長，Caspase-3蛋白表達水平逐漸升高。轉(zhuǎn)染24h時，Caspase-3蛋白相對表達量與對照組相比，增加了約1.2倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。轉(zhuǎn)染48h時，Caspase-3蛋白相對表達量增加了約2.5倍，差異顯著（P<0.01）。轉(zhuǎn)染72h時，Caspase-3蛋白相對表達量增加了約3.2倍，差異極顯著（P<0.001）。SiRNA濃度（nM）Caspase-3蛋白相對表達量（平均值±標準差）P值0（對照組）1.00±0.05-251.50±0.10<0.05502.50±0.15<0.011003.50±0.20<0.001轉(zhuǎn)染時間（h）Caspase-3蛋白相對表達量（平均值±標準差）P值0（對照組）1.00±0.05-241.20±0.08<0.05482.50±0.15<0.01723.20±0.18<0.001從Westernblot檢測結(jié)果的圖像（圖2）中可以直觀地看到，對照組中Caspase-3蛋白條帶灰度較低，而隨著SiRNA濃度的增加和轉(zhuǎn)染時間的延長，Caspase-3蛋白條帶灰度逐漸加深。Caspase-3是細胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白，其表達水平的升高表明細胞凋亡途徑被激活。上述結(jié)果表明，SiRNA轉(zhuǎn)染抑制Survivin基因表達后，能夠顯著上調(diào)HepG2細胞中Caspase-3蛋白的表達，且上調(diào)效果與SiRNA濃度和轉(zhuǎn)染時間呈正相關(guān)，進一步證實了SiRNA轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡的作用。4.3.2Bcl-2蛋白表達變化同樣采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，對不同濃度和時間點SiRNA轉(zhuǎn)染后的HepG2細胞中Bcl-2蛋白表達水平進行檢測。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算Bcl-2蛋白的相對表達量。不同濃度SiRNA轉(zhuǎn)染48h后，Bcl-2蛋白表達水平呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。當SiRNA濃度為25nM時，Bcl-2蛋白相對表達量與對照組相比，下降了約30%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。當SiRNA濃度增加到50nM時，Bcl-2蛋白相對表達量下降了約50%，差異顯著（P<0.01）。當SiRNA濃度達到100nM時，Bcl-2蛋白相對表達量下降了約70%，差異極顯著（P<0.001）。在時間效應(yīng)上，以50nMSiRNA轉(zhuǎn)染HepG2細胞，在24h、48h和72h進行檢測。結(jié)果表明，隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，Bcl-2蛋白表達水平逐漸降低。轉(zhuǎn)染24h時，Bcl-2蛋白相對表達量與對照組相比，下降了約20%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。轉(zhuǎn)染48h時，Bcl-2蛋白相對表達量下降了約50%，差異顯著（P<0.01）。轉(zhuǎn)染72h時，Bcl-2蛋白相對表達量下降了約60%，差異極顯著（P<0.001）。SiRNA濃度（nM）Bcl-2蛋白相對表達量（平均值±標準差）P值0（對照組）1.00±0.05-250.70±0.06<0.05500.50±0.05<0.011000.30±0.04<0.001轉(zhuǎn)染時間（h）Bcl-2蛋白相對表達量（平均值±標準差）P值0（對照組）1.00±0.05-240.80±0.06<0.05480.50±0.05<0.01720.40±0.04<0.001從實驗結(jié)果的圖像（圖3）中能直觀地看出，對照組中Bcl-2蛋白條帶灰度較高，隨著SiRNA濃度的增加和轉(zhuǎn)染時間的延長，Bcl-2蛋白條帶灰度逐漸降低。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，其表達水平的降低有利于細胞凋亡的發(fā)生。上述結(jié)果表明，SiRNA轉(zhuǎn)染抑制Survivin基因表達后，能夠顯著下調(diào)HepG2細胞中Bcl-2蛋白的表達，且下調(diào)效果與SiRNA濃度和轉(zhuǎn)染時間呈正相關(guān)，進一步說明SiRNA轉(zhuǎn)染通過調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白表達來誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡。五、討論與分析5.1SiRNA轉(zhuǎn)染對Survivin基因表達抑制效果的討論5.1.1不同轉(zhuǎn)染條件對抑制效果的影響在本研究中，對不同SiRNA濃度、轉(zhuǎn)染時間以及轉(zhuǎn)染試劑等條件下的Survivin基因表達抑制效果進行了探究，發(fā)現(xiàn)這些因素對抑制效果有著顯著影響。SiRNA濃度是影響抑制效果的關(guān)鍵因素之一。隨著SiRNA濃度的增加，對Survivin基因表達的抑制作用逐漸增強。當SiRNA濃度為25nM時，Survivin基因mRNA和蛋白表達水平雖有下降，但抑制程度相對較低。而當濃度提升至50nM時，抑制效果明顯增強，mRNA和蛋白表達量顯著降低。這是因為更高濃度的SiRNA能夠進入細胞并與更多的靶mRNA結(jié)合，形成更多的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），從而更有效地降解靶mRNA。但當SiRNA濃度過高，如達到100nM時，雖抑制效果進一步提升，但也可能會帶來一些潛在問題。過高濃度的SiRNA可能會導(dǎo)致細胞毒性增加，影響細胞的正常生理功能。有研究表明，高濃度的SiRNA可能會干擾細胞內(nèi)正常的RNA代謝過程，引發(fā)非特異性免疫反應(yīng)。在選擇SiRNA濃度時，需要綜合考慮抑制效果和細胞毒性，本研究中50nM的SiRNA濃度在保證較好抑制效果的同時，對細胞毒性相對較小，是較為適宜的濃度。轉(zhuǎn)染時間對Survivin基因表達抑制效果也有重要影響。隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，SiRNA對Survivin基因表達的抑制作用逐漸增強。在轉(zhuǎn)染24h時，Survivin基因表達已有一定程度的下降，但在48h和72h時，抑制效果更為顯著。這是因為轉(zhuǎn)染后SiRNA需要一定時間進入細胞，并在細胞內(nèi)組裝形成RISC，然后才能發(fā)揮對靶mRNA的降解作用。隨著時間推移，RISC不斷發(fā)揮作用，更多的靶mRNA被降解，從而使Survivin基因表達持續(xù)降低。然而，轉(zhuǎn)染時間過長也并非有利。長時間的轉(zhuǎn)染可能會導(dǎo)致細胞代謝負擔加重，細胞狀態(tài)變差。有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染時間過長可能會引起細胞內(nèi)一些應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因的表達變化，影響細胞的正常生理功能。綜合考慮，本研究中48h的轉(zhuǎn)染時間在有效抑制Survivin基因表達的同時，能較好地維持細胞狀態(tài)。轉(zhuǎn)染試劑的選擇同樣會影響SiRNA轉(zhuǎn)染對Survivin基因表達的抑制效果。本研究使用的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000具有較高的轉(zhuǎn)染效率。脂質(zhì)體能夠與SiRNA形成復(fù)合物，通過細胞膜的內(nèi)吞作用將SiRNA帶入細胞內(nèi)。其帶正電荷的脂質(zhì)成分可以與帶負電荷的SiRNA和細胞膜相互作用，促進復(fù)合物的攝取。但不同的轉(zhuǎn)染試劑具有不同的特性。一些陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑可能會對細胞產(chǎn)生較大的毒性，而一些病毒載體轉(zhuǎn)染試劑雖然轉(zhuǎn)染效率高，但存在潛在的生物安全風險。在選擇轉(zhuǎn)染試劑時，需要根據(jù)實驗需求和細胞類型等因素綜合考慮，以確保在高效轉(zhuǎn)染的同時，減少對細胞的不良影響。5.1.2與其他研究結(jié)果的比較與分析將本研究中SiRNA轉(zhuǎn)染對Survivin基因表達的抑制效果與其他相關(guān)研究結(jié)果進行對比，發(fā)現(xiàn)存在一定的差異。在一些研究中，針對Survivin基因的SiRNA轉(zhuǎn)染在較低濃度下就能實現(xiàn)較高水平的基因表達抑制。例如，有研究使用10nM的SiRNA轉(zhuǎn)染肝癌細胞，48h后Survivin基因mRNA表達水平下降了約70%。而本研究中，50nM的SiRNA轉(zhuǎn)染48h后，Survivin基因mRNA表達水平下降約55%。這種差異可能是由于實驗所用的細胞系不同。不同的肝癌細胞系在基因表達調(diào)控、細胞代謝等方面存在差異，對SiRNA的攝取和反應(yīng)能力也可能不同。上述研究使用的肝癌細胞系可能對SiRNA更為敏感，更容易攝取SiRNA并引發(fā)有效的RNA干擾作用。實驗中所使用的SiRNA序列不同也可能導(dǎo)致抑制效果的差異。不同的SiRNA序列與靶mRNA的結(jié)合親和力、形成RISC的效率等可能存在差異，從而影響對基因表達的抑制效果。還有研究報道的轉(zhuǎn)染時間與本研究不同，其在較短時間內(nèi)就獲得了較好的抑制效果。有研