蘋果組培苗繁育技術(shù)規(guī)程2017-12-22實施2017-12-22實施河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB13/T2596—2017本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：師校欣、杜國強(qiáng)、高儀、楊麗麗、許建鋒、王燕霞、張瑩、劉婉君、成曉華。1DB13/T2596—2017蘋果組培苗繁育技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了蘋果品種和砧木(Malusspp.)組織培養(yǎng)繁育過程中的術(shù)語和定義、蘋果組培苗生產(chǎn)設(shè)施、培養(yǎng)基制備、組培室消毒滅菌、蘋果組培苗生產(chǎn)、組培苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、包裝、標(biāo)簽和運輸?shù)确矫娴牟僮饕?guī)程。本標(biāo)準(zhǔn)適用于蘋果品種和砧木組織培養(yǎng)繁育苗木。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB9847蘋果苗木LY/TNY/TNY/TNY/T2306-20132719-2015林木組織培養(yǎng)育苗技術(shù)規(guī)程蘋果苗木繁育技術(shù)規(guī)程花卉種苗組培快繁技術(shù)規(guī)程蘋果苗木脫毒技術(shù)規(guī)范LY/T1882-2010、NY/T2306-2013等界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。為便于使用，以下重復(fù)列出了LY/T1882-2010、NY/T2306-2013中的某些術(shù)語和定3.1在無菌條件下，將離體的植物器官、組織、細(xì)胞以及原生質(zhì)體，在人工培養(yǎng)基和人工控制的環(huán)境中，使其再生新植株的過程和技術(shù)。[LY/T1882-2010,定義3.2]以植物莖尖為外植體，通過組織培養(yǎng)的方式獲得完整植株的一種生物技術(shù)。一般用來進(jìn)行脫毒種苗的生產(chǎn)，以獲得不含檢疫及影響植物正常生長的病毒的植株。[NY/T2306-2013,定義3.4]根據(jù)植物營養(yǎng)原理和植物組織培養(yǎng)的要求，人工配制的營養(yǎng)基質(zhì)。[LY/T1882-2010,定義3.4]2DB13/T2596—2017[LY/T1882-2010,定義3.5]通過物理、化學(xué)及一些理化方法，殺滅一切微生物(包括孢子等)的過程。[NY/T2306-2013,定義3.5]通過物理、化學(xué)方法去除物體表面大部分有害病原微生物(孢子除外)的過程。[NY/T2306-2013,定義3.10][NY/T2306-2013,定義3.8]注：改寫NY/T2306-2013,定義3.3。材料的過程。3.10繼代培養(yǎng)subculture[LY/T1882-2010,定義3.7]3.11此過程重復(fù)發(fā)生而形成的多芽多梢的集合體。3DB13/T2596—20173.12通過組織培養(yǎng)方法獲得的培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)材料。包括外植體初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)各階段的組培材料。注：改寫NY/T2306-2013,定義3.7。3.13組培苗plantpropagatedviatissueculture利用植物組織、器官或細(xì)胞等作為起始材料，通過植物組織培養(yǎng)方式生產(chǎn)獲得的植株。[NY/T2306-2013,定義3.12]4蘋果組培苗生產(chǎn)設(shè)施蘋果組培苗繁育實驗室或組培生產(chǎn)工廠應(yīng)包括培養(yǎng)基制備室、洗滌室、滅菌室、接種室、培養(yǎng)室、制水室、儲存室(倉庫)、溫室或大棚等部分，面積可視工作(生產(chǎn))規(guī)模確定。5.1.1基本培養(yǎng)基采用MS培養(yǎng)基或C?7培養(yǎng)基，具體成分分別見附錄A中的表A.1和附錄B中的表B.1。5.1.2外植體初代培養(yǎng)基新紅星等元帥系品種：C?7+6-芐基腺嘌呤(6-BA)0.5mg/L+吲哚丁酸(IBA)0.2mg/L+水解酪蛋白(CH)300mg/L+蔗糖30g/L+固化劑(能使培養(yǎng)基凝固的最低用量，視固化劑種類確定)。除元帥系外的其它蘋果品種和砧木：MS+6-BA0.5mg/L～1.0mg/L+萘乙酸(NAA)0.05mg/L+蔗糖35g/L+固化劑(能使培養(yǎng)基凝固的最低用量，視固化劑種類確定)。5.1.3繼代培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基MS(C?7)+6-BA1.0mg/L～3.0mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖35g/L+固化劑(同5.1.2)。5.1.4生根培養(yǎng)基：1/2MS(1/2C??)+IBA0.3mg/L~0.6mg/L+吲哚乙酸(IAA)1.0mg/L+蔗糖25g/L+固化劑(同5.1.2)。5.1.5不同蘋果品種或砧木組織培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的濃度可根據(jù)以上配方給出的濃度范圍適當(dāng)調(diào)整。5.1.6為降低成本，蔗糖可用等量食用白砂糖代替。5.2.1母液配制選用化學(xué)純以上純度的化學(xué)試劑，使用蒸餾水或去離子水。4DB13/T2596—20175.2.2根據(jù)附錄A中表A.1和附錄B中表B.1的基本培養(yǎng)基配方成分分組和濃度擴(kuò)大倍數(shù)，分別配制大量元素(50倍)母液、鈣元素(50倍)母液、微量元素-1(200倍)母液、微量元素-2(500倍)母液、鐵元素(100倍)母液和有機(jī)物(100倍)母液。5.2.3植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)配制成單一成分母液，濃度以方便使用為原則，一般為0.1mg/ml～0.5mg/ml。5.2.4培養(yǎng)基母液試劑瓶分別貼上標(biāo)簽，標(biāo)注母液名稱、配制倍數(shù)和日期，置于冰箱冷藏保存。有機(jī)物母液、鐵元素母液和植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)母液應(yīng)儲存在棕色試劑瓶中。5.3培養(yǎng)基配制程序以備查證。5.3.2按照計算結(jié)果稱量固化劑與蔗糖(或白砂糖),加入已溫?zé)岬恼麴s水中，蒸餾水的量以培養(yǎng)基配制體積的1/2～2/3為宜，不斷攪拌，熬至沸騰。5.3.3在熬開的鍋內(nèi)加入相應(yīng)母液，加蒸餾水定容，充分?jǐn)嚢杈鶆颉?.3.4用1.0mol/L鹽酸或1.0mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至5.8～6.0。5.3.5將培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)容器中，用封口膜、封口蓋或棉塞加牛皮紙封口。5.3.6將培養(yǎng)基放入高壓蒸汽滅菌器內(nèi)滅菌。滅菌溫度121℃,滅菌時間20min。5.3.7滅菌后的培養(yǎng)基在干凈、陰涼的室內(nèi)常溫平放保存，保存時間不宜超過2周。6組培室消毒滅菌工作細(xì)則組培室保持清潔衛(wèi)生，消毒滅菌工作細(xì)則參見附錄C。7.1無菌接種操作7.1.1利用超凈工作臺提供的無菌環(huán)境進(jìn)行接種，使用超凈工作臺接種前應(yīng)提前20min開機(jī)及紫外燈。接種前關(guān)閉紫外燈，用75%的酒精擦拭工作臺臺面及玻璃內(nèi)壁。7.1.2用于切分外植體或無菌組培材料的培養(yǎng)皿、不銹鋼小盤等需事先高壓滅菌。7.1.3刀、鑷子等接種工具用酒精擦拭或浸泡，再用電熱接種工具滅菌器(280℃~320℃)或酒精燈灼燒滅菌后，置擱置臺上冷卻至常溫使用。7.2.1外植體采集及處理7.2.1.1選擇品種純正或砧木類型一致、性狀穩(wěn)定、生長健壯、無病蟲危害和機(jī)械損傷的植株。5DB13/T2596—20177.2.1.2在春季采集由葉芽萌發(fā)長出幾片小幼葉的幼嫩新梢、未木質(zhì)化或半木質(zhì)化新梢，去除新梢上展開的葉片，未展開的小幼葉可不去除。亦可選用一年生枝，將基部浸于水中室內(nèi)催芽，待葉芽萌動長出幼嫩新梢后及時采集。7.2.1.3將外植體表面用自來水沖洗干凈，較長新梢剪段，置于瓶中。7.2.2.1按照7.1的要求準(zhǔn)備好超凈工作臺及接種工具。7.2.2.2使用5%次氯酸鈉溶液，消毒時間10min～15min;使用0.1%氯化汞溶液，消毒時間6min~15min。消毒時間可根據(jù)材料的幼嫩程度、潔凈程度適當(dāng)調(diào)整。7.2.2.3消毒期間多次晃動消毒容器，以保證外植體與消毒劑充分接觸。7.2.2.4外植體消毒完成后，用無菌水沖洗4遍以上。7.2.2.5使用過的氯化汞廢液禁止隨意傾倒，應(yīng)妥善收集保存，交由當(dāng)?shù)丨h(huán)保部門處理。7.2.3外植體切分接種7.2.3.1長度1cm以下的幼嫩新梢去掉外圍葉片，基部切出新鮮切口，接入培養(yǎng)基；較長的新梢切單節(jié)莖段，節(jié)位密集時，亦可切雙節(jié)或多節(jié)莖段接種。7.2.3.2每瓶接1個～3個外植體，要求分布均勻，深淺適中。7.2.3.3封好瓶口后，注明品種代號、接種人員、接種日期等，放至培養(yǎng)室培養(yǎng)。7.2.3.4外植體出現(xiàn)褐化時要頻繁多次轉(zhuǎn)接，減輕毒害。7.2.3.5元帥系品種初代培養(yǎng)較難，可在接種后常規(guī)培養(yǎng)1周，然后暗培養(yǎng)1周，再常規(guī)培養(yǎng)。暗培養(yǎng)可將材料置于培養(yǎng)室中的暗培養(yǎng)櫥，或在培養(yǎng)架用黑布遮蓋。7.2.3.6利用莖尖培養(yǎng)脫除病毒培育無病毒原種和無病毒苗時，應(yīng)剝?nèi)?.1mm～0.2mm的莖尖分生組織(帶1個或2個葉原基)作為外植體接種。7.3繼代與增殖培養(yǎng)7.3.1將初代或繼代培養(yǎng)材料，去除基部愈傷組織、老化組織及生長不良的組織，切分成0.5cm~1.5cm大小的叢梢或莖段，接入繼代培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)室培養(yǎng)。7.3.2接種數(shù)量根據(jù)培養(yǎng)容器的大小決定，要求材料擺布均勻，間距1.0cm～2.0cm。7.3.3培養(yǎng)4周～6周，繼代苗生長緩慢至停長時，及時進(jìn)行繼代轉(zhuǎn)接。個別蘋果品種或砧木(如蘋果砧木難咽等)繼代苗停長后衰老速度較快，應(yīng)適當(dāng)縮短繼代間隔時間。7.3.4繼代增殖階段，如遇繼代苗發(fā)生“玻璃化”,在繼代培養(yǎng)基中添加1g/L～3g/L聚乙烯醇(PVA),可有效防止玻璃苗發(fā)生，也可使部分玻璃化程度較輕的試管苗恢復(fù)正常。7.4生根培養(yǎng)7.4.1繼代培養(yǎng)4周～6周后，切取長度大于2cm的單根粗壯嫩梢插入生根培養(yǎng)基，接種數(shù)量參見6DB13/T2596—20177.4.2接種后放至培養(yǎng)室培養(yǎng)，元帥系品種先暗培養(yǎng)1周，再常規(guī)培養(yǎng)，有助于提高生根效果。7.4.3富士等多數(shù)蘋果品種需連續(xù)繼代培養(yǎng)8代～10代以上才能獲得較高且穩(wěn)定的生根率。外植體初代培養(yǎng)、繼代增殖、生根培養(yǎng)各階段的接種材料均放至培養(yǎng)室(25±2)℃,光照強(qiáng)度：1500Lx～2000Lx,光周期：14h～16h光照時間，8h～10h黑暗時間。生根苗出瓶移栽應(yīng)先在溫室(或大棚)進(jìn)行鍛煉和過渡移栽。溫室(或大棚)的最適溫度25℃,最低溫度>10℃,最高溫度<35℃,光照強(qiáng)度18000Lx～30000Lx以上。7.6.2移栽容器及基質(zhì)試管苗移栽容器可選用塑料或無紡布營養(yǎng)缽。基質(zhì)可用蛭石、草炭、珍珠巖或沙壤土等混合物，裝入移栽容器的2/3處，澆透水。生根培養(yǎng)2周~3周、不定根長至約1.0cm時，將試管苗由培養(yǎng)室移至溫室，閉瓶鍛煉3周，促使試管苗生長充實健壯，適應(yīng)性和抗逆性增強(qiáng)。溫室光照過強(qiáng)時可遮蔭。閉瓶鍛煉后除去封口材料，開瓶鍛煉2d～4d,以增強(qiáng)鍛煉效果。將試管苗從培養(yǎng)容器內(nèi)取出，輕輕抖掉根部的培養(yǎng)基，將小苗直立置于移栽容器的基質(zhì)上，根系盡量舒展，用0.1%多菌靈藥液攪拌消毒過的蛭石覆蓋并固定根系。栽后噴0.1%多菌靈液防病，扣小拱棚，保證小拱棚內(nèi)空氣濕度90%以上。7.6.5過渡移栽栽后管理7.6.5.1移栽7d～10d即緩苗期過后應(yīng)逐漸揭膜通風(fēng)，降低濕度，直至完全除去薄膜。7.6.5.2視小苗發(fā)病狀況，每1周～2周噴1次0.1%多菌靈液。7.6.5.3過渡移栽后期，視苗況，適當(dāng)補(bǔ)充營養(yǎng)液，以利壯苗。7.6.6.1圃地選擇按照NY/T1085-2006的規(guī)定執(zhí)行。7.6.6.2過渡移栽2個月后，成活苗地上部生長>10cm,從移栽容器中倒出，帶基質(zhì)土坨移栽至田間。7.6.6.3移栽前加強(qiáng)通風(fēng)煉苗，控制澆水。高溫季節(jié)移栽應(yīng)適當(dāng)遮陰。脫毒方法及病毒檢測方法按NY/T2719-2015執(zhí)行。經(jīng)病毒檢測確認(rèn)脫除了病毒的材料進(jìn)行組織培DB13/T2596—201778試管苗及組培苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)8.1試管苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)適宜出瓶移栽的合格試管苗應(yīng)無污染，具有3條以上不定根，根長適中，最好有側(cè)根發(fā)出，幼莖粗壯，莖基部沒有或僅有少量愈傷組織，葉片發(fā)育良好，無黃葉，無枯尖。8.2組培苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)出圃的組培苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)按GB9847執(zhí)行。9包裝、標(biāo)簽和運輸9.1試管苗包裝、標(biāo)簽和運輸試管苗應(yīng)放于泡沫箱中，用填充物固定好，高溫季節(jié)加冰袋，泡沫箱用膠帶密封。標(biāo)簽標(biāo)明品種、瓶苗數(shù)量、包裝時間等。碼放禁止上下倒置，運輸過程避免劇烈顛簸。9.2組培苗包裝、標(biāo)簽和運輸組培苗的包裝、標(biāo)簽和運輸按照GB9847的規(guī)定執(zhí)行。DB13/T2596—20178(規(guī)范性附錄)表A.1MS培養(yǎng)基成分及母液配制表母液種類及倍數(shù)試劑配方規(guī)定量mg/L配制1升母液所需量g大量元素KNO3NH4NO382.5KH2P04鈣元素440鐵元素27.82.78有機(jī)物VB10.01VB60.05煙酸0.05甘氨酸2肌醇微量元素-1200x22.34.46H3B03KI0.830.166微量元素-20.250.1250.0250.01250.0250.01259DB13/T2596—2017(規(guī)范性附錄)C??基本培養(yǎng)基配方(適合元帥系品種)表B.1C?培養(yǎng)基成分及母液配制表母液倍數(shù)試劑配方規(guī)定量mg/L配制1升母液所需量g大量元素