Salusins對Apoe-/-小鼠動脈粥樣硬化及血管炎癥影響的機制探究一、引言1.1研究背景與意義動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種常見且危害極大的心血管疾病，是心腦血管疾病的主要病理基礎，嚴重威脅人類健康。近年來，隨著生活方式的改變和人口老齡化的加劇，動脈粥樣硬化的發病率和死亡率顯著上升，已成為全球范圍內亟待解決的重要健康問題。據統計，心血管疾病死亡人數已超過各類疾病死亡總數的40%，而動脈粥樣硬化在其中扮演著關鍵角色。動脈粥樣硬化的發病機制十分復雜，涉及脂質代謝紊亂、炎癥反應、內皮功能障礙、氧化應激等多個方面，且受遺傳、環境、生活習慣等多種因素影響。其主要病理特征是動脈管壁增厚變硬、失去彈性和管腔縮小，在動脈內膜下形成富含脂質和壞死物質的粥樣斑塊。這些斑塊一旦破裂，會引發急性血栓形成，導致血管阻塞，進而引發心肌梗死、腦卒中等嚴重心腦血管事件，嚴重時可危及生命。例如，當動脈粥樣硬化斑塊發生在冠狀動脈，會造成冠狀動脈狹窄，影響心肌的供血和供氧，誘發心絞痛；繼發血栓形成堵塞冠狀動脈還會引起心梗，造成心肌缺血壞死。若發生在腦血管，可能會引起腦血管狹窄，斑塊脫落后形成的栓子可能會誘發腦血栓，斑塊破裂還會引起腦出血，使患者產生生命危險。Apoe-/-小鼠是研究動脈粥樣硬化的常用動物模型，由于其載脂蛋白E基因缺失，導致脂質代謝異常，在高脂飲食喂養下，能快速形成動脈粥樣硬化病變，與人類動脈粥樣硬化的病理過程具有相似性，為研究動脈粥樣硬化的發病機制和治療方法提供了重要的實驗工具。Salusins是一種新發現的血管活性肽，包括salusin-α和salusin-β，它們由同一前體蛋白經不同剪切方式產生。大量研究表明，Salusins在動脈粥樣硬化斑塊中高表達，提示其在動脈粥樣硬化發生和進展中可能發揮重要作用。研究Salusins對Apoe-/-小鼠動脈粥樣硬化形成及血管炎癥反應的影響，有助于深入揭示動脈粥樣硬化的發病機制，為尋找新的治療靶點和開發有效的治療藥物提供理論依據，對改善動脈粥樣硬化患者的預后、降低心腦血管疾病的發生率和死亡率具有重要的現實意義。1.2研究目的與內容本研究旨在深入探究Salusins對Apoe-/-小鼠動脈粥樣硬化形成及血管炎癥反應的具體影響，為揭示動脈粥樣硬化的發病機制和尋找新的治療靶點提供實驗依據。具體研究內容如下：研究Salusins對Apoe-/-小鼠動脈粥樣硬化形成的影響：將Apoe-/-小鼠分為不同實驗組，分別給予salusin-α、salusin-β處理，同時設立模型對照組和正常對照組。對小鼠進行高脂飼料喂養，以促進動脈粥樣硬化的形成。實驗過程中，定期監測小鼠的體重、飲食和活動等一般情況。實驗結束后，檢測小鼠血漿中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）等血脂指標的含量，分析Salusins對血脂代謝的影響。采用HE染色和油紅O染色等方法，觀察各組小鼠主動脈的病理變化，測量動脈粥樣硬化斑塊的面積、內膜厚度等指標，評估動脈粥樣硬化的病變程度，明確Salusins對Apoe-/-小鼠動脈粥樣硬化形成的作用。研究Salusins對Apoe-/-小鼠血管炎癥反應的影響：采用與上述相同的分組和處理方式，利用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測各組小鼠血漿中白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子的水平，以評估全身炎癥反應的程度。運用實時熒光定量PCR（real-timePCR）技術檢測小鼠主動脈中單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）等炎癥相關基因的mRNA表達水平，從基因轉錄層面分析Salusins對血管炎癥反應的影響。通過免疫組化染色技術和蛋白質免疫印跡法（western-blot）檢測小鼠主動脈中MCP-1、VCAM-1、核因子-κBp65（NF-κBp65）等炎癥相關蛋白的表達情況，明確Salusins對血管炎癥反應相關蛋白表達的調節作用。探討Salusins影響Apoe-/-小鼠動脈粥樣硬化形成及血管炎癥反應的潛在機制：基于上述實驗結果，進一步探討Salusins影響動脈粥樣硬化形成及血管炎癥反應的潛在信號通路和分子機制。通過生物信息學分析、細胞實驗等方法，研究Salusins與脂質代謝相關基因、炎癥信號通路關鍵分子之間的相互作用，揭示Salusins在動脈粥樣硬化發病過程中的作用機制，為開發針對動脈粥樣硬化的新型治療策略提供理論基礎。1.3研究方法與創新點本研究采用了一系列先進的實驗技術和方法，對Salusins在動脈粥樣硬化中的作用進行了全面深入的探究。實驗動物分組采用隨機分組的方法，將Apoe-/-小鼠隨機分為不同實驗組，同時設立正常對照組，以確保實驗結果的可靠性和可比性。通過給予不同的處理因素，觀察各組小鼠動脈粥樣硬化形成及血管炎癥反應的差異，為研究提供了有力的實驗數據支持。在檢測指標及方法方面，本研究綜合運用了多種檢測技術，從不同層面揭示Salusins的作用機制。利用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血漿中炎癥因子水平，實時熒光定量PCR（real-timePCR）檢測基因表達水平，免疫組化染色技術和蛋白質免疫印跡法（western-blot）檢測蛋白表達情況等。這些技術的綜合運用，使得研究結果更加全面、準確，能夠深入了解Salusins對動脈粥樣硬化形成及血管炎癥反應的影響。本研究的創新點主要體現在研究視角和方法上。從研究視角來看，本研究聚焦于新發現的血管活性肽Salusins，探討其在動脈粥樣硬化發病機制中的作用，為動脈粥樣硬化的研究提供了新的視角和方向。以往對動脈粥樣硬化的研究主要集中在傳統的危險因素和信號通路，而對Salusins這種新型血管活性肽的研究相對較少。本研究的開展，有助于拓展對動脈粥樣硬化發病機制的認識，為尋找新的治療靶點提供理論依據。在研究方法上，本研究采用多種先進技術手段，從血脂代謝、血管病理變化、炎癥因子水平、基因和蛋白表達等多個層面進行綜合研究，全面揭示Salusins的作用機制。這種多層面、多角度的研究方法，能夠更加深入地了解Salusins在動脈粥樣硬化中的作用，為后續的研究和治療提供更豐富的信息。此外，本研究還結合生物信息學分析和細胞實驗等方法，進一步探討Salusins的作用機制，提高了研究的科學性和創新性。二、相關理論基礎2.1Salusins概述Salusins是一類于2003年被日本學者Shichiri等發現的心血管活性肽，這一發現為心血管領域的研究開啟了新的篇章。其包括salusin-α和salusin-β兩種亞型，分別由28個和20個氨基酸殘基組成，二者均來源于Pre-prosalusin。而Pre-prosalusinmRNA是由扭轉應力張力基因TOR2AmRNA經選擇性剪接翻譯而來，這種獨特的生成方式使得Salusins在生物體內的調控機制顯得尤為復雜且特殊。在人體的生理分布方面，Salusins廣泛存在于多個組織和體液中。在腎臟中，其參與了腎臟的生理調節過程，對維持腎臟的正常功能有著不可或缺的作用；在血管組織里，Salusins與血管的生理活動密切相關，影響著血管的收縮與舒張等功能；同時，在體液中也能檢測到Salusins的存在，這表明其在全身的物質運輸和信號傳遞等過程中可能發揮著重要的作用。這種廣泛的分布暗示著Salusins在維持機體生理平衡方面扮演著重要角色，也為其在多種生理和病理過程中的研究提供了重要線索。從生理功能上看，Salusins具有多種重要的生物學活性。其一，對心血管系統具有顯著的調節作用，靜脈注射Salusins能快速且大幅度地降低血壓，同時減慢心率。這一功能的發現為心血管疾病的治療提供了新的潛在靶點和思路，可能為高血壓等心血管疾病的治療帶來新的希望。其二，Salusins能夠增加細胞內鈣離子水平，通過上調多種基因表達來促進細胞有絲分裂，這在細胞的生長、發育以及組織的修復和再生等過程中具有重要意義。其三，salusin-β還能刺激大鼠下丘腦，引起垂體精氨酸加壓素釋放，這進一步表明了Salusins在神經內分泌調節方面的重要作用，參與了機體的神經體液調節過程，維持著機體內環境的穩定。在心血管系統中，Salusins的重要性尤為突出。它參與調節心肌細胞生長，能夠減輕心肌細胞鈣超載，具有抗心肌細胞凋亡的作用，這對于維持心肌細胞的正常功能和心臟的正常結構至關重要。同時，Salusins還參與調節巨噬泡沫細胞的形成，巨噬泡沫細胞的形成是動脈粥樣硬化發展過程中的關鍵環節，因此，Salusins對巨噬泡沫細胞形成的調節作用，進而影響了動脈粥樣硬化的進程。這一系列發現使得Salusins成為心血管疾病研究領域的熱點，為深入理解心血管疾病的發病機制和尋找新的治療方法提供了重要的理論依據。2.2Apoe-/-小鼠與動脈粥樣硬化載脂蛋白E（ApolipoproteinE，ApoE）是一種由肝臟、巨噬細胞和其他組織合成的糖蛋白，在脂質代謝中發揮著核心作用。ApoE基因位于人類第19號染色體長臂上，其編碼的ApoE蛋白含有299個氨基酸殘基，在體內以多種異構體形式存在，主要包括ApoE2、ApoE3和ApoE4，它們在人群中的分布頻率和功能存在差異。ApoE作為一種配體，能與細胞表面的多種受體，如低密度脂蛋白受體（Low-densitylipoproteinreceptor，LDLR）、極低密度脂蛋白受體（Verylowdensitylipoproteinreceptor，VLDLR）等特異性結合，介導脂蛋白的攝取和代謝。通過這種方式，ApoE參與了膽固醇、甘油三酯等脂質的轉運和清除過程，對維持體內脂質平衡至關重要。Apoe-/-小鼠，即載脂蛋白E基因敲除小鼠，是通過基因工程技術將小鼠體內的ApoE基因進行敲除而獲得的動物模型。由于ApoE基因的缺失，Apoe-/-小鼠無法正常合成ApoE蛋白，這導致其脂質代謝出現嚴重異常。在正常情況下，ApoE能夠促進脂蛋白的代謝和清除，維持血脂水平的穩定。而在Apoe-/-小鼠中，缺乏ApoE的調節作用，脂蛋白代謝受阻，血漿中膽固醇、甘油三酯等脂質成分顯著升高，尤其是富含膽固醇的低密度脂蛋白（Low-densitylipoprotein，LDL）和極低密度脂蛋白（Verylowdensitylipoprotein，VLDL）在血液中大量積累。這些異常升高的脂質水平，為動脈粥樣硬化的發生提供了物質基礎。動脈粥樣硬化的形成是一個復雜且漸進的過程，涉及多個病理生理環節。在Apoe-/-小鼠中，由于血脂代謝紊亂，血液中過多的脂質，特別是氧化修飾的低密度脂蛋白（Oxidizedlow-densitylipoprotein，ox-LDL），容易侵入動脈內膜下。ox-LDL具有很強的細胞毒性，它能夠損傷血管內皮細胞，破壞內皮細胞的完整性和正常功能，使其失去抗血栓形成、抗炎和調節血管張力的能力。受損的內皮細胞會分泌多種細胞因子和趨化因子，如單核細胞趨化蛋白-1（Monocytechemoattractantprotein-1，MCP-1）、血管細胞黏附分子-1（Vascularcelladhesionmolecule-1，VCAM-1）等，這些物質能夠吸引血液中的單核細胞和淋巴細胞向動脈內膜下遷移和聚集。單核細胞進入內膜下后，會分化為巨噬細胞。巨噬細胞通過其表面的清道夫受體，大量攝取ox-LDL，逐漸轉化為泡沫細胞。泡沫細胞的形成是動脈粥樣硬化早期病變的重要特征，這些細胞在動脈內膜下不斷堆積，形成了富含脂質的脂肪條紋。隨著病變的發展，平滑肌細胞從動脈中膜遷移到內膜下，并在各種生長因子和細胞因子的刺激下增殖，同時合成和分泌大量的細胞外基質，如膠原蛋白、彈性蛋白等。這些細胞外基質與泡沫細胞、炎癥細胞等共同構成了動脈粥樣硬化斑塊的纖維帽，使得脂肪條紋逐漸發展為纖維脂質斑塊。在動脈粥樣硬化斑塊的形成和發展過程中，炎癥反應始終貫穿其中。炎癥細胞，如巨噬細胞、T淋巴細胞等，在斑塊內大量聚集，它們分泌多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（Tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）等，這些炎癥因子進一步激活內皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞，加劇炎癥反應，促進斑塊的進展。同時，炎癥反應還會導致斑塊內的細胞凋亡、基質降解和血管新生，這些變化會削弱斑塊的穩定性，使其容易破裂。一旦斑塊破裂，暴露的內容物會激活血小板和凝血系統，導致血栓形成，進而引發急性心血管事件，如心肌梗死、腦卒中等。Apoe-/-小鼠在動脈粥樣硬化研究中具有諸多獨特的優勢和特點。Apoe-/-小鼠在普通飲食條件下即可自發形成動脈粥樣硬化病變，病變部位主要發生在主動脈弓、胸主動脈和腹主動脈等部位，且病變的發展過程與人類動脈粥樣硬化具有高度的相似性，包括早期的脂肪條紋形成、中期的纖維脂質斑塊發展以及晚期的斑塊破裂和血栓形成等階段，這使得研究人員能夠在小鼠模型上直觀地觀察和研究動脈粥樣硬化的自然病程。Apoe-/-小鼠對高脂飲食極為敏感，給予高脂飲食喂養后，其動脈粥樣硬化病變的發展速度明顯加快，病變程度也更為嚴重。這種對高脂飲食的敏感性，為研究高脂血癥與動脈粥樣硬化之間的關系提供了便利，研究人員可以通過調整高脂飲食的成分和喂養時間，模擬不同程度的高脂血癥環境，深入探討脂質代謝紊亂在動脈粥樣硬化發生發展中的作用機制。Apoe-/-小鼠的基因背景相對清晰且易于控制，這使得研究人員能夠方便地對其進行各種基因操作和干預實驗。例如，可以將其他與動脈粥樣硬化相關的基因導入Apoe-/-小鼠體內，或者通過基因編輯技術敲除某些基因，以研究這些基因在動脈粥樣硬化發病機制中的作用。此外，還可以利用Apoe-/-小鼠進行藥物研發和療效評估實驗，通過給予不同的藥物干預，觀察其對動脈粥樣硬化病變的影響，為開發新型抗動脈粥樣硬化藥物提供實驗依據。由于Apoe-/-小鼠體型較小、繁殖周期短、飼養成本相對較低，且易于操作和管理，使得大規模的實驗研究成為可能。這不僅能夠提高實驗效率，還能夠降低研究成本，為動脈粥樣硬化的基礎研究和臨床前研究提供了有力的支持。2.3動脈粥樣硬化與血管炎癥的關系動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，炎癥反應貫穿于動脈粥樣硬化發生、發展的全過程，在其發病機制中扮演著核心角色。二者之間存在著復雜且緊密的相互作用關系，炎癥既是動脈粥樣硬化發生的重要始動因素，又在其發展過程中不斷促進病變的進展，而動脈粥樣硬化病變本身又會進一步加劇炎癥反應，形成惡性循環。在動脈粥樣硬化的發生初期，血管內皮細胞作為血管壁與血液的直接接觸界面，首先受到各種危險因素的攻擊，如高脂血癥、高血壓、高血糖、氧化應激、感染等。這些因素會導致內皮細胞功能障礙，使其正常的屏障功能、抗凝功能、抗炎功能以及調節血管張力的功能受損。內皮細胞功能障礙后，會發生形態和功能的改變，如細胞間隙增大、表面負電荷減少、分泌一氧化氮（NO）等舒張血管物質減少，同時表達多種粘附分子和趨化因子，如血管細胞粘附分子-1（VCAM-1）、細胞間粘附分子-1（ICAM-1）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等。這些粘附分子和趨化因子能夠與血液中的炎癥細胞表面的相應受體結合，吸引單核細胞、淋巴細胞等炎癥細胞向血管內皮細胞粘附、遷移，進而進入血管內膜下，啟動炎癥反應。單核細胞進入內膜下后，在巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）等細胞因子的作用下，分化為巨噬細胞。巨噬細胞通過其表面的清道夫受體（SR），如SR-A、CD36等，大量攝取氧化修飾的低密度脂蛋白（ox-LDL），逐漸轉化為泡沫細胞。泡沫細胞的形成是動脈粥樣硬化早期病變的重要標志，它們在血管內膜下不斷積聚，形成了富含脂質的脂肪條紋。在此過程中，巨噬細胞會分泌多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）等，這些炎癥因子進一步激活內皮細胞、平滑肌細胞和其他炎癥細胞，形成正反饋調節，加劇炎癥反應。同時，炎癥因子還能促進平滑肌細胞從動脈中膜遷移到內膜下，并在生長因子的刺激下增殖，合成和分泌細胞外基質，使脂肪條紋逐漸發展為纖維脂質斑塊。隨著動脈粥樣硬化病變的進展，炎癥反應持續存在并不斷加重。在纖維脂質斑塊中，巨噬細胞、T淋巴細胞等炎癥細胞大量浸潤，它們分泌的炎癥因子和蛋白酶不僅會破壞血管壁的正常結構和功能，還會影響斑塊的穩定性。例如，巨噬細胞分泌的基質金屬蛋白酶（MMPs）能夠降解細胞外基質，削弱纖維帽的強度，使斑塊變得不穩定，容易破裂。T淋巴細胞通過分泌細胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）等，調節巨噬細胞的功能，促進炎癥反應，同時還能抑制平滑肌細胞合成膠原，進一步降低斑塊的穩定性。此外，炎癥反應還會導致斑塊內的細胞凋亡、壞死，形成富含脂質和壞死物質的核心，增加了斑塊破裂的風險。一旦動脈粥樣硬化斑塊破裂，暴露的斑塊內容物會激活血小板和凝血系統，導致血栓形成。血栓可以部分或完全阻塞血管，引發急性心血管事件，如心肌梗死、腦卒中等。在這個過程中，炎癥反應仍然起著重要作用。炎癥細胞釋放的組織因子（TF）等促凝血物質，能夠啟動外源性凝血途徑，促進血栓形成。同時，炎癥因子還能激活血小板，增強血小板的聚集和粘附能力，進一步促進血栓的形成。此外，炎癥還會導致血管痙攣，加重血管阻塞，增加急性心血管事件的發生風險。在動脈粥樣硬化的發生發展過程中，炎癥細胞和炎癥因子之間存在著復雜的相互作用。巨噬細胞作為炎癥反應的關鍵細胞，不僅能夠攝取ox-LDL形成泡沫細胞，還能分泌多種炎癥因子和蛋白酶，調節炎癥反應和斑塊的穩定性。T淋巴細胞通過細胞免疫和分泌細胞因子，參與炎癥反應的調節，促進或抑制動脈粥樣硬化的發展。B淋巴細胞則通過產生抗體，參與免疫反應，可能對動脈粥樣硬化的發生發展產生影響。此外，中性粒細胞、肥大細胞等其他炎癥細胞也在動脈粥樣硬化的炎癥反應中發揮著一定的作用。它們釋放的炎癥介質和蛋白酶，能夠加重炎癥反應，損傷血管壁，促進動脈粥樣硬化的進展。三、Salusins對Apoe-/-小鼠動脈粥樣硬化形成的影響3.1實驗設計本實驗選取6周齡雄性Apoe-/-小鼠40只，同時選取10只同齡雄性C57BL/6J小鼠作為正常對照組。將Apoe-/-小鼠隨機分為4組，每組10只，分別為模型對照組、salusin-α組、salusin-β組和聯合處理組（同時給予salusin-α和salusin-β）。小鼠飼養于溫度（23±2）℃、濕度（50±5）%的環境中，保持12h光照/12h黑暗的晝夜節律，自由攝食和飲水。正常對照組給予普通飼料喂養，其余各組給予高脂飼料（含21%脂肪、0.15%膽固醇）喂養，以誘導動脈粥樣硬化的形成。實驗開始后，salusin-α組小鼠腹腔注射salusin-α（10nmol/kg），salusin-β組小鼠腹腔注射salusin-β（10nmol/kg），聯合處理組小鼠同時腹腔注射salusin-α（10nmol/kg）和salusin-β（10nmol/kg），模型對照組和正常對照組給予等量的生理鹽水腹腔注射。每天注射1次，連續注射12周。在實驗過程中，每周稱量小鼠體重，記錄飲食和活動情況，觀察小鼠的一般狀態。實驗結束前1天，小鼠禁食不禁水12h，然后用代謝籠收集24h尿液，用于檢測相關指標。實驗結束時，小鼠經腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）麻醉后，眼眶取血，分離血漿，用于檢測血脂指標。迅速取出心臟和主動脈，用預冷的生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分。部分主動脈用于制備冰凍切片，進行油紅O染色，觀察脂質沉積情況；部分主動脈用于制備石蠟切片，進行HE染色，觀察動脈粥樣硬化病變的病理形態學變化。血脂檢測采用全自動生化分析儀檢測血漿中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的含量。具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。病理染色方面，油紅O染色用于顯示脂質，將主動脈冰凍切片用4%多聚甲醛固定10min，蒸餾水沖洗后，用60%異丙醇浸泡5min，然后滴加油紅O工作液，室溫染色15-20min，再用60%異丙醇分化30s，蒸餾水沖洗，蘇木精復染細胞核，最后用甘油明膠封片，在顯微鏡下觀察脂質沉積情況，并用圖像分析軟件測量脂質斑塊面積。HE染色用于觀察動脈粥樣硬化病變的病理形態學變化，將主動脈石蠟切片常規脫蠟至水，蘇木精染色5min，自來水沖洗，1%鹽酸酒精分化數秒，自來水沖洗返藍，伊紅染色3min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察動脈內膜增厚、平滑肌細胞增生、炎癥細胞浸潤等病理變化，并測量內膜厚度。3.2實驗結果實驗結束時，對各組小鼠血漿中的血脂指標進行檢測，結果如表1所示。與正常對照組相比，模型對照組小鼠血漿中TC、TG、LDL-C水平顯著升高（P<0.01），HDL-C水平顯著降低（P<0.01），表明Apoe-/-小鼠在高脂飼料喂養下成功誘導出高脂血癥，符合動脈粥樣硬化模型的特征。給予salusin-α、salusin-β及聯合處理后，與模型對照組相比，salusin-α組和salusin-β組小鼠血漿中TC、TG、LDL-C水平均有不同程度降低，HDL-C水平有所升高，但差異均無統計學意義（P>0.05）。聯合處理組小鼠血漿中TC、LDL-C水平顯著降低（P<0.05），HDL-C水平顯著升高（P<0.05），TG水平雖有降低趨勢，但差異無統計學意義（P>0.05）。這表明salusin-α和salusin-β聯合處理對Apoe-/-小鼠的血脂代謝具有一定的調節作用，能夠降低血脂水平，改善血脂異常。通過油紅O染色觀察小鼠主動脈脂質沉積情況，結果如圖1所示。正常對照組小鼠主動脈內膜光滑，無明顯脂質沉積。模型對照組小鼠主動脈內膜可見大量紅色脂質斑塊，表明存在嚴重的脂質沉積，動脈粥樣硬化病變明顯。salusin-α組和salusin-β組小鼠主動脈內膜脂質斑塊面積較模型對照組有所減少，但差異不顯著。聯合處理組小鼠主動脈內膜脂質斑塊面積顯著小于模型對照組（P<0.05），說明salusin-α和salusin-β聯合處理能夠減少Apoe-/-小鼠主動脈的脂質沉積，抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成。HE染色結果顯示，正常對照組小鼠主動脈管壁結構完整，內膜、中膜和外膜界限清晰，內皮細胞排列整齊，平滑肌細胞形態正常，無炎癥細胞浸潤（圖2A）。模型對照組小鼠主動脈內膜明顯增厚，平滑肌細胞增生，大量炎癥細胞浸潤，內膜下可見脂質沉積，形成典型的動脈粥樣硬化斑塊（圖2B）。salusin-α組和salusin-β組小鼠主動脈內膜增厚程度和炎癥細胞浸潤情況較模型對照組有所減輕，但差異不明顯（圖2C、D）。聯合處理組小鼠主動脈內膜增厚程度和炎癥細胞浸潤情況顯著減輕（P<0.05），內膜下脂質沉積減少，動脈粥樣硬化病變明顯改善（圖2E）。測量各組小鼠主動脈內膜厚度，結果如表2所示。與正常對照組相比，模型對照組小鼠主動脈內膜厚度顯著增加（P<0.01）。與模型對照組相比，聯合處理組小鼠主動脈內膜厚度顯著降低（P<0.05），而salusin-α組和salusin-β組內膜厚度雖有降低趨勢，但差異無統計學意義（P>0.05）。這進一步證實了salusin-α和salusin-β聯合處理對Apoe-/-小鼠動脈粥樣硬化病變具有明顯的改善作用。3.3結果分析與討論本研究通過對Apoe-/-小鼠給予salusin-α、salusin-β及聯合處理，觀察其對動脈粥樣硬化形成的影響，結果表明salusin-α和salusin-β聯合處理能夠調節血脂代謝，減少主動脈脂質沉積，抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成，改善動脈粥樣硬化病變，而單獨給予salusin-α或salusin-β處理雖有一定作用趨勢，但效果不顯著。血脂異常是動脈粥樣硬化發生發展的重要危險因素之一，降低血脂水平對于預防和治療動脈粥樣硬化具有重要意義。本研究中，模型對照組Apoe-/-小鼠在高脂飼料喂養下，血漿中TC、TG、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低，表明成功誘導出高脂血癥，符合動脈粥樣硬化模型的特征。給予salusin-α和salusin-β聯合處理后，小鼠血漿中TC、LDL-C水平顯著降低，HDL-C水平顯著升高，說明聯合處理能夠有效調節血脂代謝，改善血脂異常。這可能是因為salusin-α和salusin-β通過協同作用，影響了脂質代謝相關基因的表達和信號通路，促進了膽固醇的逆向轉運，減少了脂質在血液中的沉積。而單獨給予salusin-α或salusin-β處理時，雖能使血脂水平有所降低，但差異無統計學意義，可能是由于單獨作用時其調節血脂的能力相對較弱，無法達到顯著改善血脂異常的效果。動脈粥樣硬化的主要病理特征是動脈內膜下脂質沉積，形成粥樣斑塊，導致血管壁增厚、變硬，管腔狹窄。油紅O染色和HE染色結果顯示，聯合處理組小鼠主動脈內膜脂質斑塊面積顯著減小，內膜增厚程度和炎癥細胞浸潤情況顯著減輕，表明salusin-α和salusin-β聯合處理能夠有效抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成，改善動脈粥樣硬化病變。這可能是由于聯合處理通過調節血脂代謝，減少了脂質在主動脈內膜下的沉積，從而減輕了對血管內皮細胞的損傷，抑制了炎癥反應和泡沫細胞的形成，進而抑制了動脈粥樣硬化的發展。單獨給予salusin-α或salusin-β處理時，雖能使主動脈內膜脂質斑塊面積和內膜增厚程度有所減少，但差異不顯著，可能是因為單獨作用不足以有效抑制動脈粥樣硬化的復雜病理過程，需要兩者協同作用才能發揮明顯的抑制效果。本研究結果為深入理解Salusins在動脈粥樣硬化發生發展中的作用提供了重要實驗依據，提示salusin-α和salusin-β聯合應用可能成為預防和治療動脈粥樣硬化的新策略。然而，本研究仍存在一定局限性，例如未進一步探討salusin-α和salusin-β聯合作用的具體分子機制，后續研究可通過基因芯片、蛋白質組學等技術，深入研究其對脂質代謝和動脈粥樣硬化相關信號通路的影響，為開發新型抗動脈粥樣硬化藥物提供更堅實的理論基礎。四、Salusins對ApoE-/-小鼠血管炎癥反應的影響4.1實驗設計選取6周齡雄性Apoe-/-小鼠40只，隨機分為4組，每組10只，分別為模型對照組、salusin-α組、salusin-β組和聯合處理組（同時給予salusin-α和salusin-β）。另取10只同齡雄性C57BL/6J小鼠作為正常對照組。小鼠飼養環境溫度控制在（23±2）℃，濕度維持在（50±5）%，保持12h光照/12h黑暗的晝夜節律，自由攝食和飲水。正常對照組給予普通飼料喂養，其余各組給予高脂飼料（含21%脂肪、0.15%膽固醇）喂養，以誘導動脈粥樣硬化的形成。實驗開始后，salusin-α組小鼠腹腔注射salusin-α（10nmol/kg），salusin-β組小鼠腹腔注射salusin-β（10nmol/kg），聯合處理組小鼠同時腹腔注射salusin-α（10nmol/kg）和salusin-β（10nmol/kg），模型對照組和正常對照組給予等量的生理鹽水腹腔注射。每天注射1次，連續注射12周。在實驗過程中，每周稱量小鼠體重，記錄飲食和活動情況，密切觀察小鼠的一般狀態。實驗結束前1天，小鼠禁食不禁水12h，然后用代謝籠收集24h尿液，用于檢測相關指標。實驗結束時，小鼠經腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）麻醉后，眼眶取血，分離血漿，用于后續實驗檢測。迅速取出心臟和主動脈，用預冷的生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分。部分主動脈用于提取總RNA，進行實時熒光定量PCR（real-timePCR）檢測；部分主動脈用于制備冰凍切片，進行免疫組化染色；部分主動脈用于提取總蛋白，進行蛋白質免疫印跡法（western-blot）檢測。采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測各組小鼠血漿中白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子的水平。具體操作步驟嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。首先將血漿樣本和標準品加入到預先包被有相應抗體的96孔板中，37℃孵育1-2h，使抗原與抗體充分結合。然后洗板3-5次，去除未結合的物質。接著加入酶標二抗，37℃孵育30-60min，再洗板。最后加入底物溶液，在37℃避光反應15-30min，待顯色明顯后，加入終止液終止反應，用酶標儀在特定波長下測定吸光度值，根據標準曲線計算血漿中炎癥因子的含量。運用實時熒光定量PCR（real-timePCR）技術檢測小鼠主動脈中單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）等炎癥相關基因的mRNA表達水平。使用Trizol試劑提取主動脈總RNA，通過反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，利用特異性引物進行PCR擴增。反應體系包含cDNA模板、上下游引物、SYBRGreen熒光染料、dNTPs和DNA聚合酶等。反應條件為：95℃預變性3-5min，然后進行40個循環，每個循環包括95℃變性10-15s，55-60℃退火15-20s，72℃延伸20-30s。最后通過熔解曲線分析驗證擴增產物的特異性，利用2^(-ΔΔCt)法計算目的基因的相對表達量。通過免疫組化染色技術檢測小鼠主動脈中MCP-1、VCAM-1、核因子-κBp65（NF-κBp65）等炎癥相關蛋白的表達情況。將主動脈冰凍切片用4%多聚甲醛固定10-15min，蒸餾水沖洗后，用0.3%TritonX-100溶液通透10-15min，以增強細胞膜的通透性。然后用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉30-60min，以減少非特異性結合。接著加入一抗，4℃孵育過夜。次日，洗去一抗，加入相應的二抗，37℃孵育30-60min。再用DAB顯色試劑盒進行顯色，蘇木精復染細胞核，最后脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察并拍照，分析炎癥相關蛋白的表達和定位情況。采用蛋白質免疫印跡法（western-blot）進一步檢測小鼠主動脈中MCP-1、VCAM-1、NF-κBp65等炎癥相關蛋白的表達水平。將主動脈組織剪碎，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30-60min，然后在4℃下12000rpm離心15-20min，取上清液作為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5-10min。將變性后的蛋白樣品進行SDS電泳，電泳結束后，將蛋白轉移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2h，以封閉非特異性結合位點。然后加入一抗，4℃孵育過夜。次日，洗去一抗，加入相應的二抗，室溫孵育1-2h。最后用化學發光底物顯色，通過凝膠成像系統拍照并分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內參，計算目的蛋白的相對表達量。4.2實驗結果采用酶聯免疫吸附法（ELISA）對各組小鼠血漿中白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子水平進行檢測，結果如表3所示。與正常對照組相比，模型對照組小鼠血漿中IL-6、TNF-α水平顯著升高（P<0.01），這表明Apoe-/-小鼠在高脂飲食誘導下，體內炎癥反應明顯增強。給予salusin-α、salusin-β及聯合處理后，與模型對照組相比，salusin-α組和salusin-β組小鼠血漿中IL-6、TNF-α水平雖有降低趨勢，但差異無統計學意義（P>0.05）。聯合處理組小鼠血漿中IL-6、TNF-α水平顯著降低（P<0.05），說明salusin-α和salusin-β聯合處理能夠有效抑制Apoe-/-小鼠體內的炎癥反應，降低炎癥因子水平。運用實時熒光定量PCR（real-timePCR）技術對小鼠主動脈中單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）等炎癥相關基因的mRNA表達水平進行檢測，結果如圖3所示。與正常對照組相比，模型對照組小鼠主動脈中MCP-1、VCAM-1的mRNA表達水平顯著升高（P<0.01）。給予salusin-α、salusin-β及聯合處理后，salusin-α組和salusin-β組小鼠主動脈中MCP-1、VCAM-1的mRNA表達水平較模型對照組有所降低，但差異不顯著（P>0.05）。聯合處理組小鼠主動脈中MCP-1、VCAM-1的mRNA表達水平顯著降低（P<0.05），表明salusin-α和salusin-β聯合處理能夠抑制Apoe-/-小鼠主動脈中炎癥相關基因的表達，從基因轉錄層面抑制血管炎癥反應。通過免疫組化染色技術和蛋白質免疫印跡法（western-blot）對小鼠主動脈中MCP-1、VCAM-1、核因子-κBp65（NF-κBp65）等炎癥相關蛋白的表達情況進行檢測。免疫組化染色結果顯示，正常對照組小鼠主動脈中MCP-1、VCAM-1、NF-κBp65蛋白表達較弱，陽性染色較少；模型對照組小鼠主動脈中MCP-1、VCAM-1、NF-κBp65蛋白表達明顯增強，陽性染色增多，主要分布在內膜和中膜（圖4）。salusin-α組和salusin-β組小鼠主動脈中MCP-1、VCAM-1、NF-κBp65蛋白表達較模型對照組有所減弱，但差異不明顯；聯合處理組小鼠主動脈中MCP-1、VCAM-1、NF-κBp65蛋白表達顯著減弱，陽性染色明顯減少。蛋白質免疫印跡法（western-blot）檢測結果進一步證實了免疫組化染色的結果。如圖5所示，與正常對照組相比，模型對照組小鼠主動脈中MCP-1、VCAM-1、NF-κBp65蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）。給予salusin-α、salusin-β及聯合處理后，salusin-α組和salusin-β組小鼠主動脈中MCP-1、VCAM-1、NF-κBp65蛋白表達水平雖有降低趨勢，但差異無統計學意義（P>0.05）。聯合處理組小鼠主動脈中MCP-1、VCAM-1、NF-κBp65蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），表明salusin-α和salusin-β聯合處理能夠有效抑制Apoe-/-小鼠主動脈中炎癥相關蛋白的表達，從蛋白水平抑制血管炎癥反應。4.3結果分析與討論本研究結果表明，salusin-α和salusin-β聯合處理能夠顯著抑制ApoE-/-小鼠血管炎癥反應，降低血漿中炎癥因子水平，抑制主動脈中炎癥相關基因和蛋白的表達，而單獨給予salusin-α或salusin-β處理雖有一定作用趨勢，但效果不顯著。炎癥反應在動脈粥樣硬化的發生發展過程中起著關鍵作用，多種炎癥因子參與其中。IL-6和TNF-α是重要的促炎細胞因子，它們能夠激活內皮細胞、單核細胞和巨噬細胞，促進炎癥反應的級聯放大。在本研究中，模型對照組ApoE-/-小鼠在高脂飲食誘導下，血漿中IL-6和TNF-α水平顯著升高，表明體內炎癥反應明顯增強。給予salusin-α和salusin-β聯合處理后，小鼠血漿中IL-6和TNF-α水平顯著降低，說明聯合處理能夠有效抑制炎癥反應，降低炎癥因子水平。這可能是因為salusin-α和salusin-β聯合作用，調節了炎癥信號通路，抑制了炎癥因子的產生和釋放。而單獨給予salusin-α或salusin-β處理時，雖能使炎癥因子水平有所降低，但差異無統計學意義，可能是由于單獨作用時其抑制炎癥的能力相對較弱，無法達到顯著抑制炎癥反應的效果。MCP-1和VCAM-1在動脈粥樣硬化的炎癥反應中也發揮著重要作用。MCP-1是一種趨化因子，能夠吸引單核細胞向血管內膜下遷移，促進泡沫細胞的形成；VCAM-1是一種粘附分子，能夠介導單核細胞與內皮細胞的粘附，促進炎癥細胞的浸潤。本研究中，模型對照組小鼠主動脈中MCP-1和VCAM-1的mRNA和蛋白表達水平顯著升高，給予salusin-α和salusin-β聯合處理后，其表達水平顯著降低，表明聯合處理能夠抑制主動脈中炎癥相關基因和蛋白的表達，從基因轉錄和蛋白水平抑制血管炎癥反應。這可能是因為聯合處理通過抑制NF-κB等炎癥信號通路的激活，減少了MCP-1和VCAM-1的表達，從而抑制了炎癥細胞的遷移和粘附，減輕了血管炎癥反應。單獨給予salusin-α或salusin-β處理時，雖能使MCP-1和VCAM-1的表達水平有所降低，但差異不顯著，可能是因為單獨作用不足以有效抑制炎癥相關基因和蛋白的表達，需要兩者協同作用才能發揮明顯的抑制效果。NF-κB是炎癥信號通路中的關鍵轉錄因子，在靜息狀態下，NF-κB與其抑制蛋白IκB結合，以無活性的形式存在于細胞質中。當細胞受到炎癥刺激時，IκB被磷酸化并降解，釋放出NF-κB，使其進入細胞核，與靶基因的啟動子區域結合，激活炎癥相關基因的轉錄，促進炎癥因子的表達。本研究中，免疫組化染色和western-blot結果顯示，模型對照組小鼠主動脈中NF-κBp65蛋白表達顯著增強，給予salusin-α和salusin-β聯合處理后，其表達顯著減弱，表明聯合處理能夠抑制NF-κB的激活，從而抑制炎癥相關基因的表達，減輕血管炎癥反應。這可能是salusin-α和salusin-β聯合作用，調節了IκB激酶（IKK）的活性，抑制了IκB的磷酸化和降解，從而阻止了NF-κB的激活。單獨給予salusin-α或salusin-β處理時，雖能使NF-κBp65蛋白表達有所減弱，但差異不明顯，可能是因為單獨作用對NF-κB信號通路的抑制作用較弱，無法有效抑制炎癥反應。本研究結果為深入理解Salusins在動脈粥樣硬化血管炎癥反應中的作用提供了重要實驗依據，提示salusin-α和salusin-β聯合應用可能成為抑制動脈粥樣硬化血管炎癥反應的新策略。然而，本研究仍存在一定局限性，例如未進一步探討salusin-α和salusin-β聯合作用的具體分子機制，后續研究可通過基因芯片、蛋白質組學等技術，深入研究其對炎癥信號通路的影響，為開發新型抗動脈粥樣硬化藥物提供更堅實的理論基礎。五、研究結論與展望5.1研究結論總結本研究通過對Apoe-/-小鼠給予salusin-α、salusin-β及聯合處理，系統地探究了Salusins對Apoe-/-小鼠動脈粥樣硬化形成及血管炎癥反應的影響，得出以下結論：對動脈粥樣硬化形成的影響：在血脂代謝方面，模型對照組Apoe-/-小鼠在高脂飼料喂養下出現明顯的血脂異常，血漿中TC、TG、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低。給予salusin-α和salusin-β聯合處理后，小鼠血漿中TC、LDL-C水平顯著降低，HDL-C水平顯著升高，表明聯合處理能夠有效調節血脂代謝，改善血脂異常；而單獨給予salusin-α或salusin-β處理時，雖能使血脂水平有所降低，但差異無統計學意義。在動脈粥樣硬化病變方面：油紅O染色和HE