shRNA介導P115基因沉默對人胃癌細胞BGC-823侵襲能力的多維度解析與機制探究一、引言1.1研究背景與意義1.1.1胃癌的現狀胃癌作為一種常見的消化道惡性腫瘤，嚴重威脅著人類的健康。據國際癌癥研究機構（IARC）發布的2020年全球癌癥統計數據顯示，當年全世界胃癌新發病例約108.9萬，在所有惡性腫瘤發病人數中位居第五位；死亡病例數約76.9萬，居惡性腫瘤死亡人數的第四位。在中國，胃癌的形勢更為嚴峻，發病病例和死亡病例分別占全球的43.9%和48.6%，發病率和死亡率分別位于所有惡性腫瘤的第二位和第三位，是我國發病率第一的消化道惡性腫瘤，遠高于世界平均水平。胃癌的高死亡率與其早期癥狀不明顯密切相關。早期胃癌患者常無特異性癥狀，或僅表現出一些如反酸、噯氣、上腹部不適等輕微癥狀，這些癥狀與常見的胃炎、胃潰瘍等良性疾病相似，容易被患者忽視。因此，多數患者在確診時已處于疾病的中晚期，錯過了最佳的手術治療時機。中晚期胃癌患者不僅手術切除率低，且術后復發和轉移的風險高，五年生存率較低。由于胃癌的高發病率和高死亡率，給患者家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔和精神壓力。因此，深入研究胃癌的發病機制，尋找有效的治療靶點，對于提高胃癌的早期診斷率、改善患者預后具有重要的臨床意義和社會價值。1.1.2P115基因與胃癌的關聯P115基因編碼的高爾基體囊泡轉運蛋白P115，在細胞內膜泡運輸過程中發揮著關鍵作用，參與維持細胞內高爾基體的結構和功能完整性，調節細胞內物質的運輸和分泌。越來越多的研究表明，P115基因在多種惡性腫瘤中存在異常表達，與腫瘤的發生、發展密切相關。在胃癌中，P115基因的表達水平常常顯著增加。研究發現，P115在胃癌組織中的陽性表達率明顯高于正常胃黏膜組織，且在低分化胃癌細胞株中的表達水平顯著高于高分化胃癌細胞株。這表明P115基因的高表達可能與胃癌細胞的增殖、侵襲和轉移能力增強有關。進一步的機制研究發現，P115可能通過參與細胞內的多條信號通路，如Wnt/β-catenin、PI3K/AKT等重要信號通路，調節與細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲相關基因的表達，從而促進胃癌細胞的惡性行為。此外，P115還被發現與巨噬細胞移動抑制因子（MIF）存在相互作用，共同調節胃癌細胞的生物學行為。P115基因沉默可下調MIF的表達和分泌，進而抑制下游ERK1/2信號通路的激活，最終導致胃癌細胞增殖相關蛋白如細胞周期素D1（cyclinD1）、微小染色體維持缺陷蛋白2（Mcm2）和增殖細胞核抗原（PCNA）的表達降低，抑制胃癌細胞的增殖。綜上所述，P115基因在胃癌的發生、發展過程中扮演著重要角色，抑制P115基因的表達有可能成為胃癌治療的新策略，為胃癌的靶向治療提供了潛在的靶點。深入研究P115基因在胃癌中的作用機制，對于開發新型的胃癌治療方法具有重要的理論和實踐意義。1.1.3shRNA技術的應用shRNA（短發夾RNA）技術是一種基于RNA干擾（RNAi）原理的基因沉默技術，在基因功能研究和疾病治療領域具有廣泛的應用前景。RNAi是一種在真核生物中高度保守的轉錄后基因沉默機制，通過導入雙鏈RNA（dsRNA），特異性地降解或抑制細胞內與之同源的mRNA，從而阻斷靶基因的表達。shRNA是一種具有緊密發卡環結構的RNA序列，由兩個短的反向重復序列和連接它們的環狀區域組成。在基因功能研究中，shRNA技術為研究人員提供了一種強大的工具，能夠精確地調控基因的表達水平，深入探究基因在細胞生理和病理過程中的功能。通過設計針對特定基因的shRNA，并將其導入細胞中，可有效沉默該基因的表達，觀察細胞在基因缺失或低表達狀態下的生物學行為變化，從而明確基因的功能及其在疾病發生發展中的作用機制。在疾病治療方面，shRNA技術展現出巨大的潛力。尤其是在癌癥治療領域，通過靶向沉默與腫瘤發生、發展密切相關的關鍵基因，有望抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移，為癌癥的治療提供新的策略。與傳統的治療方法相比，shRNA技術具有高度的特異性，能夠精準地作用于靶基因，減少對正常細胞的損傷，降低治療的副作用。此外，隨著載體技術的不斷發展，如腺病毒載體、慢病毒載體和腺相關病毒載體等的應用，使得shRNA能夠更高效地遞送至靶細胞中，提高了基因沉默的效果和穩定性。針對P115基因，利用shRNA技術抑制其在胃癌細胞中的表達，為研究P115基因對胃癌細胞侵襲能力的影響及其分子機制提供了可行的方法。通過構建靶向P115基因的shRNA表達載體，并將其轉染至胃癌細胞中，可實現對P115基因的特異性沉默，進而觀察胃癌細胞侵襲能力的變化，揭示P115基因在胃癌侵襲轉移過程中的作用，為尋找新的胃癌治療靶點和開發有效的治療方法奠定基礎。1.2研究目的與問題提出本研究旨在深入探究shRNA抑制P115基因表達對人胃癌細胞BGC-823侵襲能力的影響，并揭示其潛在的分子機制。這一研究不僅有助于加深我們對胃癌侵襲轉移分子機制的理解，更為開發基于P115基因的胃癌靶向治療新策略提供了理論依據和實驗基礎。圍繞這一核心目標，研究過程中需要解決以下關鍵問題：shRNA的設計與驗證：如何針對P115基因設計出特異性高、干擾效率強的shRNA序列？通過生物信息學分析篩選候選序列后，如何利用體外轉錄、載體構建等技術獲得穩定表達shRNA的載體，并通過測序、酶切等方法驗證其正確性？P115基因表達抑制效果評估：將構建好的shRNA表達載體轉染至人胃癌細胞BGC-823后，采用何種技術手段（如實時熒光定量PCR、蛋白質免疫印跡等）準確檢測P115基因在mRNA和蛋白質水平的表達變化，以確定shRNA對P115基因的沉默效率？侵襲能力變化檢測：運用何種實驗方法（如Transwell小室實驗、細胞劃痕實驗等）直觀有效地檢測shRNA抑制P115基因表達后，人胃癌細胞BGC-823侵襲能力的改變？如何對實驗結果進行量化分析，以準確評估P115基因表達與胃癌細胞侵襲能力之間的關聯？相關分子機制探討：P115基因表達被抑制后，胃癌細胞侵襲能力改變的背后涉及哪些分子信號通路和關鍵分子？通過哪些實驗技術（如基因芯片、蛋白質組學、免疫共沉淀等）來篩選和驗證相關的信號通路及分子，揭示shRNA抑制P115基因表達影響胃癌細胞侵襲能力的深層分子機制？1.3研究創新點本研究在實驗設計、研究方法和研究視角上均有獨特的創新之處，為深入理解胃癌侵襲轉移機制及開發新的治療策略提供了全新的思路。實驗設計創新：構建了多組不同靶向序列的shRNA表達載體，針對P115基因的不同關鍵區域進行干擾，增加了篩選出高效沉默P115基因shRNA的可能性，與以往僅使用單一或少數幾種shRNA序列的研究相比，能夠更全面、深入地探究P115基因對胃癌細胞侵襲能力的影響。此外，設置了多時間點的動態檢測實驗，不僅檢測了shRNA轉染后短期（48小時、72小時）內P115基因表達及胃癌細胞侵襲能力的變化，還長期追蹤了細胞在穩定轉染后的生物學行為，從而更準確地揭示P115基因表達抑制與胃癌細胞侵襲能力改變之間的時間相關性和動態變化規律。研究方法創新：結合了多種先進的檢測技術，從多個層面深入探究shRNA抑制P115基因表達影響胃癌細胞侵襲能力的分子機制。在基因和蛋白水平，運用實時熒光定量PCR、蛋白質免疫印跡和免疫組化技術，精確檢測P115基因及其相關信號通路分子（如Wnt/β-catenin、PI3K/AKT信號通路中的關鍵蛋白）在mRNA和蛋白質層面的表達變化；在細胞功能層面，采用Transwell小室實驗、細胞劃痕實驗和三維細胞培養侵襲實驗，全面評估胃癌細胞侵襲能力的改變，并通過活細胞成像技術對細胞侵襲過程進行實時動態監測，獲取更直觀、準確的實驗數據；在分子機制研究層面，利用基因芯片技術和蛋白質組學技術，大規模篩選在P115基因表達被抑制后差異表達的基因和蛋白質，進而運用生物信息學分析構建相關的調控網絡，為揭示潛在的分子機制提供了全面的數據支持和新的研究思路。研究視角創新：首次從高爾基體囊泡轉運蛋白P115的角度，系統研究其在胃癌細胞侵襲過程中的作用及分子機制。以往關于胃癌侵襲轉移機制的研究多集中在常見的癌基因、抑癌基因以及細胞表面受體等方面，對細胞內膜泡運輸相關蛋白在胃癌侵襲中的作用關注較少。本研究聚焦于P115基因，不僅豐富了對胃癌侵襲轉移分子機制的認識，還為胃癌的治療提供了一個全新的潛在靶點和治療思路。同時，本研究將細胞內膜泡運輸與腫瘤侵襲轉移這兩個相對獨立的研究領域相結合，拓展了胃癌研究的范疇，有望為腫瘤生物學的發展開辟新的研究方向。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1細胞株人胃癌細胞BGC-823購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。該細胞株源自一位62歲男性的低分化胃癌患者，呈上皮細胞樣，貼壁生長，具有胃癌細胞的典型特性，如高增殖能力、侵襲性和轉移潛能，且可穩定表達癌胚抗原（CEA），是研究胃癌生物學行為和發病機制常用的細胞模型。在本研究中選擇BGC-823細胞株，是因為其低分化特性使其更接近臨床中惡性程度較高的胃癌類型，對探究P115基因在高侵襲性胃癌細胞中的作用及機制具有代表性。細胞培養于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國）、1%青霉素-鏈霉素雙抗（Solarbio公司，中國）的RPMI-1640培養基（HyClone公司，美國）中，置于37℃、5%CO?的細胞培養箱（ThermoFisherScientific公司，美國）中培養，每隔2-3天更換一次培養液，待細胞融合度達到80%-90%時進行傳代。傳代時，先用PBS清洗細胞2次，加入適量0.25%胰蛋白酶（Solarbio公司，中國）消化細胞，在顯微鏡下觀察細胞變圓、脫壁后，加入含血清的培養基終止消化，輕輕吹打制成細胞懸液，按1:3-1:4的比例接種到新的培養瓶中繼續培養。2.1.2主要試劑與儀器主要試劑：shRNA表達載體：針對P115基因設計并合成的shRNA表達載體（GenScript公司，中國），同時構建陰性對照shRNA表達載體，其序列不與任何已知基因互補。轉染試劑：Lipofectamine3000轉染試劑（Invitrogen公司，美國），用于將shRNA表達載體轉染至人胃癌細胞BGC-823中。細胞培養基及相關試劑：RPMI-1640培養基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶，用于細胞的培養和傳代。抗體：兔抗人P115多克隆抗體（Abcam公司，英國），用于檢測P115蛋白的表達；鼠抗人β-actin單克隆抗體（Sigma公司，美國）作為內參抗體；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗（JacksonImmunoResearch公司，美國），用于蛋白質免疫印跡實驗中的信號檢測。其他試劑：TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國）用于提取細胞總RNA；逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）用于將RNA逆轉錄為cDNA；SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（Roche公司，瑞士）用于實時熒光定量PCR檢測基因表達水平；Matrigel基質膠（Corning公司，美國）用于Transwell侵襲實驗；結晶紫染液（Solarbio公司，中國）用于細胞染色；BCA蛋白定量試劑盒（ThermoFisherScientific公司，美國）用于測定蛋白濃度。主要儀器：熒光顯微鏡：NikonEclipseTi2倒置熒光顯微鏡（Nikon公司，日本），用于觀察轉染后細胞中熒光標記的shRNA表達載體的轉染效率及細胞形態變化。PCR儀：AppliedBiosystemsVeriti96孔熱循環儀（ThermoFisherScientific公司，美國），用于進行逆轉錄反應和PCR擴增。實時熒光定量PCR儀：RocheLightCycler480II實時熒光定量PCR系統（Roche公司，瑞士），用于精確檢測P115基因在mRNA水平的表達量。蛋白質電泳儀及轉膜儀：Bio-RadMini-PROTEANTetra垂直電泳系統和Trans-BlotTurbo轉膜系統（Bio-Rad公司，美國），用于蛋白質免疫印跡實驗中的蛋白電泳和轉膜過程。酶標儀：ThermoScientificMultiskanFC酶標儀（ThermoFisherScientific公司，美國），用于BCA蛋白定量檢測時讀取吸光度值。細胞培養箱：ThermoScientificHeracellVIOS160iCO?培養箱（ThermoFisherScientific公司，美國），為細胞提供穩定的培養環境。超凈工作臺：蘇州凈化SW-CJ-2FD雙人雙面垂直凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司，中國），用于細胞培養和實驗操作過程中的無菌環境保障。高速離心機：Eppendorf5424R小型高速離心機（Eppendorf公司，德國），用于細胞和試劑的離心分離。Transwell小室：CorningCostarTranswell聚碳酸酯膜小室（Corning公司，美國），孔徑8μm，用于進行細胞侵襲實驗。2.2shRNA的設計與合成2.2.1P115基因序列分析從NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）數據庫中獲取人P115基因的mRNA序列（登錄號：NM_001256786.2）。運用生物信息學分析軟件，如BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）對P115基因mRNA序列進行保守區域分析。保守區域通常在不同物種間具有較高的序列相似性，選擇這些區域作為靶點，能夠增加shRNA作用的有效性和普適性。同時，為避免脫靶效應，將候選序列與人類基因組數據庫進行比對，確保所選序列與其他非靶基因的同源性低于一定閾值（如70%），以減少對非目標基因的干擾。利用在線工具如RNAstructure等預測mRNA的二級結構，避開mRNA的二級結構復雜區域，如高度折疊的莖環結構等，因為這些區域可能會影響shRNA與mRNA的結合效率，從而降低基因沉默效果。2.2.2shRNA序列設計依據P115基因的mRNA序列，使用專門的shRNA設計軟件，如siDirect2.0、RNAiDesigner等進行序列設計。設計時遵循以下原則：shRNA的長度一般為19-23bp，包括19-21bp的互補序列和3-4bp的環狀結構序列。互補序列應特異性地靶向P115基因mRNA的特定區域，環狀結構通常選擇常用的序列如“TTCAAGAGA”，其能保證shRNA形成穩定的發卡結構。選擇多個不同的靶點序列，一般設計3-5條針對P115基因不同區域的shRNA序列，以篩選出干擾效率最高的序列。靶點應盡量避開P115基因的5'端非翻譯區（UTR）和3'端UTR，優先選擇在編碼區（CDS）的序列，因為編碼區序列在基因表達過程中更關鍵，干擾編碼區能更有效地抑制蛋白表達。通過軟件對設計的shRNA序列進行評分，評估其潛在的干擾效率、脫靶可能性等參數，選擇評分較高的序列進行后續實驗。例如，經過軟件分析和篩選，設計出的針對P115基因的三條shRNA序列分別為shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3，其序列信息如下（具體序列根據實際設計情況列出）。同時，設計一條陰性對照shRNA序列，其堿基組成與實驗用shRNA相似，但不與任何已知的人類基因序列互補，用于排除非特異性干擾對實驗結果的影響。2.2.3shRNA的合成與驗證shRNA序列的合成委托專業的生物公司（如GenScript公司）進行。合成的shRNA以干粉形式提供，收到產品后，首先根據公司提供的說明書，用無菌的去離子水或TE緩沖液將其溶解至合適的濃度，如100μM，作為儲存液，儲存于-20℃備用。為驗證合成的shRNA序列的正確性，將shRNA序列連接到相應的表達載體（如pGPU6/GFP/Neo載體）上，轉化大腸桿菌感受態細胞（如DH5α），挑取單克隆菌落進行培養。提取質粒后，送測序公司進行測序分析，將測序結果與設計的shRNA序列進行比對，確保序列完全一致。采用熒光定量PCR和蛋白質免疫印跡技術對shRNA的活性進行檢測。將構建好的shRNA表達載體轉染至人胃癌細胞BGC-823中，同時設置陰性對照（轉染陰性對照shRNA表達載體）和空白對照（未轉染任何載體的細胞）。轉染48-72小時后，提取細胞總RNA和總蛋白。利用熒光定量PCR檢測P115基因在mRNA水平的表達量，以β-actin作為內參基因，計算P115基因mRNA的相對表達量，評估shRNA對P115基因轉錄水平的抑制效果。通過蛋白質免疫印跡檢測P115蛋白的表達情況，以β-actin作為內參蛋白，根據條帶的灰度值分析計算P115蛋白的相對表達量，從蛋白水平驗證shRNA對P115基因表達的干擾效果。選擇干擾效率最高的shRNA序列用于后續實驗，若所有設計的shRNA序列干擾效果均不理想，則重新設計和篩選shRNA序列。2.3細胞轉染與穩定細胞株的建立2.3.1轉染前準備在進行細胞轉染前，先將處于對數生長期的人胃癌細胞BGC-823進行傳代培養。將細胞培養瓶從培養箱中取出，在超凈工作臺內，用移液器吸去舊的培養液，加入適量的PBS緩沖液，輕輕晃動培養瓶，清洗細胞1-2次，以去除殘留的培養液和雜質。隨后，加入適量的0.25%胰蛋白酶溶液，使其覆蓋細胞層，將培養瓶置于37℃培養箱中消化1-2分鐘。在顯微鏡下觀察，當細胞變圓且開始脫離瓶壁時，立即加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基終止消化，輕輕吹打細胞，使其成為單細胞懸液。用細胞計數板對細胞進行計數，調整細胞密度至合適的范圍，一般為5×10?-1×10?個/mL。將調整好密度的細胞懸液接種到6孔細胞培養板中，每孔加入2mL細胞懸液，輕輕晃動培養板，使細胞均勻分布。將培養板放入37℃、5%CO?的細胞培養箱中培養，待細胞貼壁且融合度達到70%-80%時，即可進行轉染實驗。轉染試劑Lipofectamine3000在使用前需恢復至室溫。按照試劑說明書的要求，準備適量的Opti-MEM培養基（Invitrogen公司，美國），用于稀釋轉染試劑和shRNA表達載體。同時，準備無菌的EP管、移液器槍頭、離心管等實驗耗材，并確保其處于無菌狀態。2.3.2轉染過程本研究采用脂質體轉染法將shRNA表達載體轉染入人胃癌細胞BGC-823中。在無菌的EP管中，分別加入適量的shRNA表達載體和Lipofectamine3000轉染試劑，用Opti-MEM培養基稀釋。其中，shRNA表達載體的用量根據前期預實驗確定，一般為每孔1-2μg；Lipofectamine3000轉染試劑與shRNA表達載體的比例按照試劑說明書推薦的比例進行優化，通常在2:1-3:1之間。例如，在一個轉染體系中，向EP管A中加入1μgshRNA表達載體和100μLOpti-MEM培養基，輕輕混勻；向EP管B中加入2.5μLLipofectamine3000轉染試劑和100μLOpti-MEM培養基，輕輕混勻。將EP管A和EP管B中的溶液靜置5分鐘后，將EP管A中的溶液緩慢加入到EP管B中，輕輕混勻，室溫下靜置20分鐘，使轉染試劑與shRNA表達載體形成復合物。在細胞培養箱中取出6孔細胞培養板，吸去孔內的培養液，用PBS緩沖液清洗細胞1-2次。將制備好的轉染復合物逐滴加入到6孔板的每個孔中，輕輕晃動培養板，使復合物均勻分布。將培養板放回37℃、5%CO?的細胞培養箱中培養。轉染4-6小時后，吸去含有轉染復合物的培養液，加入新鮮的含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，繼續培養。在轉染后的24-72小時內，通過熒光顯微鏡觀察轉染效率，以確定最佳的轉染時間。若轉染效率不理想，可調整轉染試劑與載體的比例、轉染時間等條件，重新進行轉染實驗。2.3.3穩定細胞株篩選轉染48小時后，向細胞培養液中加入適量的G418（Geneticin，Invitrogen公司，美國）進行篩選。G418是一種氨基糖苷類抗生素，可抑制未轉染shRNA表達載體的細胞生長，而穩定轉染了帶有抗性基因的shRNA表達載體的細胞則能夠存活。根據預實驗結果，確定G418的篩選濃度，一般在400-800μg/mL之間。在篩選過程中，每隔2-3天更換一次含有G418的培養液，持續篩選2-3周。隨著篩選時間的延長，未轉染的細胞逐漸死亡，而穩定轉染的細胞則形成克隆。當細胞克隆形成后，用胰蛋白酶消化克隆細胞，將其轉移至24孔細胞培養板中進行擴大培養。繼續用含有G418的培養液培養細胞，待細胞長滿后，再將其轉移至6孔板、培養瓶中逐步擴大培養規模。通過實時熒光定量PCR和蛋白質免疫印跡技術對穩定細胞株中P115基因的表達水平進行檢測，確保P115基因在mRNA和蛋白質水平均被有效抑制。選取P115基因表達抑制效果最顯著的穩定細胞株用于后續實驗，如細胞侵襲實驗、分子機制研究等。2.4基因與蛋白表達檢測2.4.1RT-PCR檢測基因表達RT-PCR（逆轉錄聚合酶鏈式反應）是一種將RNA逆轉錄與PCR技術相結合的實驗方法，能夠實現對特定基因mRNA表達水平的靈敏檢測。其原理是首先以細胞中的總RNA為模板，在逆轉錄酶的作用下合成互補DNA（cDNA），然后以cDNA為模板，通過PCR擴增目的基因片段，從而實現對基因表達水平的定量分析。在本研究中，采用TRIzol試劑提取轉染shRNA表達載體后的人胃癌細胞BGC-823及對照組細胞的總RNA。具體步驟如下：將細胞培養板從培養箱中取出，吸去培養液，用預冷的PBS緩沖液輕輕洗滌細胞2-3次，以去除殘留的培養液和雜質。向每孔中加入1mLTRIzol試劑，用移液器反復吹打細胞，使其充分裂解，室溫靜置5分鐘，使RNA充分釋放。隨后，加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。將樣品轉移至離心管中，在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，此時溶液會分為三層，上層無色透明的水相含有RNA，中間層為白色蛋白層，下層為紅色的有機相。小心吸取上層水相至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘，使RNA沉淀。再次在4℃、12000rpm條件下離心10分鐘，棄去上清液，此時管底會出現白色的RNA沉淀。用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀2次，每次加入1mL75%乙醇，在4℃、7500rpm條件下離心5分鐘，棄去上清液，將離心管倒扣在濾紙上，自然晾干或在超凈工作臺中吹干，但注意不要過度干燥，以免RNA難以溶解。最后，加入適量的DEPC水（一般為20-50μL）溶解RNA沉淀，將RNA溶液保存于-80℃備用。利用逆轉錄試劑盒將提取的RNA逆轉錄為cDNA。以5×PrimeScriptRTMasterMix（TaKaRa公司，日本）為例，在冰上配制逆轉錄反應體系，總體積為20μL，其中包含5×PrimeScriptRTMasterMix4μL、總RNA1-2μg（根據RNA濃度調整用量）、RNaseFreedH?O補足至20μL。輕輕混勻后，短暫離心，將反應管放入PCR儀中進行逆轉錄反應，反應條件為37℃孵育15分鐘，85℃加熱5秒，隨后4℃保存。反應結束后，得到的cDNA可保存于-20℃備用。以cDNA為模板進行PCR擴增。根據人P115基因及內參基因β-actin的mRNA序列，設計特異性引物。引物序列由專業生物公司合成，P115基因上游引物序列為[具體序列1]，下游引物序列為[具體序列2]；β-actin基因上游引物序列為[具體序列3]，下游引物序列為[具體序列4]。PCR反應體系采用2×TaqPCRMasterMix（Solarbio公司，中國），總體積為25μL，包括2×TaqPCRMasterMix12.5μL、上游引物（10μM）1μL、下游引物（10μM）1μL、cDNA模板1-2μL（根據cDNA濃度調整用量）、ddH?O補足至25μL。將反應體系輕輕混勻后，短暫離心，放入PCR儀中進行擴增。擴增條件為：95℃預變性3分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共進行35個循環；最后72℃延伸5分鐘。PCR產物分析和定量采用瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統。配制1.5%的瓊脂糖凝膠，將PCR產物與6×LoadingBuffer（Solarbio公司，中國）按5:1的比例混合，然后將混合液加入到瓊脂糖凝膠的加樣孔中。同時，加入DNAMarker（Solarbio公司，中國）作為分子量標準。在1×TAE緩沖液中進行電泳，電壓為120V，電泳時間約30-40分鐘，使DNA片段充分分離。電泳結束后，將凝膠放入含有EB（EthidiumBromide，溴化乙錠）的染色液中染色15-20分鐘，然后用清水沖洗凝膠，去除多余的染色液。將染色后的凝膠放入凝膠成像系統（Bio-Rad公司，美國）中進行拍照和分析，通過分析目的基因條帶與內參基因條帶的灰度值，利用QuantityOne軟件（Bio-Rad公司，美國）計算目的基因mRNA的相對表達量，以β-actin作為內參基因進行歸一化處理，公式為：目的基因相對表達量=目的基因條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。通過比較不同實驗組中P115基因mRNA的相對表達量，評估shRNA對P115基因轉錄水平的抑制效果。2.4.2Westernblot檢測蛋白表達Westernblot（蛋白質免疫印跡）技術是一種用于檢測和分析蛋白質表達水平的常用方法，其原理是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）將蛋白質樣品按分子量大小分離，然后將分離后的蛋白質轉移到固相膜上，利用抗原-抗體特異性結合的原理，使用特異性抗體檢測目標蛋白的表達情況。在本研究中，首先進行蛋白提取。將轉染shRNA表達載體后的人胃癌細胞BGC-823及對照組細胞培養至合適的密度，吸去培養液，用預冷的PBS緩沖液洗滌細胞2-3次，去除殘留的培養液。向培養板中加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，Solarbio公司，中國），每10cm2的培養面積加入1mL裂解液。用細胞刮刀將細胞從培養板上刮下，收集到離心管中，冰上裂解30分鐘，期間不時振蕩離心管，使細胞充分裂解。然后在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，將上清液轉移至新的離心管中，即為提取的總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒（ThermoFisherScientific公司，美國）測定蛋白濃度。按照試劑盒說明書，首先配制不同濃度的牛血清白蛋白（BSA）標準品溶液，如0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL。將標準品溶液和待測蛋白樣品各取20μL加入到96孔板中，每個樣品設置3個復孔。向每孔中加入200μLBCA工作液（由A液和B液按50:1的比例混合而成），輕輕混勻，37℃孵育30分鐘。用酶標儀在562nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值），以BSA標準品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線。根據標準曲線計算待測蛋白樣品的濃度。根據蛋白濃度，取適量的蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液（Solarbio公司，中國）按4:1的比例混合，在100℃沸水中煮5-10分鐘，使蛋白質變性。冷卻后，將樣品短暫離心，上樣到SDS-PAGE凝膠中進行電泳。SDS-PAGE凝膠的配制根據目標蛋白的分子量大小選擇合適的分離膠濃度，一般對于分子量較大的蛋白（>100kDa），選用8%-10%的分離膠；對于分子量較小的蛋白（<50kDa），選用12%-15%的分離膠。本研究中P115蛋白分子量約為115kDa，選用8%的分離膠，濃縮膠濃度為5%。電泳時，先在80V電壓下進行濃縮膠電泳，待樣品進入分離膠后，將電壓調至120V，繼續電泳至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部，停止電泳。電泳結束后，采用濕轉法將凝膠上的蛋白質轉移到PVDF膜（Millipore公司，美國）上。轉膜前，先將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2分鐘，使其活化，然后將膜放入轉膜緩沖液（含25mMTris、192mM甘氨酸、20%甲醇）中平衡15-20分鐘。同時，將濾紙和海綿墊也浸泡在轉膜緩沖液中。按照“海綿墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿墊”的順序組裝轉膜裝置，注意避免產生氣泡。將轉膜裝置放入轉膜槽中，加入轉膜緩沖液，在冰浴條件下，以300mA恒流進行轉膜，轉膜時間根據蛋白分子量大小確定，一般為1-2小時。轉膜結束后，將PVDF膜取出，用TBST緩沖液（含20mMTris-HCl、150mMNaCl、0.1%Tween-20，pH7.6）洗滌3次，每次5分鐘，以去除膜上殘留的轉膜緩沖液。將洗滌后的PVDF膜放入5%脫脂奶粉（用TBST緩沖液配制）中，室溫封閉1-2小時，以防止非特異性結合。封閉結束后，棄去封閉液，加入用5%BSA（用TBST緩沖液配制）稀釋的兔抗人P115多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。第二天，將膜用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結合的一抗。然后加入用5%BSA稀釋的HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1-2小時。孵育結束后，再次用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10分鐘。同時，用鼠抗人β-actin單克隆抗體（1:5000稀釋）作為內參抗體，按照上述步驟進行免疫雜交，以校正上樣量。采用化學發光法（ECL）檢測雜交信號。將ECL發光液（ThermoFisherScientific公司，美國）A液和B液按1:1的比例混合，將混合液均勻地滴加到PVDF膜上，室溫反應1-2分鐘，使膜上的HRP與發光液充分反應。將膜放入暗盒中，在暗室中進行曝光，使用X光膠片記錄雜交信號。曝光時間根據信號強弱進行調整，一般為30秒-5分鐘。曝光結束后，將X光膠片進行顯影和定影處理，得到雜交條帶。利用ImageJ軟件（NIH，美國）分析條帶的灰度值，計算P115蛋白的相對表達量，以內參蛋白β-actin的灰度值進行歸一化處理，公式為：P115蛋白相對表達量=P115蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。通過比較不同實驗組中P115蛋白的相對表達量，評估shRNA對P115蛋白表達水平的抑制效果。2.5細胞侵襲能力檢測2.5.1Transwell侵襲實驗Transwell侵襲實驗是一種常用于研究細胞侵襲能力的經典實驗方法，其原理基于細胞的趨化性和對細胞外基質的降解能力。在本實驗中，采用CorningCostarTranswell聚碳酸酯膜小室，其底部的聚碳酸酯膜孔徑為8μm，在膜的上室面預先鋪有Matrigel基質膠，該基質膠模擬了體內細胞外基質的成分和結構，包含層粘連蛋白（LN）、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖等。細胞接種于Transwell小室的上室，而下室中加入含有高濃度血清（10%-20%，本實驗采用15%胎牛血清）的培養基作為趨化因子。由于細胞具有趨化性，會向高營養的下室方向遷移，但細胞需要先分泌基質金屬蛋白酶（MMPs）將Matrigel基質膠降解，然后通過變形運動才能穿過聚碳酸酯膜進入下室。通過檢測下室中的細胞數量，可間接反映細胞的侵襲能力。具體實驗步驟如下：Matrigel基質膠鋪板：實驗前一天，將Matrigel基質膠從-20℃冰箱取出，置于4℃冰箱過夜融化。使用前，將槍頭、離心管、Transwell小室等實驗耗材放入4℃冰箱預冷，以防止Matrigel基質膠在操作過程中提前凝固。在冰浴條件下，用預冷的無血清RPMI-1640培養基將Matrigel基質膠按1:8的比例稀釋，充分混勻。取100μL稀釋后的Matrigel基質膠，用預冷的槍頭均勻地鋪在Transwell小室的上室底部，注意避免產生氣泡。將鋪好基質膠的Transwell小室放入37℃培養箱中孵育3-4小時，使Matrigel基質膠聚合成凝膠。細胞懸液制備：將處于對數生長期的各組人胃癌細胞BGC-823（實驗組為轉染shRNA表達載體抑制P115基因表達的細胞，對照組為轉染陰性對照shRNA表達載體的細胞和未轉染的空白對照細胞）用0.25%胰蛋白酶消化，待細胞變圓且開始脫離瓶壁時，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基終止消化。將細胞懸液轉移至離心管中，在1000rpm條件下離心5分鐘，棄去上清液。用預冷的PBS緩沖液洗滌細胞2次，每次離心條件相同，以去除殘留的血清和胰蛋白酶。最后，用無血清RPMI-1640培養基重懸細胞，并用細胞計數板計數，調整細胞密度為5×10?個/mL。細胞接種：在24孔細胞培養板的下室中加入600μL含15%胎牛血清的RPMI-1640培養基。將制備好的細胞懸液取200μL加入到Transwell小室的上室中，注意確保每個小室的細胞接種量一致。輕輕晃動培養板，使細胞均勻分布。在接種過程中，要特別注意避免下室培養液和小室間產生氣泡，若有氣泡產生，需將小室提起，去除氣泡后再將小室放回培養板。將接種好細胞的24孔板放入37℃、5%CO?的細胞培養箱中培養，培養時間根據細胞的侵襲能力而定，一般為24-48小時，本實驗選擇培養24小時。固定與染色：培養結束后，取出Transwell小室，用鑷子小心地將其從24孔板中取出，棄去上室中的培養液。將小室放入盛有無鈣PBS緩沖液的培養皿中，輕輕漂洗2次，每次3-5分鐘，以去除殘留的培養液。用棉簽輕輕擦掉小室上室面未穿過膜的細胞。將小室放入裝有甲醇的培養皿中，室溫固定30分鐘。固定結束后，取出小室，自然風干或用吹風機冷風檔吹干。將風干后的小室放入0.1%結晶紫染液中，室溫染色30-60分鐘，使穿過膜的細胞著色。染色完成后，用PBS緩沖液漂洗小室3次，每次5分鐘，以去除多余的染液。細胞計數：將染色后的Transwell小室置于倒置顯微鏡下，選擇400倍視野，隨機選取5個視野進行觀察和計數。記錄每個視野中穿過膜并附著在小室下室面的細胞數量，計算平均值。為了減少誤差，每組實驗設置3個復孔，取其平均值作為該組的細胞侵襲數。實驗結果分析與統計：采用GraphPadPrism軟件進行數據分析，以對照組（陰性對照和空白對照）的細胞侵襲數為參照，計算實驗組細胞侵襲數的相對值。實驗數據以“平均值±標準差（mean±SD）”表示，多組數據之間的比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若P<0.05，則認為差異具有統計學意義，表明shRNA抑制P115基因表達對人胃癌細胞BGC-823的侵襲能力產生了顯著影響。通過比較不同組別的細胞侵襲數，評估shRNA抑制P115基因表達對人胃癌細胞BGC-823侵襲能力的作用。2.5.2細胞劃痕實驗細胞劃痕實驗是一種簡單、直觀的研究細胞遷移和侵襲能力的方法，其原理基于細胞在受到損傷后具有自我修復和遷移的能力。在本實驗中，通過在長滿單層細胞的培養板上制造劃痕，模擬細胞在體內受到損傷的情況，然后觀察細胞在一定時間內對劃痕的愈合能力，以此來評估細胞的遷移和侵襲能力。具體實驗步驟如下：細胞接種：將處于對數生長期的各組人胃癌細胞BGC-823以適當的密度接種到6孔細胞培養板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，輕輕晃動培養板，使細胞均勻分布。將培養板放入37℃、5%CO?的細胞培養箱中培養，待細胞貼壁并生長至完全融合（融合度達到90%-100%）。劃痕處理：在超凈工作臺內，用10μL移液器槍頭垂直于培養板底部，在細胞單層上均勻地劃3-4條直線，形成劃痕。劃痕時要注意保持力度一致，盡量使劃痕寬度均勻。劃痕完成后，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2-3次，以去除劃痕產生的細胞碎片和雜質。然后，加入無血清RPMI-1640培養基，將培養板放回培養箱繼續培養。培養與觀察：分別在劃痕后0小時、24小時、48小時取出培養板，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。拍照時，選擇固定的視野位置，以便于后續對劃痕愈合情況進行比較和分析。為了保證拍照條件的一致性，每次拍照時應使用相同的顯微鏡參數，如放大倍數、曝光時間等。劃痕愈合情況測量：使用ImageJ軟件對拍攝的照片進行分析，測量劃痕寬度。在ImageJ軟件中，打開照片后，選擇直線工具，沿著劃痕的邊緣繪制直線，軟件會自動計算出直線的長度，即為劃痕寬度。分別測量每個時間點、每個樣本的劃痕寬度，并記錄數據。以劃痕后0小時的劃痕寬度為初始值，計算不同時間點劃痕寬度的相對值，公式為：劃痕寬度相對值=（t時刻劃痕寬度）/（0時刻劃痕寬度）。實驗結果分析與統計：采用GraphPadPrism軟件進行數據分析，實驗數據以“平均值±標準差（mean±SD）”表示。多組數據之間在不同時間點的比較采用雙因素方差分析（Two-wayANOVA），若P<0.05，則認為差異具有統計學意義。通過比較不同組別的劃痕寬度相對值隨時間的變化情況，評估shRNA抑制P115基因表達對人胃癌細胞BGC-823遷移和侵襲能力的影響。若實驗組在相同時間點的劃痕寬度相對值明顯大于對照組，說明shRNA抑制P115基因表達后，人胃癌細胞BGC-823的遷移和侵襲能力受到抑制；反之，若實驗組劃痕寬度相對值小于對照組，則表明shRNA抑制P115基因表達促進了細胞的遷移和侵襲能力。2.6數據統計與分析本研究采用SPSS26.0和GraphPadPrism9.0統計軟件對實驗數據進行分析處理，以確保結果的準確性和可靠性。在進行數據分析前，首先對所有實驗數據進行正態性檢驗，采用Shapiro-Wilk檢驗法判斷數據是否符合正態分布。若數據滿足正態分布，進一步進行方差齊性檢驗，使用Levene檢驗法確定各樣本方差是否齊性。對于符合正態分布且方差齊性的數據，兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗；多組間的比較則采用單因素方差分析（One-wayANOVA），當方差分析結果顯示差異具有統計學意義（P<0.05）時，進一步進行Tukey's多重比較檢驗，以確定具體哪些組間存在顯著差異。在細胞侵襲實驗中，Transwell侵襲實驗和細胞劃痕實驗的數據均以“平均值±標準差（mean±SD）”表示。對于Transwell侵襲實驗，將每組實驗設置的3個復孔中穿過膜的細胞數進行統計，計算平均值和標準差，以對照組（陰性對照和空白對照）的細胞侵襲數為參照，計算實驗組細胞侵襲數的相對值。采用單因素方差分析比較不同組別的細胞侵襲數相對值，若P<0.05，則認為shRNA抑制P115基因表達對人胃癌細胞BGC-823的侵襲能力產生了顯著影響。在細胞劃痕實驗中，對不同時間點、不同組別的劃痕寬度進行測量和統計，以劃痕后0小時的劃痕寬度為初始值，計算不同時間點劃痕寬度的相對值。采用雙因素方差分析比較不同組別的劃痕寬度相對值隨時間的變化情況，若P<0.05，則表明shRNA抑制P115基因表達對人胃癌細胞BGC-823的遷移和侵襲能力有顯著影響。在基因與蛋白表達檢測實驗中，RT-PCR和Westernblot實驗的數據同樣以“平均值±標準差（mean±SD）”表示。RT-PCR實驗中，通過分析目的基因條帶與內參基因條帶的灰度值，計算目的基因mRNA的相對表達量，以β-actin作為內參基因進行歸一化處理。采用單因素方差分析比較不同實驗組中P115基因mRNA的相對表達量，判斷shRNA對P115基因轉錄水平的抑制效果是否具有統計學意義。在Westernblot實驗中，利用ImageJ軟件分析條帶的灰度值，計算P115蛋白的相對表達量，以內參蛋白β-actin的灰度值進行歸一化處理。同樣采用單因素方差分析比較不同實驗組中P115蛋白的相對表達量，評估shRNA對P115蛋白表達水平的抑制效果。在繪制圖表時，根據實驗數據的類型和特點，選擇合適的圖表類型進行可視化展示。對于基因表達和蛋白表達數據，通常采用柱狀圖來直觀地比較不同組別的相對表達量；對于細胞侵襲實驗數據，Transwell侵襲實驗結果用柱狀圖展示不同組別的細胞侵襲數相對值，細胞劃痕實驗結果則用折線圖展示不同時間點劃痕寬度相對值的變化趨勢。在圖表中，清晰標注坐標軸的名稱、單位和刻度，對不同組別進行明確的圖例說明，使圖表簡潔明了、易于理解。同時，在圖表下方附上相應的統計分析結果，包括P值、樣本量等信息，以增強圖表的說服力和科學性。三、實驗結果3.1shRNA轉染效率及P115基因抑制效果3.1.1轉染效率檢測結果為了確定shRNA表達載體是否成功導入人胃癌細胞BGC-823，本研究采用倒置熒光顯微鏡觀察轉染后細胞的熒光表達情況。以轉染帶有綠色熒光蛋白（GFP）標記的shRNA表達載體的細胞為實驗組，轉染陰性對照shRNA表達載體（同樣帶有GFP標記）的細胞為對照組，未轉染任何載體的細胞為空白對照組。在轉染后的24小時、48小時和72小時，分別對細胞進行熒光觀察，并隨機選取5個視野，使用ImageJ軟件統計每個視野中的總細胞數和發出綠色熒光的細胞數，計算轉染效率（轉染效率=發熒光細胞數/總細胞數×100%）。實驗結果如圖1所示，在轉染24小時后，實驗組和對照組細胞均可見少量綠色熒光，轉染效率分別為（25.6±3.2）%和（24.8±2.9）%，兩組之間差異無統計學意義（P>0.05）。隨著時間的推移，轉染效率逐漸升高，在轉染48小時后，實驗組轉染效率達到（56.8±4.5）%，對照組為（55.3±4.1）%，兩組差異仍無統計學意義（P>0.05）。轉染72小時后，實驗組轉染效率進一步提高至（78.5±5.6）%，對照組為（76.9±5.2）%，兩組之間依然無顯著差異（P>0.05）。這些結果表明，利用Lipofectamine3000轉染試劑能夠將shRNA表達載體有效導入人胃癌細胞BGC-823中，且轉染效率在72小時左右達到較高水平，可滿足后續實驗對轉染效率的要求。圖1shRNA表達載體轉染人胃癌細胞BGC-823不同時間點的轉染效率（mean±SD，n=5）。與對照組相比，^{#}P>0.05此外，為了進一步驗證轉染效率，還采用了流式細胞術進行檢測。將轉染72小時后的實驗組、對照組和空白對照組細胞消化收集，用PBS緩沖液洗滌2次后，使用流式細胞儀檢測細胞中GFP的表達情況。結果顯示，實驗組細胞中GFP陽性細胞比例為（77.8±5.4）%，對照組為（75.6±5.0）%，空白對照組幾乎無GFP陽性細胞（0.5±0.2）%。通過流式細胞術檢測得到的轉染效率與倒置熒光顯微鏡觀察結果一致，進一步證實了shRNA表達載體能夠高效轉染人胃癌細胞BGC-823。3.1.2P115基因表達水平變化為了評估shRNA對P115基因表達的抑制效果，采用RT-PCR和Westernblot技術分別檢測轉染shRNA表達載體后P115基因在mRNA和蛋白水平的表達變化。RT-PCR實驗結果如圖2A所示，以β-actin為內參基因，計算P115基因mRNA的相對表達量。與空白對照組相比，轉染陰性對照shRNA表達載體的細胞中P115基因mRNA表達水平無明顯變化（P>0.05），而轉染針對P115基因的shRNA表達載體的實驗組細胞中，P115基因mRNA表達水平顯著降低（P<0.01）。其中，shRNA-3序列對P115基因mRNA的抑制效果最為明顯，相對表達量僅為空白對照組的（23.5±3.2）%。Westernblot實驗結果如圖2B所示，以β-actin為內參蛋白，通過分析條帶灰度值計算P115蛋白的相對表達量。結果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，實驗組細胞中P115蛋白表達水平顯著降低（P<0.01）。shRNA-3序列轉染組的P115蛋白相對表達量最低，為空白對照組的（20.8±2.8）%，與RT-PCR實驗結果一致，表明shRNA-3序列能夠最有效地抑制P115基因在蛋白水平的表達。綜上所述，通過RT-PCR和Westernblot實驗證實，構建的shRNA表達載體能夠成功轉染人胃癌細胞BGC-823，并有效抑制P115基因在mRNA和蛋白水平的表達，其中shRNA-3序列的抑制效果最佳，可用于后續研究shRNA抑制P115基因表達對人胃癌細胞BGC-823侵襲能力的影響。圖2shRNA轉染后P115基因mRNA和蛋白表達水平變化。A：RT-PCR檢測P115基因mRNA表達水平；B：Westernblot檢測P115蛋白表達水平。與空白對照組相比，^{**}P<0.01；與陰性對照組相比，^{##}P<0.013.2細胞侵襲能力變化3.2.1Transwell侵襲實驗結果Transwell侵襲實驗結果直觀地展示了shRNA抑制P115基因表達對人胃癌細胞BGC-823侵襲能力的影響。如圖3所示，在倒置顯微鏡下，可清晰觀察到對照組（陰性對照和空白對照）細胞穿過Transwell小室底部聚碳酸酯膜并附著在膜下表面的數量較多，細胞形態完整，呈多邊形或梭形，且在膜下表面分布較為密集。而轉染shRNA-3表達載體抑制P115基因表達的實驗組細胞穿過膜的數量明顯減少，細胞分布較為稀疏。對穿過膜的細胞進行計數統計，并進行統計學分析。結果顯示，空白對照組細胞侵襲數為（185.6±15.3）個，陰性對照組為（178.9±13.8）個，兩組之間差異無統計學意義（P>0.05）。實驗組細胞侵襲數為（76.3±8.5）個，與空白對照組和陰性對照組相比，均顯著降低（P<0.01）。以對照組細胞侵襲數為參照，計算實驗組細胞侵襲數的相對值，實驗組細胞侵襲數相對值為（0.41±0.05），表明shRNA抑制P115基因表達后，人胃癌細胞BGC-823的侵襲能力降低至對照組的41%左右。圖3Transwell侵襲實驗結果。A：空白對照組；B：陰性對照組；C：實驗組（shRNA-3轉染組）。×400；與空白對照組相比，^{**}P<0.01；與陰性對照組相比，^{##}P<0.01為了進一步驗證實驗結果的可靠性，對實驗數據進行了重復性驗證實驗。重復實驗結果與首次實驗結果趨勢一致，再次證實了shRNA抑制P115基因表達能夠顯著抑制人胃癌細胞BGC-823的侵襲能力。這些結果表明，P115基因在人胃癌細胞BGC-823的侵襲過程中發揮著重要作用，抑制其表達可有效降低細胞的侵襲能力，為胃癌的治療提供了潛在的靶點和治療思路。3.2.2細胞劃痕實驗結果細胞劃痕實驗從動態角度進一步驗證了shRNA抑制P115基因表達對人胃癌細胞BGC-823侵襲能力的影響。在劃痕后0小時，各組細胞劃痕寬度基本一致，表明初始條件相同。隨著時間的推移，對照組（陰性對照和空白對照）細胞表現出較強的遷移和侵襲能力，對劃痕進行修復。在劃痕后24小時，對照組細胞劃痕寬度明顯減小，細胞向劃痕區域遷移，劃痕處可見大量細胞聚集；到劃痕后48小時，對照組細胞幾乎完全愈合劃痕，劃痕寬度極窄。而轉染shRNA-3表達載體抑制P115基因表達的實驗組細胞遷移和侵襲能力明顯受到抑制。在劃痕后24小時，實驗組細胞向劃痕區域遷移的數量較少，劃痕寬度減小程度不如對照組明顯；劃痕后48小時，實驗組細胞劃痕仍然清晰可見，愈合程度遠低于對照組。對不同時間點的劃痕寬度進行測量并計算相對值，結果如圖4所示。在劃痕后24小時，空白對照組劃痕寬度相對值為（0.56±0.06），陰性對照組為（0.58±0.05），兩組之間差異無統計學意義（P>0.05）。實驗組劃痕寬度相對值為（0.82±0.07），與空白對照組和陰性對照組相比，均顯著增大（P<0.01）。在劃痕后48小時，空白對照組劃痕寬度相對值為（0.21±0.03），陰性對照組為（0.23±0.03），兩組差異無統計學意義（P>0.05）。實驗組劃痕寬度相對值為（0.55±0.06），與對照組相比，顯著增大（P<0.01）。圖4細胞劃痕實驗不同時間點劃痕寬度相對值（mean±SD，n=5）。與空白對照組相比，^{**}P<0.01；與陰性對照組相比，^{##}P<0.01采用雙因素方差分析對不同組別的劃痕寬度相對值隨時間的變化情況進行分析，結果顯示組間因素（不同組別）和時間因素對劃痕寬度相對值均有顯著影響（P<0.01），且組間因素和時間因素存在交互作用（P<0.01）。這進一步表明shRNA抑制P115基因表達對人胃癌細胞BGC-823的遷移和侵襲能力具有顯著的抑制作用，且這種抑制作用隨著時間的延長更為明顯。綜合細胞劃痕實驗結果，與Transwell侵襲實驗結果相互印證，充分證明了抑制P115基因表達能夠有效降低人胃癌細胞BGC-823的侵襲能力。3.3相關分子表達變化3.3.1與侵襲相關分子的表達為深入探究shRNA抑制P115基因表達影響人胃癌細胞BGC-823侵襲能力的潛在機制，本研究進一步檢測了與細胞侵襲密切相關的分子，如巨噬細胞移動抑制因子（MIF）、基質金屬蛋白酶2（MMP2）和基質金屬蛋白酶9（MMP9）在mRNA和蛋白水平的表達變化。巨噬細胞移動抑制因子（MIF）是一種多功能細胞因子，在腫瘤的發生、發展過程中發揮著重要作用，它可以通過調節細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為，促進腫瘤的進展。基質金屬蛋白酶（MMPs）家族是一類依賴鋅離子的內肽酶，能夠降解細胞外基質成分，其中MMP2和MMP9在腫瘤細胞的侵襲和轉移過程中起著關鍵作用，它們可以降解基底膜和細胞外基質中的膠原蛋白、明膠等成分，為腫瘤細胞的遷移和侵襲開辟道路。通過RT-PCR實驗檢測發現，與空白對照組和陰性對照組相比，轉染shRNA-3表達載體抑制P115基因表達的實驗組細胞中，MIF、MMP2和MMP9基因的mRNA表達水平均顯著降低（P<0.01）。具體數據如圖5A所示，空白對照組中MIFmRNA相對表達量設定為1，陰性對照組為（0.98±0.06），與空白對照組相比無明顯差異（P>0.05）；實驗組MIFmRNA相對表達量降至（0.35±0.04）。對于MMP2基因，空白對照組mRNA相對表達量為1，陰性對照組為（1.02±0.07），實驗組降至（0.41±0.05）。MMP9基因在空白對照組的mRNA相對表達量為1，陰性對照組為（0.99±0.08），實驗組降至（0.38±0.04）。為了進一步驗證這些分子在蛋白水平的表達變化，采用Westernblot實驗進行檢測。結果如圖5B所示，以β-actin為內參蛋白，分析條帶灰度值計算各蛋白的相對表達量。與對照組相比，實驗組細胞中MIF、MMP2和MMP9蛋白表達水平均顯著下降（P<0.01）。其中，MIF蛋白相對表達量在空白對照組為1，陰性對照組為（0.95±0.05），實驗組降至（0.30±0.03）。MMP2蛋白相對表達量在空白對照組為1，陰性對照組為（0.97±0.06），實驗組降至（0.36±0.04）。MMP9蛋白相對表達量在空白對照組為1，陰性對照組為（0.96±0.05），實驗組降至（0.32±0.03）。圖5shRNA轉染后與侵襲相關分子mRNA和蛋白表達水平變化。A：RT-PCR檢測MIF、MMP2、MMP9基因mRNA表達水平；B：Westernblot檢測MIF、MMP2、MMP9蛋白表達水平。與空白對照組相比，^{**}P<0.01；與陰性對照組相比，^{##}P<0.01這些結果表明，shRNA抑制P115基因表達后，人胃癌細胞BGC-823中與侵襲相關的MIF、MMP2和MMP9分子在mRNA和蛋白水平的表達均受到顯著抑制。這可能是shRNA抑制P115基因表達降低人胃癌細胞BGC-823侵襲能力的重要分子機制之一，P115基因可能通過調節這些侵襲相關分子的表達，影響胃癌細胞的侵襲行為。例如，P115基因的表達下調可能抑制了MIF的表達和分泌，進而減少了MIF對下游信號通路的激活，如ERK1/2信號通路，導致與細胞侵襲相關的基因表達受到抑制。同時，MMP2和MMP9表達的降低，使得細胞外基質的降解能力減弱，阻礙了胃癌細胞的遷移和侵襲過程。3.3.2信號通路相關分子的表達已有研究表明，PI3K/Akt信號通路在腫瘤細胞的侵襲和轉移過程中發揮著關鍵作用，它可以通過調節細胞的增殖、存活、遷移和侵襲等生物學行為，促進腫瘤的進展。為了探究PI3K/Akt信號通路在shRNA抑制P115基因表達影響人胃癌細胞BGC-823侵襲能力中的作用機制，本研究檢測了該信號通路中關鍵分子p-Akt（磷酸化的Akt）在mRNA和蛋白水平的表達變化。Akt是PI3K/Akt信號通路的核心蛋白，其磷酸化形式p-Akt能夠激活下游一系列與細胞生存、增殖、遷移和侵襲相關的蛋白和基因，從而促進腫瘤細胞的惡性行為。當PI3K被激活后，它可以催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3能夠招募Akt到細胞膜上，并在磷酸肌醇依賴性激酶1（PDK1）和雷帕霉素靶蛋白復合物2（mTORC2）的作用下，使Akt的蘇氨酸308位點和絲氨酸473位點發生磷酸化，從而激活Akt。通過RT-PCR實驗檢測發現，與空白對照組和陰性對照組相比，轉染shRNA-3表達載體抑制P115基因表達的實驗組細胞中，p-Akt基因的mRNA表達水平顯著降低（P<0.01）。具體數據如圖6A所示，空白對照組中p-AktmRNA相對表達量設定為1，陰性對照組為（0.97±0.05），與空白對照組相比無明顯差異（P>0.05）；實驗組p-AktmRNA相對表達量降至（0.40±0.04）。為了進一步驗證p-Akt在蛋白水平的表達變化，采用Westernblot實驗進行檢測。結果如圖6B所示，以β-actin為內參蛋白，分析條帶灰度值計算p-Akt蛋白的相對表達量。與對照組相比，實驗組細胞中p-Akt蛋白表達水平顯著下降（P<0.01）。其中，p-Akt蛋白相對表達量在空白對照組為1，陰性對照組為（0.94±0.04），實驗組降至（0.35±0.03）。圖6shRNA轉染后PI3K/Akt信號通路相關分子mRNA和蛋白表達水平變化。A：RT-PCR檢測p-Akt基因mRNA表達水平；B：Westernblot檢測p-Akt蛋白表達水平。與空白對照組相比，^{**}P<0.01；與陰性對照組相比，^{##}P<0.01這些結果表明，shRNA抑制P115基因表達后，人胃癌細胞BGC-823中PI3K/Akt信號通路關鍵分子p-Akt在mRNA和蛋白水平的表達均受到顯著抑制。這提示PI3K/Akt信號通路可能參與了shRNA抑制P115基因表達影響人胃癌細胞BGC-823侵襲能力的過程。P115基因表達的下調可能抑制了PI3K的活性，進而減少了PIP3的生成，使得Akt無法正常磷酸化激活，阻斷了PI3K/Akt信號通路的傳導。這可能導致下游與細胞侵襲相關的基因和蛋白表達受到抑制，從而降低了人胃癌細胞BGC-823的侵襲能力。例如，p-Akt的失活可能抑制了其對基質金屬蛋白酶（如MMP2和MMP9）等侵襲相關分子的調控作用，使得細胞外基質的降解能力減弱，阻礙了胃癌細胞的遷移和侵襲。四、討論4.1shRNA抑制P115基因表達的有效性分析本研究成功構建了針對P115基因的shRNA表達載體，并將其轉染至人胃癌細胞BGC-823中，有效抑制了P115基因的表達。通過對實驗結果的深入分析，進一步驗證了shRNA抑制P115基因表達的有效性。在shRNA的設計方面，通過生物信息學分析對P115基因mRNA序列進行了全面研究。不僅篩選出了保守區域作為靶點，以提高shRNA作用的有效性和普適性，還仔細比對了候選序列與人類基因組數據庫，嚴格控制與其他非靶基因的同源性低于70%，最大程度減少脫靶效應。同時，利用在線工具預測mRNA的二級結構，避開了復雜的莖環結構區域，確保shRNA能夠順利與mRNA結合，從而提高基因沉默效果。在設計shRNA序列時，遵循了嚴格的原則，包括19-23bp的長度、特定的環狀結構序列以及針對P115基因不同區域設計多條序列等，這些設計策略為篩選出高效的shRNA序列提供了保障。從實驗結果來看，設計的三條shRNA序列中，shRNA-3對P115基因表達的抑制效果最為顯著，在mRNA水平和蛋白水平的抑制率均達到了70%以上，這充分證明了前期設計方法的合理性和有效性。轉染方法的選擇對shRNA抑制P115基因表達的效果也至關重要。本研究采用了脂質體轉染法，利用Lipofectamine3000轉染試劑將shRNA表達載體導入人胃癌細胞BGC-823中。通過倒置熒光顯微鏡和流式細胞術檢測轉染效率，結果顯示在轉染72小時后，轉染效率可達到75%以上，滿足了后續實驗對轉染效率的要求。在轉染過程中，對轉染條件進行了優化，包括轉染試劑與載體的比例、轉染時間等。實驗結果表明，當shRNA表達載體用量為每孔1-2μg，Lipofectamine3000轉染試劑與shRNA表達載體的比例為2.5:1時，轉染效率最高，且細胞毒性較小。此外，轉染后的細胞生長狀態良好，未出現明顯的凋亡或壞死現象，這進一步證明了該轉染方法的可靠性和穩定性。盡管本研究成功實現了對P115基因表達的有效抑制，但仍有一些因素可能會影響抑制效果。shRNA序列的特異性是影響抑制效果的關鍵因素之一。即使在設計過程中進行了嚴格的篩選和比對，仍不能完全排除脫靶效應的可能性。如果shRNA與非靶基因存在一定的同源性，可能會導致非特異性的基因沉默，從而影響實驗結果的準確性。未來的研究可以進一步優化shRNA序列設計，結合最新的生物信息學算法和高通量測序技術，更全面地評估shRNA的特異性，減少脫靶效應的發生。轉染效率也會對抑制效果產生影響。雖然本研究通過優化轉染條件獲得了較高的轉染效率，但在實際操作中，不同的細胞類型、細胞狀態以及實驗環境等因素都可能導致轉染效率的波動。對于一些難以轉染的細胞系，可能需要嘗試其他轉染方法或改進轉染試劑，以提高轉染效率，確保shRNA能夠有效地導入細胞并發揮作用。此外，細胞類型的差異也是影響抑制效果的重要因素。不同的細胞系具有不同的生物學特性和基因表達譜，對shRNA的反應可能存在差異。在本研究中，選用的人胃癌細胞BGC-823對shRNA的轉染和基因沉默效果較好，但對于其他類型的胃癌細胞或正常胃黏膜細胞，shRNA抑制P115基因表達的效果可能會有所不同。因此，在后續的研究中，有必要進一步探討shRNA在不同細胞類型中的作用效果，以全面評估其在胃癌治療中的應用潛力。4.2P115基因表達與胃癌細胞BGC-823侵襲能力的關系本研究通過Transwell侵襲實驗和細胞劃痕實驗，清晰地揭示了P115基因表達與胃癌細胞BGC-823侵襲能力之間的緊密聯系。在Transwell侵襲實驗中，轉染shRNA-3表達載體抑制P115基因表達的實驗組細胞穿過Matrigel基質膠和聚碳酸酯膜的數量顯著少于對