REV病毒表達(dá)外源基因的構(gòu)建、拯救及特性研究：技術(shù)突破與應(yīng)用探索一、引言1.1研究背景網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒（Reticuloendotheliosisvirus，REV）是一種反轉(zhuǎn)錄病毒，屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科γ-反轉(zhuǎn)錄病毒屬。REV能感染多種家禽和野鳥(niǎo)，如雞、鴨、火雞等，給全球家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。REV感染可導(dǎo)致禽類(lèi)出現(xiàn)多種病癥，其中最主要的是免疫抑制、腫瘤形成和生長(zhǎng)發(fā)育受阻。免疫抑制使得感染禽對(duì)其他病原體的易感性增加，疫苗免疫效果降低，從而引發(fā)多種疾病的并發(fā)或繼發(fā)感染，進(jìn)一步加重病情和經(jīng)濟(jì)損失。例如，感染REV的雞群對(duì)新城疫病毒、馬立克氏病病毒等的易感性顯著提高，常常導(dǎo)致這些疾病的大規(guī)模爆發(fā)。腫瘤形成會(huì)導(dǎo)致患病禽類(lèi)的死亡率上升，生長(zhǎng)發(fā)育受阻則會(huì)使禽類(lèi)生長(zhǎng)緩慢、體重減輕、飼料轉(zhuǎn)化率降低，影響?zhàn)B殖效益。此外，REV還可通過(guò)污染禽用疫苗，導(dǎo)致疫苗免疫失敗，造成REV的大面積人工傳播。日本曾因疫苗污染REV，給本國(guó)經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重?fù)p失。目前，針對(duì)REV感染，主要采取疫苗接種和防控措施來(lái)進(jìn)行預(yù)防和控制。然而，現(xiàn)有的疫苗在免疫效果和安全性等方面仍存在一定的局限性，無(wú)法完全滿足家禽養(yǎng)殖業(yè)的需求。因此，開(kāi)發(fā)新型、高效、安全的疫苗成為了當(dāng)前家禽疫病防控領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。構(gòu)建表達(dá)外源基因的REV病毒具有重要的意義。一方面，它可以作為新型疫苗的研發(fā)平臺(tái)。通過(guò)將外源抗原基因插入REV病毒基因組，使其在病毒感染過(guò)程中表達(dá)，從而激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)該抗原的免疫反應(yīng)，為開(kāi)發(fā)多價(jià)或新型疫苗提供了可能。例如，將禽流感病毒的抗原基因插入REV病毒，構(gòu)建的重組病毒疫苗有望同時(shí)預(yù)防REV和禽流感的感染。另一方面，表達(dá)外源基因的REV病毒有助于深入研究病毒的致病機(jī)制。通過(guò)對(duì)攜帶不同外源基因的REV病毒進(jìn)行研究，可以分析外源基因?qū)Σ《緩?fù)制、傳播、致病等過(guò)程的影響，從而進(jìn)一步揭示REV的致病機(jī)理，為疾病的防治提供理論依據(jù)。同時(shí)，這也有助于研究病毒與宿主細(xì)胞之間的相互作用，為開(kāi)發(fā)新的抗病毒策略提供思路。綜上所述，REV病毒對(duì)家禽業(yè)的危害嚴(yán)重，構(gòu)建表達(dá)外源基因的REV病毒在新型疫苗開(kāi)發(fā)和病毒致病機(jī)制研究等方面具有重要價(jià)值，開(kāi)展相關(guān)研究具有迫切性和必要性。1.2研究目的與意義本研究旨在成功構(gòu)建并拯救表達(dá)外源基因的REV病毒，深入探究其生物學(xué)特性。具體而言，通過(guò)基因工程技術(shù)，將特定的外源基因精準(zhǔn)插入REV病毒基因組，實(shí)現(xiàn)病毒的重組構(gòu)建。利用細(xì)胞培養(yǎng)和病毒拯救技術(shù)，獲得具有感染性的重組REV病毒，并對(duì)其進(jìn)行全面的生物學(xué)特性分析，包括病毒的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、感染特性、免疫原性等。本研究具有重要的理論和實(shí)踐意義。在實(shí)踐上，家禽養(yǎng)殖業(yè)中，REV感染嚴(yán)重威脅家禽健康和養(yǎng)殖效益，現(xiàn)有疫苗存在局限性。構(gòu)建表達(dá)外源基因的REV病毒可作為新型多價(jià)疫苗研發(fā)的關(guān)鍵技術(shù)路徑，將多種病原體的抗原基因整合到REV病毒載體中，開(kāi)發(fā)出能夠同時(shí)預(yù)防REV和其他重要家禽疫病的新型疫苗，如將新城疫病毒、禽流感病毒等抗原基因插入REV病毒，有望研發(fā)出多聯(lián)疫苗，為家禽疫病防控提供有力的技術(shù)支持，減少疫病造成的經(jīng)濟(jì)損失。在理論上，本研究有助于深入理解REV病毒的基因功能、復(fù)制機(jī)制以及病毒與宿主細(xì)胞的相互作用機(jī)制。通過(guò)對(duì)攜帶不同外源基因的REV病毒的研究，可以分析外源基因?qū)Σ《净虮磉_(dá)、復(fù)制周期、感染宿主細(xì)胞的能力以及致病過(guò)程的影響，進(jìn)一步揭示REV病毒的致病機(jī)理，為病毒學(xué)研究提供新的理論依據(jù)，推動(dòng)病毒學(xué)學(xué)科的發(fā)展。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在REV病毒構(gòu)建方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了一定成果。國(guó)外研究中，有團(tuán)隊(duì)利用基因編輯技術(shù)，將特定的熒光蛋白基因插入REV病毒基因組，成功構(gòu)建了重組REV病毒，用于病毒感染機(jī)制的研究。他們通過(guò)優(yōu)化載體設(shè)計(jì)和轉(zhuǎn)染條件，提高了重組病毒的構(gòu)建效率和穩(wěn)定性。國(guó)內(nèi)研究人員則針對(duì)不同的家禽疫病防控需求，嘗試將多種病原體的抗原基因?qū)隦EV病毒，如將禽流感病毒的血凝素（HA）基因、新城疫病毒的F基因等與REV病毒進(jìn)行重組。在構(gòu)建過(guò)程中，注重對(duì)病毒基因組的精細(xì)操作，以確保外源基因的有效插入和穩(wěn)定表達(dá)，同時(shí)對(duì)重組病毒的生物學(xué)特性進(jìn)行了初步分析。在REV病毒拯救方面，國(guó)外研究主要集中在優(yōu)化拯救技術(shù)和提高拯救效率。通過(guò)改進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)體系和病毒接種方法，使得重組病毒的拯救成功率得到顯著提升。有研究利用特定的細(xì)胞系和培養(yǎng)條件，成功拯救出具有高滴度和感染性的重組REV病毒，并對(duì)其生長(zhǎng)特性進(jìn)行了深入研究。國(guó)內(nèi)研究人員則結(jié)合本土實(shí)際情況，探索適合我國(guó)家禽養(yǎng)殖環(huán)境的病毒拯救方法。他們通過(guò)篩選合適的宿主細(xì)胞和優(yōu)化拯救流程，建立了一套高效、穩(wěn)定的REV病毒拯救技術(shù)體系，并應(yīng)用于多種重組REV病毒的拯救工作。在REV病毒特性研究方面，國(guó)外對(duì)REV病毒的致病機(jī)制、免疫逃逸機(jī)制等進(jìn)行了深入研究。通過(guò)基因敲除、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)手段，揭示了REV病毒感染宿主細(xì)胞后，對(duì)宿主細(xì)胞信號(hào)通路、免疫應(yīng)答等方面的影響機(jī)制。國(guó)內(nèi)研究則在病毒的流行病學(xué)、分子生物學(xué)特性等方面取得了重要進(jìn)展。通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)不同地區(qū)REV病毒分離株的基因序列分析，明確了病毒的遺傳變異規(guī)律和流行特點(diǎn)。同時(shí)，對(duì)REV病毒感染家禽后的免疫反應(yīng)和免疫抑制機(jī)制進(jìn)行了研究，為疫苗的研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。然而，當(dāng)前的研究仍存在一些不足之處。在病毒構(gòu)建方面，雖然已有多種外源基因被成功插入REV病毒基因組，但對(duì)于外源基因的插入位點(diǎn)、表達(dá)調(diào)控等方面的研究還不夠深入，導(dǎo)致部分重組病毒的穩(wěn)定性和表達(dá)效率有待提高。在病毒拯救方面，現(xiàn)有技術(shù)在某些情況下仍存在拯救效率低、病毒滴度不穩(wěn)定等問(wèn)題，限制了重組REV病毒的大規(guī)模制備和應(yīng)用。在病毒特性研究方面，對(duì)于REV病毒與宿主細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用機(jī)制，以及病毒在不同宿主和環(huán)境條件下的致病機(jī)制，還需要進(jìn)一步深入探究。此外，針對(duì)表達(dá)外源基因的REV病毒作為新型疫苗的安全性和有效性評(píng)價(jià)，目前的研究還不夠全面和系統(tǒng)，需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和臨床驗(yàn)證。二、REV病毒概述2.1REV病毒病原學(xué)2.1.1核酸結(jié)構(gòu)REV病毒的核酸為單股正鏈RNA，基因組大小約為9.0kb。其基因組成主要包括gag、pol和env三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，以及一些調(diào)控基因。gag基因編碼病毒的核心結(jié)構(gòu)蛋白，如基質(zhì)蛋白、衣殼蛋白和核衣殼蛋白等，這些蛋白對(duì)于維持病毒粒子的結(jié)構(gòu)完整性和穩(wěn)定性至關(guān)重要。pol基因編碼病毒復(fù)制所需的酶類(lèi)，包括逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶等。逆轉(zhuǎn)錄酶能夠以病毒RNA為模板合成互補(bǔ)的DNA，這是REV病毒生命周期中的關(guān)鍵步驟，使得病毒能夠?qū)⑵溥z傳物質(zhì)整合到宿主細(xì)胞基因組中；整合酶則負(fù)責(zé)將合成的DNA整合到宿主細(xì)胞染色體上，實(shí)現(xiàn)病毒基因組的穩(wěn)定存在；蛋白酶參與病毒蛋白前體的切割和加工，以產(chǎn)生具有功能活性的成熟蛋白。env基因編碼病毒的囊膜糖蛋白，這些糖蛋白位于病毒粒子的表面，在病毒感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，負(fù)責(zé)識(shí)別和結(jié)合宿主細(xì)胞表面的受體，介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的融合，從而使病毒能夠進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)。此外，REV病毒基因組兩端還存在長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）。LTR雖然不編碼病毒蛋白，但對(duì)于病毒基因的表達(dá)調(diào)控起著至關(guān)重要的作用。它包含了多個(gè)順式作用元件，可與宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，啟動(dòng)和調(diào)節(jié)病毒基因的轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，LTR在病毒的整合過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用，幫助病毒DNA準(zhǔn)確地整合到宿主細(xì)胞基因組的特定位置。REV病毒的核酸結(jié)構(gòu)決定了其病毒特性。單股正鏈RNA的基因組結(jié)構(gòu)使得病毒在復(fù)制過(guò)程中需要依賴逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA，這一過(guò)程增加了病毒變異的可能性。由于逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正功能，在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中容易發(fā)生堿基錯(cuò)配，從而導(dǎo)致病毒基因組的突變，使得病毒能夠快速適應(yīng)不同的宿主環(huán)境和逃避宿主的免疫監(jiān)視。gag、pol和env等基因的特定功能和相互協(xié)作，決定了病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)、感染能力和復(fù)制特性。例如，gag基因編碼的蛋白決定了病毒粒子的基本形態(tài)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；env基因編碼的囊膜糖蛋白的特異性決定了病毒的宿主范圍和組織嗜性，不同的env蛋白能夠識(shí)別和結(jié)合不同宿主細(xì)胞表面的受體，從而影響病毒的感染對(duì)象和感染部位。LTR的存在則確保了病毒基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的有效表達(dá)和穩(wěn)定整合，對(duì)于病毒的持續(xù)感染和致病過(guò)程具有重要意義。2.1.2蛋白結(jié)構(gòu)REV病毒的主要蛋白包括囊膜蛋白、衣殼蛋白等，它們?cè)诓《镜纳芷谥懈髯园l(fā)揮著獨(dú)特的作用。囊膜蛋白由env基因編碼，是病毒與宿主細(xì)胞相互作用的關(guān)鍵分子。它由表面糖蛋白（SU）和跨膜糖蛋白（TM）組成。表面糖蛋白位于病毒粒子的最外層，具有高度的抗原性，能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合宿主細(xì)胞表面的受體。不同的REV病毒株，其表面糖蛋白的氨基酸序列存在一定差異，這種差異決定了病毒對(duì)不同宿主細(xì)胞的親和力和感染能力。例如，某些REV病毒株的表面糖蛋白能夠與雞細(xì)胞表面的特定受體高效結(jié)合，從而優(yōu)先感染雞細(xì)胞；而另一些病毒株可能對(duì)鴨細(xì)胞表面受體具有更高的親和力。跨膜糖蛋白則貫穿病毒的囊膜，將表面糖蛋白與病毒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)連接起來(lái)，在病毒與宿主細(xì)胞融合的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)表面糖蛋白與宿主細(xì)胞受體結(jié)合后，跨膜糖蛋白會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，促使病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜融合，進(jìn)而將病毒的核心物質(zhì)釋放到宿主細(xì)胞內(nèi)。衣殼蛋白由gag基因編碼，是構(gòu)成病毒核心結(jié)構(gòu)的主要成分。它包括基質(zhì)蛋白（MA）、衣殼蛋白（CA）和核衣殼蛋白（NC）。基質(zhì)蛋白位于病毒囊膜的內(nèi)側(cè)，起到連接囊膜和核心的作用，同時(shí)也參與病毒粒子的組裝和成熟過(guò)程。衣殼蛋白則形成了病毒核心的外殼，保護(hù)病毒的核酸免受外界環(huán)境的影響。核衣殼蛋白與病毒的核酸緊密結(jié)合，參與病毒基因組的包裝和保護(hù)，確保病毒核酸在病毒粒子內(nèi)的穩(wěn)定性和完整性。這些蛋白結(jié)構(gòu)與病毒的感染和致病過(guò)程密切相關(guān)。囊膜蛋白的受體結(jié)合特性決定了病毒的感染范圍和組織嗜性，影響著病毒在宿主體內(nèi)的傳播和擴(kuò)散。衣殼蛋白和核衣殼蛋白對(duì)病毒核酸的保護(hù)作用，保證了病毒基因組在感染過(guò)程中的穩(wěn)定性，使得病毒能夠成功地將遺傳物質(zhì)傳遞給宿主細(xì)胞，并在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。此外，病毒蛋白的抗原性也會(huì)引發(fā)宿主的免疫反應(yīng)。宿主免疫系統(tǒng)會(huì)識(shí)別病毒蛋白作為外來(lái)抗原，產(chǎn)生特異性的抗體和免疫細(xì)胞來(lái)攻擊病毒。然而，REV病毒也會(huì)通過(guò)蛋白變異等方式來(lái)逃避宿主的免疫監(jiān)視，例如囊膜蛋白的抗原變異，使得宿主先前產(chǎn)生的抗體無(wú)法有效地識(shí)別和中和病毒，從而導(dǎo)致病毒能夠持續(xù)感染和致病。2.1.3復(fù)制過(guò)程REV病毒的復(fù)制過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜而有序的過(guò)程，主要包括吸附、侵入、逆轉(zhuǎn)錄、整合、轉(zhuǎn)錄、翻譯和裝配釋放等步驟。當(dāng)REV病毒與宿主細(xì)胞相遇時(shí)，病毒表面的囊膜糖蛋白（env基因編碼產(chǎn)物）會(huì)特異性地識(shí)別并結(jié)合宿主細(xì)胞表面的受體。囊膜糖蛋白的表面亞基（SU）具有高度的特異性，能夠與宿主細(xì)胞表面相應(yīng)的受體分子精確匹配。不同的REV病毒株可能識(shí)別不同的宿主細(xì)胞受體，這決定了病毒的宿主范圍和組織嗜性。一旦病毒與受體結(jié)合，跨膜亞基（TM）會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，促使病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜融合。通過(guò)膜融合，病毒的核衣殼被釋放到宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，完成侵入過(guò)程。進(jìn)入宿主細(xì)胞后，病毒的單股正鏈RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶（pol基因編碼產(chǎn)物）的作用下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄酶以病毒RNA為模板，合成互補(bǔ)的單鏈DNA。在這個(gè)過(guò)程中，逆轉(zhuǎn)錄酶首先利用自身攜帶的tRNA引物，從病毒RNA的特定區(qū)域開(kāi)始合成DNA。隨后，逆轉(zhuǎn)錄酶繼續(xù)延伸DNA鏈，并降解RNA-DNA雜合鏈中的RNA部分，再以新合成的DNA鏈為模板，合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，最終形成雙鏈DNA，即前病毒DNA。前病毒DNA在整合酶（同樣由pol基因編碼）的作用下，整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA中。整合酶能夠識(shí)別宿主細(xì)胞染色體上的特定序列，并將前病毒DNA準(zhǔn)確地插入其中。整合后的前病毒DNA成為宿主細(xì)胞基因組的一部分，隨著宿主細(xì)胞的分裂而傳遞給子代細(xì)胞。這一過(guò)程使得病毒能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期潛伏，為后續(xù)的復(fù)制和感染奠定基礎(chǔ)。當(dāng)宿主細(xì)胞受到某些刺激或處于特定的生理狀態(tài)時(shí)，整合在宿主染色體上的前病毒DNA會(huì)被激活，開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。宿主細(xì)胞的RNA聚合酶結(jié)合到前病毒DNA的啟動(dòng)子區(qū)域（位于長(zhǎng)末端重復(fù)序列LTR中），啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程，合成病毒的mRNA。這些mRNA包含了病毒復(fù)制所需的各種基因信息。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，在核糖體上進(jìn)行翻譯，合成病毒的各種蛋白質(zhì)。gag基因編碼的蛋白形成病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，如基質(zhì)蛋白、衣殼蛋白和核衣殼蛋白等；pol基因編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶等參與病毒的復(fù)制和裝配過(guò)程；env基因編碼的囊膜糖蛋白則在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中進(jìn)行加工和修飾，最終運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜表面。在宿主細(xì)胞內(nèi)，新合成的病毒核酸和蛋白質(zhì)開(kāi)始進(jìn)行裝配。核衣殼蛋白首先與病毒的基因組RNA結(jié)合，形成核衣殼結(jié)構(gòu)。然后，衣殼蛋白圍繞核衣殼組裝，形成完整的病毒核心。基質(zhì)蛋白則位于病毒核心與細(xì)胞膜之間，起到連接和穩(wěn)定的作用。在裝配過(guò)程中，病毒的蛋白酶會(huì)對(duì)一些前體蛋白進(jìn)行切割和加工，使其成為具有功能活性的成熟蛋白。裝配完成的病毒粒子通過(guò)出芽的方式從宿主細(xì)胞膜上釋放出來(lái)。在出芽過(guò)程中，病毒粒子獲得了含有囊膜糖蛋白的宿主細(xì)胞膜，形成完整的具有感染性的病毒顆粒。這些新釋放的病毒又可以繼續(xù)感染其他宿主細(xì)胞，開(kāi)始新一輪的復(fù)制循環(huán)。2.2REV病毒流行病學(xué)2.2.1宿主范圍REV病毒具有較廣泛的宿主范圍，自然宿主涵蓋了多種家禽和野鳥(niǎo)。雞是REV病毒的常見(jiàn)宿主之一，不同品種和日齡的雞對(duì)REV病毒的易感性存在差異。一般來(lái)說(shuō)，幼齡雞尤其是1-3周齡的雛雞對(duì)REV病毒更為易感。感染后的雛雞可能出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、免疫抑制等癥狀，表現(xiàn)為體重增長(zhǎng)緩慢，相較于正常雛雞，感染REV病毒的雛雞在相同飼養(yǎng)條件下，體重可能會(huì)低20%-30%。免疫抑制則使得雛雞對(duì)其他病原體的抵抗力下降，容易繼發(fā)感染其他疾病，如大腸桿菌病、支原體病等，增加雛雞的死亡率。成年雞感染REV病毒后，癥狀相對(duì)較輕，可能僅表現(xiàn)為一過(guò)性的病毒血癥，不出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，但仍可成為病毒的攜帶者，向外界排毒，傳播病毒。鴨也是REV病毒的自然宿主。鴨感染REV病毒后，可能出現(xiàn)貧血、生長(zhǎng)不良等癥狀。在一些鴨養(yǎng)殖群體中，感染REV病毒的鴨可能表現(xiàn)出羽毛蓬松、精神萎靡、采食量下降等癥狀，導(dǎo)致鴨的生長(zhǎng)速度減緩，養(yǎng)殖周期延長(zhǎng)，飼料轉(zhuǎn)化率降低，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)損失。此外，REV病毒感染還可能影響鴨的繁殖性能，導(dǎo)致種鴨產(chǎn)蛋量下降、孵化率降低等問(wèn)題。火雞對(duì)REV病毒也具有較高的易感性。火雞感染REV病毒后，可引發(fā)急性網(wǎng)狀細(xì)胞瘤，導(dǎo)致火雞死亡率升高。感染REV病毒的火雞通常在感染后6-21天內(nèi)出現(xiàn)癥狀，表現(xiàn)為精神沉郁、消瘦、羽毛脫落等，隨后病情迅速惡化，出現(xiàn)腫瘤相關(guān)癥狀，最終死亡。REV病毒還可感染鵝、雉、日本鵪鶉等禽類(lèi)。不同宿主對(duì)REV病毒的易感性和感染后的癥狀差異，可能與宿主的遺傳背景、免疫系統(tǒng)功能以及病毒株的特性等因素有關(guān)。了解這些差異，對(duì)于制定針對(duì)性的防控措施具有重要意義。2.2.2傳播途徑REV病毒的傳播途徑主要包括水平傳播和垂直傳播兩種方式。水平傳播是REV病毒傳播的重要方式之一。直接接觸感染是水平傳播的常見(jiàn)途徑，感染REV病毒的禽類(lèi)通過(guò)糞便、泄殖腔拭子、體液等排出病毒，健康禽類(lèi)接觸到這些含有病毒的排泄物或分泌物后，可能被感染。例如，在雞群中，如果一只感染REV病毒的雞與健康雞混養(yǎng)，健康雞接觸到感染雞的糞便后，病毒可通過(guò)口腔、呼吸道等途徑進(jìn)入健康雞體內(nèi)，引發(fā)感染。吸血昆蟲(chóng)在REV病毒的傳播中也發(fā)揮著一定作用。蚊子、蜱蟲(chóng)等吸血昆蟲(chóng)在叮咬感染REV病毒的禽類(lèi)后，病毒可在昆蟲(chóng)體內(nèi)存活一段時(shí)間，當(dāng)這些昆蟲(chóng)再叮咬健康禽類(lèi)時(shí)，就可能將病毒傳播給健康禽類(lèi)。有研究表明，在一些蚊蟲(chóng)密集的養(yǎng)殖環(huán)境中，REV病毒的傳播速度明顯加快，感染率也顯著提高。此外，污染的疫苗也是REV病毒水平傳播的重要因素。如果禽用疫苗被REV病毒污染，在疫苗接種過(guò)程中，病毒可通過(guò)注射、滴鼻、點(diǎn)眼等方式進(jìn)入禽類(lèi)體內(nèi)，導(dǎo)致大規(guī)模的人工傳播。歷史上曾有因禽痘疫苗、馬立克疫苗等被REV病毒污染，引發(fā)禽類(lèi)REV感染的事件，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大損失。垂直傳播也是REV病毒傳播的一種方式，但垂直傳播率相對(duì)較低。母雞的生殖道、公禽的精液中可分離到REV病毒，感染病毒的種雞可通過(guò)受精過(guò)程將病毒傳遞給胚胎，導(dǎo)致胚胎感染。從感染REV病毒的種雞所產(chǎn)的蛋中，可分離到病毒，這些感染病毒的蛋孵化出的雛雞，在出生時(shí)就已攜帶病毒。研究發(fā)現(xiàn)，感染REV病毒的種雞所產(chǎn)蛋的垂直傳播率約為1%-5%，雖然傳播率不高，但在種雞養(yǎng)殖中，這種垂直傳播可能導(dǎo)致病毒在雞群中持續(xù)存在，難以徹底清除，對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)的危害不容忽視。2.2.3國(guó)內(nèi)流行現(xiàn)狀近年來(lái)，國(guó)內(nèi)REV病毒的流行呈現(xiàn)出一定的趨勢(shì)和特點(diǎn)。從流行趨勢(shì)來(lái)看，REV病毒的感染率在部分地區(qū)有上升的態(tài)勢(shì)。隨著家禽養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)模化發(fā)展，家禽的流通更加頻繁，這為REV病毒的傳播提供了有利條件。一些地區(qū)的家禽養(yǎng)殖場(chǎng)由于養(yǎng)殖密度大、衛(wèi)生條件差等原因，REV病毒的傳播風(fēng)險(xiǎn)增加，導(dǎo)致感染率上升。有研究對(duì)國(guó)內(nèi)多個(gè)省份的家禽養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，部分地區(qū)雞群中REV病毒的抗體陽(yáng)性率在過(guò)去幾年中從20%左右上升到了30%-40%。在地域分布方面，REV病毒在國(guó)內(nèi)多個(gè)省份均有檢出，呈現(xiàn)出廣泛分布的特點(diǎn)。東北地區(qū)、華北地區(qū)、華東地區(qū)等家禽養(yǎng)殖密集的地區(qū)，REV病毒的感染情況較為普遍。東北地區(qū)由于冬季寒冷，家禽養(yǎng)殖多采用封閉式養(yǎng)殖模式，在通風(fēng)條件不佳的情況下，病毒容易在雞群中傳播。而華東地區(qū)家禽養(yǎng)殖規(guī)模大，家禽交易頻繁，增加了病毒傳播的機(jī)會(huì)。不同地區(qū)的流行情況可能受到當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖環(huán)境、養(yǎng)殖管理水平、疫苗使用情況等多種因素的影響。REV病毒感染對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)影響。感染REV病毒的家禽生長(zhǎng)發(fā)育受阻，體重減輕，飼料轉(zhuǎn)化率降低，導(dǎo)致養(yǎng)殖成本增加。例如，感染REV病毒的肉雞，其出欄體重可能比正常肉雞低10%-20%，飼料消耗卻增加15%-20%。同時(shí)，REV病毒感染還會(huì)導(dǎo)致家禽免疫抑制，使家禽對(duì)其他疫苗的免疫應(yīng)答降低，增加了其他疫病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步造成經(jīng)濟(jì)損失。因REV病毒感染導(dǎo)致的家禽死亡、淘汰，以及為防控疫病所增加的藥物、疫苗等投入，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)估算，每年REV病毒感染給我國(guó)家禽養(yǎng)殖業(yè)造成的直接經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)數(shù)億元。2.3REV病毒致病性與診斷方法2.3.1致病性REV病毒感染宿主后，會(huì)引發(fā)一系列復(fù)雜的致病過(guò)程，對(duì)宿主的免疫系統(tǒng)、生長(zhǎng)發(fā)育以及組織器官產(chǎn)生嚴(yán)重影響。免疫抑制是REV病毒感染的重要致病機(jī)制之一。REV病毒主要感染宿主的免疫細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。病毒在這些免疫細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，會(huì)破壞細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致免疫細(xì)胞數(shù)量減少、活性降低。研究表明，感染REV病毒的雞，其外周血中T淋巴細(xì)胞的數(shù)量在感染后7-14天顯著下降，可降低30%-50%。同時(shí)，免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力也受到抑制，如白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等細(xì)胞因子的分泌量明顯減少，這使得機(jī)體的免疫應(yīng)答能力下降，無(wú)法有效地抵御其他病原體的入侵。免疫抑制還會(huì)影響疫苗的免疫效果，使疫苗接種后機(jī)體產(chǎn)生的抗體水平降低，無(wú)法達(dá)到有效的免疫保護(hù)。例如，在接種新城疫疫苗的雞群中，如果雞同時(shí)感染了REV病毒，其對(duì)新城疫疫苗產(chǎn)生的抗體滴度可能會(huì)比未感染REV病毒的雞群低2-3個(gè)對(duì)數(shù)單位，從而增加了雞群感染新城疫病毒的風(fēng)險(xiǎn)。生長(zhǎng)遲緩也是REV病毒感染常見(jiàn)的癥狀。感染REV病毒的家禽，其生長(zhǎng)激素的分泌受到抑制，蛋白質(zhì)合成減少，脂肪代謝紊亂，導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育受阻。在肉雞養(yǎng)殖中，感染REV病毒的肉雞體重增長(zhǎng)緩慢，與正常肉雞相比，在相同飼養(yǎng)周期內(nèi)，體重可能會(huì)低15%-25%。這不僅影響了家禽的養(yǎng)殖效益，還降低了家禽的品質(zhì)。此外，REV病毒感染還會(huì)導(dǎo)致家禽羽毛發(fā)育異常，羽毛稀疏、易折斷，影響家禽的外觀和市場(chǎng)價(jià)值。腫瘤發(fā)生是REV病毒感染較為嚴(yán)重的后果。REV病毒可整合到宿主細(xì)胞的基因組中，通過(guò)插入突變、激活原癌基因或抑制抑癌基因等方式，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生癌變。REV病毒可引起急性網(wǎng)狀細(xì)胞瘤、慢性淋巴細(xì)胞瘤等多種腫瘤疾病。在火雞中，感染REV病毒后，常引發(fā)急性網(wǎng)狀細(xì)胞瘤，導(dǎo)致火雞在短時(shí)間內(nèi)死亡。腫瘤的發(fā)生不僅會(huì)導(dǎo)致患病家禽的死亡率升高，還會(huì)增加養(yǎng)殖成本和疫病防控的難度。2.3.2診斷方法準(zhǔn)確診斷REV病毒感染對(duì)于家禽疫病的防控至關(guān)重要。目前，常用的REV病毒診斷技術(shù)主要包括病毒分離鑒定、血清學(xué)檢測(cè)和分子診斷等。病毒分離鑒定是診斷REV病毒的經(jīng)典方法。該方法通常采集感染家禽的組織樣本，如脾臟、肝臟、血液等，將樣本處理后接種到雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）、鴨胚成纖維細(xì)胞（DEF）等敏感細(xì)胞上進(jìn)行培養(yǎng)。在適宜的培養(yǎng)條件下，REV病毒會(huì)在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并引起細(xì)胞病變。一般在接種后3-7天，可觀察到細(xì)胞出現(xiàn)變圓、脫落、融合等典型的病變特征。通過(guò)對(duì)病變細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)，如免疫熒光染色、電鏡觀察等，可確定是否存在REV病毒。免疫熒光染色可以使用特異性的REV病毒抗體，與感染細(xì)胞內(nèi)的病毒抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察到特異性的熒光信號(hào)，從而確認(rèn)病毒的存在。電鏡觀察則可以直接觀察到病毒粒子的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，REV病毒粒子呈球形，直徑約為100nm，有囊膜，囊膜表面有突起。病毒分離鑒定方法的優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確性高，能夠直接分離到病毒，為后續(xù)的病毒研究和疫苗開(kāi)發(fā)提供病毒材料。但其缺點(diǎn)是操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)要求較高，不適用于大規(guī)模的臨床檢測(cè)。血清學(xué)檢測(cè)是檢測(cè)REV病毒抗體的常用方法。常用的血清學(xué)檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫熒光抗體試驗(yàn)（IFA）和中和試驗(yàn)等。ELISA是目前應(yīng)用最廣泛的血清學(xué)檢測(cè)方法之一。它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，將REV病毒的抗原包被在酶標(biāo)板上，加入待檢血清，若血清中含有REV病毒抗體，則會(huì)與抗原結(jié)合。然后加入酶標(biāo)記的二抗，與結(jié)合在抗原上的抗體結(jié)合，再加入底物，通過(guò)酶催化底物顯色，根據(jù)顏色的深淺來(lái)判斷血清中抗體的含量。ELISA方法具有操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、可同時(shí)檢測(cè)大量樣本等優(yōu)點(diǎn)，適用于家禽養(yǎng)殖場(chǎng)的大規(guī)模血清學(xué)監(jiān)測(cè)。IFA則是將感染REV病毒的細(xì)胞固定在玻片上，加入待檢血清，再加入熒光標(biāo)記的二抗，在熒光顯微鏡下觀察。如果血清中含有抗體，會(huì)在細(xì)胞上出現(xiàn)特異性的熒光，從而判斷抗體的存在。中和試驗(yàn)是通過(guò)檢測(cè)血清中抗體對(duì)REV病毒感染細(xì)胞的中和能力來(lái)判斷抗體的效價(jià)，該方法準(zhǔn)確性高，但操作復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)，一般用于科研和病毒抗體效價(jià)的精確測(cè)定。分子診斷技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展迅速的REV病毒診斷方法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是最常用的分子診斷技術(shù)之一。它根據(jù)REV病毒基因組的特定序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增反應(yīng)，將病毒的核酸片段進(jìn)行大量擴(kuò)增。擴(kuò)增后的產(chǎn)物可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，若出現(xiàn)特異性的條帶，則表明樣本中存在REV病毒核酸。PCR方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速等優(yōu)點(diǎn)，能夠在病毒感染的早期檢測(cè)到病毒核酸，為疫病的早期診斷和防控提供依據(jù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）則在PCR的基礎(chǔ)上，加入了熒光標(biāo)記探針，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，對(duì)病毒核酸進(jìn)行定量分析。該方法不僅能夠檢測(cè)病毒的存在，還能夠準(zhǔn)確測(cè)定病毒核酸的含量，對(duì)于評(píng)估病毒感染的程度和監(jiān)測(cè)病情的發(fā)展具有重要意義。此外，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）也是一種新型的分子診斷技術(shù)，它能夠在恒溫條件下快速擴(kuò)增病毒核酸，具有操作簡(jiǎn)便、快速、不需要特殊儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，適合在基層實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中應(yīng)用。2.4REV病毒預(yù)防控制措施2.4.1免疫接種目前，針對(duì)REV病毒的疫苗主要包括滅活疫苗和弱毒疫苗。滅活疫苗是將病毒經(jīng)過(guò)物理或化學(xué)方法滅活后，添加適當(dāng)?shù)淖魟┲瞥伞缁钜呙绲膬?yōu)點(diǎn)是安全性高，不易發(fā)生毒力返強(qiáng)的現(xiàn)象。例如，一些采用甲醛滅活的REV病毒疫苗，在生產(chǎn)過(guò)程中嚴(yán)格控制滅活條件，確保病毒失去感染性但保留其抗原性。接種滅活疫苗后，機(jī)體能夠產(chǎn)生一定的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生特異性抗體，對(duì)病毒的感染起到一定的免疫保護(hù)作用。然而，滅活疫苗的免疫效果相對(duì)較弱，需要多次接種才能達(dá)到較好的免疫效果，且免疫持續(xù)時(shí)間較短。一般來(lái)說(shuō)，接種滅活疫苗后，抗體水平在2-3個(gè)月后逐漸下降，需要定期進(jìn)行加強(qiáng)免疫。弱毒疫苗則是通過(guò)對(duì)病毒進(jìn)行致弱處理后獲得的。弱毒疫苗能夠在機(jī)體內(nèi)進(jìn)行一定程度的復(fù)制，從而激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。如某些經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代致弱的REV病毒弱毒疫苗，在接種后能夠在雞體內(nèi)引起輕微的感染，但不會(huì)導(dǎo)致明顯的臨床癥狀，同時(shí)能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫。弱毒疫苗的免疫效果相對(duì)較好，一次接種即可產(chǎn)生較長(zhǎng)時(shí)間的免疫保護(hù)。不過(guò)，弱毒疫苗存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)，如可能發(fā)生毒力返強(qiáng)，導(dǎo)致接種動(dòng)物發(fā)病。此外，弱毒疫苗在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中對(duì)溫度等條件要求較為嚴(yán)格，若保存不當(dāng)，容易導(dǎo)致疫苗失效。現(xiàn)有疫苗研發(fā)面臨諸多挑戰(zhàn)。一方面，REV病毒存在不同的毒株，其抗原性存在一定差異。這使得單一疫苗難以對(duì)所有毒株提供有效的免疫保護(hù)。不同地區(qū)的REV病毒分離株在基因序列和抗原性上可能存在差異，導(dǎo)致現(xiàn)有的疫苗在某些地區(qū)的免疫效果不佳。另一方面，REV病毒感染后可引起免疫抑制，這會(huì)影響疫苗的免疫應(yīng)答。感染REV病毒的家禽，其免疫系統(tǒng)受到抑制，對(duì)疫苗的免疫反應(yīng)降低，從而降低了疫苗的免疫效果。因此，研發(fā)能夠覆蓋多種毒株、克服免疫抑制影響的新型疫苗，是當(dāng)前REV病毒疫苗研究的重點(diǎn)方向。2.4.2防控措施加強(qiáng)生物安全管理是防控REV病毒的重要措施。養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)建立嚴(yán)格的生物安全制度，限制人員和車(chē)輛的進(jìn)出，防止外來(lái)人員和車(chē)輛將病毒帶入養(yǎng)殖場(chǎng)。進(jìn)入養(yǎng)殖場(chǎng)的人員和車(chē)輛必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的消毒處理，如人員更換工作服和鞋套，車(chē)輛進(jìn)行噴霧消毒等。養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)要定期進(jìn)行清潔和消毒，對(duì)禽舍、養(yǎng)殖設(shè)備等進(jìn)行徹底消毒，可使用過(guò)氧乙酸、戊二醛等消毒劑，每周至少進(jìn)行1-2次全面消毒。同時(shí)，要加強(qiáng)對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境的管理，保持禽舍的通風(fēng)良好，控制養(yǎng)殖密度，避免家禽過(guò)度擁擠，減少病毒傳播的機(jī)會(huì)。監(jiān)測(cè)與凈化也是防控REV病毒的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。定期對(duì)家禽進(jìn)行REV病毒的監(jiān)測(cè)，可采用血清學(xué)檢測(cè)、分子診斷等方法，及時(shí)發(fā)現(xiàn)感染家禽。對(duì)于檢測(cè)出的陽(yáng)性家禽，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行隔離和淘汰，防止病毒在雞群中傳播。通過(guò)持續(xù)的監(jiān)測(cè)和凈化措施，逐步降低雞群中的感染率，最終實(shí)現(xiàn)雞群的凈化。例如，一些大型種雞場(chǎng)通過(guò)定期對(duì)種雞進(jìn)行REV病毒檢測(cè)，淘汰陽(yáng)性種雞，經(jīng)過(guò)幾年的努力，成功實(shí)現(xiàn)了種雞群的REV病毒凈化，為雞苗的健康提供了保障。此外，要避免疫苗污染。疫苗生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)疫苗生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量控制，確保疫苗不被REV病毒污染。在疫苗生產(chǎn)過(guò)程中，要嚴(yán)格篩選原材料，對(duì)生產(chǎn)用水、細(xì)胞基質(zhì)等進(jìn)行嚴(yán)格檢測(cè)，防止REV病毒的污染。同時(shí)，要加強(qiáng)對(duì)疫苗生產(chǎn)車(chē)間的環(huán)境監(jiān)測(cè)和消毒，避免病毒在生產(chǎn)車(chē)間內(nèi)傳播。養(yǎng)殖戶在購(gòu)買(mǎi)疫苗時(shí)，應(yīng)選擇正規(guī)廠家生產(chǎn)的疫苗，并注意疫苗的保存和使用方法，避免因疫苗污染導(dǎo)致REV病毒的傳播。通過(guò)加強(qiáng)生物安全管理、監(jiān)測(cè)與凈化、避免疫苗污染等綜合性防控策略的實(shí)施，能夠有效降低REV病毒的感染風(fēng)險(xiǎn)，保障家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。三、表達(dá)外源基因的REV病毒構(gòu)建3.1材料準(zhǔn)備3.1.1質(zhì)粒及細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)選用了含REV病毒基因組的質(zhì)粒pREV，該質(zhì)粒完整包含了REV病毒的基因組序列，為病毒的構(gòu)建提供了基礎(chǔ)的遺傳物質(zhì)。同時(shí)，攜帶外源基因的質(zhì)粒pEGFP，其外源基因編碼綠色熒光蛋白（EGFP），該蛋白在藍(lán)光或紫外光激發(fā)下能夠發(fā)出綠色熒光，便于后續(xù)對(duì)重組病毒的檢測(cè)和分析。選用的細(xì)胞系為雞胚成纖維細(xì)胞（CEF），CEF對(duì)REV病毒具有較高的敏感性，能夠支持病毒的有效感染和復(fù)制。CEF細(xì)胞易于培養(yǎng)和傳代，在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中能夠良好生長(zhǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，定期觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%-90%時(shí)，可進(jìn)行傳代或用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.1.2培養(yǎng)基及主要試劑實(shí)驗(yàn)所需的培養(yǎng)基為DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）培養(yǎng)基，它為細(xì)胞提供了生長(zhǎng)所需的各種營(yíng)養(yǎng)成分，包括氨基酸、維生素、糖類(lèi)、無(wú)機(jī)鹽等。在DMEM培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清，可補(bǔ)充細(xì)胞生長(zhǎng)所需的生長(zhǎng)因子、激素和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。同時(shí)，添加1%的雙抗（青霉素和鏈霉素），青霉素可抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，鏈霉素能與細(xì)菌核糖體結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)合成，二者協(xié)同作用，可有效防止細(xì)菌污染，保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無(wú)菌狀態(tài)。限制性內(nèi)切酶是基因工程中的關(guān)鍵工具酶，本實(shí)驗(yàn)使用的限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII，它們能夠識(shí)別并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。BamHI識(shí)別的序列為GGATCC，HindIII識(shí)別的序列為AAGCTT，通過(guò)這兩種酶對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行切割，可產(chǎn)生粘性末端，便于后續(xù)的基因片段連接。T4DNA連接酶則能夠催化具有互補(bǔ)粘性末端或平末端的DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，實(shí)現(xiàn)外源基因與REV病毒基因組質(zhì)粒的連接。DNAMarker用于確定DNA片段的大小，在瓊脂糖凝膠電泳中，通過(guò)與已知大小的DNAMarker進(jìn)行對(duì)比，可準(zhǔn)確判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物的大小。質(zhì)粒提取試劑盒用于從細(xì)菌中提取質(zhì)粒DNA，其原理基于堿裂解法，通過(guò)裂解細(xì)菌細(xì)胞，分離質(zhì)粒DNA，并去除蛋白質(zhì)、RNA等雜質(zhì)，獲得高純度的質(zhì)粒DNA。凝膠回收試劑盒則用于從瓊脂糖凝膠中回收特定的DNA片段，利用硅膠膜對(duì)DNA的特異性吸附，在高鹽環(huán)境下結(jié)合DNA，經(jīng)過(guò)洗滌去除雜質(zhì)后，再在低鹽環(huán)境下洗脫DNA，實(shí)現(xiàn)DNA片段的回收和純化。3.1.3主要儀器設(shè)備PCR儀是實(shí)現(xiàn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的關(guān)鍵儀器，它能夠精確控制反應(yīng)溫度和時(shí)間，通過(guò)變性、退火和延伸三個(gè)步驟的循環(huán)，使DNA片段在短時(shí)間內(nèi)得到大量擴(kuò)增。在本實(shí)驗(yàn)中，利用PCR儀擴(kuò)增外源基因和REV病毒基因組的特定片段。其溫度控制精度可達(dá)±0.1℃，能夠滿足不同引物和模板的擴(kuò)增需求。離心機(jī)用于分離不同密度的物質(zhì)，在質(zhì)粒提取、細(xì)胞收集、DNA片段純化等實(shí)驗(yàn)步驟中發(fā)揮重要作用。高速離心機(jī)可達(dá)到12000rpm以上的轉(zhuǎn)速，能夠快速沉淀細(xì)胞和DNA等物質(zhì)。在質(zhì)粒提取過(guò)程中，通過(guò)離心去除細(xì)菌細(xì)胞碎片，分離上清液中的質(zhì)粒DNA。在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，利用離心機(jī)收集細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和后續(xù)處理。熒光顯微鏡用于觀察細(xì)胞和病毒中熒光蛋白的表達(dá)情況。本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)熒光顯微鏡可觀察轉(zhuǎn)染了攜帶EGFP基因質(zhì)粒的細(xì)胞，以及拯救出的表達(dá)EGFP基因的REV病毒感染的細(xì)胞，在藍(lán)光或紫外光激發(fā)下，能夠清晰看到細(xì)胞發(fā)出的綠色熒光，從而判斷外源基因是否成功表達(dá)。其配備了高靈敏度的熒光檢測(cè)器和優(yōu)質(zhì)的光學(xué)鏡頭，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)熒光信號(hào)的高分辨率成像。細(xì)胞培養(yǎng)箱為細(xì)胞提供了適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，能夠精確控制溫度、濕度和CO?濃度。本實(shí)驗(yàn)中，將CEF細(xì)胞置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，維持細(xì)胞的正常生理功能和生長(zhǎng)狀態(tài)。其溫度波動(dòng)范圍可控制在±0.5℃以內(nèi)，CO?濃度精度可達(dá)±0.1%，確保細(xì)胞在穩(wěn)定的環(huán)境中生長(zhǎng)。此外，還使用了超凈工作臺(tái)，為細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒操作等實(shí)驗(yàn)提供無(wú)菌環(huán)境，通過(guò)過(guò)濾空氣中的微生物，防止實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的污染。3.2構(gòu)建方法與步驟3.2.1引物設(shè)計(jì)依據(jù)REV病毒基因組和外源基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)原則主要參考相關(guān)的分子生物學(xué)原理和實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。引物長(zhǎng)度一般控制在18-30bp之間，這樣既能保證引物與模板的特異性結(jié)合，又能避免引物過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致合成成本增加和錯(cuò)配幾率上升。GC含量維持在40%-60%，以確保引物具有合適的Tm值（解鏈溫度）。上下游引物的Tm值盡量保持接近，差值一般不超過(guò)5℃，以保證在PCR反應(yīng)中，引物能夠同時(shí)與模板有效地結(jié)合。在設(shè)計(jì)過(guò)程中，利用專業(yè)的生物信息學(xué)軟件，如PrimerPremier5.0，輸入REV病毒基因組和外源基因的核苷酸序列。軟件會(huì)根據(jù)設(shè)定的引物設(shè)計(jì)參數(shù)，自動(dòng)搜索合適的引物序列，并對(duì)引物的特異性、二級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行評(píng)估。針對(duì)外源基因，設(shè)計(jì)一對(duì)引物P1和P2，P1的5’端添加BamHI酶切位點(diǎn)，P2的5’端添加HindIII酶切位點(diǎn)。這兩種酶切位點(diǎn)的選擇是基于它們?cè)谫|(zhì)粒載體和外源基因上的特異性識(shí)別序列，能夠保證后續(xù)的酶切和連接反應(yīng)順利進(jìn)行。同時(shí)，為了避免引物二聚體的形成和非特異性擴(kuò)增，對(duì)引物進(jìn)行全面的分析和優(yōu)化。通過(guò)軟件分析引物之間以及引物與模板之間可能形成的互補(bǔ)配對(duì)區(qū)域，調(diào)整引物序列，減少這些不利因素的影響。最終確定的引物用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以獲得帶有特定酶切位點(diǎn)的外源基因片段，為后續(xù)的基因克隆和重組病毒構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。3.2.2PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的優(yōu)化是確保擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)中，25μL的反應(yīng)體系包含10×PCRbuffer2.5μL，它為PCR反應(yīng)提供了合適的緩沖環(huán)境，維持反應(yīng)體系的pH值穩(wěn)定，保證TaqDNA聚合酶的活性。2.5mmol/L的dNTPs2μL，dNTPs是DNA合成的原料，包括dATP、dTTP、dCTP和dGTP，為擴(kuò)增反應(yīng)提供了構(gòu)建DNA鏈所需的堿基。10μmol/L的上下游引物各0.5μL，引物在PCR反應(yīng)中引導(dǎo)DNA聚合酶與模板結(jié)合，啟動(dòng)DNA的合成。5U/μL的TaqDNA聚合酶0.2μL，TaqDNA聚合酶具有耐高溫的特性，能夠在高溫條件下催化DNA的合成反應(yīng)。模板DNA1μL，它是擴(kuò)增的起始DNA序列，本實(shí)驗(yàn)中為攜帶外源基因的質(zhì)粒DNA或REV病毒基因組質(zhì)粒DNA。最后用ddH?O補(bǔ)足至25μL，以保證反應(yīng)體系的體積準(zhǔn)確。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。首先，95℃預(yù)變性5min，目的是使模板DNA完全解鏈，為后續(xù)的引物結(jié)合和DNA合成創(chuàng)造條件。然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30s，使雙鏈DNA解鏈為單鏈；55℃退火30s，在此溫度下，引物與模板特異性結(jié)合；72℃延伸1min，TaqDNA聚合酶以dNTPs為原料，在引物的引導(dǎo)下，沿著模板DNA合成新的DNA鏈。循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸10min，確保所有的DNA片段都能夠充分延伸，得到完整的擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定采用瓊脂糖凝膠電泳方法。將擴(kuò)增產(chǎn)物與DNAMarker一起上樣到1%的瓊脂糖凝膠中，在1×TAE緩沖液中進(jìn)行電泳。DNAMarker含有已知大小的DNA片段，在電泳過(guò)程中作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用于判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中，在紫外光下觀察。如果擴(kuò)增成功，可在凝膠上觀察到與預(yù)期大小相符的特異性條帶。對(duì)于外源基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，預(yù)期大小為1000bp左右，在凝膠上應(yīng)出現(xiàn)清晰、單一的條帶，表明成功擴(kuò)增出了目的基因片段。通過(guò)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定，篩選出正確的擴(kuò)增產(chǎn)物，用于后續(xù)的克隆轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。3.2.3快速克隆轉(zhuǎn)化本實(shí)驗(yàn)選用重組酶法進(jìn)行快速克隆轉(zhuǎn)化，其原理基于重組酶能夠識(shí)別特定的DNA序列，并催化DNA片段之間的重組反應(yīng)。首先，利用PCR擴(kuò)增得到帶有同源臂的外源基因片段和線性化的REV病毒基因組質(zhì)粒。同源臂的設(shè)計(jì)是關(guān)鍵，它的長(zhǎng)度一般為15-25bp，與線性化質(zhì)粒兩端的序列具有高度同源性。在PCR擴(kuò)增外源基因時(shí)，通過(guò)引物設(shè)計(jì)引入與線性化質(zhì)粒同源的序列，使得擴(kuò)增得到的外源基因片段兩端帶有與線性化質(zhì)粒互補(bǔ)的同源臂。將帶有同源臂的外源基因片段和線性化的REV病毒基因組質(zhì)粒混合，加入重組酶，在適宜的溫度和緩沖條件下進(jìn)行重組反應(yīng)。重組酶能夠識(shí)別同源臂序列，將外源基因片段準(zhǔn)確地插入到線性化質(zhì)粒中，實(shí)現(xiàn)基因的克隆。重組反應(yīng)體系一般為10μL，包含5μL的2×重組酶反應(yīng)buffer，提供適宜的反應(yīng)環(huán)境；1μL的重組酶，催化重組反應(yīng)的進(jìn)行；外源基因片段和線性化質(zhì)粒各適量，具體用量根據(jù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化確定，一般使二者的摩爾比在3:1-5:1之間，以提高重組效率。反應(yīng)在37℃條件下進(jìn)行30min，然后置于冰上冷卻，終止反應(yīng)。將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，常用的感受態(tài)細(xì)胞為大腸桿菌DH5α。感受態(tài)細(xì)胞是經(jīng)過(guò)特殊處理的細(xì)胞，具有攝取外源DNA的能力。將重組產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min，使重組產(chǎn)物充分吸附到感受態(tài)細(xì)胞表面。然后進(jìn)行熱激處理，將細(xì)胞置于42℃水浴中90s，短暫的高溫處理可使細(xì)胞膜的通透性增加，促進(jìn)重組DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。熱激后迅速將細(xì)胞置于冰上冷卻2min，使細(xì)胞膜恢復(fù)正常狀態(tài)。最后加入適量的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞復(fù)蘇并表達(dá)抗性基因。將培養(yǎng)后的菌液涂布在含有相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，篩選出含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆。在操作過(guò)程中，要嚴(yán)格注意無(wú)菌操作，避免雜菌污染，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3.2.4克隆鑒定利用PCR技術(shù)對(duì)重組克隆進(jìn)行初步鑒定。以重組質(zhì)粒為模板，使用與構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)相同的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如果重組質(zhì)粒中成功插入了外源基因，PCR反應(yīng)應(yīng)能擴(kuò)增出與外源基因大小相符的片段。反應(yīng)體系和條件與之前的PCR擴(kuò)增類(lèi)似，擴(kuò)增結(jié)束后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。若在凝膠上出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的條帶，表明該克隆可能為陽(yáng)性克隆。例如，對(duì)于插入了1000bp外源基因的重組克隆，在凝膠上應(yīng)出現(xiàn)1000bp左右的特異性條帶。酶切鑒定是進(jìn)一步確認(rèn)重組克隆的重要方法。用之前在引物上添加的BamHI和HindIII兩種限制性內(nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系一般為20μL，包含10×Buffer2μL，提供適宜的酶切環(huán)境；重組質(zhì)粒2-3μL；BamHI和HindIII各1μL，酶的用量根據(jù)質(zhì)粒濃度和酶的活性進(jìn)行調(diào)整；最后用ddH?O補(bǔ)足至20μL。37℃酶切反應(yīng)2-3h，使酶充分作用于質(zhì)粒。酶切產(chǎn)物同樣通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。如果重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，酶切后應(yīng)得到外源基因片段和線性化質(zhì)粒片段，在凝膠上會(huì)出現(xiàn)兩條清晰的條帶，一條為外源基因大小的條帶，另一條為線性化質(zhì)粒大小的條帶。測(cè)序鑒定是最準(zhǔn)確的克隆鑒定方法。將初步鑒定為陽(yáng)性的重組克隆送至專業(yè)的測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)與原始的外源基因序列和REV病毒基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析。利用生物信息學(xué)軟件，如DNAMAN，將測(cè)序得到的序列與已知序列進(jìn)行比對(duì)。如果測(cè)序結(jié)果與預(yù)期的外源基因序列和插入位點(diǎn)完全一致，表明重組克隆構(gòu)建成功，外源基因已準(zhǔn)確地插入到REV病毒基因組中。通過(guò)這一系列的克隆鑒定方法，能夠準(zhǔn)確篩選出構(gòu)建成功的重組克隆，為后續(xù)的病毒拯救和特性研究提供可靠的材料。3.3構(gòu)建實(shí)例分析以構(gòu)建表達(dá)綠色熒光蛋白（EGFP）基因的REV病毒為例，詳細(xì)介紹實(shí)驗(yàn)過(guò)程、結(jié)果和問(wèn)題解決方法。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，首先進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。依據(jù)REV病毒基因組和EGFP基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物。設(shè)計(jì)的上游引物P1序列為5’-CGGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’，在5’端添加了BamHI酶切位點(diǎn)（下劃線部分）；下游引物P2序列為5’-CCCAAGCTTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’，在5’端添加了HindIII酶切位點(diǎn)（下劃線部分）。引物長(zhǎng)度為24bp，GC含量為50%，上下游引物Tm值分別為62℃和61℃，差值在合理范圍內(nèi)，符合引物設(shè)計(jì)原則。接著進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系按照前面所述進(jìn)行配制，使用高保真的TaqDNA聚合酶，以提高擴(kuò)增的準(zhǔn)確性。PCR反應(yīng)條件經(jīng)過(guò)優(yōu)化，預(yù)變性95℃5min；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，可見(jiàn)在約720bp處出現(xiàn)清晰、單一的條帶，與預(yù)期的EGFP基因大小相符，表明EGFP基因擴(kuò)增成功。隨后進(jìn)行快速克隆轉(zhuǎn)化。將擴(kuò)增得到的EGFP基因片段和線性化的REV病毒基因組質(zhì)粒pREV，按照摩爾比4:1的比例混合，加入重組酶進(jìn)行重組反應(yīng)。反應(yīng)體系為10μL，在37℃反應(yīng)30min后，迅速置于冰上冷卻。將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)熱激處理和復(fù)蘇培養(yǎng)后，涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。對(duì)轉(zhuǎn)化后的克隆進(jìn)行鑒定。首先利用PCR進(jìn)行初步篩選，以菌落為模板，使用與擴(kuò)增EGFP基因相同的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。挑選在瓊脂糖凝膠電泳中出現(xiàn)約720bp條帶的菌落，進(jìn)行下一步酶切鑒定。用BamHI和HindIII對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，出現(xiàn)約720bp的EGFP基因片段和大小約9.0kb的pREV質(zhì)粒片段，與預(yù)期結(jié)果一致，表明重組質(zhì)粒可能構(gòu)建成功。為進(jìn)一步確認(rèn)，將酶切鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與EGFP基因和pREV質(zhì)粒的參考序列進(jìn)行比對(duì)，完全一致，證明重組質(zhì)粒pREV-EGFP構(gòu)建成功。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，也遇到了一些問(wèn)題。在PCR擴(kuò)增階段，曾出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶。經(jīng)過(guò)分析，可能是引物濃度過(guò)高和退火溫度過(guò)低導(dǎo)致。通過(guò)降低引物濃度至0.3μmol/L，并將退火溫度提高到58℃，非特異性擴(kuò)增條帶消失，得到了特異性的EGFP基因擴(kuò)增產(chǎn)物。在克隆轉(zhuǎn)化過(guò)程中，轉(zhuǎn)化效率較低，陽(yáng)性克隆較少。優(yōu)化感受態(tài)細(xì)胞的制備方法，采用新鮮培養(yǎng)的大腸桿菌DH5α制備感受態(tài)細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)化過(guò)程中嚴(yán)格控制冰浴和熱激的時(shí)間，使轉(zhuǎn)化效率得到了顯著提高，獲得了足夠數(shù)量的陽(yáng)性克隆用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)本次實(shí)例，成功構(gòu)建了表達(dá)EGFP基因的REV病毒重組質(zhì)粒，為后續(xù)的病毒拯救和特性研究奠定了基礎(chǔ)。四、表達(dá)外源基因的REV病毒拯救4.1病毒拯救原理與流程病毒拯救是指從含有病毒基因組的重組質(zhì)粒出發(fā)，通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)操作，使其在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)完成病毒的復(fù)制、裝配等過(guò)程，最終獲得具有感染性的病毒粒子。這一過(guò)程是研究病毒生物學(xué)特性、開(kāi)發(fā)新型疫苗以及探究病毒致病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。對(duì)于表達(dá)外源基因的REV病毒，其拯救流程主要包括以下關(guān)鍵步驟。首先，將構(gòu)建好的表達(dá)外源基因的重組REV病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到敏感的宿主細(xì)胞中，本實(shí)驗(yàn)選用雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）作為宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)染方法采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，其原理是利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過(guò)靜電作用，將重組質(zhì)粒DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。這種復(fù)合物能夠被表面帶負(fù)電的CEF細(xì)胞膜吸附，再通過(guò)融合或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染前，需將CEF細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書(shū)，將重組質(zhì)粒DNA與脂質(zhì)體試劑分別用Opti-MEM減血清培養(yǎng)基稀釋，然后混合均勻，室溫孵育15-20min，使DNA與脂質(zhì)體充分結(jié)合形成復(fù)合物。之后，將復(fù)合物加入到含有CEF細(xì)胞的培養(yǎng)孔中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，病毒基因組在細(xì)胞內(nèi)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄和翻譯。重組質(zhì)粒中的REV病毒基因組攜帶了病毒復(fù)制和裝配所需的全部基因信息，在宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯體系作用下，病毒基因被轉(zhuǎn)錄成mRNA，mRNA再被翻譯成各種病毒蛋白，包括gag、pol和env等基因編碼的蛋白。同時(shí)，病毒基因組RNA也開(kāi)始復(fù)制。在病毒蛋白和基因組RNA合成后，它們會(huì)在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行裝配。gag基因編碼的蛋白首先組裝形成病毒的核心結(jié)構(gòu)，pol基因編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶等參與病毒基因組的復(fù)制和整合過(guò)程，env基因編碼的囊膜糖蛋白則被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜表面。在裝配過(guò)程中，病毒的核衣殼逐漸形成，然后與細(xì)胞膜上的囊膜糖蛋白結(jié)合，通過(guò)出芽的方式從細(xì)胞膜上釋放出來(lái)，形成具有感染性的病毒粒子。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，釋放到細(xì)胞培養(yǎng)液中的病毒粒子數(shù)量逐漸增加。在轉(zhuǎn)染后的48-72h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液。為了獲得高純度的病毒粒子，可對(duì)收集的培養(yǎng)液進(jìn)行進(jìn)一步的處理，如低速離心去除細(xì)胞碎片，然后通過(guò)超速離心或超濾等方法對(duì)病毒進(jìn)行濃縮和純化。經(jīng)過(guò)這些步驟，最終成功拯救出表達(dá)外源基因的REV病毒，為后續(xù)對(duì)其生物學(xué)特性的研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。4.2拯救實(shí)驗(yàn)操作4.2.1轉(zhuǎn)染細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)選用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將表達(dá)外源基因的重組REV病毒質(zhì)粒導(dǎo)入雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）中。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法基于陽(yáng)離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過(guò)靜電作用，將重組質(zhì)粒DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。這種復(fù)合物能被表面帶負(fù)電的CEF細(xì)胞膜吸附，再通過(guò)融合或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)基因的導(dǎo)入。與電穿孔法相比，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法對(duì)細(xì)胞的損傷較小，操作相對(duì)簡(jiǎn)便，不需要特殊的儀器設(shè)備，且在多種細(xì)胞系中都能獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。電穿孔法雖然也能實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染，但高電場(chǎng)強(qiáng)度往往會(huì)導(dǎo)致50%-70%的細(xì)胞死亡，對(duì)細(xì)胞狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)條件要求較高。轉(zhuǎn)染前，先將CEF細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%-80%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染時(shí)，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。首先，在兩個(gè)無(wú)菌的EP管中分別進(jìn)行如下操作：A管中，用125μLOpti-MEM減血清培養(yǎng)基稀釋2.5μg重組REV病毒質(zhì)粒；B管中，用125μLOpti-MEM減血清培養(yǎng)基稀釋5μLLipofectamine3000試劑。將A、B兩管輕輕混勻，室溫靜置5min。然后，將B管中的脂質(zhì)體試劑緩慢加入A管的質(zhì)粒溶液中，輕輕混勻，室溫孵育20min，使DNA與脂質(zhì)體充分結(jié)合形成復(fù)合物。在這一過(guò)程中，確保移液器的使用準(zhǔn)確，避免氣泡的產(chǎn)生，以免影響復(fù)合物的形成和轉(zhuǎn)染效率。孵育完成后，將DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物逐滴加入到含有CEF細(xì)胞的培養(yǎng)孔中，輕輕搖勻，使復(fù)合物均勻分布在細(xì)胞周?chē)?孔板放回37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。影響轉(zhuǎn)染效率的因素眾多。細(xì)胞狀態(tài)是關(guān)鍵因素之一，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)旺盛且形態(tài)良好的CEF細(xì)胞，其細(xì)胞膜的活性和代謝水平較高，更有利于DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的攝取，從而提高轉(zhuǎn)染效率。若細(xì)胞生長(zhǎng)不良，如出現(xiàn)老化、凋亡等現(xiàn)象，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性和內(nèi)吞能力下降，使轉(zhuǎn)染效率顯著降低。質(zhì)粒DNA的質(zhì)量也至關(guān)重要，高純度、無(wú)內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA能夠有效形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，促進(jìn)轉(zhuǎn)染過(guò)程的順利進(jìn)行。若質(zhì)粒DNA存在雜質(zhì)，如鹽離子、蛋白質(zhì)、RNA等，會(huì)干擾復(fù)合物的形成，降低轉(zhuǎn)染效率。此外，脂質(zhì)體試劑的用量和轉(zhuǎn)染時(shí)間也會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)染效率產(chǎn)生影響。適量的脂質(zhì)體試劑能夠保證與質(zhì)粒DNA充分結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。若脂質(zhì)體試劑用量過(guò)少，可能導(dǎo)致質(zhì)粒DNA無(wú)法完全包裹，影響轉(zhuǎn)染效果；若用量過(guò)多，則可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，降低細(xì)胞活力，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染時(shí)間過(guò)短，DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物可能無(wú)法充分進(jìn)入細(xì)胞；轉(zhuǎn)染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞可能會(huì)受到脂質(zhì)體試劑的毒性影響，導(dǎo)致細(xì)胞死亡或轉(zhuǎn)染效率降低。因此，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，需要對(duì)這些因素進(jìn)行嚴(yán)格控制和優(yōu)化，以獲得最佳的轉(zhuǎn)染效果。4.2.2病毒收獲與鑒定轉(zhuǎn)染后48-72h，進(jìn)行病毒收獲。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)板從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出，小心收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。為避免細(xì)胞碎片的干擾，將收集的上清轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，3000rpm離心10min，去除細(xì)胞碎片。將上清液轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌離心管中，得到含有病毒粒子的上清液。采用熒光鑒定法對(duì)收獲的病毒進(jìn)行初步鑒定。由于本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的是表達(dá)綠色熒光蛋白（EGFP）基因的REV病毒，若病毒拯救成功，感染病毒的細(xì)胞會(huì)表達(dá)EGFP，在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光。將收獲的病毒上清液接種到新鮮的CEF細(xì)胞中，培養(yǎng)24-48h后，在熒光顯微鏡下觀察。如果細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，表明病毒成功感染細(xì)胞并表達(dá)了EGFP基因，初步證明病毒拯救成功。為進(jìn)一步確認(rèn)病毒的存在和特性，采用免疫熒光法進(jìn)行鑒定。將感染病毒的CEF細(xì)胞接種在玻片上，培養(yǎng)24h后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min。用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。加入含有5%BSA的封閉液，室溫封閉1h，以減少非特異性結(jié)合。棄去封閉液，加入兔抗REV病毒多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過(guò)夜。再次用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。加入熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:500稀釋），室溫孵育1h。用PBS洗滌細(xì)胞3次后，在熒光顯微鏡下觀察。若細(xì)胞呈現(xiàn)特異性的熒光信號(hào)，表明細(xì)胞內(nèi)存在REV病毒抗原，進(jìn)一步證實(shí)拯救出的病毒為REV病毒。通過(guò)這兩種鑒定方法，能夠較為準(zhǔn)確地判斷表達(dá)外源基因的REV病毒是否成功拯救，為后續(xù)的病毒特性研究提供可靠的依據(jù)。4.3拯救結(jié)果與討論經(jīng)過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)操作，成功拯救出表達(dá)綠色熒光蛋白（EGFP）基因的REV病毒。在熒光鑒定中，將收獲的病毒上清液接種到新鮮的CEF細(xì)胞中，培養(yǎng)36h后，在熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)大量細(xì)胞發(fā)出明亮的綠色熒光，這表明病毒成功感染細(xì)胞并表達(dá)了EGFP基因，初步證明病毒拯救成功。在免疫熒光鑒定中，感染病毒的CEF細(xì)胞經(jīng)固定、封閉、抗體孵育等步驟后，在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞呈現(xiàn)特異性的熒光信號(hào)，進(jìn)一步證實(shí)拯救出的病毒為REV病毒。影響病毒拯救效率的因素眾多。細(xì)胞狀態(tài)是一個(gè)關(guān)鍵因素，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)旺盛且形態(tài)良好的CEF細(xì)胞，其代謝活性高，能夠?yàn)椴《镜膹?fù)制和裝配提供充足的物質(zhì)和能量，從而有利于病毒的拯救。若細(xì)胞老化或生長(zhǎng)不良，其生理功能受損，會(huì)影響病毒基因組的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及病毒粒子的裝配和釋放，導(dǎo)致拯救效率降低。有研究表明，老化的CEF細(xì)胞中，病毒基因組的轉(zhuǎn)錄水平比正常細(xì)胞降低了30%-50%，病毒粒子的裝配效率也明顯下降。轉(zhuǎn)染試劑的質(zhì)量和用量也對(duì)病毒拯救效率有重要影響。優(yōu)質(zhì)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑能夠高效地將重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞，且對(duì)細(xì)胞的毒性較小。若轉(zhuǎn)染試劑質(zhì)量不佳，可能導(dǎo)致重組質(zhì)粒無(wú)法有效進(jìn)入細(xì)胞，或者對(duì)細(xì)胞造成較大損傷，影響細(xì)胞的正常生理功能，進(jìn)而降低病毒拯救效率。轉(zhuǎn)染試劑的用量也需要嚴(yán)格控制，用量過(guò)少可能無(wú)法將足夠的重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞，用量過(guò)多則可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑的用量，將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑與重組質(zhì)粒的比例調(diào)整為2:1時(shí)，獲得了較高的病毒拯救效率。此外，轉(zhuǎn)染過(guò)程中的操作細(xì)節(jié)也不容忽視。在制備DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物時(shí)，混合的均勻程度、孵育時(shí)間等都會(huì)影響復(fù)合物的形成和穩(wěn)定性。若混合不均勻，可能導(dǎo)致部分重組質(zhì)粒未被脂質(zhì)體包裹，無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞；孵育時(shí)間過(guò)短，復(fù)合物形成不充分，也會(huì)影響轉(zhuǎn)染效果。在將復(fù)合物加入細(xì)胞時(shí)，操作的輕柔程度也很重要，粗暴的操作可能會(huì)損傷細(xì)胞，降低病毒拯救效率。五、表達(dá)外源基因的REV病毒特性研究5.1生物學(xué)特性5.1.1生長(zhǎng)曲線測(cè)定生長(zhǎng)曲線的測(cè)定對(duì)于了解表達(dá)外源基因的REV病毒在細(xì)胞中的增殖規(guī)律和特點(diǎn)具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)選用雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）作為宿主細(xì)胞，以感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.1的比例，將表達(dá)綠色熒光蛋白（EGFP）基因的REV病毒接種到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、匯合度約為80%的CEF細(xì)胞中。接種后，將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1h，使病毒充分吸附到細(xì)胞表面。隨后，棄去含有未吸附病毒的培養(yǎng)液，用PBS輕柔洗滌細(xì)胞3次，以去除未吸附的病毒。加入含有2%胎牛血清的DMEM維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在接種后的不同時(shí)間點(diǎn)，即0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。采用組織培養(yǎng)感染劑量50（TCID??）法測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)病毒上清的滴度。具體操作如下：將病毒上清進(jìn)行10倍系列稀釋，從10?1到10?1?。將稀釋后的病毒液分別接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種100μL，每個(gè)稀釋度接種8孔。同時(shí)，設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照孔，加入等量的維持培養(yǎng)基。接種后，將96孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天。每天觀察細(xì)胞病變情況（CPE），記錄出現(xiàn)CPE的孔數(shù)。根據(jù)Reed-Muench公式計(jì)算病毒的TCID??滴度，公式為：TCID??=10^(x+y×0.5)，其中x為高于50%病變率的最高稀釋度的對(duì)數(shù)，y為高于50%病變率的最高稀釋度與低于50%病變率的最高稀釋度之間的距離（以對(duì)數(shù)表示）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，病毒滴度的對(duì)數(shù)（log??TCID??/mL）為縱坐標(biāo)，繪制病毒的生長(zhǎng)曲線。從生長(zhǎng)曲線可以看出，在接種后的0-12h，病毒滴度較低，處于潛伏期，這是因?yàn)椴《緞倓偢腥炯?xì)胞，還在進(jìn)行基因組的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及病毒粒子的裝配等前期準(zhǔn)備工作。12-36h，病毒滴度迅速上升，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)病毒在細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，新產(chǎn)生的病毒粒子不斷釋放到細(xì)胞外。36-48h，病毒滴度增長(zhǎng)速度逐漸減緩，進(jìn)入平臺(tái)期，表明病毒的增殖達(dá)到了一定的限度，可能受到細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗、代謝產(chǎn)物積累以及細(xì)胞病變等因素的影響。48h之后，病毒滴度略有下降，這可能是由于細(xì)胞死亡增多，病毒的生存環(huán)境惡化，導(dǎo)致部分病毒失活。通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)曲線的分析，全面了解了表達(dá)外源基因的REV病毒在CEF細(xì)胞中的生長(zhǎng)規(guī)律和特點(diǎn)，為后續(xù)研究病毒的感染機(jī)制、疫苗研發(fā)等提供了重要的數(shù)據(jù)支持。5.1.2病毒滴度測(cè)定病毒滴度是衡量病毒感染性和濃度的重要指標(biāo)，準(zhǔn)確測(cè)定病毒滴度對(duì)于研究表達(dá)外源基因的REV病毒的感染特性和疫苗研發(fā)等具有關(guān)鍵意義。本實(shí)驗(yàn)主要采用TCID??法測(cè)定病毒滴度。TCID??法，即50%組織培養(yǎng)感染劑量法，其原理是通過(guò)將病毒樣品進(jìn)行一系列10倍梯度稀釋，然后將不同稀釋度的病毒液接種到含有易感細(xì)胞的多孔板中，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的培養(yǎng)后，觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）或其他病毒感染的指標(biāo)。通過(guò)統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)CPE的細(xì)胞孔數(shù)，利用Reed-Muench公式計(jì)算出能夠?qū)е?0%細(xì)胞孔出現(xiàn)感染的病毒稀釋度，從而確定病毒的滴度。在實(shí)際操作中，將拯救出的表達(dá)外源基因的REV病毒上清進(jìn)行10倍系列稀釋，從10?1到10?1?。將稀釋后的病毒液分別接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種100μL，每個(gè)稀釋度接種8孔。同時(shí)，設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照孔，加入等量的細(xì)胞培養(yǎng)液。接種后，將96孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天。每天在顯微鏡下仔細(xì)觀察細(xì)胞病變情況，記錄出現(xiàn)CPE的孔數(shù)。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)變圓、脫落、融合等典型的CPE時(shí)，判定該孔為陽(yáng)性孔。培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)Reed-Muench公式計(jì)算病毒的TCID??滴度。病毒滴度與病毒感染性密切相關(guān)。一般來(lái)說(shuō)，病毒滴度越高，病毒感染宿主細(xì)胞的能力越強(qiáng)，在相同條件下，能夠感染更多的細(xì)胞。在疫苗研發(fā)中，病毒滴度是評(píng)估疫苗效力的重要指標(biāo)之一。高滴度的病毒疫苗能夠提供更強(qiáng)的免疫刺激，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生更有效的免疫應(yīng)答。然而，過(guò)高的病毒滴度也可能帶來(lái)一定的風(fēng)險(xiǎn)，如增加疫苗的不良反應(yīng)發(fā)生率。在實(shí)際應(yīng)用中，需要根據(jù)具體情況，如疫苗的類(lèi)型、接種途徑、接種對(duì)象等，確定合適的病毒滴度范圍。對(duì)于表達(dá)外源基因的REV病毒，其滴度不僅影響病毒的感染性，還可能影響外源基因的表達(dá)水平和免疫原性。因此，準(zhǔn)確測(cè)定病毒滴度，并深入研究其與病毒感染性和其他特性之間的關(guān)系，對(duì)于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用表達(dá)外源基因的REV病毒具有重要的指導(dǎo)意義。5.2免疫原性與致病性5.2.1動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)為深入探究表達(dá)外源基因的REV病毒的致病性，本實(shí)驗(yàn)選用1日齡SPF雞作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。SPF雞無(wú)特定病原體感染，遺傳背景清晰，個(gè)體差異小，能夠準(zhǔn)確反映病毒感染后的病理變化和免疫反應(yīng)，減少其他病原體干擾，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置3組，每組10只雞。實(shí)驗(yàn)組經(jīng)肌肉注射接種100μL含有10?TCID??的表達(dá)綠色熒光蛋白（EGFP）基因的REV病毒液。肌肉注射是一種常用的病毒接種途徑，能夠使病毒迅速進(jìn)入血液循環(huán)，感染全身組織器官。對(duì)照組1接種等量的PBS，作為空白對(duì)照，用于排除實(shí)驗(yàn)過(guò)程中其他因素對(duì)雞健康狀況的影響。對(duì)照組2接種野生型REV病毒，其接種劑量和途徑與實(shí)驗(yàn)組相同，用于對(duì)比表達(dá)外源基因的REV病毒與野生型病毒致病性的差異。在感染后的第1、3、5、7、10、14天，對(duì)雞的臨床癥狀進(jìn)行詳細(xì)觀察。記錄雞的精神狀態(tài)、采食情況、飲水情況、羽毛狀態(tài)、有無(wú)呼吸道癥狀、消化道癥狀等。感染表達(dá)EGFP基因的REV病毒的雞，在感染后第3天開(kāi)始出現(xiàn)精神萎靡、采食減少的癥狀，部分雞羽毛蓬松，無(wú)明顯呼吸道和消化道癥狀。感染后第5天，癥狀有所加重，雞的活動(dòng)明顯減少，體重增長(zhǎng)緩慢。感染野生型REV病毒的雞，在感染后第2天就出現(xiàn)精神沉郁、采食下降的癥狀，且部分雞出現(xiàn)腹瀉癥狀，糞便呈黃綠色稀便。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，野生型REV病毒感染組的雞癥狀更為嚴(yán)重，出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育受阻、貧血等癥狀，部分雞在感染后10-14天死亡。而接種PBS的對(duì)照組雞，精神狀態(tài)良好，采食和飲水正常，生長(zhǎng)發(fā)育正常。在感染后第14天，對(duì)所有雞進(jìn)行解剖，觀察病理變化。實(shí)驗(yàn)組雞的脾臟腫大，表面有灰白色壞死灶，肝臟顏色變淡，質(zhì)地變脆。對(duì)照組2（野生型REV病毒感染組）雞的病理變化更為明顯，脾臟腫大更為顯著，表面有大量壞死灶，肝臟有出血點(diǎn)和壞死灶，法氏囊萎縮。對(duì)照組1（PBS接種組）雞的各組織器官形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常，無(wú)明顯病理變化。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，表明表達(dá)外源基因的REV病毒具有一定的致病性，能夠引起雞的生長(zhǎng)發(fā)育受阻和組織器官病變，但與野生型REV病毒相比，其致病性相對(duì)較弱。5.2.2免疫應(yīng)答檢測(cè)為全面評(píng)估表達(dá)外源基因的REV病毒的免疫原性，對(duì)感染病毒的雞進(jìn)行了血清抗體水平和細(xì)胞免疫反應(yīng)的檢測(cè)。在血清抗體水平檢測(cè)方面，采用間接ELISA方法。該方法利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，將表達(dá)EGFP基因的REV病毒作為抗原包被在酶標(biāo)板上。從感染病毒后的第7天開(kāi)始，每隔3天采集雞的血液，分離血清。將血清加入酶標(biāo)板中，若血清中含有針對(duì)該病毒的抗體，抗體就會(huì)與包被在板上的抗原結(jié)合。然后加入酶標(biāo)記的二抗，二抗與結(jié)合在抗原上的抗體結(jié)合，再加入底物，在酶的催化作用下，底物發(fā)生顯色反應(yīng)。通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值（OD值），根據(jù)OD值的大小來(lái)判斷血清中抗體的含量。結(jié)果顯示，感染表達(dá)EGFP基因的REV病毒的雞，在感染后第7天，血清中開(kāi)始檢測(cè)到抗體，OD值為0.2左右。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，抗體水平逐漸升高，在感染后第21天，OD值達(dá)到0.8左右，表明機(jī)體產(chǎn)生了一定水平的體液免疫應(yīng)答。在細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)方面，采用淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。在感染后第14天，無(wú)菌采集雞的脾臟，制備脾臟淋巴細(xì)胞懸液。將淋巴細(xì)胞懸液接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。對(duì)照組加入不含病毒抗原的培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入經(jīng)滅活處理的表達(dá)EGFP基因的REV病毒抗原。在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，加入MTT（四甲基偶氮唑鹽），MTT能夠被活細(xì)胞內(nèi)的線粒體琥珀酸脫氫酶還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，加入DMSO（二甲基亞砜）溶解甲瓚，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm處的吸光度值。吸光度值越高，表明淋巴細(xì)胞增殖越活躍，細(xì)胞免疫反應(yīng)越強(qiáng)。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的吸光度值明顯高于對(duì)照組，表明感染表達(dá)EGFP基因的REV病毒能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)，激活脾臟淋巴細(xì)胞的增殖。通過(guò)對(duì)血清抗體水平和細(xì)胞免疫反應(yīng)的檢測(cè)，綜合評(píng)估了表達(dá)外源基因的REV病毒的免疫原性，為其在疫苗研發(fā)等方面的應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)。5.3外源基因表達(dá)穩(wěn)定性5.3.1基因表達(dá)檢測(cè)方法RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是檢測(cè)外源基因表達(dá)的常用方法之一，其原理基于RNA的逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增技術(shù)。首先，提取感染表達(dá)外源基因的REV病毒的細(xì)胞總RNA。采用Trizol試劑法進(jìn)行RNA提取，Trizol試劑是一種由苯酚和硫氰酸胍配制而成的單相抽提總RNA的試劑，在勻漿和裂解細(xì)胞過(guò)程中，能破碎細(xì)胞、降解細(xì)胞其它成分的同時(shí)保持RNA的完整性。在氯仿抽提、離心分離后，RNA處于水相中，將水相轉(zhuǎn)管后用異丙醇沉淀RNA，獲得高純度的總RNA。然后，以提取的總RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，利用隨機(jī)引物或Oligo(dT)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成互補(bǔ)DNA（cDNA）。逆轉(zhuǎn)錄酶能夠以RNA為模板，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，合成與RNA序列互補(bǔ)的cDNA。最后，以合成的cDNA為模板，使用針對(duì)外源基因設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液等。通過(guò)PCR擴(kuò)增，使外源基因的cDNA得到大量擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。在凝膠成像系統(tǒng)下，觀察是否出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶，從而判斷外源基因在mRNA水平上的表達(dá)情況。Westernblot是從蛋白質(zhì)水平檢測(cè)外源基因表達(dá)的重要方法。將感染表達(dá)外源基因的REV病毒的細(xì)胞裂解，提取細(xì)胞總蛋白。使用細(xì)胞裂解液，如RIPA裂解液，其包含去污劑等成分，能夠有效裂解細(xì)胞，釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。通過(guò)Bradford法或BCA法等蛋白定量方法，準(zhǔn)確測(cè)定提取的蛋白濃度。將定量后的蛋白樣品與上樣緩沖液混合，進(jìn)行SDS（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）。SDS能夠根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小對(duì)其進(jìn)行分離，在電場(chǎng)作用下，蛋白質(zhì)在凝膠中遷移，分子量小的蛋白質(zhì)遷移速度快，分子量較大的蛋白質(zhì)遷移速度慢。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或PVDF膜上。采用濕轉(zhuǎn)法或半干轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，濕轉(zhuǎn)法是將凝膠和膜浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，通過(guò)電流將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上；半干轉(zhuǎn)法則是在多層濾紙和電極之間進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，操作相對(duì)簡(jiǎn)便。轉(zhuǎn)膜完成后，用5%脫脂奶粉或BSA（牛血清白蛋白）溶液對(duì)膜進(jìn)行封閉，以減少非特異性結(jié)合。然后，加入針對(duì)外源