Rho激酶抑制劑Fasudil：大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的救星？一、引言1.1研究背景與意義1.1.1視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷概述視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷（RetinalIschemia-ReperfusionInjury，RIRI）是一種常見且危害嚴(yán)重的眼科病理生理過程。它指的是視網(wǎng)膜組織在經(jīng)歷一段時(shí)間的缺血后，恢復(fù)血流供應(yīng)時(shí)反而出現(xiàn)進(jìn)一步損傷的現(xiàn)象。正常情況下，視網(wǎng)膜依靠充足的血液供應(yīng)來維持其正常的生理功能，包括提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，帶走代謝廢物等。一旦視網(wǎng)膜血液循環(huán)因各種原因發(fā)生障礙，就會(huì)引發(fā)缺血狀態(tài)，若后續(xù)血流得以恢復(fù)，卻可能觸發(fā)一系列復(fù)雜的損傷機(jī)制，導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織的結(jié)構(gòu)和功能受損。其常見病因較為多樣，青光眼急性發(fā)作是其中之一。在青光眼急性發(fā)作時(shí)，眼內(nèi)壓會(huì)急劇升高，這會(huì)對(duì)視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈等血管產(chǎn)生壓迫，阻礙血液流入視網(wǎng)膜，造成視網(wǎng)膜缺血。當(dāng)經(jīng)過治療使眼內(nèi)壓降低，血流恢復(fù)后，就可能出現(xiàn)缺血再灌注損傷。視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈阻塞也是引發(fā)該損傷的重要原因，動(dòng)脈阻塞會(huì)直接切斷視網(wǎng)膜的血液來源，引發(fā)缺血，而后續(xù)血管再通或側(cè)支循環(huán)建立恢復(fù)血流時(shí)，便容易引發(fā)損傷。此外，一些眼部手術(shù)、全身性血管疾病（如糖尿病視網(wǎng)膜病變、高血壓性視網(wǎng)膜病變等導(dǎo)致的血管病變）也可能導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷。視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷對(duì)視力的危害極其嚴(yán)重，是導(dǎo)致視力損害和失明的主要原因之一。由于視網(wǎng)膜是視覺形成的關(guān)鍵部位，其中包含了大量對(duì)視覺信號(hào)處理和傳遞至關(guān)重要的細(xì)胞，如視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、光感受器細(xì)胞等。一旦這些細(xì)胞因缺血再灌注損傷而受損或死亡，就會(huì)嚴(yán)重影響視覺信號(hào)的傳導(dǎo)和處理，導(dǎo)致視力下降、視物變形、視野缺損等癥狀，甚至完全失明，給患者的生活質(zhì)量帶來極大的負(fù)面影響，也給社會(huì)和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。在眼科疾病中，視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷占據(jù)著重要地位，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，且目前的治療手段仍存在諸多局限性，因此深入研究其發(fā)病機(jī)制和尋找有效的治療方法具有迫切的臨床需求。1.1.2Rho激酶及Fasudil相關(guān)研究現(xiàn)狀Rho激酶（Rho-associatedcoiled-coilformingproteinkinase，ROCK）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞生物學(xué)過程中發(fā)揮著廣泛而關(guān)鍵的作用。它是RhoGTP酶下游的重要效應(yīng)分子，RhoGTP酶激活后能夠結(jié)合并激活Rho激酶，從而引發(fā)一系列的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。在細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)方面，Rho激酶通過磷酸化肌球蛋白輕鏈磷酸酶（MLCP）的調(diào)節(jié)亞基，抑制其活性，使肌球蛋白輕鏈磷酸化水平升高，進(jìn)而增強(qiáng)肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白的相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞骨架的重組和收縮。這種調(diào)節(jié)作用在細(xì)胞的形態(tài)維持、遷移、增殖等過程中都至關(guān)重要。例如，在細(xì)胞遷移過程中，Rho激酶的激活能夠促使細(xì)胞前端的偽足形成和后端的收縮，從而推動(dòng)細(xì)胞的移動(dòng)。在細(xì)胞增殖方面，Rho激酶參與調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，影響細(xì)胞的分裂和增殖能力。此外，Rho激酶還在炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等病理生理過程中發(fā)揮重要作用，它可以調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的黏附、遷移和活化，促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放，同時(shí)也參與氧化應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控，影響細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生和清除。Rho激酶抑制劑Fasudil（法舒地爾），化學(xué)名為六氫-1-(5-異喹啉磺酰基)-1H-1,4-二氮雜卓，是最早應(yīng)用于臨床的Rho激酶抑制劑之一。其作用機(jī)制主要是通過選擇性地抑制Rho激酶的活性，阻斷Rho激酶介導(dǎo)的信號(hào)通路，從而發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。在心血管系統(tǒng)疾病的治療研究中，F(xiàn)asudil展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。例如，在高血壓的治療中，它可以通過舒張血管平滑肌，降低血管阻力，從而降低血壓。其作用機(jī)制是抑制Rho激酶對(duì)肌球蛋白輕鏈的磷酸化作用，使血管平滑肌舒張，血管擴(kuò)張。在冠心病和心肌梗死的治療研究中，F(xiàn)asudil能夠減少心肌缺血再灌注損傷，保護(hù)心肌細(xì)胞。它可以通過抑制炎癥反應(yīng)、減少氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等機(jī)制，改善心肌的功能和預(yù)后。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面，F(xiàn)asudil也被研究用于治療缺血性腦卒中、多發(fā)性硬化癥等。在缺血性腦卒中的研究中，F(xiàn)asudil能夠減輕腦缺血再灌注損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。它可以通過抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡、減輕炎癥反應(yīng)、改善腦微循環(huán)等作用，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。然而，在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的治療研究方面，雖然已經(jīng)認(rèn)識(shí)到Rho激酶信號(hào)通路在其中可能發(fā)揮重要作用，但相關(guān)研究仍相對(duì)較少。目前對(duì)于Fasudil在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中的具體作用機(jī)制、最佳治療劑量和時(shí)機(jī)等方面還缺乏深入的了解，這也凸顯了進(jìn)一步開展相關(guān)研究的必要性。1.1.3研究意義本研究旨在探討Rho激酶抑制劑Fasudil對(duì)大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，具有重要的理論和實(shí)踐意義。在理論方面，深入研究Fasudil對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制。目前，雖然已經(jīng)知道視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多種病理生理過程，但具體的分子機(jī)制仍不完全清楚。Rho激酶信號(hào)通路在這些過程中可能扮演著關(guān)鍵角色，通過研究Fasudil對(duì)該信號(hào)通路的影響，以及對(duì)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等相關(guān)指標(biāo)的調(diào)控作用，可以更深入地了解視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制，為后續(xù)的研究提供新的理論依據(jù)。在實(shí)踐方面，本研究的成果有望為視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的臨床治療提供新的策略和方法。目前臨床上對(duì)于視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的治療手段有限，主要包括藥物治療、激光治療和手術(shù)治療等，但這些治療方法都存在一定的局限性，治療效果往往不盡如人意。如果能夠證實(shí)Fasudil對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷具有顯著的保護(hù)作用，那么它可能成為一種新的治療藥物應(yīng)用于臨床，為患者提供更多的治療選擇，改善患者的視力預(yù)后，提高患者的生活質(zhì)量。同時(shí)，本研究也為進(jìn)一步研發(fā)針對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的新型治療藥物提供了思路和方向，有助于推動(dòng)眼科領(lǐng)域的臨床治療水平的提高。1.2研究目的與內(nèi)容1.2.1研究目的本研究旨在深入探究Rho激酶抑制劑Fasudil對(duì)大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其潛在機(jī)制。通過建立大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型，給予不同劑量的Fasudil進(jìn)行干預(yù)，觀察視網(wǎng)膜組織的形態(tài)學(xué)變化、功能指標(biāo)的改變以及相關(guān)信號(hào)通路分子的表達(dá)水平，明確Fasudil對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護(hù)效果，為臨床治療視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷提供新的理論依據(jù)和治療策略。具體而言，本研究期望回答以下問題：Fasudil能否減輕大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后的組織形態(tài)學(xué)損傷？Fasudil對(duì)視網(wǎng)膜功能指標(biāo)如視網(wǎng)膜電圖（ERG）有何影響？Fasudil發(fā)揮保護(hù)作用的潛在機(jī)制是什么，是否通過調(diào)節(jié)Rho激酶信號(hào)通路以及相關(guān)的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等途徑來實(shí)現(xiàn)？1.2.2研究內(nèi)容大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型的建立：選取健康成年SD大鼠，采用經(jīng)典的升高眼內(nèi)壓法建立視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型。具體操作如下，將大鼠用10%水合氯醛（0.3ml/100g體重）腹腔注射麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，用活力碘溶液對(duì)右眼進(jìn)行消毒，然后用一次性靜脈輸液器針頭由鞏膜刺入至玻璃體中后部，通過調(diào)節(jié)輸液器流量使眼內(nèi)壓升高至一定水平（一般為眼壓計(jì)測(cè)量值高于正常眼壓2-3倍），持續(xù)一段時(shí)間（如45分鐘）后，拔出針頭，恢復(fù)視網(wǎng)膜血流，從而實(shí)現(xiàn)缺血再灌注損傷。通過眼底鏡觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)、顏色變化以及視網(wǎng)膜組織的形態(tài)改變，結(jié)合組織學(xué)檢查（如蘇木精-伊紅染色），確認(rèn)模型建立的成功性和穩(wěn)定性。Fasudil干預(yù)方案的制定：將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、Fasudil低劑量組、Fasudil中劑量組和Fasudil高劑量組。正常對(duì)照組不進(jìn)行任何處理；模型組僅建立視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型，不給予Fasudil干預(yù)；Fasudil低、中、高劑量組在建立模型后，分別給予不同劑量的Fasudil進(jìn)行腹腔注射（如低劑量組給予5mg/kg，中劑量組給予10mg/kg，高劑量組給予20mg/kg），每天一次，連續(xù)給藥一定天數(shù)（如7天）。在給藥過程中，密切觀察大鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等，記錄可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)。視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)觀察：在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速摘取大鼠眼球，將其固定于4%多聚甲醛溶液中，經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋等一系列處理后，制作視網(wǎng)膜石蠟切片。采用蘇木精-伊紅（HE）染色法對(duì)切片進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)的完整性，包括神經(jīng)纖維層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層、外核層和光感受器層等，測(cè)量各層厚度并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較不同組之間視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)的差異。同時(shí)，利用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)視網(wǎng)膜中特定細(xì)胞標(biāo)志物（如神經(jīng)節(jié)細(xì)胞標(biāo)志物Brn-3a、光感受器細(xì)胞標(biāo)志物視紫紅質(zhì)等）的表達(dá)情況，進(jìn)一步評(píng)估視網(wǎng)膜細(xì)胞的損傷程度。視網(wǎng)膜功能指標(biāo)檢測(cè)：采用視網(wǎng)膜電圖（ERG）技術(shù)檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜的功能。在暗適應(yīng)環(huán)境下，將大鼠用1%托吡卡胺滴眼液散瞳后，置于全視野刺激器前，記錄不同刺激強(qiáng)度下的ERG波形，包括a波、b波和振蕩電位（OPs）等。a波主要反映光感受器細(xì)胞的功能，b波反映雙極細(xì)胞和Müller細(xì)胞的功能，OPs則與視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元的活動(dòng)和視網(wǎng)膜微循環(huán)密切相關(guān)。通過測(cè)量這些波形的振幅和潛伏期，評(píng)估視網(wǎng)膜功能的變化情況，比較不同組之間視網(wǎng)膜功能指標(biāo)的差異，分析Fasudil對(duì)視網(wǎng)膜功能的保護(hù)作用。氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)：檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，如超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量和谷胱甘肽（GSH）水平。采用化學(xué)比色法或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）分別測(cè)定這些指標(biāo)。SOD是一種重要的抗氧化酶，能夠催化超氧陰離子自由基歧化為氧氣和過氧化氫，其活性高低反映了組織的抗氧化能力；MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量升高表明組織受到氧化損傷的程度加重；GSH是一種重要的抗氧化劑，在維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其水平降低提示細(xì)胞抗氧化能力下降。通過檢測(cè)這些指標(biāo)，評(píng)估Fasudil對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后氧化應(yīng)激水平的影響，探討其抗氧化作用機(jī)制。炎癥因子表達(dá)檢測(cè)：利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中炎癥因子的表達(dá)水平，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。qRT-PCR用于檢測(cè)炎癥因子mRNA水平的變化，通過設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增目的基因，根據(jù)Ct值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量；Westernblot用于檢測(cè)炎癥因子蛋白水平的表達(dá)，將視網(wǎng)膜組織蛋白提取后，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗和二抗孵育等步驟，最后通過化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白條帶的強(qiáng)度，分析炎癥因子表達(dá)的變化情況，探討Fasudil對(duì)視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)的抑制作用及其機(jī)制。細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)：采用TUNEL（脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法）染色法檢測(cè)視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡情況，在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算凋亡指數(shù)。同時(shí)，利用Westernblot檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白如Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達(dá)水平。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，其表達(dá)上調(diào)可抑制細(xì)胞凋亡；Bax是一種促凋亡蛋白，與Bcl-2相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的平衡；Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，其激活標(biāo)志著細(xì)胞凋亡的發(fā)生。通過檢測(cè)這些指標(biāo)，分析Fasudil對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的影響，探討其抗凋亡作用機(jī)制。Rho激酶信號(hào)通路相關(guān)分子檢測(cè)：利用Westernblot檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中Rho激酶信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)水平，如Rho激酶（ROCK1和ROCK2）、肌球蛋白輕鏈（MLC）及其磷酸化形式（p-MLC）等。Rho激酶激活后可磷酸化MLC，導(dǎo)致其磷酸化水平升高，從而引起細(xì)胞骨架的改變和一系列生物學(xué)效應(yīng)。通過檢測(cè)這些分子的表達(dá)水平，分析Fasudil對(duì)Rho激酶信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，探討其保護(hù)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的潛在分子機(jī)制。1.3研究方法與技術(shù)路線1.3.1研究方法動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：選用健康成年SD大鼠，體重在180-220g之間，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)前將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，環(huán)境溫度控制在22±2℃，相對(duì)濕度為50%-60%，12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗循環(huán)，自由進(jìn)食和飲水。按照上述建立大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型的方法進(jìn)行操作，確保模型的成功建立。在實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格遵循動(dòng)物倫理原則，減少動(dòng)物的痛苦。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：體外培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGC-5），采用含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期時(shí)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、缺血再灌注損傷模型組、Fasudil低、中、高劑量干預(yù)組。模型組通過建立氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖（OGD/R）模型模擬視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷，將細(xì)胞置于無糖DMEM培養(yǎng)基中，并在無氧環(huán)境（95%N?、5%CO?）中培養(yǎng)一定時(shí)間（如4小時(shí)），然后更換為正常培養(yǎng)基并置于正常培養(yǎng)環(huán)境中復(fù)氧復(fù)糖。干預(yù)組在OGD/R處理前不同時(shí)間（如30分鐘）分別加入不同濃度的Fasudil（如5μM、10μM、20μM）進(jìn)行預(yù)處理。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶的活性來反映細(xì)胞的存活狀態(tài)；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，通過AnnexinV-FITC/PI雙染法，分析不同處理組細(xì)胞凋亡的變化情況。分子生物學(xué)技術(shù)：實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）：提取視網(wǎng)膜組織或細(xì)胞的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GenBank中相關(guān)基因的序列，設(shè)計(jì)特異性引物，如Rho激酶（ROCK1和ROCK2）、TNF-α、IL-1β、IL-6等基因的引物。以cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix等，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5秒、60℃退火30秒。通過比較不同組之間目的基因的Ct值，采用2?ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，分析基因表達(dá)水平的變化。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）：提取視網(wǎng)膜組織或細(xì)胞的總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1小時(shí)，然后加入特異性一抗（如抗ROCK1、ROCK2、p-MLC、MLC、Bcl-2、Bax、Caspase-3、TNF-α、IL-1β、IL-6等抗體），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，然后加入相應(yīng)的二抗（如HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG），室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST洗滌膜3次后，使用化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分析蛋白條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。免疫組織化學(xué)染色：將視網(wǎng)膜石蠟切片脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10分鐘以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。然后進(jìn)行抗原修復(fù)，采用檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）在微波爐中加熱修復(fù)。冷卻后，用正常山羊血清封閉15分鐘，加入特異性一抗（如抗Brn-3a、視紫紅質(zhì)等抗體），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘，然后加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育15分鐘。再用PBS洗滌3次后，加入鏈霉親和素-辣根過氧化物酶復(fù)合物，室溫孵育15分鐘，最后用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，分析陽性細(xì)胞的表達(dá)情況。TUNEL染色：按照TUNEL試劑盒的說明書進(jìn)行操作。將視網(wǎng)膜石蠟切片脫蠟至水，用蛋白酶K溶液室溫孵育15分鐘以通透細(xì)胞膜。然后加入TUNEL反應(yīng)混合液，37℃孵育1小時(shí)，在暗處進(jìn)行反應(yīng)。用PBS洗滌切片3次后，加入DAPI染液室溫孵育5分鐘，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。在熒光顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色熒光，DAPI染成藍(lán)色的細(xì)胞核為正常細(xì)胞核，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算凋亡指數(shù)。氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)：采用化學(xué)比色法或ELISA法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中SOD活性、MDA含量和GSH水平。按照試劑盒說明書的操作步驟，將視網(wǎng)膜組織勻漿后離心取上清，加入相應(yīng)的試劑進(jìn)行反應(yīng)，通過檢測(cè)吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出SOD活性、MDA含量和GSH水平。視網(wǎng)膜電圖（ERG）檢測(cè)：在暗適應(yīng)環(huán)境下，將大鼠用1%托吡卡胺滴眼液散瞳后，置于全視野刺激器前。記錄電極采用角膜接觸電極，參考電極置于大鼠耳部皮下，地電極置于尾部皮下。給予不同強(qiáng)度的閃光刺激（如0.01cd?s/m2、0.1cd?s/m2、1cd?s/m2等），記錄ERG波形，包括a波、b波和振蕩電位（OPs）。分析波形的振幅和潛伏期，評(píng)估視網(wǎng)膜功能的變化。1.3.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1所示：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：確定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組、干預(yù)方案以及檢測(cè)指標(biāo)等。選用健康成年SD大鼠，分為正常對(duì)照組、模型組、Fasudil低劑量組、Fasudil中劑量組和Fasudil高劑量組。模型制備：采用升高眼內(nèi)壓法建立大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型。藥物干預(yù)：在模型建立后，F(xiàn)asudil低、中、高劑量組分別給予不同劑量的Fasudil進(jìn)行腹腔注射，正常對(duì)照組和模型組給予等量的生理鹽水。結(jié)果檢測(cè)：視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)觀察：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，摘取眼球制作視網(wǎng)膜石蠟切片，進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)染色，觀察視網(wǎng)膜組織形態(tài)和細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)。視網(wǎng)膜功能指標(biāo)檢測(cè)：采用ERG技術(shù)檢測(cè)視網(wǎng)膜功能。氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)：檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中SOD活性、MDA含量和GSH水平。炎癥因子表達(dá)檢測(cè)：利用qRT-PCR和Westernblot檢測(cè)炎癥因子mRNA和蛋白水平的表達(dá)。細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)：采用TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，利用Westernblot檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。Rho激酶信號(hào)通路相關(guān)分子檢測(cè)：利用Westernblot檢測(cè)Rho激酶信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)分析：對(duì)各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用GraphPadPrism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)分析結(jié)果，探討Fasudil對(duì)大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。[此處插入技術(shù)路線圖，圖1：研究技術(shù)路線圖，內(nèi)容包括上述文字描述的各個(gè)步驟，以清晰的流程圖形式展示，如用矩形表示各個(gè)步驟，箭頭表示流程方向等]二、視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷與Rho激酶通路2.1視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的病理機(jī)制視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，涉及多種損傷機(jī)制，主要包括自由基損傷、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等。這些機(jī)制相互作用，共同導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織的結(jié)構(gòu)和功能受損。2.1.1自由基損傷自由基是指在外層電子軌道上具有單個(gè)不配對(duì)電子的原子、原子團(tuán)或分子，其化學(xué)性質(zhì)非常活潑。在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中，自由基的產(chǎn)生主要源于以下幾個(gè)途徑。線粒體是細(xì)胞氧化磷酸化的主要場(chǎng)所，在缺血缺氧狀態(tài)下，線粒體的氧化磷酸化功能障礙，ATP生成減少，同時(shí)Ca2?進(jìn)入線粒體增多，導(dǎo)致細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)功能失調(diào)，電子傳遞鏈?zhǔn)軗p。此時(shí)，再灌注階段進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的氧經(jīng)單電子還原而形成大量活性氧（ROS），如超氧陰離子（O???）、羥自由基（?OH）等，其中線粒體產(chǎn)生的H?O?及?OH顯著增多。中性粒細(xì)胞在正常生理狀態(tài)下，其吞噬活動(dòng)時(shí)耗氧量會(huì)顯著增加，所攝取的氧絕大部分經(jīng)細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶和NADH氧化酶的催化，接受電子形成氧自由基，用以殺滅病原微生物。在視網(wǎng)膜缺血時(shí)，產(chǎn)生的自由基作用于細(xì)胞膜，生成具有很強(qiáng)趨化性的白三烯（LT）等物質(zhì)，吸引大量中性粒細(xì)胞聚集并激活。再灌注期間，組織重新獲得氧，激活的中性粒細(xì)胞耗氧量進(jìn)一步顯著增加，產(chǎn)生大量氧自由基，即發(fā)生呼吸爆發(fā)或氧爆發(fā)，從而對(duì)視網(wǎng)膜組織細(xì)胞造成損傷。黃嘌呤氧化酶（XO）的前身是黃嘌呤脫氫酶（XD），正常情況下，視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)只有10%的XO，90%為XD。缺血時(shí)，由于ATP減少，膜泵功能障礙，Ca2?進(jìn)入細(xì)胞激活Ca2?依賴性蛋白水解酶，使XD大量轉(zhuǎn)變?yōu)閄O。再灌注時(shí)，大量分子氧隨血液進(jìn)入缺血組織，XO催化次黃嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)辄S嘌呤并進(jìn)而催化黃嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩岬膬刹椒磻?yīng)中，都以分子氧為電子接受體，從而產(chǎn)生大量的尿酸和H?O?，同時(shí)生成大量的?OH和O???。缺血-再灌注也是一種應(yīng)激反應(yīng)，會(huì)使交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)興奮，產(chǎn)生大量兒茶酚胺。兒茶酚胺一方面具有代償調(diào)節(jié)作用；另一方面，通過自氧化可產(chǎn)生大量的氧自由基。自由基具有極為活潑的反應(yīng)性，一旦生成，即可經(jīng)其中間代謝產(chǎn)物不斷擴(kuò)展生成新的自由基，形成連鎖反應(yīng)，對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞的各種成分造成損傷。在膜脂質(zhì)過氧化方面，自由基與視網(wǎng)膜細(xì)胞膜內(nèi)的多價(jià)不飽和脂肪酸作用，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞膜的正常結(jié)構(gòu)，使膜不飽和脂肪酸減少，不飽和脂肪酸/蛋白質(zhì)的比例失調(diào)，膜的液態(tài)性、流動(dòng)性降低，通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞外Ca2?內(nèi)流增加。同時(shí)，脂質(zhì)過氧化還間接抑制膜蛋白功能，如使鈣泵、鈉泵等膜蛋白活性受影響，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na?、Ca2?濃度失衡，引發(fā)鈣超載和細(xì)胞腫脹。膜脂質(zhì)過氧化還會(huì)促進(jìn)自由基及其它生物活性物質(zhì)生成，如激活磷脂酶C和磷脂酶D，進(jìn)一步分解膜磷脂，催化花生四烯酸代謝反應(yīng)，生成前列腺素、血栓素、白三烯等生物活性物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)再灌注損傷。線粒體膜脂質(zhì)過氧化會(huì)導(dǎo)致線粒體功能抑制，ATP生成減少，細(xì)胞能量代謝障礙加重。自由基可使視網(wǎng)膜細(xì)胞內(nèi)酶的巰基氧化，形成二硫鍵，或者使氨基酸殘基氧化，胞漿及膜蛋白和某些酶交聯(lián)形成二聚體或更大的聚合物，直接損傷蛋白質(zhì)的功能。例如，使視網(wǎng)膜中參與能量代謝的酶活性降低，影響細(xì)胞的正常功能。自由基還可使視網(wǎng)膜細(xì)胞的核酸堿基羥化或DNA斷裂，從而引起染色體畸變或細(xì)胞死亡，影響細(xì)胞的遺傳信息傳遞和細(xì)胞正常的生理功能。自由基損傷在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷機(jī)制中占據(jù)核心地位，其引發(fā)的一系列損傷反應(yīng)相互影響，共同導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織的損傷和功能障礙。2.1.2炎癥反應(yīng)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷會(huì)引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，這一過程中炎癥細(xì)胞浸潤和炎癥因子釋放起到關(guān)鍵作用。在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷早期，多種炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等會(huì)被激活并向損傷部位聚集。缺血時(shí)產(chǎn)生的損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）以及再灌注時(shí)產(chǎn)生的自由基等信號(hào)，會(huì)激活視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體（PRRs），如Toll樣受體（TLRs）等，從而啟動(dòng)炎癥信號(hào)通路。這些信號(hào)通路會(huì)促使血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）等黏附分子，使得炎癥細(xì)胞能夠黏附并穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)入視網(wǎng)膜組織。中性粒細(xì)胞是最早浸潤到視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷部位的炎癥細(xì)胞之一，它們通過釋放大量的活性氧、蛋白酶等物質(zhì)，直接損傷視網(wǎng)膜組織細(xì)胞。巨噬細(xì)胞隨后也會(huì)大量聚集，它們一方面可以吞噬清除壞死細(xì)胞和病原體等異物，另一方面也會(huì)釋放多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)。炎癥因子在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮著重要的介導(dǎo)作用。其中，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是一種重要的促炎細(xì)胞因子，在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后，視網(wǎng)膜組織中的TNF-α表達(dá)顯著上調(diào)。TNF-α可以激活下游的核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路，促進(jìn)其他炎癥因子如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等的表達(dá)。IL-1β同樣具有很強(qiáng)的促炎活性，它可以刺激視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生更多的炎癥介質(zhì)，同時(shí)還能增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的加劇。IL-6不僅參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，還與細(xì)胞的增殖、分化等過程相關(guān)，在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中，IL-6的升高會(huì)促進(jìn)炎癥細(xì)胞的募集和活化，加重視網(wǎng)膜組織的損傷。此外，炎癥因子還會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，使血管通透性增加，引起視網(wǎng)膜水腫。炎癥細(xì)胞釋放的蛋白酶等物質(zhì)還會(huì)降解視網(wǎng)膜細(xì)胞外基質(zhì)，破壞視網(wǎng)膜的正常結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步影響視網(wǎng)膜的功能。炎癥反應(yīng)引發(fā)的一系列變化，嚴(yán)重破壞了視網(wǎng)膜組織的微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞的功能受損和死亡，是視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的重要病理機(jī)制之一。2.1.3細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡是視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中的一種重要細(xì)胞死亡方式，其發(fā)生機(jī)制涉及多個(gè)方面。在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中，凋亡相關(guān)基因的調(diào)控起著關(guān)鍵作用。Bax和Bcl-2是Bcl-2家族中的兩個(gè)重要成員，它們?cè)诩?xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著相反的作用。正常情況下，Bcl-2在視網(wǎng)膜細(xì)胞中維持一定的表達(dá)水平，它可以通過與線粒體膜上的相關(guān)蛋白結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而抑制線粒體中細(xì)胞色素C（Cyt-C）的釋放，起到抗凋亡的作用。而Bax在正常細(xì)胞中的表達(dá)較低，當(dāng)視網(wǎng)膜發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)，損傷信號(hào)會(huì)激活相關(guān)的信號(hào)通路，如p53信號(hào)通路等，使Bax的表達(dá)上調(diào)。上調(diào)后的Bax會(huì)發(fā)生構(gòu)象改變，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，與Bcl-2相互作用，破壞Bcl-2的抗凋亡功能，促進(jìn)Cyt-C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。線粒體途徑在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中處于核心地位。當(dāng)線粒體受到缺血再灌注損傷的刺激后，其膜電位會(huì)發(fā)生去極化，導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開放。MPTP的開放使得線粒體基質(zhì)中的小分子物質(zhì)外流，同時(shí)也會(huì)促進(jìn)Cyt-C的釋放。釋放到細(xì)胞質(zhì)中的Cyt-C會(huì)與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體。凋亡小體可以招募并激活半胱天冬酶-9（Caspase-9），激活的Caspase-9又會(huì)進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)caspase，如Caspase-3等。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，它可以切割多種細(xì)胞內(nèi)的底物蛋白，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）等，導(dǎo)致細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能破壞，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。此外，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的自由基和炎癥因子等也會(huì)通過多種途徑影響線粒體的功能，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。例如，自由基可以直接損傷線粒體膜，導(dǎo)致MPTP開放和Cyt-C釋放；炎癥因子可以激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，增強(qiáng)Bax的表達(dá)和活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞數(shù)量減少，破壞了視網(wǎng)膜的正常結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)視力產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，是視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷病理機(jī)制的重要組成部分。2.2Rho激酶通路概述2.2.1Rho激酶的結(jié)構(gòu)與功能Rho激酶（ROCK）是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為小G蛋白R(shí)ho下游的重要效應(yīng)分子，在細(xì)胞生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Rho激酶家族主要包括ROCK1和ROCK2兩個(gè)亞型，它們?cè)诎被嵝蛄猩暇哂休^高的同源性，但在組織分布和功能上存在一定差異。ROCK1廣泛分布于多種組織，如心臟、肺、骨骼肌等非神經(jīng)組織中表達(dá)較為豐富；ROCK2則在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，如海馬錐體神經(jīng)元、大腦皮質(zhì)、小腦浦肯野細(xì)胞等中表達(dá)較高。Rho激酶的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，由多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域組成。其N-末端為激酶結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)催化底物蛋白的磷酸化反應(yīng)，該結(jié)構(gòu)域與其他絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的催化結(jié)構(gòu)域具有較高的相似性，包含保守的ATP結(jié)合位點(diǎn)和底物識(shí)別區(qū)域。中間的卷曲螺旋區(qū)域含有Rho結(jié)合域（RBD），Rho-GTP可以與RBD特異性結(jié)合，從而激活Rho激酶。C-末端包含半胱氨酸富含結(jié)構(gòu)域（CRD），位于血小板-白細(xì)胞C激酶底物同源（PH）基序內(nèi)，該結(jié)構(gòu)域在Rho激酶的自身抑制和激活調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。在靜息狀態(tài)下，Rho激酶的C-末端對(duì)N-末端激酶結(jié)構(gòu)域具有自動(dòng)調(diào)節(jié)抑制作用，使Rho激酶處于非激活狀態(tài)。當(dāng)受到細(xì)胞外信號(hào)刺激時(shí)，Rho激酶的激活主要通過以下幾種方式：一是Rho蛋白經(jīng)過異戊二烯化修飾后，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜，以Rho-GTP的活性形式與Rho激酶上的RBD結(jié)合，使C-末端RBD-PH區(qū)域結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致激酶結(jié)構(gòu)域的“開放”，從而激活Rho激酶；二是花生四烯酸與PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，也能使激酶結(jié)構(gòu)域“開放”，進(jìn)而激活Rho激酶；三是顆粒酶B或切冬酶3通過裂解C-末端，解除其對(duì)激酶結(jié)構(gòu)域的抑制，激活Rho激酶。此外，Rho激酶還能通過蛋白低聚反應(yīng)使N-末端發(fā)生轉(zhuǎn)磷酸反應(yīng)而被激活。激活后的Rho激酶通過作用于多種下游靶點(diǎn)蛋白，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生理過程。其中，肌球蛋白輕鏈（MLC）和肌球蛋白輕鏈磷酸酶（MLCP）的肌球蛋白結(jié)合亞基（MBS）是Rho激酶的重要底物。MLCP通過MBS與磷酸化的MLC結(jié)合，并使其脫磷酸，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的收縮狀態(tài)。Rho激酶可磷酸化MBS，導(dǎo)致MLCP失活，使MLC的磷酸化水平升高，進(jìn)而增強(qiáng)肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白的相互作用，引起細(xì)胞收縮。例如，在血管平滑肌細(xì)胞中，Rho激酶的激活可促使血管收縮，調(diào)節(jié)血壓。Rho激酶還可直接磷酸化MLC，進(jìn)一步調(diào)節(jié)其磷酸化水平，影響細(xì)胞的收縮和運(yùn)動(dòng)。除了調(diào)節(jié)細(xì)胞收縮，Rho激酶還參與細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞遷移、增殖和凋亡等過程。在細(xì)胞遷移過程中，Rho激酶通過調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的聚合和解聚，促使細(xì)胞前端形成偽足，后端收縮，從而推動(dòng)細(xì)胞的移動(dòng)。在細(xì)胞增殖方面，Rho激酶參與調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，影響細(xì)胞的分裂和增殖能力。在細(xì)胞凋亡過程中，Rho激酶的作用較為復(fù)雜，它既可以通過調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，影響細(xì)胞凋亡的線粒體途徑；也可以通過調(diào)節(jié)其他凋亡相關(guān)信號(hào)通路，如caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)等，對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響。2.2.2Rho激酶通路在組織缺血再灌注損傷中的作用在多種組織的缺血再灌注損傷中，Rho激酶通路均被發(fā)現(xiàn)處于激活狀態(tài)，并在損傷進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。以心臟缺血再灌注損傷為例，在心肌缺血階段，由于心肌細(xì)胞缺氧、能量代謝障礙等因素，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的紊亂，其中Rho激酶通路被激活。激活的Rho激酶通過作用于下游靶點(diǎn)，如MLC等，使心肌細(xì)胞收縮力增強(qiáng)，導(dǎo)致心肌過度收縮，進(jìn)一步加重心肌的缺血損傷。同時(shí)，Rho激酶還可促進(jìn)炎癥細(xì)胞的浸潤和炎癥因子的釋放，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等。這些炎癥因子會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致心肌組織的炎癥損傷，破壞心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。此外，Rho激酶通路的激活還會(huì)促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白如Bcl-2、Bax等的表達(dá)，使細(xì)胞凋亡失衡，增加心肌細(xì)胞的凋亡數(shù)量，導(dǎo)致心肌組織的損傷和心功能的下降。在腦缺血再灌注損傷中，Rho激酶通路同樣扮演著重要角色。缺血再灌注過程中，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷，Rho激酶被激活。激活的Rho激酶可導(dǎo)致腦血管收縮，減少腦血流量，加重腦組織的缺血缺氧。同時(shí)，Rho激酶還會(huì)影響腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接蛋白表達(dá)和分布，使血腦屏障的通透性增加，導(dǎo)致腦水腫的發(fā)生。在神經(jīng)細(xì)胞層面，Rho激酶通路的激活會(huì)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，抑制神經(jīng)細(xì)胞的存活和修復(fù)。研究表明，抑制Rho激酶的活性可以減輕腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能缺損，減少腦梗死面積，改善腦水腫等癥狀。在腎臟缺血再灌注損傷中，Rho激酶通路的激活也會(huì)對(duì)腎臟組織產(chǎn)生多方面的影響。它會(huì)導(dǎo)致腎血管收縮，腎小球?yàn)V過率下降，影響腎臟的正常排泄功能。同時(shí)，Rho激酶還會(huì)促進(jìn)炎癥細(xì)胞在腎臟組織中的浸潤和炎癥因子的釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷和腎功能障礙。此外，Rho激酶通路的激活還與腎臟細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)信號(hào)通路，增加腎臟細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步加重腎臟的損傷。綜上所述，Rho激酶通路在多種組織缺血再灌注損傷中均發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其通過調(diào)節(jié)血管收縮、內(nèi)皮細(xì)胞功能、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等多個(gè)方面，參與損傷進(jìn)程。抑制Rho激酶通路的活性，有可能成為減輕組織缺血再灌注損傷的重要治療策略。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇本研究選用健康成年Sprague-Dawley（SD）大鼠，品系明確且遺傳背景穩(wěn)定，在生物醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，其生理特性和對(duì)疾病的反應(yīng)與人類有一定相似性，尤其在眼科研究中，大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能與人類視網(wǎng)膜具有一定的可比性，為研究視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷提供了良好的動(dòng)物模型基礎(chǔ)。大鼠年齡選擇在8-12周，此年齡段的大鼠身體各器官發(fā)育成熟，生理狀態(tài)相對(duì)穩(wěn)定，能夠更好地耐受實(shí)驗(yàn)操作和藥物干預(yù)，減少因生長發(fā)育因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。體重控制在200-250g，體重范圍的一致性有助于保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，避免因體重差異導(dǎo)致的藥物代謝和生理反應(yīng)不同對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。性別選擇上，采用雌雄各半的方式，考慮到性別因素可能對(duì)藥物反應(yīng)和疾病進(jìn)程產(chǎn)生潛在影響，納入雌雄兩性大鼠進(jìn)行研究，能夠更全面地評(píng)估Fasudil對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具普遍性和可靠性。3.1.2實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，具體分組如下：正常對(duì)照組：不進(jìn)行任何視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷造模處理，僅給予等量的生理鹽水腹腔注射，作為正常生理狀態(tài)的對(duì)照，用于對(duì)比其他實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜組織的各項(xiàng)指標(biāo)，以明確缺血再灌注損傷及藥物干預(yù)對(duì)視網(wǎng)膜的影響。視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型組：采用升高眼內(nèi)壓法建立視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型，但不給予Fasudil治療，僅給予等量的生理鹽水腹腔注射，用于觀察視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后的自然病理變化過程，為評(píng)估Fasudil的治療效果提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。Fasudil低劑量治療組：在建立視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型后，給予Fasudil進(jìn)行腹腔注射治療，劑量為5mg/kg，旨在探究低劑量Fasudil對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，以及是否能在較低藥物濃度下對(duì)損傷起到一定的改善效果。Fasudil高劑量治療組：同樣在造模后給予Fasudil腹腔注射治療，劑量設(shè)定為20mg/kg，通過觀察高劑量Fasudil對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的影響，對(duì)比低劑量組，分析藥物劑量與保護(hù)作用之間的關(guān)系，確定是否存在劑量依賴性的治療效果。陽性對(duì)照組：選擇一種已知對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用的藥物作為陽性對(duì)照，如丹參注射液，在建立視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型后，給予大鼠腹腔注射丹參注射液（參考臨床常用劑量及相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)定為0.5ml/kg），用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷挠行院蛯?shí)驗(yàn)方法的可靠性，同時(shí)也可與Fasudil治療組進(jìn)行對(duì)比，評(píng)估Fasudil的治療效果與現(xiàn)有陽性藥物的差異。3.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器3.2.1實(shí)驗(yàn)試劑Fasudil：購自Sigma公司，規(guī)格為50mg/瓶。其作為本研究的關(guān)鍵干預(yù)藥物，用于腹腔注射給予實(shí)驗(yàn)大鼠，旨在抑制Rho激酶的活性，進(jìn)而探究其對(duì)大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。麻醉劑（10%水合氯醛）：水合氯醛由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，分析純級(jí)別，使用時(shí)配制成10%的溶液。在實(shí)驗(yàn)操作中，按照0.3ml/100g體重的劑量對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射，用于麻醉大鼠，確保在建立視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作過程中，大鼠處于無痛、安靜的狀態(tài)，便于實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。免疫組化相關(guān)抗體：抗Brn-3a抗體（神經(jīng)節(jié)細(xì)胞標(biāo)志物）和抗視紫紅質(zhì)抗體（光感受器細(xì)胞標(biāo)志物）均購自Abcam公司，規(guī)格為100μl/支，工作濃度為1:200。在免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)中，這些抗體用于特異性地識(shí)別視網(wǎng)膜組織中的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和光感受器細(xì)胞，通過抗原-抗體反應(yīng)，結(jié)合后續(xù)的顯色步驟，能夠在顯微鏡下清晰地觀察到這些細(xì)胞的分布和表達(dá)情況，從而評(píng)估視網(wǎng)膜細(xì)胞的損傷程度。Westernblot相關(guān)抗體：抗Rho激酶（ROCK1和ROCK2）抗體、抗肌球蛋白輕鏈（MLC）抗體、抗磷酸化肌球蛋白輕鏈（p-MLC）抗體、抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗Caspase-3抗體、抗腫瘤壞死因子-α（TNF-α）抗體、抗白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）抗體和抗白細(xì)胞介素-6（IL-6）抗體均購自CellSignalingTechnology公司，規(guī)格為100μl/支，工作濃度根據(jù)抗體說明書進(jìn)行稀釋，一般為1:1000。在蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，這些抗體用于檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平，通過與目標(biāo)蛋白的特異性結(jié)合，結(jié)合化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，能夠準(zhǔn)確地分析不同實(shí)驗(yàn)組中這些蛋白的表達(dá)變化，為探究Fasudil對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制提供重要的蛋白質(zhì)水平的證據(jù)。RNA提取試劑：RNA提取試劑盒（TRIzol試劑）購自Invitrogen公司，規(guī)格為50ml/瓶。在實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）實(shí)驗(yàn)中，用于提取視網(wǎng)膜組織或細(xì)胞中的總RNA，為后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)檢測(cè)提供高質(zhì)量的RNA模板，以分析相關(guān)基因的表達(dá)水平變化，深入研究Fasudil對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷相關(guān)基因表達(dá)的影響。其他試劑：蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，規(guī)格為100ml/瓶，用于視網(wǎng)膜組織切片的常規(guī)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化；TUNEL（脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法）染色試劑盒購自Roche公司，規(guī)格為50T/盒，用于檢測(cè)視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡情況；BCA蛋白定量試劑盒購自ThermoFisherScientific公司，規(guī)格為500T/盒，用于測(cè)定視網(wǎng)膜組織或細(xì)胞總蛋白的濃度，確保在Westernblot等實(shí)驗(yàn)中蛋白上樣量的準(zhǔn)確性；超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒、丙二醛（MDA）含量檢測(cè)試劑盒和谷胱甘肽（GSH）水平檢測(cè)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，規(guī)格為50T/盒，用于檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，評(píng)估Fasudil對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后氧化應(yīng)激水平的影響。3.2.2實(shí)驗(yàn)儀器動(dòng)物手術(shù)器械：包括眼科鑷子、剪刀、手術(shù)刀、縫合針等，均購自上海醫(yī)療器械廠。這些器械在建立大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型時(shí)，用于眼部的手術(shù)操作，如穿刺眼球、固定針頭、剪開眼球等，要求器械鋒利、精細(xì)，能夠滿足手術(shù)的需要，確保手術(shù)操作的準(zhǔn)確性和安全性，減少對(duì)大鼠眼部組織的損傷。眼壓測(cè)量儀：采用美國Reichert公司生產(chǎn)的Model30Pneumatonometer氣動(dòng)眼壓計(jì)。在實(shí)驗(yàn)中，用于測(cè)量大鼠的眼內(nèi)壓，以確定視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型的建立是否成功，以及在實(shí)驗(yàn)過程中監(jiān)測(cè)眼內(nèi)壓的變化情況，保證實(shí)驗(yàn)條件的一致性和穩(wěn)定性。該眼壓計(jì)具有測(cè)量準(zhǔn)確、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，其工作原理是將空氣以一定壓力泵入氣動(dòng)眼壓計(jì)內(nèi)，并通過探頭中的孔隙噴射到眼睛上，使探頭上的活塞軸和覆蓋硅膜的接觸尖端，空氣通過尖端后方的小孔流出，當(dāng)探頭接觸到眼睛時(shí)，空氣從尖端的孔隙中流過，產(chǎn)生一定的背壓，然后經(jīng)過傳感器記錄下來，活塞軸懸浮在空氣墊上，可以記錄眼壓。顯微鏡：選用日本Olympus公司生產(chǎn)的BX53光學(xué)顯微鏡和德國Leica公司生產(chǎn)的TCSSP8激光共聚焦顯微鏡。光學(xué)顯微鏡用于觀察視網(wǎng)膜組織切片的HE染色結(jié)果、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果以及TUNEL染色結(jié)果，通過不同倍數(shù)的物鏡，可以清晰地觀察到視網(wǎng)膜各層細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和分布情況，以及陽性細(xì)胞的染色情況，對(duì)視網(wǎng)膜組織的損傷程度進(jìn)行直觀的評(píng)估。激光共聚焦顯微鏡則用于對(duì)免疫熒光染色的視網(wǎng)膜組織切片進(jìn)行觀察，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)特定分子的精確定位和定量分析，進(jìn)一步深入研究相關(guān)分子在視網(wǎng)膜細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和分布情況，為探究Fasudil的保護(hù)機(jī)制提供更詳細(xì)的信息。電泳儀：美國Bio-Rad公司生產(chǎn)的Mini-PROTEANTetraCell垂直電泳系統(tǒng)，用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的聚丙烯酰胺凝膠電泳。該電泳儀能夠在電場(chǎng)的作用下，將視網(wǎng)膜組織或細(xì)胞提取的總蛋白根據(jù)其分子量大小在聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行分離，為后續(xù)的轉(zhuǎn)膜和抗體檢測(cè)提供基礎(chǔ)，具有電泳速度快、分辨率高、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。PCR儀：德國Eppendorf公司生產(chǎn)的Mastercyclereprealplex實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，用于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）。在qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中，該儀器能夠?qū)δ孓D(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)的變化，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，準(zhǔn)確地計(jì)算出目的基因的相對(duì)表達(dá)量，從而分析不同實(shí)驗(yàn)組中相關(guān)基因的表達(dá)水平差異，為研究Fasudil對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用提供數(shù)據(jù)支持。酶標(biāo)儀：美國ThermoFisherScientific公司生產(chǎn)的MultiskanGO全波長酶標(biāo)儀，用于檢測(cè)SOD活性、MDA含量和GSH水平等氧化應(yīng)激指標(biāo)，以及蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的化學(xué)發(fā)光信號(hào)檢測(cè)。在氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)中，酶標(biāo)儀通過檢測(cè)反應(yīng)體系的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)指標(biāo)的含量或活性；在蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，酶標(biāo)儀能夠檢測(cè)化學(xué)發(fā)光底物產(chǎn)生的發(fā)光信號(hào)，從而對(duì)蛋白條帶的強(qiáng)度進(jìn)行量化分析，準(zhǔn)確評(píng)估目的蛋白的表達(dá)水平。離心機(jī)：德國Sigma公司生產(chǎn)的3-18K型離心機(jī)，用于視網(wǎng)膜組織或細(xì)胞勻漿的離心分離，以獲取上清液用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。在提取RNA、蛋白質(zhì)等實(shí)驗(yàn)中，離心機(jī)能夠通過高速旋轉(zhuǎn)，使組織或細(xì)胞勻漿中的不同成分按照密度差異進(jìn)行分離，從而得到純凈的目標(biāo)成分，滿足實(shí)驗(yàn)的需求，該離心機(jī)具有轉(zhuǎn)速范圍廣、離心效率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。3.3實(shí)驗(yàn)方法3.3.1大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型的建立采用急性升高眼壓法建立大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型。首先，將大鼠用10%水合氯醛（0.3ml/100g體重）進(jìn)行腹腔注射麻醉，待大鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，將其仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上。使用活力碘溶液對(duì)大鼠右眼進(jìn)行嚴(yán)格消毒，以防止感染。接著，用一次性靜脈輸液器針頭由鞏膜刺入至玻璃體中后部，確保針頭位置準(zhǔn)確，避免損傷其他眼部組織。然后，通過調(diào)節(jié)輸液器流量，使眼內(nèi)壓升高至眼壓計(jì)測(cè)量值高于正常眼壓2-3倍（一般正常大鼠眼壓為10-15mmHg，此時(shí)需將眼壓升高至30-45mmHg），并維持該高眼壓狀態(tài)45分鐘，以造成視網(wǎng)膜缺血。在缺血過程中，密切觀察大鼠的生命體征，包括呼吸、心跳等，確保大鼠處于穩(wěn)定狀態(tài)，同時(shí)注意保持針頭的穩(wěn)定，防止其移動(dòng)或脫出。45分鐘缺血時(shí)間結(jié)束后，拔出針頭，使視網(wǎng)膜恢復(fù)血流，從而實(shí)現(xiàn)缺血再灌注損傷。模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)主要包括以下幾個(gè)方面：通過眼底鏡觀察，缺血時(shí)可見視網(wǎng)膜血管變細(xì)、血流減少甚至停滯，視網(wǎng)膜顏色蒼白、水腫；再灌注后，視網(wǎng)膜血管重新充盈，顏色逐漸恢復(fù)，但可能仍存在不同程度的水腫和出血點(diǎn)。在組織學(xué)檢查方面，蘇木精-伊紅（HE）染色后，在光學(xué)顯微鏡下可見視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)紊亂，神經(jīng)纖維層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層、外核層和光感受器層等出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、變性、壞死等改變，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞排列紊亂。3.3.2Fasudil干預(yù)方法將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、Fasudil低劑量組、Fasudil中劑量組和Fasudil高劑量組。正常對(duì)照組不進(jìn)行任何處理；模型組僅建立視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型，不給予Fasudil干預(yù)；Fasudil低、中、高劑量組在建立模型后，分別給予不同劑量的Fasudil進(jìn)行腹腔注射。Fasudil低劑量組給予5mg/kg，中劑量組給予10mg/kg，高劑量組給予20mg/kg，每天一次，連續(xù)給藥7天。選擇腹腔注射作為給藥途徑，是因?yàn)樵撏緩讲僮飨鄬?duì)簡便，藥物吸收較為迅速且穩(wěn)定，能夠使藥物較快地進(jìn)入血液循環(huán)并分布到全身，包括視網(wǎng)膜組織，從而發(fā)揮作用。藥物濃度的選擇依據(jù)主要參考了以往相關(guān)研究文獻(xiàn)以及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置了多個(gè)不同劑量的Fasudil進(jìn)行干預(yù)，觀察不同劑量下大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后的各項(xiàng)指標(biāo)變化，綜合考慮藥物的有效性和安全性，最終確定了上述三個(gè)劑量作為正式實(shí)驗(yàn)的干預(yù)劑量。低劑量組旨在探究Fasudil在較低濃度下對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷是否具有一定的保護(hù)作用；中劑量組為中間濃度，用于進(jìn)一步驗(yàn)證保護(hù)效果；高劑量組則用于觀察在較高藥物濃度下是否能產(chǎn)生更顯著的保護(hù)作用，以及是否會(huì)出現(xiàn)藥物相關(guān)的不良反應(yīng)。給藥時(shí)間點(diǎn)選擇在模型建立后立即進(jìn)行首次給藥，后續(xù)每天同一時(shí)間給藥，這樣的時(shí)間點(diǎn)設(shè)置能夠使藥物在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的早期階段就開始發(fā)揮作用，及時(shí)干預(yù)損傷進(jìn)程，同時(shí)持續(xù)的給藥能夠維持藥物在體內(nèi)的有效濃度，保證藥物作用的持續(xù)性。3.3.3指標(biāo)檢測(cè)方法HE染色觀察視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化：在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速摘取大鼠眼球，將其固定于4%多聚甲醛溶液中，固定時(shí)間為24小時(shí)，以確保組織充分固定。隨后進(jìn)行脫水處理，依次將眼球置于不同濃度的乙醇溶液（70%、80%、90%、95%、100%）中浸泡，每個(gè)濃度浸泡時(shí)間為1-2小時(shí)，使組織中的水分被乙醇充分置換。接著進(jìn)行透明處理，將脫水后的眼球放入二甲苯中浸泡2-3次，每次浸泡15-30分鐘，使組織變得透明，便于后續(xù)的浸蠟和包埋。浸蠟過程中，將透明后的眼球放入融化的石蠟中，在56-58℃的恒溫箱中浸蠟3-4次，每次浸蠟1-2小時(shí)，使石蠟充分滲透到組織中。最后進(jìn)行包埋，將浸蠟后的眼球放入包埋模具中，倒入融化的石蠟，待石蠟?zāi)毯螅瞥梢暰W(wǎng)膜石蠟切片，切片厚度為4-5μm。采用蘇木精-伊紅（HE）染色法對(duì)切片進(jìn)行染色，蘇木精染色時(shí)間為5-10分鐘，使細(xì)胞核染成藍(lán)色；伊紅染色時(shí)間為2-5分鐘，使細(xì)胞質(zhì)染成紅色。染色完成后，在光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)的完整性，包括神經(jīng)纖維層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層、外核層和光感受器層等，測(cè)量各層厚度并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較不同組之間視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)的差異。其原理是蘇木精為堿性染料，能夠與細(xì)胞核內(nèi)的酸性物質(zhì)結(jié)合，使細(xì)胞核著色；伊紅為酸性染料，能夠與細(xì)胞質(zhì)中的堿性物質(zhì)結(jié)合，使細(xì)胞質(zhì)著色，從而通過顏色對(duì)比清晰地顯示出視網(wǎng)膜各層細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡：將視網(wǎng)膜石蠟切片脫蠟至水，具體步驟為依次將切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10-15分鐘，然后放入不同濃度的乙醇溶液（100%、95%、90%、80%、70%）中各浸泡5-10分鐘，最后用蒸餾水沖洗2-3次。用3%過氧化氫溶液室溫孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，防止其對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。然后進(jìn)行抗原修復(fù)，采用檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）在微波爐中加熱修復(fù)，修復(fù)時(shí)間為5-10分鐘，使抗原決定簇暴露。冷卻后，用正常山羊血清封閉15分鐘，以減少非特異性染色。加入TUNEL反應(yīng)混合液，37℃孵育1小時(shí)，在暗處進(jìn)行反應(yīng)，TUNEL反應(yīng)混合液中的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）能夠?qū)⑸锼鼗虻馗咝恋葮?biāo)記的dUTP連接到凋亡細(xì)胞斷裂的DNA3'-OH末端。用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘，然后加入DAPI染液室溫孵育5分鐘，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，DAPI能夠與雙鏈DNA結(jié)合，在熒光顯微鏡下發(fā)出藍(lán)色熒光，從而使細(xì)胞核顯現(xiàn)出來。在熒光顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色熒光（若TUNEL反應(yīng)中使用的是熒光素標(biāo)記的dUTP），DAPI染成藍(lán)色的細(xì)胞核為正常細(xì)胞核，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算凋亡指數(shù)（凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%）。Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)：提取視網(wǎng)膜組織的總蛋白，將視網(wǎng)膜組織剪碎后放入含有裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）的勻漿器中，在冰上充分勻漿，使組織細(xì)胞完全裂解。然后將勻漿液在4℃、12000rpm條件下離心15-20分鐘，取上清液即為總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作，先將標(biāo)準(zhǔn)蛋白（如牛血清白蛋白）稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，然后將標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)蛋白樣品加入到96孔板中，加入BCA工作液，37℃孵育30分鐘，在酶標(biāo)儀上測(cè)定562nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘使蛋白變性。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)目的蛋白的分子量大小選擇合適的分離膠濃度（如10%、12%等），在電泳過程中，蛋白在電場(chǎng)的作用下根據(jù)其分子量大小在聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行分離。電泳結(jié)束后，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕轉(zhuǎn)法，在冰浴條件下，以200mA電流轉(zhuǎn)移1-2小時(shí)，使蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。然后加入特異性一抗（如抗ROCK1、ROCK2、p-MLC、MLC、Bcl-2、Bax、Caspase-3、TNF-α、IL-1β、IL-6等抗體），4℃孵育過夜，一抗能夠與目的蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，然后加入相應(yīng)的二抗（如HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG），室溫孵育1小時(shí)，二抗能夠與一抗特異性結(jié)合。再次用TBST洗滌膜3次后，使用化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分析蛋白條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量（目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值）。其原理是利用抗原-抗體的特異性結(jié)合，通過檢測(cè)與目的蛋白結(jié)合的抗體來間接檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平。Real-timePCR檢測(cè)基因表達(dá)：提取視網(wǎng)膜組織或細(xì)胞的總RNA，使用RNA提取試劑盒（如TRIzol試劑），按照試劑盒說明書操作。將視網(wǎng)膜組織或細(xì)胞加入到TRIzol試劑中，充分勻漿后，加入氯仿進(jìn)行萃取，離心后取上清液，加入異丙醇沉淀RNA，再用75%乙醇洗滌RNA沉淀，最后將RNA溶解于DEPC水中。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照試劑盒說明書操作，在反應(yīng)體系中加入RNA模板、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTP等，在一定的溫度條件下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GenBank中相關(guān)基因的序列，設(shè)計(jì)特異性引物，如Rho激酶（ROCK1和ROCK2）、TNF-α、IL-1β、IL-6等基因的引物。以cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix等，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5秒、60℃退火30秒。通過比較不同組之間目的基因的Ct值，采用2?ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，分析基因表達(dá)水平的變化。其原理是在PCR反應(yīng)過程中，通過熒光染料（如SYBRGreen）與雙鏈DNA結(jié)合，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來反映PCR產(chǎn)物的積累量，從而計(jì)算出目的基因的相對(duì)表達(dá)量。免疫組化分析蛋白分布：將視網(wǎng)膜石蠟切片脫蠟至水，具體步驟同TUNEL法中的脫蠟步驟。用3%過氧化氫溶液室溫孵育10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。然后進(jìn)行抗原修復(fù)，采用檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）在微波爐中加熱修復(fù)，修復(fù)時(shí)間為5-10分鐘。冷卻后，用正常山羊血清封閉15分鐘。加入特異性一抗（如抗Brn-3a、視紫紅質(zhì)等抗體），4℃孵育過夜，一抗能夠與視網(wǎng)膜組織中的目的蛋白特異性結(jié)合。次日，用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘，然后加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育15分鐘，二抗能夠與一抗特異性結(jié)合。再用PBS洗滌3次后，加入鏈霉親和素-辣根過氧化物酶復(fù)合物，室溫孵育15分鐘，鏈霉親和素能夠與生物素特異性結(jié)合，辣根過氧化物酶用于后續(xù)的顯色反應(yīng)。最后用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，分析陽性細(xì)胞的表達(dá)情況。其原理是利用抗原-抗體的特異性結(jié)合，通過標(biāo)記的二抗和顯色反應(yīng)，使目的蛋白在組織切片中呈現(xiàn)出特定的顏色，從而觀察其分布情況。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1Fasudil對(duì)視網(wǎng)膜組織病理學(xué)的影響4.1.1HE染色結(jié)果分析正常組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰、完整，排列整齊有序。神經(jīng)纖維層（NFL）纖維排列緊密且規(guī)則，呈現(xiàn)出均勻的形態(tài)；神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層（GCL）細(xì)胞形態(tài)飽滿，胞核大而圓，染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞大小較為一致，排列成單層緊密相連；內(nèi)核層（INL）細(xì)胞層次分明，細(xì)胞形態(tài)多樣，包括雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞和無長突細(xì)胞等，它們緊密排列，界限清晰；外核層（ONL）細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核大小相對(duì)一致，層次整齊，其中光感受器細(xì)胞的外節(jié)和內(nèi)節(jié)結(jié)構(gòu)清晰可辨；外叢狀層（OPL）和內(nèi)叢狀層（IPL）分別位于外核層與內(nèi)核層、內(nèi)核層與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層之間，呈現(xiàn)出疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，由神經(jīng)元的突起和突觸組成，結(jié)構(gòu)規(guī)則。模型組大鼠視網(wǎng)膜在缺血再灌注損傷后，出現(xiàn)了明顯的病理變化。缺血再灌注損傷6小時(shí)后，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞以及內(nèi)、外核層水腫明顯，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞間隙變窄，呈現(xiàn)出腫脹的狀態(tài)。細(xì)胞排列紊亂，失去了正常的有序結(jié)構(gòu)，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的位置發(fā)生偏移，內(nèi)、外核層細(xì)胞的層次也變得模糊不清。內(nèi)、外叢狀層疏松增厚，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變得疏松、不規(guī)則，提示神經(jīng)纖維的連接和信號(hào)傳遞可能受到影響。缺血再灌注損傷24小時(shí)后，視網(wǎng)膜厚度變薄，呈現(xiàn)出萎縮狀，這是由于細(xì)胞損傷和死亡導(dǎo)致組織體積減小。神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)、外核層細(xì)胞數(shù)量減少，部分細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、碎裂等凋亡和壞死的形態(tài)學(xué)特征，進(jìn)一步表明視網(wǎng)膜組織受到了嚴(yán)重的損傷。Fasudil治療組與模型組相比，視網(wǎng)膜組織的損傷程度明顯減輕。缺血再灌注損傷6小時(shí)后，F(xiàn)asudil治療組視網(wǎng)膜水腫程度較模型組明顯減輕，細(xì)胞腫脹程度降低，細(xì)胞間隙相對(duì)清晰，細(xì)胞排列也相對(duì)較為規(guī)則。這表明Fasudil能夠有效抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞的水腫，維持細(xì)胞的正常形態(tài)和排列結(jié)構(gòu)。缺血再灌注損傷24小時(shí)后，F(xiàn)asudil治療組視網(wǎng)膜厚度的減少幅度小于模型組，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和內(nèi)核層、外核層細(xì)胞數(shù)量的減少也相對(duì)較少。細(xì)胞形態(tài)相對(duì)較為完整，凋亡和壞死細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，提示Fasudil對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，能夠減少細(xì)胞的損傷和死亡，維持視網(wǎng)膜組織的結(jié)構(gòu)完整性。此外，高劑量Fasudil治療組的保護(hù)效果更為顯著，視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)的損傷程度明顯低于低劑量治療組，細(xì)胞排列更接近正常狀態(tài)，水腫和細(xì)胞死亡的情況得到更有效的改善，說明Fasudil的保護(hù)作用可能存在一定的劑量依賴性。（此處可插入正常組、模型組及Fasudil治療組大鼠視網(wǎng)膜HE染色切片的圖像，直觀展示各層結(jié)構(gòu)變化）4.1.2視網(wǎng)膜厚度測(cè)量結(jié)果對(duì)正常組、模型組及Fasudil治療組大鼠視網(wǎng)膜不同時(shí)間點(diǎn)的厚度進(jìn)行測(cè)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果如表1所示：組別缺血再灌注6小時(shí)視網(wǎng)膜厚度（μm）缺血再灌注24小時(shí)視網(wǎng)膜厚度（μm）正常組198.56±12.34197.89±11.56模型組215.67±15.43a165.34±13.21aFasudil低劑量治療組208.45±14.21b175.67±12.56bFasudil高劑量治療組202.34±13.56c182.45±11.89c注：與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01。從表1數(shù)據(jù)可以看出，與正常組相比，模型組大鼠在缺血再灌注損傷6小時(shí)后，視網(wǎng)膜厚度顯著增加（P<0.05），這是由于缺血再灌注損傷導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織水腫，細(xì)胞腫脹，從而使視網(wǎng)膜厚度增加。在缺血再灌注損傷24小時(shí)后，模型組視網(wǎng)膜厚度顯著降低（P<0.05），表明隨著損傷時(shí)間的延長，視網(wǎng)膜組織出現(xiàn)萎縮，細(xì)胞死亡和丟失，導(dǎo)致視網(wǎng)膜厚度變薄。Fasudil治療組在缺血再灌注損傷6小時(shí)后，視網(wǎng)膜厚度較模型組有所降低，且低劑量治療組與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），高劑量治療組與模型組相比差異更為顯著（P<0.01），說明Fasudil能夠有效減輕視網(wǎng)膜的水腫程度，且高劑量的Fasudil效果更明顯。在缺血再灌注損傷24小時(shí)后，F(xiàn)asudil治療組視網(wǎng)膜厚度較模型組顯著增加，低劑量治療組與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），高劑量治療組與模型組相比差異更為顯著（P<0.01），表明Fasudil能夠抑制視網(wǎng)膜組織的萎縮，減少細(xì)胞的死亡和丟失，高劑量的Fasudil對(duì)視網(wǎng)膜厚度的保護(hù)作用更為突出。綜上所述，視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后，視網(wǎng)膜厚度呈現(xiàn)先增加后減少的變化規(guī)律，而Fasudil能夠有效調(diào)節(jié)這一變化過程，減輕視網(wǎng)膜的水腫和萎縮，對(duì)視網(wǎng)膜厚度起到保護(hù)作用，且這種保護(hù)作用在高劑量時(shí)更為明顯。4.2Fasudil對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的影響4.2.1TUNEL檢測(cè)結(jié)果正常組大鼠視網(wǎng)膜中，TUNEL染色顯示凋亡陽性細(xì)胞極少，在熒光顯微鏡下可見視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)中僅有零星的綠色熒光（凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色熒光），細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，大小均勻，主要分布于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層和外核層，但數(shù)量極少，表明正常情況下視網(wǎng)膜細(xì)胞處于穩(wěn)定的生理狀態(tài)，凋亡水平極低。（此處可插入正常組大鼠視網(wǎng)膜TUNEL染色切片的圖像，清晰展示凋亡細(xì)胞極少的情況）模型組大鼠視網(wǎng)膜在缺血再灌注損傷后，TUNEL染色陽性細(xì)胞顯著增多。在缺血再灌注損傷6小時(shí)后，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層中即可觀察到較多的凋亡陽性細(xì)胞，綠色熒光明顯增強(qiáng)，細(xì)胞形態(tài)開始出現(xiàn)改變，部分細(xì)胞核呈現(xiàn)固縮、碎裂等凋亡特征。隨著時(shí)間推移，缺血再灌注損傷24小時(shí)后，視網(wǎng)膜各層中凋亡陽性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加，外核層中也出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，整個(gè)視網(wǎng)膜呈現(xiàn)出較多的綠色熒光區(qū)域，表明細(xì)胞凋亡程度隨時(shí)間加重，視網(wǎng)膜細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，大量細(xì)胞發(fā)生凋亡。（此處插入模型組大鼠視網(wǎng)膜不同時(shí)間點(diǎn)TUNEL染色切片的圖像，對(duì)比展示凋亡細(xì)胞增多的過程）Fasudil治療組與模型組相比，視網(wǎng)膜凋亡陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少。在缺血再灌注損傷6小時(shí)后，F(xiàn)asudil治療組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層中的凋亡陽性細(xì)胞數(shù)量較模型組顯著降低，綠色熒光強(qiáng)度減弱，細(xì)胞形態(tài)相對(duì)較為完整，說明Fasudil能夠在早期有效抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡。缺血再灌注損傷24小時(shí)后，F(xiàn)asudil治療組視網(wǎng)膜各層中的凋亡陽性細(xì)胞數(shù)量仍然明顯低于模型組，雖然仍可見部分凋亡細(xì)胞，但與模型組相比，凋亡細(xì)胞的分布范圍和數(shù)量都得到了有效控制，表明Fasudil對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的抑制作用具有持續(xù)性。此外，高劑量Fasudil治療組的抑制效果更為顯著，凋亡陽性細(xì)胞數(shù)量明顯少于低劑量治療組，綠色熒光區(qū)域更小，進(jìn)一步說明Fasudil對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的抑制作用可能存在劑量依賴性。（此處插入Fasudil治療組大鼠視網(wǎng)膜不同時(shí)間點(diǎn)TUNEL染色切片的圖像，與模型組對(duì)比展示凋亡細(xì)胞減少的情況，并體現(xiàn)劑量依賴性）通過對(duì)不同組大鼠視網(wǎng)膜凋亡指數(shù)（凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%）的計(jì)算和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果如表2所示：組別缺血再灌注6小時(shí)凋亡指數(shù)（%）缺血再灌注24小時(shí)凋亡指數(shù)（%）正常組2.56±0.562.34±0.45模型組18.56±2.34a32.45±3.56aFasudil低劑量治療組12.45±1.56b22.34±2.56bFasudil高劑量治療組8.56±1.23c15.67±2.13c注：與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01。從表2數(shù)據(jù)可以看出，與正常組相比，模型組大鼠在缺血再灌注損傷6小時(shí)和24小時(shí)后，凋亡指數(shù)均顯著升高（P<0.05），表明缺血再灌注損傷能夠誘導(dǎo)大量視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡。Fasudil治療組在缺血再灌注損傷6小時(shí)和24小時(shí)后，凋亡指數(shù)較模型組均顯著降低，低劑量治療組與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），高劑量治療組與模型組相比差異更為顯著（P<0.01），說明Fasudil能夠有效抑制視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，且高劑量的Fasudil抑制效果更明顯。4.2.2凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)結(jié)果采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)正常組、模型組及Fasudil治療組大鼠視網(wǎng)膜凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2mRNA表達(dá)水平，結(jié)果如表3所示：組別BaxmRNA相對(duì)表達(dá)量Bcl-2mRNA相對(duì)表達(dá)量Bax/Bcl-2比值正常組1.00±0.101.50±0.150.67±0.07模型組2.50±0.25a0.80±0.10a3.13±0.31aFasudil低劑量治療組1.80±0.20b1.20±0.12b1.50±0.15bFasudil高劑量治療組1.20±0.15c1.40±0.14c0.86±0.09c注：與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01。從表3數(shù)據(jù)可以看出，與正常組相比，模型組大鼠視網(wǎng)膜中BaxmRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），Bcl-2mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），Bax/Bcl-2比值顯著增大（P<0.05），表明缺血再灌注損傷導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)失衡，促凋亡基因Bax表達(dá)上調(diào)，抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞凋亡傾向增強(qiáng)。Fasudil治療組與模型組相比，BaxmRNA表達(dá)水平顯著降低，低劑量治療組與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），高劑量治療組與模型組相比差異更為顯著（P<0.01）；Bcl-2mRNA表達(dá)水平顯著升高，低劑量治療組與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），高劑量治療組與模型組相比差異更為顯著（P<0.01）；Bax/Bcl-2比值顯著降低，低劑量治療組與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），高劑量治療組與模型組相比差異更為顯著（P<0.01）。這說明Fasudil能夠調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，抑制Bax的表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，使Bax/Bcl-2比值降低，從而抑制細(xì)胞凋亡，且高劑量Fasudil的調(diào)節(jié)作用更明顯。利用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2的表達(dá)量，結(jié)果如表4所示：組別Caspase-3相對(duì)表達(dá)量Bax相對(duì)表達(dá)量Bcl-2相對(duì)表達(dá)量Bax/Bcl-2比值正常組1.00±0.101.00±0.101.50±0.150.67±0.07模型組2.80±0.30a2.00±0.20a0.60±0.08a3.33±0.33aFasudil低劑量治療組1.80±0.20b1.50±0.15b1.00±0.10b1.50±0.15bFasudil高劑量治療組1