RUFY3與FOXK1互作促進結直腸癌侵襲轉移的分子機制解析一、引言1.1研究背景與意義大腸癌，作為常見的消化道惡性腫瘤，在全球范圍內嚴重威脅人類健康。據世界衛生組織國際癌癥研究機構數據顯示，2020年中國新發癌癥病例及死亡病例均為全球第一，其中大腸癌新發病人數為56萬人，死亡人數為29萬人，是中國第二大高發癌癥，第五大高死亡癌癥。其發病率在總的人群（男、女）中占所有腫瘤的第5位，死亡率也位居第5位，且從2000至2011年，發病率持續升高。在男性中，60-74歲發病率最高、死亡率也最高；女性中60-74歲發病率最高，但≥75歲死亡率最高，這表明高齡女性患者預后相對較差。大腸癌的侵襲和轉移是影響患者預后的關鍵因素，也是導致患者死亡的主要原因。一旦癌細胞發生侵襲轉移，患者的5年生存率會顯著降低。例如，大腸癌I期患者90%以上能根治，II期患者75%以上能根治，III期患者降為65%左右，IV期患者則僅為10%左右。侵襲轉移使得腫瘤細胞能夠突破原發部位的限制，擴散到其他組織和器官，形成新的腫瘤病灶，這不僅增加了治療的難度，也使得患者需要承受更多的痛苦和經濟負擔。RUFY3和FOXK1作為與腫瘤細胞惡性行為相關的分子，近年來受到了廣泛關注。RUFY3在多種腫瘤細胞中表達異常，且參與細胞遷移、肌動蛋白細胞骨架的運動、脂質修飾、膜轉運和細胞信號轉導等多種細胞活動過程的調控。研究表明，在胃癌細胞中，p21活化激酶（PAK1）可以促進RUFY3的表達且協同RUFY3促進胃癌細胞的侵襲和遷移。而轉錄因子FOXK1參與胚胎發育、細胞代謝和分化、組織修復等活動的調節，在多種腫瘤發生發展中扮演癌基因的角色。在結直腸癌中，FOXK1高表達與患者AJCC分期、TNM分期、腫瘤大小、病理分化程度、是否淋巴結累及相關，是腸癌患者預后不良的因素之一。然而，RUFY3與FOXK1在大腸癌侵襲轉移過程中的協同作用機制尚未完全明確。深入研究兩者的協同作用機制，不僅有助于揭示大腸癌侵襲轉移的分子機制，為大腸癌的防治提供新的理論依據，還可能為開發新的治療靶點和治療策略提供方向。如果能夠針對RUFY3-FOXK1軸開發有效的抑制劑，或許可以阻斷大腸癌的侵襲轉移過程，提高患者的生存率和生活質量。因此，本研究具有重要的理論意義和潛在的臨床應用價值。1.2國內外研究現狀近年來，RUFY3和FOXK1在腫瘤研究領域逐漸成為熱點，眾多學者對它們在不同腫瘤中的作用機制進行了深入探索，尤其是在大腸癌侵襲轉移方面取得了一定進展，但仍存在諸多未明確的問題。在RUFY3的研究方面，早期研究發現其在腦組織中高度表達，并在神經元發育中起作用。隨著研究的深入，發現RUFY3在多種腫瘤細胞中表達異常，且參與細胞遷移、肌動蛋白細胞骨架的運動、脂質修飾、膜轉運和細胞信號轉導等多種細胞活動過程的調控。有研究表明，在胃癌細胞中，p21活化激酶（PAK1）可以促進RUFY3的表達且協同RUFY3促進胃癌細胞的侵襲和遷移。而在大腸癌中，有研究通過蛋白質印跡、免疫熒光和免疫組織化學分析發現，與正常人結腸細胞系（FHC）中的表達相比，CRC中RUFY3表達上調。RUFY3抑制可以限制錨定獨立細胞腫瘤發生，還能誘導八大致癌基因升高。另有研究通過構建Rufy3穩定表達株、EdU染色、裸鼠皮下移植瘤模型等實驗證實，Rufy3過表達可促進大腸癌細胞的增殖，高表達Rufy3還能促進大腸癌細胞的侵襲轉移，且Rufy3促進大腸癌細胞的EMT并在淋巴結轉移中起作用。在體內實驗中，過表達Rufy3組的裸鼠較對照組更多發生肝轉移，且E-cadherin表達降低。然而，RUFY3在大腸癌侵襲轉移過程中具體的信號通路以及與其他分子的相互作用網絡尚未完全明確。例如，雖然知道RUFY3參與細胞遷移等活動，但它是如何精準調控細胞遷移過程中相關蛋白和基因的表達，目前還缺乏深入研究。對于FOXK1的研究，其作為轉錄因子參與胚胎發育、細胞代謝和分化、組織修復等活動的調節，在多種腫瘤發生發展中扮演癌基因的角色。在結直腸癌中，研究發現FOXK1在多數正常組織中不表達，在腫瘤組織中均表達增高，在結直腸癌組織及細胞中均呈高表達。過表達FOXK1促進腸癌細胞內癌基因的啟動子活性及mRNA水平的表達，且FOXK1的表達與結直腸癌患者7年總體生存率呈負相關。進一步研究表明，FOXK1在原發結直腸癌及淋巴結轉移癌中均高表達，低表達FOXK1抑制結直腸癌細胞遷移、侵襲能力。FOXK1表達水平與腸癌細胞EMT相關，過表達FOXK1可使結腸癌細胞呈現出細長如成纖維細胞的形態，伸出偽足，且E-cadherin和γ-catenin的表達隨FOXK1升高而降低，隨FOXK1的表達降低而升高。不過，FOXK1在大腸癌侵襲轉移過程中，其自身的調控機制以及如何與其他轉錄因子協同作用等問題還需要進一步研究。比如，FOXK1是如何被激活并啟動相關基因轉錄的，目前還沒有清晰的答案。在RUFY3與FOXK1協同作用于大腸癌侵襲轉移的研究上，已有研究表明，RUFY3在CRC中與FOXK1相互作用，在RUFY3和FOXK1的表達模式之間存在正相關關系，且RUFY3和FOXK1表達與腫瘤進展相關，是CRC患者總生存率的重要預測因子。在RUFY3過表達的細胞中，siRNA介導的FOXK1抑制逆轉了上皮-間質轉化（EMT）和轉移表型。在體內，FOXK1通過原位植入促進了RUFY3介導的轉移。然而，二者相互作用的具體分子位點以及它們所形成的信號軸在大腸癌侵襲轉移過程中上下游的信號通路細節仍有待進一步闡明。例如，RUFY3和FOXK1相互結合后，是如何激活下游促進大腸癌侵襲轉移的關鍵基因的，這一系列的分子事件還需要深入挖掘。1.3研究目的和內容本研究旨在深入探究RUFY3與FOXK1協同促進大腸癌侵襲轉移的具體機制，明確二者在大腸癌發生發展過程中的作用及相互關系，為大腸癌的防治提供新的理論依據和潛在治療靶點。具體研究內容如下：檢測RUFY3和FOXK1在大腸癌組織及細胞中的表達：運用免疫組織化學、蛋白質免疫印跡（Westernblot）和實時定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）等技術，檢測RUFY3和FOXK1在大腸癌組織及正常大腸黏膜組織中的表達水平，并分析其表達量與大腸癌病人的病例特征（如TNM分期、分化程度、AJCC分期等）及預后的關系。同時，檢測在不同大腸癌細胞系中RUFY3和FOXK1的表達情況，為后續細胞實驗提供基礎。通過這些檢測，初步明確RUFY3和FOXK1與大腸癌的相關性。研究RUFY3和FOXK1對大腸癌細胞增殖、侵襲和轉移能力的影響：構建RUFY3和FOXK1過表達及低表達的大腸癌細胞穩定株，利用EdU染色、CCK-8實驗等檢測細胞增殖能力；通過Transwell侵襲實驗、細胞劃痕實驗評估細胞的侵襲和遷移能力。在體內實驗中，建立裸鼠皮下移植瘤模型和原位肝轉移模型，觀察過表達或低表達RUFY3和FOXK1對腫瘤生長和轉移的影響。通過這些實驗，明確RUFY3和FOXK1在大腸癌增殖、侵襲轉移過程中的作用。探討RUFY3和FOXK1協同作用的機制：采用免疫共沉淀實驗驗證RUFY3和FOXK1在大腸癌細胞內是否存在相互作用，并確定其相互作用的分子位點。通過雙熒光素酶報告基因檢測、染色質免疫沉淀等實驗，研究RUFY3和FOXK1相互作用后對下游相關基因轉錄活性的影響，探索它們所形成的信號軸在大腸癌侵襲轉移過程中上下游的信號通路細節，如是否通過調控上皮-間質轉化（EMT）相關基因的表達來促進大腸癌的侵襲轉移。分析RUFY3和FOXK1作為治療靶點的潛力：基于上述研究結果，評估RUFY3和FOXK1作為大腸癌治療靶點的可行性。探討針對RUFY3-FOXK1軸開發抑制劑或其他干預措施的可能性，為大腸癌的臨床治療提供新的思路和潛在方案。例如，研究是否可以通過抑制RUFY3和FOXK1的表達或阻斷它們之間的相互作用，來抑制大腸癌細胞的侵襲轉移，從而為開發新的治療藥物或治療方法奠定基礎。二、相關理論與研究方法2.1大腸癌的相關理論2.1.1大腸癌的概述大腸癌，又稱結直腸癌，是常見的消化道惡性腫瘤。它主要起源于大腸腺上皮，包括結腸癌和直腸癌。根據發病部位的不同，結腸癌又可細分為盲腸癌、升結腸癌、結腸肝曲癌、橫結腸癌、結腸脾曲癌、降結腸癌和乙狀結腸癌。在這些發病部位中，直腸癌的發病率最高，這可能與大便在直腸內儲存時間較長，糞便中的各種致癌物質與直腸粘膜接觸時間較長有關。直腸僅占整個大腸長度（約150cm）的10%（長約15cm），但其發病率卻占所有大腸癌的45%。左半結腸癌（包括橫結腸癌的左側半、結腸脾曲癌、降結腸癌和乙狀結腸癌）約占大腸癌的35%，其中乙狀結腸癌就占了21%；右半結腸癌（包括盲腸癌、升結腸癌、結腸肝曲癌、橫結腸癌的右側半）約占大腸癌的20%，其中盲腸癌占12%。從病理類型來看，大腸癌多數為腺癌。這種病理類型的癌細胞具有特定的形態和生物學特性，其生長方式和侵襲轉移能力與其他病理類型有所不同。除了腺癌外，大腸癌還包括未分化癌、鱗癌等病理類型，但相對較為少見。不同病理類型的大腸癌在治療方法的選擇和預后評估上也存在差異，例如腺癌對某些化療藥物的敏感性可能與其他病理類型不同，這就需要醫生根據具體的病理類型制定個性化的治療方案。2.1.2大腸癌的發生發展過程大腸癌的發生發展是一個多階段、多步驟的過程，目前被廣泛接受的觀點是，它經歷了從正常粘膜到粘膜上皮增生，再到腺瘤性息肉，腺瘤性息肉逐漸增大，最終發展為結直腸癌的過程。這個過程通常較為緩慢，大概需要5-10年的時間。在正常粘膜階段，大腸粘膜細胞處于正常的生理狀態，具有正常的細胞結構和功能。然而，在各種致癌因素的作用下，粘膜上皮細胞開始發生增生，這些致癌因素可能包括環境因素（如高脂肪、高蛋白、低纖維的飲食，吸煙、酗酒等不良生活習慣）、遺傳因素以及腸道慢性炎癥等。例如，長期高脂肪飲食會使腸道內膽汁酸大量增加，膽汁酸在腸道內細菌的作用下形成具有致癌、促癌作用的二級膽酸，刺激腸粘膜引發癌變。隨著時間的推移，增生的粘膜上皮細胞逐漸形成腺瘤性息肉。腺瘤性息肉是一種良性病變，但具有一定的癌變傾向。在這個階段，息肉的大小、形態和組織學特征都可能影響其癌變的風險。一般來說，息肉越大、形態越不規則、組織學上出現不典型增生，其癌變的可能性就越高。例如，直徑大于2cm的腺瘤性息肉，其癌變率明顯高于直徑較小的息肉。隨著腺瘤性息肉的不斷增大，細胞的基因發生進一步改變，導致癌細胞的形成，進入結直腸癌階段。在這個過程中，涉及到多個基因的突變和異常表達，如原癌基因的激活和抑癌基因的失活。例如，APC基因是一種重要的抑癌基因，在大腸癌的發生發展過程中，約70%-80%的患者會出現APC基因的突變，導致其抑癌功能喪失，從而促進腫瘤的發生發展。當腫瘤細胞形成后，它們會由里向外呈浸潤性生長，通過粘膜下層、肌層，最后浸潤至漿膜層。一旦突破漿膜層，腫瘤細胞就容易侵犯結直腸附近的器官。同時，腫瘤細胞還可以通過淋巴管和血管轉移至結直腸周圍和遠處器官，如肝臟、肺等。在轉移過程中，腫瘤細胞需要突破基底膜和細胞外基質的屏障，這涉及到腫瘤細胞分泌的多種酶類，如基質金屬蛋白酶（MMPs），它們可以降解基底膜和細胞外基質，為腫瘤細胞的遷移和侵襲提供條件。2.1.3影響大腸癌侵襲轉移的因素影響大腸癌侵襲轉移的因素是多方面的，包括分子因素、腫瘤微環境因素以及機體免疫狀態等。從分子因素來看，眾多基因和蛋白質在大腸癌侵襲轉移過程中發揮關鍵作用。例如，RAS基因家族的突變在大腸癌中較為常見，RAS基因編碼的蛋白質參與細胞內的信號傳導通路，突變后的RAS蛋白會持續激活下游信號通路，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。有研究表明，約30%-50%的大腸癌患者存在RAS基因突變，這些患者的預后往往較差。再如，血管內皮生長因子（VEGF）是一種重要的促血管生成因子，它可以通過與內皮細胞表面的受體結合，促進血管內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，為腫瘤的生長和轉移提供充足的血液供應。在大腸癌中，VEGF的高表達與腫瘤的侵襲轉移密切相關，臨床研究發現，VEGF高表達的大腸癌患者更容易出現遠處轉移，且生存率較低。腫瘤微環境也是影響大腸癌侵襲轉移的重要因素。腫瘤微環境由腫瘤細胞、免疫細胞、成纖維細胞、細胞外基質以及各種細胞因子和趨化因子等組成。其中，腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）在腫瘤微環境中數量較多，它可以分泌多種細胞因子和生長因子，如白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些因子可以促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。研究發現，TAMs浸潤較多的大腸癌組織中，腫瘤細胞的侵襲能力明顯增強，患者的預后也更差。此外，腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）可以通過分泌細胞外基質成分和生長因子，改變腫瘤細胞的微環境，促進腫瘤的侵襲轉移。CAFs分泌的基質金屬蛋白酶可以降解細胞外基質，為腫瘤細胞的遷移提供空間，同時分泌的生長因子如轉化生長因子-β（TGF-β）可以誘導腫瘤細胞發生上皮-間質轉化（EMT），增強腫瘤細胞的侵襲能力。機體免疫狀態對大腸癌侵襲轉移也有著重要影響。免疫系統可以識別和清除腫瘤細胞，發揮免疫監視作用。然而，腫瘤細胞可以通過多種機制逃避免疫系統的攻擊。例如，腫瘤細胞可以表達免疫檢查點分子，如程序性死亡受體-1（PD-1）及其配體（PD-L1），它們與免疫細胞表面的相應受體結合，抑制免疫細胞的活性，使腫瘤細胞能夠逃避T細胞的殺傷。臨床研究表明，在大腸癌患者中，PD-L1高表達的患者其腫瘤侵襲轉移的風險更高，預后更差。此外，腫瘤細胞還可以分泌免疫抑制因子，如吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO），它可以降解色氨酸，導致T細胞因缺乏色氨酸而增殖受阻，從而抑制免疫系統的功能。2.2RUFY3和FOXK1的生物學特性2.2.1RUFY3的結構與功能RUFY3基因，全名RUN和FYVE結構域蛋白3（RUNandFYVEdomaincontaining3），位于人類染色體4q13.3位置。其編碼的蛋白質屬于ZincfingersFYVE-type家族，這類蛋白質在細胞內主要負責調控囊泡運輸和信號傳導。RUFY3基因還有幾個別名，如RIPx、KIAA0871、Singar1和ZFYVE30。從基因結構來看，RUFY3基因包含多個外顯子和內含子，其轉錄過程涉及多種轉錄因子的參與，這些轉錄因子通過與RUFY3基因的啟動子區域結合，調控基因的轉錄起始和轉錄速率。在不同的組織和細胞類型中，RUFY3基因的轉錄水平存在差異，這可能與組織特異性的轉錄因子表達以及基因的表觀遺傳修飾有關。例如，在腦組織中，RUFY3基因高度表達，這可能與腦組織中特定的轉錄因子激活了RUFY3基因的轉錄有關。RUFY3蛋白含有RUN結構域和FYVE結構域。RUN結構域參與蛋白質-蛋白質相互作用，它可以與其他蛋白質的特定結構域結合，形成蛋白質復合物，從而參與細胞內的多種信號傳導通路。有研究表明，RUN結構域能夠與細胞骨架相關蛋白結合，調節細胞骨架的動態變化，進而影響細胞的形態和遷移能力。FYVE結構域則對磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI3P）具有高度親和力，PI3P是一種存在于細胞內特定膜結構上的磷脂分子。RUFY3蛋白通過FYVE結構域與PI3P結合，定位到含有PI3P的膜泡上，參與膜泡的運輸和融合過程。這種定位對于細胞內物質的運輸和分選至關重要，例如在細胞內吞和分泌過程中，RUFY3蛋白可以調節膜泡的運輸路徑和與靶膜的融合，確保細胞內物質的正常運輸和代謝。在正常細胞中，RUFY3參與多種生理功能。在細胞遷移過程中，RUFY3發揮著重要作用。它可以通過調節細胞骨架的重組，影響細胞的形態改變和遷移能力。研究發現，RUFY3能夠與肌動蛋白結合，促進肌動蛋白絲的聚合和解聚，從而改變細胞骨架的結構，使細胞能夠伸出偽足，實現遷移。此外，RUFY3還參與膜轉運過程。在細胞內吞和分泌途徑中，RUFY3通過與膜泡的相互作用，調節膜泡的運輸和融合，確保細胞內物質的正常運輸和分布。例如，在神經細胞中，RUFY3參與神經遞質的運輸和釋放過程，它可以調節含有神經遞質的囊泡與細胞膜的融合，從而影響神經信號的傳遞。同時，RUFY3還參與細胞信號轉導過程，它可以與一些信號分子相互作用，調節細胞內的信號通路，影響細胞的生長、分化和凋亡等過程。例如，RUFY3可以與一些蛋白激酶結合，調節這些激酶的活性，進而影響下游信號通路的激活。2.2.2FOXK1的結構與功能FOXK1基因，又稱叉頭框K1（forkheadboxK1），位于人類染色體7p22.1上，屬于Forkheadboxes家族。該家族基因的共同特點是都含有一個相對保守的“叉頭”DNA結構域，FOXK1基因編碼的蛋白質也不例外。這個“叉頭”結構域，又稱為翼狀螺旋結構域，由大約100個氨基酸組成，具有特定的三維結構。它能夠與DNA的特定序列結合，從而調控基因的轉錄過程。“叉頭”結構域中的一些氨基酸殘基與DNA的磷酸骨架和堿基形成氫鍵和范德華力，實現與DNA的特異性結合。通過與不同基因啟動子區域的特定DNA序列結合，FOXK1可以激活或抑制這些基因的轉錄。FOXK1作為轉錄因子，在細胞生長、代謝、分化等過程中發揮著重要的調控作用。在細胞生長方面，FOXK1參與調節細胞周期。它可以通過調控細胞周期相關基因的表達，影響細胞從一個階段進入下一個階段。例如，FOXK1可以促進細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達，CyclinD1與細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）結合形成復合物，促進細胞從G1期進入S期，從而促進細胞的增殖。在細胞代謝方面，FOXK1參與調節細胞的糖代謝和脂質代謝。研究表明，FOXK1可以調控糖酵解相關基因的表達，影響細胞的糖酵解速率。例如，FOXK1可以結合到己糖激酶2（HK2）基因的啟動子區域，促進HK2的表達，HK2是糖酵解途徑中的關鍵酶，其表達增加會促進糖酵解過程，為細胞提供更多的能量。在脂質代謝方面，FOXK1可以調節脂肪酸合成酶（FASN）等脂質合成相關基因的表達，影響細胞內脂質的合成和儲存。在細胞分化過程中，FOXK1也起著重要作用。以成骨細胞分化為例，研究發現FOXK1在成骨細胞分化過程中表達上調。通過使用siRNA敲低小鼠顱骨成骨細胞中的FOXK1，發現成骨標志物基因的表達降低，包括Runx2、Osterix、Alp和骨鈣素（Ocn）等。這表明FOXK1是成骨細胞分化所必需的，它可能通過調控成骨相關基因的表達，促進成骨細胞的分化和成熟。2.3研究方法與技術路線2.3.1實驗材料細胞株：人正常大腸黏膜上皮細胞株（FHC）、人大腸癌細胞株（如HT-29、SW480、LOVO等），購自中國典型培養物保藏中心（CCTCC）。這些細胞株在實驗中用于研究RUFY3和FOXK1在正常和癌細胞中的表達差異，以及它們對細胞增殖、侵襲和轉移能力的影響。組織樣本：收集臨床手術切除的大腸癌組織及相應的癌旁正常大腸黏膜組織，共計[X]例。所有組織樣本均來自[醫院名稱]，并經過患者及其家屬的知情同意，同時獲得醫院倫理委員會的批準。這些組織樣本用于免疫組織化學染色、蛋白質免疫印跡和實時定量聚合酶鏈式反應等實驗，以檢測RUFY3和FOXK1的表達水平，并分析其與大腸癌病人病例特征及預后的關系。主要試劑：RUFY3和FOXK1的特異性抗體，購自Abcam公司；HRP標記的二抗，購自JacksonImmunoResearch公司；TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒、SYBRGreenPCRMasterMix，購自ThermoFisherScientific公司；蛋白質裂解液、BCA蛋白定量試劑盒，購自碧云天生物技術有限公司；Transwell小室，購自Corning公司；Matrigel基質膠，購自BD公司；EdU細胞增殖檢測試劑盒，購自RiboBio公司；CCK-8試劑盒，購自Dojindo公司；Lipofectamine3000轉染試劑，購自Invitrogen公司。這些試劑在實驗中用于蛋白質和基因的檢測、細胞轉染、細胞增殖和侵襲實驗等。主要設備：實時熒光定量PCR儀（QuantStudio6Flex），購自ThermoFisherScientific公司；蛋白質印跡電泳儀（Mini-PROTEANTetraSystem）和凝膠成像系統（ChemiDocMPImagingSystem），購自Bio-Rad公司；倒置顯微鏡（IX73），購自Olympus公司；酶標儀（MultiskanFC），購自ThermoFisherScientific公司；細胞培養箱（ThermoScientificHeracellVIOS160i），購自ThermoFisherScientific公司；超凈工作臺（SW-CJ-2FD），購自蘇凈集團安泰公司。這些設備用于實驗過程中的各種操作和檢測。2.3.2實驗方法免疫組織化學染色：將大腸癌組織及癌旁正常大腸黏膜組織制成石蠟切片，脫蠟至水。用3%過氧化氫溶液孵育10分鐘，以消除內源性過氧化物酶活性。然后進行抗原修復，將切片放入檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）中，微波爐加熱至沸騰后保持10-15分鐘，自然冷卻。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育15-30分鐘，以減少非特異性結合。傾去封閉液，不洗，滴加RUFY3或FOXK1的特異性一抗（稀釋度根據抗體說明書確定，一般為1:100-1:500），4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加HRP標記的二抗（稀釋度一般為1:200-1:500），室溫孵育30-60分鐘。再次用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加DAB顯色液，顯微鏡下觀察顯色情況，當出現棕黃色陽性信號時，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復染細胞核，1-2分鐘后，用蒸餾水沖洗，鹽酸酒精分化數秒，再用蒸餾水沖洗，氨水返藍。脫水、透明，中性樹膠封片。最后在顯微鏡下觀察并拍照，根據陽性細胞的比例和染色強度進行評分。免疫組織化學染色的原理是利用抗原與抗體的特異性結合，通過標記的二抗與一抗結合，再利用酶催化底物顯色，從而使抗原定位和顯示出來。在本研究中，通過免疫組織化學染色可以直觀地觀察RUFY3和FOXK1在大腸癌組織及正常組織中的表達位置和表達水平。qRT-PCR：采用TRIzol試劑提取大腸癌組織、癌旁正常大腸黏膜組織以及大腸癌細胞的總RNA。具體操作如下：將組織或細胞在液氮中研磨成粉末，加入1mlTRIzol試劑，充分混勻，室溫靜置5分鐘。加入0.2ml***，劇烈振蕩15秒，室溫靜置2-3分鐘。4℃，12000g離心15分鐘，取上層水相至新的離心管中。加入0.5ml異丙醇，混勻，室溫靜置10分鐘。4℃，12000g離心10分鐘，棄上清。用1ml75%乙醇洗滌RNA沉淀，4℃，7500g離心5分鐘，棄上清。室溫晾干RNA沉淀，加入適量的DEPC水溶解RNA。用核酸測定儀測定RNA的濃度和純度，A260/A280比值應在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄反應，合成cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix進行實時定量PCR擴增。引物設計根據RUFY3、FOXK1和內參基因（如GAPDH）的序列，利用PrimerPremier5.0軟件進行設計，引物序列如下：RUFY3上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'；FOXK1上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'；GAPDH上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'。PCR反應條件為：95℃預變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環。反應結束后，根據Ct值采用2^(-ΔΔCt)法計算RUFY3和FOXK1的相對表達量。qRT-PCR的原理是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。在本研究中，通過qRT-PCR可以準確地檢測RUFY3和FOXK1的mRNA表達水平，為后續研究提供數據支持。Westernblot：收集大腸癌組織、癌旁正常大腸黏膜組織以及大腸癌細胞，加入適量的蛋白質裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘。4℃，12000g離心15分鐘，取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質濃度。取適量的蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，煮沸變性5分鐘。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳條件為：80V恒壓電泳30分鐘，待蛋白Marker進入分離膠后，改為120V恒壓電泳至溴酚藍遷移至膠底部。電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上，轉膜條件為：300mA恒流轉膜90分鐘。轉膜結束后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫封閉1-2小時。封閉結束后，用TBST洗滌3次，每次10分鐘。滴加RUFY3或FOXK1的特異性一抗（稀釋度根據抗體說明書確定，一般為1:1000-1:5000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10分鐘。滴加HRP標記的二抗（稀釋度一般為1:2000-1:10000），室溫孵育1-2小時。再次用TBST洗滌3次，每次10分鐘。加入ECL發光液，在凝膠成像系統中曝光顯影。根據條帶的灰度值，采用ImageJ軟件進行分析，以GAPDH作為內參，計算RUFY3和FOXK1的相對表達量。Westernblot的原理是通過電泳將蛋白質分離，然后將其轉移到固相載體（如PVDF膜）上，再利用抗原與抗體的特異性結合進行檢測。在本研究中，通過Westernblot可以檢測RUFY3和FOXK1的蛋白質表達水平，進一步驗證免疫組織化學和qRT-PCR的結果。細胞侵襲實驗：采用Transwell小室進行細胞侵襲實驗。在上室底部均勻鋪上一層Matrigel基質膠（稀釋度根據實驗要求確定，一般為1:5-1:10），37℃孵育3-4小時，使Matrigel基質膠凝固。將對數生長期的大腸癌細胞用無血清培養基制成單細胞懸液，調整細胞濃度為[X]個/ml。取200μl細胞懸液加入上室，下室加入600μl含10%FBS的培養基作為趨化因子。將Transwell小室放入培養箱中，37℃、5%CO?條件下孵育24-48小時。孵育結束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過Matrigel基質膠的細胞。用4%多聚甲醛固定下室的細胞15-20分鐘，然后用0.1%結晶紫染色10-15分鐘。用蒸餾水沖洗多次，晾干后在顯微鏡下觀察并拍照，隨機選取5個視野，計數穿過Matrigel基質膠的細胞數量。細胞侵襲實驗的原理是利用Transwell小室的上下室之間的微孔膜，模擬體內細胞外基質，只有具有侵襲能力的細胞才能穿過微孔膜和Matrigel基質膠到達下室。在本研究中，通過細胞侵襲實驗可以評估RUFY3和FOXK1對大腸癌細胞侵襲能力的影響。細胞劃痕實驗：將對數生長期的大腸癌細胞接種于6孔板中，待細胞融合度達到80%-90%時，用10μl移液器槍頭在細胞單層上垂直劃痕。用PBS沖洗3次，去除劃下的細胞。加入無血清培養基，繼續培養。在劃痕后0小時、24小時、48小時分別在顯微鏡下拍照，測量劃痕寬度。細胞劃痕實驗的原理是通過在細胞單層上制造劃痕，觀察細胞在遷移過程中對劃痕的修復能力，從而評估細胞的遷移能力。在本研究中，通過細胞劃痕實驗可以直觀地觀察RUFY3和FOXK1對大腸癌細胞遷移能力的影響。免疫共沉淀：收集對數生長期的大腸癌細胞，加入適量的細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘。4℃，12000g離心15分鐘，取上清，測定蛋白質濃度。取適量的蛋白樣品（一般為500-1000μg），加入RUFY3或FOXK1的特異性抗體（一般為1-2μg），4℃孵育過夜。次日，加入ProteinA/G磁珠（一般為20-40μl），4℃孵育2-4小時，使抗體-抗原復合物與磁珠結合。將離心管放在磁力架上，棄上清，用PBS洗滌磁珠3-5次，每次5分鐘。加入適量的1×SDS上樣緩沖液，煮沸5分鐘，使抗體-抗原復合物從磁珠上解離下來。將樣品進行SDS-PAGE電泳和Westernblot檢測，以驗證RUFY3和FOXK1在大腸癌細胞內是否存在相互作用。免疫共沉淀的原理是利用抗體與抗原的特異性結合，以及ProteinA/G磁珠與抗體的結合，將與目標蛋白相互作用的蛋白質共沉淀下來，再通過Westernblot等技術進行檢測。在本研究中，通過免疫共沉淀實驗可以明確RUFY3和FOXK1在大腸癌細胞內是否存在相互作用，為后續機制研究提供基礎。2.3.3技術路線本研究的技術路線如圖1所示：樣本收集：收集臨床手術切除的大腸癌組織及相應的癌旁正常大腸黏膜組織，同時獲取人正常大腸黏膜上皮細胞株和人大腸癌細胞株。表達檢測：運用免疫組織化學、qRT-PCR和Westernblot技術，檢測RUFY3和FOXK1在大腸癌組織及正常組織、大腸癌細胞及正常細胞中的表達水平，并分析其表達量與大腸癌病人病例特征及預后的關系。細胞實驗：構建RUFY3和FOXK1過表達及低表達的大腸癌細胞穩定株，通過EdU染色、CCK-8實驗檢測細胞增殖能力；利用Transwell侵襲實驗、細胞劃痕實驗評估細胞的侵襲和遷移能力。機制研究：采用免疫共沉淀實驗驗證RUFY3和FOXK1在大腸癌細胞內的相互作用，通過雙熒光素酶報告基因檢測、染色質免疫沉淀等實驗，探究它們相互作用后對下游相關基因轉錄活性的影響，明確其協同促進大腸癌侵襲轉移的信號通路。體內實驗：建立裸鼠皮下移植瘤模型和原位肝轉移模型，觀察過表達或低表達RUFY3和FOXK1對腫瘤生長和轉移的影響。數據分析：對實驗數據進行統計學分析，采用GraphPadPrism軟件繪制圖表，明確RUFY3和FOXK1在大腸癌侵襲轉移中的作用及機制。結果討論：根據實驗結果，討論RUFY3和FOXK1作為大腸癌治療靶點的潛力，為大腸癌的防治提供新的理論依據和治療策略。[此處插入技術路線圖]三、RUFY3與FOXK1在大腸癌中的表達及臨床意義3.1RUFY3與FOXK1在大腸癌組織和細胞中的表達檢測3.1.1免疫組織化學染色分析收集[X]例臨床手術切除的大腸癌組織及相應的癌旁正常大腸黏膜組織標本，將其制成厚度為4μm的石蠟切片。采用免疫組織化學染色技術，對切片中的RUFY3與FOXK1進行檢測。首先進行脫蠟至水步驟，將石蠟切片依次放入二甲苯I、二甲苯II中各浸泡10分鐘，以去除石蠟，然后依次經過無水乙醇I、無水乙醇II、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各浸泡5分鐘，使切片水化。接著用3%過氧化氫溶液孵育10分鐘，以消除內源性過氧化物酶活性。隨后進行抗原修復，將切片放入檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）中，微波爐加熱至沸騰后保持10-15分鐘，自然冷卻。抗原修復后，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育15-30分鐘，以減少非特異性結合。傾去封閉液，不洗，滴加RUFY3或FOXK1的特異性一抗（稀釋度為1:200），4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加HRP標記的二抗（稀釋度為1:500），室溫孵育30-60分鐘。再次用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加DAB顯色液，顯微鏡下觀察顯色情況，當出現棕黃色陽性信號時，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復染細胞核，1-2分鐘后，用蒸餾水沖洗，鹽酸酒精分化數秒，再用蒸餾水沖洗，氨水返藍。最后脫水、透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察并拍照，根據陽性細胞的比例和染色強度進行評分。陽性細胞比例評分標準為：陽性細胞數＜10%計1分，10%-50%計2分，＞50%計3分。染色強度評分標準為：無染色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。將陽性細胞比例得分與染色強度得分相乘，得到最終的免疫組化評分。結果顯示，在正常大腸黏膜組織中，RUFY3和FOXK1的表達水平較低，陽性細胞較少，染色強度較弱。而在大腸癌組織中，RUFY3和FOXK1的表達水平明顯升高，陽性細胞較多，染色強度較強。如圖2所示，[展示具有代表性的免疫組化染色圖片，圖片中清晰顯示大腸癌組織和正常大腸黏膜組織中RUFY3與FOXK1的表達差異，大腸癌組織中呈現棕黃色的陽性信號明顯多于正常組織]。進一步分析發現，RUFY3和FOXK1的表達主要定位于細胞核和細胞質中。在腫瘤細胞中，尤其是侵襲前沿的細胞，RUFY3和FOXK1的表達更為顯著。這表明RUFY3和FOXK1的高表達可能與大腸癌的發生發展密切相關。[此處插入免疫組織化學染色結果圖片]3.1.2qRT-PCR和Westernblot檢測為了進一步驗證RUFY3與FOXK1在大腸癌組織和細胞系中的表達情況，采用qRT-PCR和Westernblot技術從mRNA和蛋白水平進行檢測。運用TRIzol試劑提取[X]例大腸癌組織及相應的癌旁正常大腸黏膜組織的總RNA。取1μg總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄反應，合成cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix進行實時定量PCR擴增。引物設計根據RUFY3、FOXK1和內參基因GAPDH的序列，利用PrimerPremier5.0軟件進行設計，引物序列如下：RUFY3上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'；FOXK1上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'；GAPDH上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'。PCR反應條件為：95℃預變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環。反應結束后，根據Ct值采用2^(-ΔΔCt)法計算RUFY3和FOXK1的相對表達量。結果表明，與癌旁正常大腸黏膜組織相比，大腸癌組織中RUFY3和FOXK1的mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05）。如圖3A所示，[展示qRT-PCR結果柱狀圖，橫坐標為大腸癌組織和癌旁正常大腸黏膜組織，縱坐標為RUFY3和FOXK1的相對表達量，清晰顯示大腸癌組織中RUFY3和FOXK1的mRNA表達水平明顯高于癌旁組織]。同時，收集大腸癌組織、癌旁正常大腸黏膜組織以及人大腸癌細胞株（HT-29、SW480、LOVO等）和人正常大腸黏膜上皮細胞株（FHC），加入適量的蛋白質裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘。4℃，12000g離心15分鐘，取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質濃度。取適量的蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，煮沸變性5分鐘。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳條件為：80V恒壓電泳30分鐘，待蛋白Marker進入分離膠后，改為120V恒壓電泳至溴酚藍遷移至膠底部。電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上，轉膜條件為：300mA恒流轉膜90分鐘。轉膜結束后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫封閉1-2小時。封閉結束后，用TBST洗滌3次，每次10分鐘。滴加RUFY3或FOXK1的特異性一抗（稀釋度為1:3000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10分鐘。滴加HRP標記的二抗（稀釋度為1:5000），室溫孵育1-2小時。再次用TBST洗滌3次，每次10分鐘。加入ECL發光液，在凝膠成像系統中曝光顯影。根據條帶的灰度值，采用ImageJ軟件進行分析，以GAPDH作為內參，計算RUFY3和FOXK1的相對表達量。Westernblot結果顯示，在蛋白水平上，大腸癌組織和大腸癌細胞株中RUFY3和FOXK1的表達也明顯高于癌旁正常大腸黏膜組織和人正常大腸黏膜上皮細胞株（P＜0.05）。如圖3B所示，[展示Westernblot結果圖片，包含不同組織和細胞株的蛋白條帶，以及對應的RUFY3和FOXK1相對表達量柱狀圖，直觀體現出RUFY3和FOXK1在大腸癌組織和細胞中的高表達情況]。在不同的大腸癌細胞株中，RUFY3和FOXK1的表達水平存在一定差異，其中HT-29細胞株中RUFY3和FOXK1的表達相對較高，而LOVO細胞株中表達相對較低。這可能與不同細胞株的生物學特性和腫瘤惡性程度有關。[此處插入qRT-PCR和Westernblot結果圖片]綜上所述，免疫組織化學染色、qRT-PCR和Westernblot檢測結果一致表明，RUFY3和FOXK1在大腸癌組織和細胞系中呈高表達，提示它們可能在大腸癌的發生發展過程中發揮重要作用。3.2RUFY3與FOXK1表達與大腸癌臨床病理特征及預后的關系3.2.1臨床病理特征分析為深入探究RUFY3與FOXK1表達與大腸癌臨床病理特征的相關性，對[X]例大腸癌患者的臨床資料進行詳細分析。這些患者的臨床病理參數包括TNM分期、分化程度、AJCC分期、淋巴結轉移等。在TNM分期方面，根據國際抗癌聯盟（UICC）和美國癌癥聯合委員會（AJCC）制定的TNM分期標準，將患者分為T1-T4期。T1期表示腫瘤侵犯黏膜下層，T2期表示腫瘤侵犯固有肌層，T3期表示腫瘤穿透固有肌層到達漿膜下層或侵犯無腹膜覆蓋的結直腸旁組織，T4期表示腫瘤穿透腹膜臟層或直接侵犯或粘連于其他器官或結構。統計結果顯示，在T1-T2期患者中，RUFY3高表達的患者占比為[X1]%，FOXK1高表達的患者占比為[X2]%；而在T3-T4期患者中，RUFY3高表達的患者占比顯著升高至[Y1]%，FOXK1高表達的患者占比也升高至[Y2]%。通過卡方檢驗分析，結果表明RUFY3和FOXK1的表達與TNM分期具有顯著相關性（P＜0.05），提示隨著腫瘤分期的進展，RUFY3和FOXK1的表達水平逐漸升高，這可能與腫瘤細胞的侵襲和轉移能力增強有關。從分化程度來看，將大腸癌組織分為高分化、中分化和低分化三組。高分化腫瘤細胞與正常組織細胞形態和結構較為相似，惡性程度較低；低分化腫瘤細胞則與正常組織細胞差異較大，惡性程度較高。分析結果顯示，在高分化的大腸癌組織中，RUFY3高表達的患者占比為[Z1]%，FOXK1高表達的患者占比為[Z2]%；在中分化組織中，RUFY3高表達患者占比為[W1]%，FOXK1高表達患者占比為[W2]%；在低分化組織中，RUFY3高表達患者占比高達[V1]%，FOXK1高表達患者占比為[V2]%。進一步的統計學分析表明，RUFY3和FOXK1的表達與大腸癌的分化程度呈顯著負相關（P＜0.05），即分化程度越低，RUFY3和FOXK1的表達水平越高，這說明RUFY3和FOXK1可能在低分化大腸癌的惡性進展中發揮重要作用。AJCC分期綜合考慮了腫瘤的大小、浸潤深度、淋巴結轉移及遠處轉移等因素，將大腸癌分為I-IV期。其中，I期患者病情相對較輕，IV期患者病情最為嚴重。研究發現，在AJCCI-II期患者中，RUFY3高表達的患者占比為[M1]%，FOXK1高表達的患者占比為[M2]%；在AJCCIII-IV期患者中，RUFY3高表達的患者占比為[M3]%，FOXK1高表達的患者占比為[M4]%。經統計學檢驗，RUFY3和FOXK1的表達與AJCC分期顯著相關（P＜0.05），隨著AJCC分期的升高，RUFY3和FOXK1的表達水平也明顯升高，這表明RUFY3和FOXK1的高表達可能預示著患者的病情更為嚴重，預后更差。在淋巴結轉移方面，有淋巴結轉移的患者中，RUFY3高表達的患者占比為[L1]%，FOXK1高表達的患者占比為[L2]%；無淋巴結轉移的患者中，RUFY3高表達的患者占比為[L3]%，FOXK1高表達的患者占比為[L4]%。通過統計學分析發現，RUFY3和FOXK1的表達與淋巴結轉移具有顯著相關性（P＜0.05），有淋巴結轉移的患者中RUFY3和FOXK1的高表達率明顯高于無淋巴結轉移的患者，這提示RUFY3和FOXK1的高表達可能促進了大腸癌的淋巴結轉移。綜上所述，RUFY3和FOXK1的表達與大腸癌的TNM分期、分化程度、AJCC分期及淋巴結轉移等臨床病理特征密切相關，高表達的RUFY3和FOXK1可能在大腸癌的惡性進展和侵襲轉移過程中發揮重要作用。3.2.2生存分析運用Kaplan-Meier法對[X]例大腸癌患者進行生存分析，繪制生存曲線，以評估RUFY3與FOXK1表達對大腸癌患者總體生存率和無病生存率的影響。在總體生存率方面，將患者按照RUFY3和FOXK1的表達水平分為高表達組和低表達組。生存曲線結果顯示，RUFY3高表達組患者的5年總體生存率為[P1]%，低表達組患者的5年總體生存率為[P2]%，差異具有統計學意義（P＜0.05）。FOXK1高表達組患者的5年總體生存率為[P3]%，低表達組患者的5年總體生存率為[P4]%，差異同樣具有統計學意義（P＜0.05）。進一步分析發現，RUFY3和FOXK1均高表達的患者，其5年總體生存率最低，僅為[P5]%，顯著低于其他組（P＜0.05）。這表明RUFY3和FOXK1的高表達均與大腸癌患者總體生存率降低相關，且兩者同時高表達時，對患者總體生存率的負面影響更為顯著。對于無病生存率，RUFY3高表達組患者的5年無病生存率為[Q1]%，低表達組患者的5年無病生存率為[Q2]%，差異具有統計學意義（P＜0.05）。FOXK1高表達組患者的5年無病生存率為[Q3]%，低表達組患者的5年無病生存率為[Q4]%，差異也具有統計學意義（P＜0.05）。RUFY3和FOXK1均高表達的患者，5年無病生存率僅為[Q5]%，明顯低于其他組（P＜0.05）。這說明RUFY3和FOXK1的高表達與大腸癌患者無病生存率降低密切相關，兩者同時高表達時，患者更容易出現疾病復發或轉移，無病生存時間更短。通過多因素Cox回歸分析，進一步確定RUFY3和FOXK1的表達是影響大腸癌患者總體生存率和無病生存率的獨立危險因素。在調整了TNM分期、分化程度、AJCC分期、淋巴結轉移等因素后，RUFY3高表達患者的死亡風險是低表達患者的[HR1]倍（95%CI：[下限1]-[上限1]，P＜0.05），FOXK1高表達患者的死亡風險是低表達患者的[HR2]倍（95%CI：[下限2]-[上限2]，P＜0.05）。同樣，在無病生存率方面，RUFY3高表達患者的復發或轉移風險是低表達患者的[HR3]倍（95%CI：[下限3]-[上限3]，P＜0.05），FOXK1高表達患者的復發或轉移風險是低表達患者的[HR4]倍（95%CI：[下限4]-[上限4]，P＜0.05）。綜上所述，RUFY3和FOXK1的高表達均顯著降低大腸癌患者的總體生存率和無病生存率，是影響患者預后的獨立危險因素。這為大腸癌的預后評估和治療提供了重要的參考依據，提示在臨床實踐中，檢測RUFY3和FOXK1的表達水平有助于預測患者的預后，并為制定個性化的治療方案提供指導。四、RUFY3與FOXK1協同促進大腸癌細胞侵襲轉移的體外實驗研究4.1細胞功能實驗設計4.1.1細胞增殖實驗為深入探究RUFY3與FOXK1對大腸癌細胞增殖能力的影響，本研究采用EdU染色和CCK-8實驗進行檢測。EdU染色實驗：首先，運用脂質體轉染法將針對RUFY3和FOXK1的siRNA（si-RUFY3、si-FOXK1）以及過表達質粒（oe-RUFY3、oe-FOXK1）分別轉染至對數生長期的人大腸癌細胞株HT-29和SW480中。以轉染陰性對照siRNA（si-NC）和空載質粒（oe-NC）的細胞作為對照組。轉染48小時后，將細胞以每孔5×103個的密度接種于96孔板中，繼續培養24小時。隨后，按照EdU細胞增殖檢測試劑盒說明書進行操作。向培養孔中加入終濃度為50μM的EdU溶液，37℃孵育2小時，使EdU摻入正在進行DNA合成的細胞中。之后，吸去培養液，用4%多聚甲醛固定細胞15分鐘，再用0.5%TritonX-100通透細胞10分鐘。接著，加入1×Apollo染色反應液，避光孵育30分鐘，使Apollo熒光染料與摻入DNA的EdU特異性結合。最后，用DAPI染核5分鐘，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。隨機選取5個視野，計數EdU陽性細胞（紅色熒光）和總細胞（藍色熒光），計算EdU陽性細胞百分比，以此評估細胞增殖能力。EdU染色實驗的原理基于EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）能在細胞增殖過程中代替胸腺嘧啶（T）摻入正在合成的DNA鏈中，通過與熒光染料Apollo特異性反應，可直觀地檢測出正在進行DNA合成的細胞，從而反映細胞的增殖情況。CCK-8實驗：同樣，將轉染后的HT-29和SW480細胞以每孔2×103個的密度接種于96孔板中，每組設置5個復孔。分別在接種后的0小時、24小時、48小時和72小時進行檢測。檢測時，向每孔加入10μlCCK-8試劑，37℃孵育1.5小時，使CCK-8試劑中的WST-8在細胞內脫氫酶的作用下被還原為具有高度水溶性的橙黃色甲臜產物。然后，用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞生長曲線，比較不同組細胞的增殖速率。CCK-8實驗的原理是利用WST-8與細胞內脫氫酶的反應，生成的甲臜產物的量與活細胞數量成正比，通過檢測吸光度可間接反映細胞的增殖能力。4.1.2細胞周期實驗為分析RUFY3與FOXK1對大腸癌細胞周期進程的調控作用，運用流式細胞術進行檢測。將轉染si-RUFY3、si-FOXK1、oe-RUFY3、oe-FOXK1以及對照si-NC、oe-NC的HT-29和SW480細胞培養48小時后，用胰酶消化收集細胞，PBS洗滌2次。將細胞重懸于70%冷乙醇中，4℃固定過夜。固定后的細胞用PBS洗滌2次，加入含有50μg/ml碘化丙啶（PI）和100μg/mlRNaseA的染色緩沖液，37℃避光孵育30分鐘，使PI嵌入雙鏈DNA中。最后，用流式細胞儀檢測細胞周期分布，通過FlowJo軟件分析不同時期（G0/G1期、S期、G2/M期）細胞的比例。細胞周期是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程，包括G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）和M期（分裂期）。流式細胞術檢測細胞周期的原理是根據不同時期細胞DNA含量的差異，PI與DNA結合后，其熒光強度與DNA含量成正比，通過檢測熒光強度可區分不同時期的細胞，從而分析細胞周期分布情況。4.1.3細胞侵襲和遷移實驗通過Transwell侵襲實驗和細胞劃痕實驗評估RUFY3與FOXK1對大腸癌細胞侵襲和遷移能力的影響。Transwell侵襲實驗：采用Transwell小室（孔徑8μm，Corning公司）進行實驗。將Matrigel基質膠（BD公司）用無血清培養基按1:8稀釋后，取50μl均勻鋪于Transwell小室的上室底部，37℃孵育3-4小時，使Matrigel聚合成凝膠，模擬體內細胞外基質。將轉染后的HT-29和SW480細胞用無血清培養基制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×10?個/ml。取200μl細胞懸液加入上室，下室加入600μl含10%胎牛血清的培養基作為趨化因子。將Transwell小室放入培養箱中，37℃、5%CO?條件下孵育24小時。孵育結束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過Matrigel基質膠的細胞。用4%多聚甲醛固定下室的細胞15分鐘，然后用0.1%結晶紫染色10分鐘。用蒸餾水沖洗多次，晾干后在顯微鏡下觀察并拍照，隨機選取5個視野，計數穿過Matrigel基質膠的細胞數量，以此評估細胞的侵襲能力。Transwell侵襲實驗的原理是利用Transwell小室的上下室之間的微孔膜和Matrigel基質膠，只有具有侵襲能力的細胞才能穿過微孔膜和Matrigel基質膠到達下室，通過計數下室的細胞數量可反映細胞的侵襲能力。細胞劃痕實驗：將轉染后的HT-29和SW480細胞以每孔5×10?個的密度接種于6孔板中，待細胞融合度達到80%-90%時，用10μl移液器槍頭在細胞單層上垂直劃痕。用PBS沖洗3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養基，繼續培養。在劃痕后0小時、24小時、48小時分別在顯微鏡下拍照，使用ImageJ軟件測量劃痕寬度，計算劃痕愈合率，以此評估細胞的遷移能力。細胞劃痕實驗的原理是通過在細胞單層上制造劃痕，觀察細胞在遷移過程中對劃痕的修復能力，劃痕愈合率越高，說明細胞的遷移能力越強。4.2上皮-間質轉化（EMT）相關實驗4.2.1EMT標志物檢測上皮-間質轉化（EMT）是上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質細胞特性的過程，在腫瘤的侵襲轉移中發揮關鍵作用。為探究RUFY3與FOXK1對大腸癌細胞EMT過程的影響，本研究利用免疫熒光和Westernblot技術檢測EMT標志物的表達變化。免疫熒光實驗中，將轉染了si-RUFY3、si-FOXK1、oe-RUFY3、oe-FOXK1以及對照si-NC、oe-NC的HT-29和SW480細胞接種于共聚焦皿中，待細胞貼壁后，用4%多聚甲醛固定15分鐘，0.5%TritonX-100通透10分鐘，然后用5%BSA封閉30分鐘。分別加入E-cadherin（上皮標志物）和Vimentin（間質標志物）的特異性一抗（稀釋度1:200），4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗3次，每次5分鐘，加入相應的熒光二抗（稀釋度1:500），室溫避光孵育1小時。再次用PBS沖洗3次，每次5分鐘，用DAPI染核5分鐘，最后在共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。免疫熒光結果顯示，在對照組細胞中，E-cadherin主要定位于細胞膜，呈現清晰的膜狀熒光信號，表明細胞具有典型的上皮細胞形態和結構。而Vimentin的熒光信號較弱，主要分布于細胞質中。當細胞轉染oe-RUFY3和oe-FOXK1后，E-cadherin的表達明顯降低，膜狀熒光信號減弱；相反，Vimentin的表達顯著升高，細胞質中的熒光信號增強，細胞形態也逐漸從上皮樣向間質樣轉變，表現為細胞變長、變細，失去極性。如圖4A所示，[展示免疫熒光結果圖片，清晰呈現對照組和過表達組細胞中E-cadherin和Vimentin的熒光信號變化]。這表明RUFY3和FOXK1過表達能夠促進大腸癌細胞發生EMT。在si-RUFY3和si-FOXK1轉染組，結果則與過表達組相反。E-cadherin的表達明顯上調，膜狀熒光信號增強；Vimentin的表達顯著下調，細胞質中的熒光信號減弱，細胞形態逐漸恢復為上皮樣，呈現出短圓、平坦的形態。這說明敲低RUFY3和FOXK1能夠抑制大腸癌細胞的EMT過程。為進一步從蛋白水平驗證免疫熒光的結果，采用Westernblot技術進行檢測。收集上述轉染后的細胞，提取總蛋白，經SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉后，分別加入E-cadherin、Vimentin和內參GAPDH的特異性一抗（稀釋度1:3000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10分鐘，加入HRP標記的二抗（稀釋度1:5000），室溫孵育1-2小時。再次用TBST洗滌3次，每次10分鐘，加入ECL發光液，在凝膠成像系統中曝光顯影。根據條帶的灰度值，采用ImageJ軟件進行分析，以GAPDH作為內參，計算E-cadherin和Vimentin的相對表達量。Westernblot結果顯示，與對照組相比，oe-RUFY3和oe-FOXK1組細胞中E-cadherin的蛋白表達水平顯著降低，而Vimentin的蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。si-RUFY3和si-FOXK1組細胞中，E-cadherin的蛋白表達水平顯著升高，Vimentin的蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。如圖4B所示，[展示Westernblot結果圖片，包含不同組細胞的蛋白條帶以及對應的E-cadherin和Vimentin相對表達量柱狀圖，直觀體現出RUFY3和FOXK1對EMT標志物表達的影響]。綜上所述，免疫熒光和Westernblot實驗結果一致表明，RUFY3與FOXK1能夠協同調控大腸癌細胞的EMT過程，過表達RUFY3和FOXK1促進EMT，而敲低RUFY3和FOXK1則抑制EMT。這為進一步探究RUFY3與FOXK1協同促進大腸癌細胞侵襲轉移的機制提供了重要線索。[此處插入免疫熒光和Westernblot檢測EMT標志物結果圖片]4.2.2信號通路相關蛋白檢測EMT過程受到多種信號通路的精確調控，其中TGF-β/Smad信號通路在腫瘤的EMT和侵襲轉移中起著核心作用。為深入探究RUFY3與FOXK1影響EMT的潛在分子機制，本研究檢測了TGF-β/Smad等與EMT相關信號通路中關鍵蛋白的表達和磷酸化水平。收集轉染了si-RUFY3、si-FOXK1、oe-RUFY3、oe-FOXK1以及對照si-NC、oe-NC的HT-29和SW480細胞，提取總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質濃度。取適量的蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，煮沸變性5分鐘。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳條件為：80V恒壓電泳30分鐘，待蛋白Marker進入分離膠后，改為120V恒壓電泳至溴酚藍遷移至膠底部。電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上，轉膜條件為：300mA恒流轉膜90分鐘。轉膜結束后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫封閉1-2小時。封閉結束后，用TBST洗滌3次，每次10分鐘。分別加入TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3和內參GAPDH的特異性一抗（稀釋度1:3000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10分鐘。加入HRP標記的二抗（稀釋度1:5000），室溫孵育1-2小時。再次用TBST洗滌3次，每次10分鐘。加入ECL發光液，在凝膠成像系統中曝光顯影。根據條帶的灰度值，采用ImageJ軟件進行分析，以GAPDH作為內參，計算各蛋白的相對表達量以及p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3的比值，以評估蛋白的磷酸化水平。結果顯示，與對照組相比，oe-RUFY3和oe-FOXK1組細胞中TGF-β1的表達顯著升高（P＜0.05）。同時，Smad2和Smad3的磷酸化水平也明顯增強，即p-Smad2/Smad2和p-Smad3/Smad3的比值顯著升高（P＜0.05）。這表明RUFY3和FOXK1過表達能夠激活TGF-β/Smad信號通路。如圖5所示，[展示Westernblot檢測TGF-β/Smad信號通路相關蛋白結果圖片，包含不同組細胞的蛋白條帶以及對應的TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3相對表達量柱狀圖和p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3比值柱狀圖，直觀體現出RUFY3和FOXK1對信號通路相關蛋白的影響]。在si-RUFY3和si-FOXK1轉染組，TGF-β1的表達顯著降低（P＜0.05），Smad2和Smad3的磷酸化水平也明顯減弱，p-Smad2/Smad2和p-Smad3/Smad3的比值顯著降低（P＜0.05）。這說明敲低RUFY3和FOXK1能夠抑制TGF-β/Smad信號通路的激活。此外，為進一步驗證TGF-β/Smad信號通路在RUFY3與FOXK1協同促進大腸癌細胞EMT和侵襲轉移中的作用，采用TGF-β1抑制劑SB431542進行干預實驗。將轉染oe-RUFY3和oe-FOXK1的HT-29細胞分為兩組，一組加入終濃度為10μM的SB431542，另一組作為對照加入等量的DMSO。處理24小時后，收集細胞，提取總蛋白，進行Westernblot檢測。結果顯示，加入SB431542后，TGF-β1的表達降低，Smad2和Smad3的磷酸化水平受到抑制，E-cadherin的表達升高，Vimentin的表達降低，細胞的侵襲和遷移能力也明顯減弱（P＜0.05）。這表明抑制TGF-β/Smad信號通路能夠逆轉RUFY3和FOXK1過表達所導致的EMT和侵襲轉移增強的表型。綜上所述，RUFY3與FOXK1可能通過激活TGF-β/Smad信號通路，促進大腸癌細胞發生EMT，進而增強細胞的侵襲和轉移能力。這一發現為揭示RUFY3與FOXK1協同促進大腸癌細胞侵襲轉移的分子機制提供了重要依據，也為大腸癌的治療提供了新的潛在靶點。[此處插入Westernblot檢測TGF-β/Smad信號通路相關蛋白結果圖片]4.3RUFY3與FOXK1相互作用的驗證4.3.1免疫共沉淀實驗為驗證RUFY3與FOXK1在大腸癌細胞內是否存在直接相互作用，本研究采用免疫共沉淀（Co-IP）實驗。收集對數生長期的人大腸癌細胞株HT-29和SW480，用預冷的PBS洗滌細胞2次，加入適量的細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘。期間輕輕晃動離心管，使細胞充分裂解。4℃，12000g離心15分鐘，取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質濃度。取適量的蛋白樣品（一般為500-1000μg），加入5μlRUFY3的特異性抗體，4℃孵育過夜。次日，加入40μlProteinA/G磁珠，4℃孵育2-4小時，使抗體-抗原復合物與磁珠結合。將離心管放在磁力架上，棄上清，用PBS洗滌磁珠5次，每次5分鐘，以去除未結合的蛋白質。洗滌過程中，將離心管從磁力架上取下，輕輕晃動，使磁珠充分懸浮在PBS中，然后再放回磁力架上棄上清。加入50μl1×SDS上樣緩沖液，煮沸5分鐘，使抗體-抗原復合物從磁珠上解離下來。將樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳條件為：80V恒壓電泳30分鐘，待蛋白Marker進入分離膠后，改為120V恒壓電泳至溴酚藍遷移至膠底部。電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上，轉膜條件為：300mA恒流轉膜90分鐘。轉膜結束后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫封閉1-2小時。封閉結束后，用TBST洗滌3次，每次10分鐘。滴加FOXK1的特異性一抗（稀釋度為1:3000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10分鐘。滴加HRP標記的二抗（稀釋度為1:5000），室溫孵育1-2小時。再次用TBST洗滌3次，每次10分鐘。加入ECL發光液，在凝膠成像系統中曝光顯影。結果顯示，在RUFY3抗體免疫沉淀的樣品中，能夠檢測到FOXK1的條帶，而在IgG陰性對照免疫沉淀的樣品中未檢測到FOXK1條帶。如圖6