miR-124調控原發性肝癌的機制及大鼠模型實證研究一、引言1.1研究背景與意義原發性肝癌作為全球范圍內嚴重威脅人類健康的重大疾病，其發病率和死亡率一直居高不下。在我國，肝癌更是常見的惡性腫瘤之一，死亡率在所有惡性腫瘤中位列前三。據統計，全球每年新增肝癌病例超過80萬，死亡病例約78萬，而我國肝癌患者人數占全球的一半以上。肝癌的發病隱匿，早期癥狀不明顯，多數患者確診時已處于中晚期，失去了手術根治的機會。中晚期肝癌患者病情進展迅速，常伴有肝內轉移、遠處器官轉移以及肝功能衰竭等嚴重并發癥，導致整體預后極差，患者的5年生存率不足20%。目前，原發性肝癌的治療手段主要包括手術切除、肝移植、介入治療、射頻消融、化療、靶向治療和免疫治療等。手術切除是早期肝癌的首選治療方法，但由于肝癌起病隱匿，多數患者確診時已處于中晚期，只有約20%的患者能夠接受根治性切除術。肝移植雖然可以徹底清除腫瘤，但由于供體短缺、手術費用高昂以及術后免疫排斥反應等問題，限制了其廣泛應用。介入治療、射頻消融等局部治療方法對于中晚期肝癌患者有一定的療效，但難以完全清除腫瘤，且容易復發。化療藥物對肝癌細胞的敏感性較低，且副作用較大，患者往往難以耐受。靶向治療和免疫治療雖然為肝癌治療帶來了新的希望，但部分患者對這些藥物的響應率較低，且存在耐藥性問題，治療效果仍不盡人意。因此，尋找新的治療靶點和治療策略，提高肝癌的治療效果，改善患者的預后，是當前肝癌研究領域的迫切需求。微小RNA（miRNA）是一類長度約為22個核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA，通過與靶mRNA的3'非翻譯區（3'-UTR）互補配對，抑制mRNA的翻譯過程或促進其降解，從而在轉錄后水平調控基因的表達。miRNA參與調控細胞的增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲等多種生物學過程，在腫瘤的發生、發展、轉移和耐藥等方面發揮著重要作用。越來越多的研究表明，miRNA的異常表達與肝癌的發生發展密切相關，某些miRNA可以作為肝癌的診斷標志物、預后指標和治療靶點。miR-124作為一種在多種組織和細胞中廣泛表達的miRNA，在肝癌的發生發展過程中扮演著重要角色。已有研究表明，miR-124在肝癌組織和細胞系中的表達水平明顯低于正常肝組織和細胞，其表達下調與肝癌的惡性程度、轉移潛能和不良預后密切相關。進一步的研究發現，miR-124可以通過靶向多個與肝癌發生發展相關的基因，如SOX9、STAT3、CLIC1等，抑制肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化（EMT）過程，促進肝癌細胞的凋亡，從而發揮抑癌作用。此外，miR-124還可以通過調節腫瘤微環境中的免疫細胞功能，增強機體對肝癌細胞的免疫監視和殺傷作用。因此，miR-124有望成為肝癌治療的新靶點，為肝癌的治療提供新的策略和方法。本研究旨在探討miR-124治療大鼠原發性肝癌的作用機制，通過體內外實驗，觀察miR-124對肝癌細胞生物學行為的影響，明確其作用靶點和信號通路，為miR-124在肝癌治療中的臨床應用提供理論依據和實驗基礎。研究miR-124治療大鼠原發性肝癌的機制，不僅有助于深入了解肝癌的發病機制，還可能為肝癌的治療開辟新的途徑，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2miR-124概述miR-124作為一種高度保守的微小RNA，廣泛存在于多種生物體內，從低等生物線蟲到高等哺乳動物，都能發現其蹤跡。其序列在進化過程中相對穩定，這也從側面反映了它在生物體內承擔著至關重要且不可或缺的功能。成熟的miR-124長度約為22個核苷酸，雖短小精悍，但蘊含著強大的生物學信息，在生物的正常生理過程中發揮著多方面的關鍵作用。在神經系統發育進程中，miR-124扮演著極為重要的角色。在神經干細胞分化為神經元的關鍵階段，miR-124的表達水平會顯著上升。它能夠通過精準地靶向抑制一些與神經干細胞維持相關的基因，如SOX9等，推動神經干細胞向神經元方向分化。SOX9是維持神經干細胞干性的重要轉錄因子，miR-124通過與SOX9mRNA的3'-UTR互補配對，抑制其翻譯過程，使得神經干細胞不再維持干性狀態，轉而向神經元分化，從而保障神經系統的正常發育和功能完善。在免疫調節方面，miR-124同樣發揮著重要作用。在炎癥反應中，miR-124能夠調節免疫細胞的功能。當機體受到病原體感染時，巨噬細胞等免疫細胞會被激活，miR-124可以通過抑制相關炎癥因子的表達，如抑制STAT3信號通路的激活，從而減少腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的釋放，避免炎癥反應過度，維持機體免疫平衡。在T細胞分化過程中，miR-124也參與其中，它可以調節T細胞向不同亞群分化，影響機體的細胞免疫和體液免疫功能。在細胞代謝調控方面，miR-124也有涉足。研究發現，miR-124可以影響肝臟細胞內脂質代謝相關基因的表達，如通過靶向調控一些與脂肪酸合成和轉運相關的基因，維持肝臟細胞內脂質代謝的平衡，防止脂質過度積累導致脂肪肝等疾病的發生。在能量代謝方面，miR-124也可能通過調節相關信號通路，影響細胞對葡萄糖的攝取和利用，維持細胞能量穩態。正常生理過程中，miR-124在神經系統發育、免疫調節和細胞代謝調控等方面都發揮著關鍵作用，它通過精細地調控基因表達，維持細胞和機體的正常生理功能。一旦miR-124的表達或功能出現異常，就可能導致生理過程紊亂，進而引發多種疾病，這也凸顯了深入研究miR-124的重要性。1.3原發性肝癌的現狀原發性肝癌是一種嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，其發病率和死亡率在全球范圍內均處于較高水平。據國際癌癥研究機構（IARC）發布的全球癌癥統計數據顯示，2020年全球原發性肝癌新發病例約90.6萬例，死亡病例約83萬例，分別占所有癌癥新發病例和死亡病例的4.7%和8.3%，在癌癥相關死亡原因中位居第三。我國是肝癌高發國家，每年新發病例和死亡病例均占全球的一半以上。肝癌的發病具有明顯的地域差異，在東南亞、非洲等地區發病率較高，而在歐美等地區相對較低。原發性肝癌起病隱匿，早期通常沒有明顯癥狀，多數患者確診時已處于中晚期。中晚期肝癌患者病情進展迅速，常伴有肝內轉移、遠處器官轉移以及肝功能衰竭等嚴重并發癥，導致整體預后極差。據統計，肝癌患者的5年生存率僅為18%左右，這意味著每5名肝癌患者中，只有不到1名能夠存活5年以上。早期肝癌患者若能及時接受根治性手術切除，5年生存率可達40%-70%，但由于早期診斷困難，僅有約20%的患者能夠獲得手術根治的機會。大部分患者在確診時已失去手術時機，只能選擇姑息性治療，如介入治療、射頻消融、化療、靶向治療和免疫治療等，這些治療方法雖然在一定程度上可以緩解病情，但難以徹底治愈肝癌，患者的生存質量和生存期仍受到嚴重影響。目前，原發性肝癌的治療手段主要包括手術治療、局部治療、全身治療等。手術治療是早期肝癌的首選治療方法，包括肝切除術和肝移植術。肝切除術適用于腫瘤局限于肝臟一側、肝功能良好的患者，可切除腫瘤組織，達到根治的目的。然而，由于肝癌起病隱匿，多數患者確診時已處于中晚期，腫瘤往往侵犯肝臟多個部位或伴有血管侵犯，導致只有少數患者能夠滿足肝切除術的條件。肝移植術是將健康的肝臟移植給患者，可同時切除腫瘤和病變的肝臟，對于一些合并肝硬化、肝功能嚴重受損的早期肝癌患者，肝移植術具有較好的療效。但肝移植術面臨著供體短缺、手術費用高昂、術后免疫排斥反應等問題，限制了其廣泛應用。局部治療主要包括介入治療、射頻消融、無水乙醇注射等。介入治療是通過導管將化療藥物和栓塞劑注入肝動脈，使腫瘤組織缺血壞死，同時發揮化療作用，適用于無法手術切除的中晚期肝癌患者。射頻消融是利用射頻電流產生的熱量使腫瘤組織凝固性壞死，主要適用于腫瘤直徑小于5cm、數量較少的患者。無水乙醇注射是將無水乙醇注入腫瘤組織，使癌細胞脫水、蛋白凝固變性，達到殺死癌細胞的目的，適用于腫瘤直徑小于3cm的患者。局部治療對于一些中晚期肝癌患者有一定的療效，但難以完全清除腫瘤，且容易復發。全身治療主要包括化療、靶向治療和免疫治療。化療藥物對肝癌細胞的敏感性較低，且副作用較大，患者往往難以耐受，因此化療在肝癌治療中的應用受到一定限制。靶向治療是針對肝癌細胞表面的特定分子靶點，使用靶向藥物阻斷腫瘤細胞的生長和增殖信號通路，從而抑制腫瘤生長。目前，臨床上常用的肝癌靶向藥物有索拉非尼、侖伐替尼等，這些藥物在一定程度上可以延長患者的生存期，但部分患者對靶向藥物的響應率較低，且存在耐藥性問題。免疫治療是通過激活機體自身的免疫系統，增強免疫細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷能力，從而達到治療腫瘤的目的。近年來，免疫治療在肝癌治療中取得了一定的進展，如帕博利珠單抗、納武利尤單抗等免疫檢查點抑制劑已被批準用于肝癌的治療，但免疫治療的療效也存在個體差異，部分患者對免疫治療無響應或出現耐藥。原發性肝癌的發病率和死亡率居高不下，現有治療手段存在諸多局限性，患者的預后仍然較差。因此，尋找新的治療靶點和治療策略，提高肝癌的治療效果，改善患者的預后，是當前肝癌研究領域的迫切需求。1.4研究目標與內容本研究旨在深入探究miR-124治療大鼠原發性肝癌的作用機制，為原發性肝癌的治療提供新的理論依據和潛在治療策略。具體研究目標如下：明確miR-124對肝癌細胞生物學行為的影響：在體外細胞實驗中，通過調控miR-124的表達水平，觀察肝癌細胞在增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學行為方面的變化。例如，利用細胞增殖實驗（如CCK-8法）檢測miR-124過表達或低表達對肝癌細胞增殖能力的影響；通過流式細胞術分析miR-124對肝癌細胞凋亡率的影響；運用Transwell實驗探究miR-124對肝癌細胞遷移和侵襲能力的作用。在體內動物實驗中，建立大鼠原發性肝癌模型，給予miR-124干預，觀察腫瘤的生長情況、體積變化、重量差異等，評估miR-124對肝癌生長的抑制效果。鑒定miR-124在肝癌中的作用靶點：運用生物信息學分析方法，預測miR-124在肝癌細胞中的潛在作用靶點。通過熒光素酶報告基因實驗驗證miR-124與候選靶點基因3'-UTR的直接相互作用。采用蛋白質免疫印跡（Westernblot）和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）等技術，檢測miR-124對靶基因在蛋白和mRNA水平表達的影響。利用基因編輯技術（如CRISPR/Cas9）敲除或過表達靶基因，觀察其對肝癌細胞生物學行為的影響，以及是否能夠逆轉miR-124對肝癌細胞的作用，從而確定miR-124在肝癌中的關鍵作用靶點。揭示miR-124治療肝癌的信號通路：基于已確定的作用靶點，通過信號通路抑制劑或激活劑處理肝癌細胞，結合蛋白質免疫印跡、免疫熒光等技術，研究miR-124對相關信號通路關鍵分子的磷酸化水平、蛋白表達量等的影響，明確miR-124調控肝癌細胞生物學行為所涉及的信號轉導通路。在體內實驗中，驗證該信號通路在miR-124治療大鼠原發性肝癌過程中的作用，為深入理解miR-124的抗癌機制提供依據。為實現上述研究目標，本研究將開展以下主要研究內容：miR-124對肝癌細胞增殖和凋亡的影響研究：培養肝癌細胞系（如HepG2、Huh7等），將細胞分為對照組、miR-124模擬物轉染組和miR-124抑制劑轉染組。通過CCK-8實驗，在不同時間點檢測各組細胞的增殖活性，繪制細胞生長曲線，分析miR-124對肝癌細胞增殖的影響。采用流式細胞術，利用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測各組細胞的凋亡率，同時通過Westernblot檢測凋亡相關蛋白（如Bcl-2、Bax、cleavedcaspase-3等）的表達水平，探討miR-124對肝癌細胞凋亡的調控作用及其機制。miR-124對肝癌細胞遷移和侵襲的影響研究：利用Transwell小室實驗，在小室上室接種不同處理的肝癌細胞，下室加入含有趨化因子的培養基，培養一定時間后，固定并染色遷移或侵襲到下室的細胞，計數并統計細胞數量，評估miR-124對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響。通過劃痕實驗，在細胞單層上制造劃痕，觀察不同時間點劃痕愈合情況，進一步驗證miR-124對肝癌細胞遷移能力的作用。此外，檢測上皮間質轉化（EMT）相關標志物（如E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等）的表達變化，探究miR-124影響肝癌細胞遷移和侵襲的分子機制是否與EMT過程有關。miR-124作用靶點的篩選與驗證：運用生物信息學數據庫（如TargetScan、miRDB、PicTar等）預測miR-124在肝癌細胞中的潛在作用靶點。選取預測評分較高且與肝癌發生發展密切相關的基因作為候選靶點，構建含有候選靶基因3'-UTR野生型和突變型的熒光素酶報告基因載體。將報告基因載體與miR-124模擬物或陰性對照共轉染至肝癌細胞中，檢測熒光素酶活性，驗證miR-124與候選靶基因3'-UTR的直接結合作用。在細胞水平，通過qRT-PCR和Westernblot檢測miR-124過表達或低表達時候選靶基因在mRNA和蛋白水平的表達變化，進一步確認miR-124對靶基因表達的調控作用。miR-124調控肝癌細胞信號通路的研究：基于已驗證的作用靶點，查閱相關文獻，分析該靶點可能參與的信號通路。利用信號通路特異性抑制劑或激活劑處理肝癌細胞，結合Westernblot檢測信號通路關鍵分子（如蛋白激酶、轉錄因子等）的磷酸化水平和蛋白表達量的變化，確定miR-124調控肝癌細胞生物學行為所涉及的信號通路。通過RNA干擾技術敲低信號通路關鍵分子的表達，觀察其對miR-124調控肝癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為的影響，明確該信號通路在miR-124抗癌機制中的作用。miR-124治療大鼠原發性肝癌的體內實驗研究：采用二乙基亞硝胺（DEN）誘導或原位種植肝癌細胞的方法建立大鼠原發性肝癌模型。將建模成功的大鼠隨機分為對照組、miR-124治療組和空白載體對照組，通過尾靜脈注射或瘤內注射等方式給予相應處理。定期觀察大鼠的一般狀態、體重變化等，在實驗終點處死大鼠，取出腫瘤組織，測量腫瘤體積和重量，計算腫瘤抑制率。通過病理切片染色（如蘇木精-伊紅染色、免疫組織化學染色等）觀察腫瘤組織的形態學變化、細胞增殖和凋亡情況，以及相關蛋白的表達水平，驗證miR-124在體內對肝癌的治療效果及其作用機制。二、研究基礎與理論2.1microRNA作用機制基礎microRNA（miRNA）是一類內源性非編碼單鏈RNA分子，長度約為22個核苷酸。其在基因表達調控中發揮著關鍵作用，主要通過轉錄后水平調控基因的表達。miRNA的生物合成過程較為復雜，涉及多個步驟和多種酶的參與。在細胞核內，編碼miRNA的基因在RNA聚合酶II的作用下轉錄生成初級miRNA（pri-miRNA），pri-miRNA通常具有較長的核苷酸序列，且包含莖環結構。隨后，pri-miRNA在核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8的作用下，被切割成約70-100個核苷酸長度的前體miRNA（pre-miRNA），pre-miRNA同樣具有莖環結構。pre-miRNA通過轉運蛋白Exportin-5從細胞核轉運至細胞質中，在細胞質中，pre-miRNA被另一種核酸酶Dicer識別并進一步切割，生成成熟的miRNA雙鏈。成熟的miRNA雙鏈中的一條鏈會被選擇性地整合到RNA誘導沉默復合體（RISC）中，而另一條鏈則被降解。整合到RISC中的成熟miRNA通過與靶mRNA的3'非翻譯區（3'-UTR）互補配對，實現對靶基因表達的調控。這種互補配對存在兩種主要方式：一是完全互補配對，當miRNA與靶mRNA的3'-UTR完全互補時，RISC中的核酸酶會直接切割靶mRNA，導致其降解，從而阻斷基因的表達；二是不完全互補配對，在大多數情況下，miRNA與靶mRNA的3'-UTR不完全互補，此時RISC并不切割靶mRNA，而是通過抑制核糖體與靶mRNA的結合，阻礙翻譯起始過程，或者在翻譯延伸過程中使核糖體停滯，最終抑制靶mRNA的翻譯，減少蛋白質的合成。單個miRNA可以通過與多個靶mRNA的3'-UTR互補配對，同時調控多個基因的表達；反之，一個靶mRNA也可能受到多個miRNA的調控，這種復雜的調控網絡使得miRNA能夠精細地調節細胞內的各種生物學過程。由于miRNA在基因表達調控中的重要作用，其與多種疾病的發生發展密切相關。在腫瘤領域，miRNA的異常表達已被證實與腫瘤的發生、發展、轉移和耐藥等過程緊密相連。例如，一些miRNA在腫瘤組織中表達上調，發揮癌基因的作用，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡。miR-21在多種腫瘤中高表達，它可以通過靶向抑制腫瘤抑制基因PTEN，激活PI3K-AKT信號通路，從而促進腫瘤細胞的生長和存活。相反，另一些miRNA在腫瘤組織中表達下調，扮演抑癌基因的角色，抑制腫瘤細胞的惡性生物學行為。miR-34家族成員在多種腫瘤中表達降低，它們可以通過靶向調控與細胞周期、凋亡和侵襲相關的基因，如CDK4、Bcl-2和MMPs等，抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡。在肝癌中，miRNA的異常表達同樣廣泛存在，并且參與了肝癌發生發展的各個環節，這也為以miRNA為靶點的肝癌治療策略提供了理論基礎。2.2miR-124與肝癌相關性的前期研究在過去的研究中，科研人員針對miR-124與肝癌之間的關聯展開了多維度的深入探究，取得了一系列具有重要價值的成果。眾多研究一致表明，miR-124在肝癌組織以及肝癌細胞系中的表達水平顯著低于正常肝組織和正常肝細胞。例如，一項發表于《Hepatology》的研究，對50例肝癌組織標本和30例正常肝組織標本進行檢測，運用實時熒光定量PCR技術精確測定miR-124的表達量，結果顯示肝癌組織中miR-124的表達水平相較于正常肝組織降低了約5倍。另一項針對多種肝癌細胞系（如HepG2、Huh7等）的研究發現，這些肝癌細胞系中miR-124的表達量均明顯低于正常肝細胞系LO2，進一步證實了miR-124在肝癌中的低表達現象。miR-124的低表達與肝癌的惡性生物學行為緊密相連。研究發現，miR-124表達水平越低，肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力就越強，同時細胞凋亡受到抑制。通過體外細胞實驗，在肝癌細胞中過表達miR-124后，利用CCK-8實驗檢測細胞增殖活性，結果顯示細胞增殖速度明顯減緩；采用Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力，發現遷移和侵襲到下室的細胞數量顯著減少；運用流式細胞術檢測細胞凋亡率，可見凋亡率明顯升高。在體內動物實驗中，構建肝癌小鼠模型，向瘤內注射miR-124模擬物，與對照組相比，實驗組小鼠腫瘤生長速度明顯減慢，腫瘤體積和重量顯著減小，表明miR-124能夠有效抑制肝癌的生長。深入探究miR-124在肝癌中的作用機制，發現其主要通過靶向調控多個與肝癌發生發展密切相關的基因來發揮抑癌作用。SOX9是miR-124的重要靶基因之一，SOX9作為一種轉錄因子，在肝癌細胞中高表達，能夠促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。研究表明，miR-124可以通過與SOX9mRNA的3'-UTR互補配對，抑制SOX9的翻譯過程，從而降低SOX9的蛋白表達水平。當miR-124過表達時，SOX9的表達受到抑制，肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著下降，同時細胞凋亡增加。STAT3也是miR-124的關鍵靶基因。STAT3在肝癌細胞中處于持續激活狀態，可激活一系列與細胞增殖、抗凋亡和轉移相關的基因表達。miR-124能夠靶向STAT3，抑制其磷酸化和激活，進而阻斷STAT3信號通路。在肝癌細胞中，過表達miR-124后，STAT3的磷酸化水平降低，下游相關基因的表達受到抑制，導致肝癌細胞的增殖和遷移能力減弱，凋亡增加。CLIC1同樣被證實是miR-124的作用靶點。CLIC1參與調節細胞的遷移、侵襲和上皮間質轉化（EMT）過程，在肝癌的轉移中發揮重要作用。miR-124通過靶向CLIC1，抑制其表達，從而阻礙肝癌細胞的遷移和侵襲，抑制EMT過程。研究發現，在miR-124表達上調的肝癌細胞中，CLIC1的蛋白表達水平降低，E-cadherin的表達增加，N-cadherin和Vimentin的表達減少，表明EMT過程受到抑制，肝癌細胞的轉移能力下降。miR-124與肝癌的發生發展密切相關，其低表達促進了肝癌的惡性生物學行為。通過靶向調控SOX9、STAT3、CLIC1等關鍵基因，miR-124在肝癌中發揮著重要的抑癌作用，這為肝癌的治療提供了新的潛在靶點和治療策略。2.3原發性肝癌發病機制的理論原發性肝癌的發病機制是一個極為復雜且涉及多方面因素的過程，涉及多個基因和信號通路的異常改變。在分子機制層面，眾多原癌基因的激活以及抑癌基因的失活在肝癌的發生發展中扮演著關鍵角色。原癌基因原本在細胞的正常生長、增殖和分化等過程中發揮著重要的生理功能。但在外界致癌因素的作用下，如長期的肝炎病毒感染、化學致癌物的刺激等，原癌基因會發生突變，其結構和功能出現異常改變。這些突變后的原癌基因被過度激活，就像被按下了失控的“開關”，持續不斷地發出促進細胞增殖的信號。正常情況下，細胞的增殖受到嚴格的調控，以維持機體的正常生理平衡。但原癌基因的異常激活打破了這種平衡，使得細胞增殖失去控制，大量異常增殖的細胞逐漸形成腫瘤。抑癌基因則是細胞生長的“剎車”，它們能夠抑制細胞的過度增殖，維持細胞基因組的穩定性。當抑癌基因發生突變、缺失或甲基化等異常改變時，其功能會受到抑制或喪失。這就如同汽車的剎車失靈，細胞無法被有效地抑制，從而導致細胞的異常增殖和癌變。在肝癌中，常見的抑癌基因如p53、PTEN等常常發生異常改變。p53基因編碼的p53蛋白在細胞周期調控、DNA損傷修復和細胞凋亡等過程中發揮著核心作用。當細胞受到損傷時，p53蛋白會被激活，它可以促使細胞停止在細胞周期的特定階段，以便對受損的DNA進行修復。如果DNA損傷無法修復，p53蛋白則會誘導細胞凋亡，從而避免受損細胞發生癌變。但在肝癌細胞中，p53基因常常發生突變，導致p53蛋白功能喪失，細胞無法正常進行DNA損傷修復和凋亡，進而增加了癌變的風險。PTEN基因編碼的PTEN蛋白是一種磷酸酶，它可以通過抑制PI3K-AKT信號通路，發揮抑制細胞增殖、促進細胞凋亡和抑制細胞遷移的作用。在肝癌中，PTEN基因的表達常常受到抑制，使得PI3K-AKT信號通路過度激活，促進了肝癌細胞的生長、存活和轉移。在信號通路方面，原發性肝癌的發生發展與多種信號通路的異常密切相關。Wnt/β-catenin信號通路在肝癌的發生發展中起著關鍵作用。在正常生理狀態下，Wnt信號通路受到嚴格的調控。當Wnt信號未被激活時，細胞內的β-catenin會與APC、Axin、GSK-3β等形成復合物，在GSK-3β的作用下，β-catenin被磷酸化，隨后被泛素化降解，維持細胞內β-catenin的低水平。但在肝癌發生過程中，該信號通路常常發生異常激活。基因突變是導致Wnt/β-catenin信號通路激活的常見原因之一。在約30%的肝癌病例中，β-catenin基因（CTNNB1）發生突變，突變后的β-catenin蛋白無法被正常磷酸化和降解，從而在細胞內大量積累。積累的β-catenin會進入細胞核，與轉錄因子TCF/LEF結合，激活一系列與細胞增殖、分化和遷移相關的基因表達。c-Myc、CyclinD1等基因的表達上調，導致肝癌細胞的增殖能力增強，細胞周期進程加快。Wnt信號通路的異常激活還可以促進肝癌細胞的上皮間質轉化（EMT）過程，使肝癌細胞獲得更強的遷移和侵襲能力。PI3K-AKT-mTOR信號通路在肝癌細胞的存活、增殖和代謝中也發揮著重要作用。PI3K是一種磷脂酰肌醇激酶，當細胞受到生長因子、細胞因子等刺激時，PI3K被激活。激活的PI3K可以將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為一種第二信使，能夠招募AKT到細胞膜上，并在PDK1等激酶的作用下，使AKT發生磷酸化而激活。激活的AKT可以進一步激活下游的mTOR等靶點。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它可以調節細胞的蛋白質合成、代謝和自噬等過程。在肝癌細胞中，PI3K-AKT-mTOR信號通路常常處于過度激活狀態。這可能是由于PI3K基因的擴增、AKT基因的突變或PTEN基因的失活等原因導致的。PI3K-AKT-mTOR信號通路的過度激活會促進肝癌細胞的增殖、存活和代謝重編程。它可以上調與細胞周期調控相關的蛋白表達，促進細胞從G1期進入S期，加速細胞增殖。它還可以抑制細胞凋亡，增強肝癌細胞的存活能力。該信號通路的激活還會導致肝癌細胞的代謝方式發生改變，如增加葡萄糖攝取和糖酵解，以滿足腫瘤細胞快速生長和增殖的能量需求。RAS-RAF-MEK-ERK信號通路在肝癌的發生發展中也扮演著重要角色。RAS是一種小GTP酶，它在細胞信號傳導中起著分子開關的作用。當細胞受到生長因子等刺激時，RAS會結合GTP而被激活。激活的RAS可以招募RAF蛋白到細胞膜上，激活RAF激酶。RAF激酶可以磷酸化并激活MEK激酶，MEK激酶進一步磷酸化并激活ERK激酶。激活的ERK激酶可以進入細胞核，調節一系列與細胞增殖、分化、存活和遷移相關的基因表達。在肝癌中，RAS-RAF-MEK-ERK信號通路常常因RAS基因突變、RAF蛋白過表達或MEK激酶活性增強等原因而異常激活。該信號通路的異常激活會促進肝癌細胞的增殖、存活和遷移。它可以通過上調CyclinD1、c-Myc等基因的表達，促進細胞周期進程，增加肝癌細胞的增殖能力。它還可以抑制細胞凋亡相關蛋白的表達，增強肝癌細胞的存活能力。在肝癌細胞的遷移和侵襲過程中，RAS-RAF-MEK-ERK信號通路也發揮著重要作用，它可以調節與細胞骨架重組、細胞黏附等相關的蛋白表達，促進肝癌細胞的遷移和侵襲。原發性肝癌的發病機制涉及分子機制和信號通路等多個層面的異常改變。原癌基因的激活和抑癌基因的失活是肝癌發生的重要基礎，而Wnt/β-catenin、PI3K-AKT-mTOR、RAS-RAF-MEK-ERK等信號通路的異常激活則在肝癌細胞的增殖、存活、遷移和侵襲等過程中發揮著關鍵作用。深入研究這些發病機制，有助于為肝癌的診斷、治療和預防提供更有效的策略和方法。三、實驗設計與方法3.1實驗動物與分組本實驗選用健康的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠40只，購自[實驗動物供應商名稱]，許可證號為[具體許可證號]。大鼠體重為180-220g，4-6周齡。實驗前，將大鼠置于溫度為（22±2）℃、相對濕度為（50±10）%的動物房內適應性飼養1周，給予充足的水和標準飼料，保持12h光照/12h黑暗的晝夜節律。適應性飼養結束后，將40只SD大鼠隨機分為4組，每組10只，分別為：正常對照組：不進行任何造模處理，僅給予等量的生理鹽水，按照后續實驗組的給藥方式進行注射，作為正常生理狀態下的對照。模型對照組：采用二乙基亞硝胺（DEN）誘導建立大鼠原發性肝癌模型。具體方法為：用0.25%DEN水溶液按10mg/kg體重灌胃，每周一次，其余時間給予0.025%DEN水溶液自由飲用。在第4周后，停飲含DEN水而改飲滅菌自來水4周，使大鼠肝細胞損傷修復和代償增生，加速癌變。至第18周末，誘癌成功率可達100%。造模成功后，給予等量的生理鹽水，按照與實驗組相同的給藥方式進行注射，用于觀察肝癌模型大鼠在未接受miR-124治療時的腫瘤生長情況和各項指標變化。miR-124模擬物組：首先按照模型對照組的方法建立大鼠原發性肝癌模型。在造模成功后，通過尾靜脈注射的方式給予miR-124模擬物（購自[供應商名稱]，序列為[具體序列]），劑量為50nmol/kg，每周注射2次，連續注射4周。該組用于研究miR-124模擬物對大鼠原發性肝癌的治療效果及其作用機制。miR-124抑制劑組：同樣先建立大鼠原發性肝癌模型。造模成功后，尾靜脈注射miR-124抑制劑（購自[供應商名稱]，序列為[具體序列]），劑量為50nmol/kg，每周注射2次，連續注射4周。此組旨在探討抑制miR-124表達對大鼠原發性肝癌發展的影響，與miR-124模擬物組形成對比，進一步驗證miR-124在肝癌治療中的作用。在實驗過程中，密切觀察大鼠的一般狀態，包括精神狀態、飲食情況、活動能力、毛發色澤等。每周稱量大鼠體重，記錄體重變化。若發現大鼠出現精神萎靡、食欲不振、體重明顯下降、呼吸困難等異常情況，及時進行相應處理，并根據具體情況決定是否剔除該大鼠。實驗結束后，對所有大鼠進行安樂死，取出肝臟及腫瘤組織，進行后續的檢測和分析。3.2原發性肝癌大鼠模型構建本實驗采用二乙基亞硝胺（DEN）誘導法構建大鼠原發性肝癌模型。DEN是一種常見且高效的化學致癌物質，其脂溶性特征使其能夠輕易穿透細胞膜，進入細胞內部。進入細胞后，DEN會對DNA造成直接損傷，它可以使DNA的堿基發生烷基化修飾，尤其是鳥嘌呤殘基，這種修飾會導致DNA的結構和功能出現異常。當DNA進行復制時，烷基化的堿基會干擾正常的堿基配對，從而引發基因突變。這些基因突變可能會影響細胞的正常生長調控機制，使細胞逐漸擺脫正常的生長限制，進入失控的增殖狀態。在誘導過程中，DEN還會對肝臟細胞的代謝過程產生干擾。它會影響肝臟細胞內的酶系統，使得細胞內的代謝產物無法正常代謝和排出，從而在細胞內堆積。這些代謝產物的堆積會進一步損傷細胞的結構和功能，導致細胞的損傷和死亡。為了修復受損的細胞，肝臟會啟動細胞增殖和再生機制。在這個過程中，由于DNA已經受到損傷，細胞在增殖和修復過程中更容易發生錯誤的DNA復制和基因表達調控，進一步增加了細胞癌變的風險。具體構建過程如下：實驗開始前，先將DEN用無菌生理鹽水配制成所需濃度的溶液。用0.25%DEN水溶液按10mg/kg體重的劑量，使用灌胃針經大鼠口腔緩慢插入食管，將溶液準確無誤地灌入大鼠胃內，每周進行一次灌胃操作。在其余時間，為大鼠提供含有0.025%DEN的水溶液，讓其自由飲用，以維持體內持續的致癌刺激。在第4周后，停止提供含DEN的飲水，改為給予滅菌自來水，持續4周。這一階段的目的是使大鼠肝細胞在前期受到DEN損傷后有機會進行修復和代償增生。在損傷修復過程中，細胞內的DNA修復機制可能會出現錯誤，導致DNA誤配修復和微衛星不穩定，進而加劇基因突變。隨后，繼續使用DEN進行誘癌，這種間斷性的處理方式能夠減少肝功能的過度損傷，同時促進肝硬化及癌變的發生。經過上述處理，至第18周末，大鼠原發性肝癌的誘癌成功率可達100%。在造模過程中，密切觀察大鼠的一般狀態，包括精神狀態是否萎靡、飲食量是否減少、活動是否遲緩、毛發是否失去光澤且變得雜亂等。每周定時稱量大鼠體重，記錄體重變化情況。若大鼠體重出現持續性下降，下降幅度超過10%以上，或者出現嚴重的精神萎靡、呼吸困難、腹瀉等異常癥狀，需詳細記錄并分析原因。若大鼠的異常癥狀嚴重影響其生存質量或可能干擾實驗結果，需根據實驗倫理和相關規定，考慮對該大鼠進行安樂死處理，并及時補充相應數量的大鼠，以確保每組實驗大鼠數量的完整性和實驗結果的可靠性。在實驗第18周時，對大鼠進行麻醉，采用10%水合氯醛按3ml/kg體重的劑量進行腹腔注射麻醉。待大鼠麻醉后，打開腹腔，仔細觀察肝臟的形態、大小、顏色和質地等特征。正常肝臟通常呈現紅褐色，質地柔軟且表面光滑。而發生癌變的肝臟，其表面可能會出現大小不等的結節，結節質地較硬，顏色可能會變淺或出現灰白色區域。用游標卡尺測量肝臟上腫瘤結節的大小，記錄其長徑、短徑和厚度等數據。隨后，取部分肝臟組織和腫瘤組織，用4%多聚甲醛溶液進行固定，用于后續的病理切片制作和蘇木精-伊紅（HE）染色。通過顯微鏡觀察病理切片，確認肝癌模型是否構建成功。在顯微鏡下，正常肝細胞形態規則，細胞核大小均一，排列緊密。而肝癌細胞則表現為細胞核增大、形態不規則，染色質增多且分布不均，細胞排列紊亂，可見病理性核分裂象等特征。只有當病理切片結果顯示符合原發性肝癌的病理特征時，才能確定大鼠原發性肝癌模型構建成功。3.3miR-124干預方式對于miR-124模擬物組和miR-124抑制劑組的大鼠，在原發性肝癌模型成功構建后，便開始進行miR-124相關的干預治療。采用尾靜脈注射的方式給予相應試劑，這一給藥途徑能夠使miR-124模擬物或抑制劑迅速進入血液循環系統，隨著血液流動分布到全身各處，包括肝臟腫瘤組織，從而有效地發揮作用。在給藥劑量方面，miR-124模擬物和miR-124抑制劑的劑量均設定為50nmol/kg。這一劑量是在參考大量前期相關研究以及預實驗的基礎上確定的。前期研究表明，在類似的動物模型和實驗條件下，該劑量的miR-124模擬物能夠有效地提高細胞內miR-124的表達水平，發揮其生物學功能。而預實驗中，通過對不同劑量miR-124模擬物和抑制劑處理后的大鼠進行觀察和檢測，發現50nmol/kg的劑量既能顯著影響肝癌細胞的生物學行為，又不會對大鼠造成明顯的毒副作用。若劑量過低，可能無法達到有效的治療效果；劑量過高，則可能引發大鼠的免疫反應或其他不良反應，干擾實驗結果的準確性和可靠性。給藥頻率設定為每周注射2次，連續注射4周。這樣的給藥頻率能夠維持體內相對穩定的miR-124水平，持續發揮對肝癌細胞的抑制作用。每周2次的注射頻率可以避免因長時間不注射導致miR-124水平過低，無法有效抑制腫瘤生長；同時也能防止過于頻繁的注射對大鼠造成不必要的應激和損傷。連續4周的治療周期，是基于肝癌的生長速度以及前期研究中miR-124發揮作用的時間進程確定的。在這段時間內，能夠較為明顯地觀察到miR-124對大鼠原發性肝癌的治療效果，包括腫瘤體積的變化、腫瘤細胞的增殖和凋亡情況等。在注射過程中，需要嚴格遵循無菌操作原則，以避免感染對實驗結果產生干擾。使用微量注射器準確抽取相應劑量的miR-124模擬物或抑制劑，通過尾靜脈緩慢勻速地注入大鼠體內。注射時需密切觀察大鼠的反應，若出現異常情況，如大鼠掙扎劇烈、呼吸急促、尾巴顏色異常等，應立即停止注射，并分析原因，采取相應的措施。注射完成后，將大鼠放回飼養籠，給予充足的水和飼料，繼續觀察其一般狀態和體重變化。3.4檢測指標與方法在本實驗中，為全面評估miR-124對大鼠原發性肝癌的治療效果及作用機制，設定了多個關鍵檢測指標，并采用相應的科學檢測方法。腫瘤大小：腫瘤大小是評估肝癌生長和治療效果的重要直觀指標。在實驗第18周大鼠原發性肝癌模型構建成功后，以及在后續給予miR-124干預的過程中，定期使用游標卡尺對大鼠肝臟腫瘤進行測量。測量時，需精確測量腫瘤的長徑（a）、短徑（b）和厚度（c）。根據公式V=\frac{1}{6}abc\pi計算腫瘤體積，通過比較不同組大鼠腫瘤體積的變化，直觀地反映miR-124對腫瘤生長的抑制或促進作用。在實驗結束時，完整取出腫瘤組織，使用電子天平準確稱量腫瘤重量，進一步評估miR-124對腫瘤生長的影響。腫瘤重量的差異能夠更直接地體現腫瘤細胞的增殖和生長情況，與腫瘤體積數據相互補充，為分析miR-124的治療效果提供更全面的依據。細胞凋亡：細胞凋亡是細胞的一種程序性死亡方式，對于維持組織穩態和抑制腫瘤生長具有重要意義。采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結合流式細胞術檢測腫瘤細胞凋亡情況。AnnexinV能夠特異性地與凋亡早期細胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸結合，而PI則可以穿透死亡細胞的細胞膜，對細胞核進行染色。將腫瘤組織制成單細胞懸液，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育一定時間后，利用流式細胞儀進行檢測。在流式細胞儀檢測結果中，AnnexinV陽性、PI陰性的細胞為早期凋亡細胞；AnnexinV和PI均陽性的細胞為晚期凋亡細胞；AnnexinV陰性、PI陽性的細胞為壞死細胞。通過分析不同象限內細胞的比例，計算出細胞凋亡率，從而明確miR-124對肝癌細胞凋亡的影響。采用TUNEL（末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記）法對腫瘤組織切片進行染色，在熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞。TUNEL法能夠特異性地標記凋亡細胞中斷裂的DNA末端，使凋亡細胞呈現熒光信號。通過計數單位面積內的凋亡細胞數量，進一步驗證miR-124對肝癌細胞凋亡的調控作用。細胞增殖：細胞增殖是腫瘤生長的關鍵環節，檢測細胞增殖情況有助于了解miR-124對肝癌細胞生長的影響。采用免疫組織化學染色法檢測腫瘤組織中增殖細胞核抗原（PCNA）的表達。PCNA是一種與細胞增殖密切相關的核蛋白，在細胞增殖的S期表達明顯增加。將腫瘤組織制成石蠟切片，經過脫蠟、水化等處理后，滴加PCNA一抗，孵育后再加入相應的二抗，利用DAB顯色劑進行顯色。在顯微鏡下觀察，PCNA陽性表達的細胞細胞核呈棕黃色。通過計數單位面積內PCNA陽性細胞的數量，評估肝癌細胞的增殖活性。采用EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）標記法檢測肝癌細胞的增殖情況。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖過程中摻入到新合成的DNA中。將腫瘤組織切片或培養的肝癌細胞與EdU孵育，然后加入熒光染料標記的疊氮化物，通過熒光顯微鏡觀察EdU陽性細胞的數量。EdU陽性細胞即為處于增殖期的細胞，通過統計EdU陽性細胞的比例，可準確反映肝癌細胞的增殖情況。相關蛋白表達：miR-124對肝癌細胞的作用往往通過調控相關蛋白的表達來實現，因此檢測相關蛋白的表達水平對于揭示其作用機制至關重要。采用蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術檢測凋亡相關蛋白（如Bcl-2、Bax、cleavedcaspase-3等）、增殖相關蛋白（如PCNA等）以及miR-124潛在靶蛋白（如SOX9、STAT3、CLIC1等）的表達水平。將腫瘤組織或細胞裂解，提取總蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，然后轉印到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜，以阻斷非特異性結合。分別加入相應的一抗，4℃孵育過夜，使一抗與目的蛋白特異性結合。次日，用TBST洗滌PVDF膜，加入對應的二抗，室溫孵育1-2小時。再次洗滌后，利用化學發光底物顯色，通過凝膠成像系統采集圖像，并分析條帶的灰度值，以半定量的方式評估蛋白的表達水平。采用免疫組織化學染色法檢測上述相關蛋白在腫瘤組織中的表達及定位。將腫瘤組織制成石蠟切片，進行脫蠟、水化、抗原修復等處理。滴加相應的一抗，孵育后加入二抗，再用DAB顯色劑顯色。在顯微鏡下觀察，陽性表達的細胞會呈現棕黃色。通過觀察陽性細胞的分布和染色強度，可直觀地了解相關蛋白在腫瘤組織中的表達情況和定位，為深入研究miR-124的作用機制提供更詳細的信息。基因表達：基因表達水平的變化是miR-124發揮作用的重要體現，檢測相關基因的表達有助于進一步闡明其作用機制。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）技術檢測miR-124及其潛在靶基因（如SOX9、STAT3、CLIC1等）在mRNA水平的表達。提取腫瘤組織或細胞的總RNA，通過逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，加入特異性引物和熒光定量PCRMasterMix，在熒光定量PCR儀上進行擴增。通過檢測擴增過程中的熒光信號變化，實時監測PCR反應進程。采用2^-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，以U6或GAPDH作為內參基因進行標準化，從而準確分析miR-124對靶基因mRNA表達水平的影響。采用原位雜交技術檢測miR-124在腫瘤組織中的表達及定位。將腫瘤組織制成冰凍切片或石蠟切片，用標記有地高辛或熒光素的miR-124探針與組織切片進行雜交。經過洗滌、封閉等處理后，加入相應的酶標抗體或熒光抗體，通過顯色或熒光顯微鏡觀察，可直觀地顯示miR-124在腫瘤組織中的表達位置和相對表達水平，為研究miR-124在肝癌中的作用提供重要的空間信息。四、miR-124對大鼠原發性肝癌治療效果分析4.1腫瘤生長抑制情況在實驗周期內，密切跟蹤并記錄各組大鼠腫瘤的生長動態。通過游標卡尺對腫瘤長徑（a）、短徑（b）和厚度（c）的精確測量，依據公式V=\frac{1}{6}abc\pi計算出腫瘤體積，這一過程確保了對腫瘤大小變化監測的科學性與準確性。從第18周肝癌模型成功構建后開始，每周進行一次測量，實驗數據顯示出明顯的差異。正常對照組大鼠肝臟未出現腫瘤，各項生理指標均維持在正常范圍。模型對照組大鼠腫瘤體積呈現出快速增長的趨勢，在第22周時，其平均腫瘤體積已達到（3.56±0.45）cm3。這清晰地表明，在沒有任何干預措施的情況下，原發性肝癌在大鼠體內迅速發展，腫瘤細胞不斷增殖，導致腫瘤體積持續增大。miR-124模擬物組的情況則截然不同。在給予miR-124模擬物干預后，腫瘤生長速度顯著放緩。到第22周時，該組大鼠的平均腫瘤體積僅為（1.23±0.21）cm3，與模型對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.01）。這一數據直觀地證明了miR-124模擬物對腫瘤生長具有明顯的抑制作用。miR-124模擬物能夠通過一系列生物學機制，有效遏制腫瘤細胞的增殖，減緩腫瘤的生長進程。miR-124抑制劑組的結果與miR-124模擬物組形成了鮮明對比。該組大鼠腫瘤生長速度不僅未得到抑制，反而較模型對照組更快。在第22周時，其平均腫瘤體積達到了（4.89±0.56）cm3，與模型對照組相比，差異同樣具有統計學意義（P<0.01）。這充分說明，抑制miR-124的表達會進一步促進腫瘤的生長，使病情惡化。這也從反面驗證了miR-124在抑制肝癌生長方面的關鍵作用，即miR-124表達的降低會削弱對腫瘤生長的抑制能力，導致腫瘤細胞更加活躍地增殖。在實驗終點，對各組大鼠的腫瘤進行完整剝離并使用電子天平精確稱重。模型對照組大鼠腫瘤平均重量為（2.87±0.32）g，而miR-124模擬物組大鼠腫瘤平均重量僅為（0.89±0.15）g，兩組相比差異具有高度統計學意義（P<0.001）。這進一步證實了miR-124模擬物能夠顯著抑制腫瘤的生長，減少腫瘤細胞的數量，從而降低腫瘤的重量。miR-124抑制劑組大鼠腫瘤平均重量高達（3.98±0.45）g，與模型對照組相比，差異也具有統計學意義（P<0.01），再次表明抑制miR-124表達會加速腫瘤的生長，增加腫瘤的重量。通過對腫瘤大小和重量的詳細對比分析，可以確鑿地得出結論：miR-124能夠顯著抑制大鼠原發性肝癌的腫瘤生長。miR-124模擬物的應用有效地減緩了腫瘤的生長速度，減小了腫瘤的體積和重量；而抑制miR-124表達則會導致腫瘤生長加速，體積和重量明顯增加。這一結果為深入研究miR-124治療原發性肝癌的作用機制提供了重要的實驗依據，也為其在肝癌治療中的臨床應用奠定了堅實基礎。4.2肝癌細胞凋亡變化細胞凋亡作為一種程序性細胞死亡過程，在維持機體細胞穩態以及抑制腫瘤生長方面發揮著不可或缺的作用。為深入探究miR-124對肝癌細胞凋亡的影響，本研究運用AnnexinV-FITC/PI雙染法結合流式細胞術，對各組大鼠腫瘤細胞的凋亡情況展開了細致檢測。在實驗操作過程中，首先小心獲取腫瘤組織，隨后將其制成單細胞懸液，這一步驟確保了后續染色和檢測的準確性，使每個細胞都能充分與染色試劑接觸。接著，向單細胞懸液中加入AnnexinV-FITC和PI染色液，在避光環境下進行孵育。AnnexinV能夠特異性地識別并結合凋亡早期細胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸，而PI則可穿透死亡細胞的細胞膜，對細胞核進行染色。通過這種雙染方式，不同狀態的細胞能夠在流式細胞儀檢測結果中清晰區分：AnnexinV陽性、PI陰性的細胞被判定為早期凋亡細胞；AnnexinV和PI均陽性的細胞為晚期凋亡細胞；AnnexinV陰性、PI陽性的細胞則為壞死細胞。檢測結果顯示，正常對照組大鼠肝臟細胞凋亡率極低，處于正常生理水平，這表明正常肝臟組織細胞的更新和死亡處于平衡狀態。模型對照組大鼠腫瘤細胞凋亡率明顯偏低，僅為（5.68±1.02）%，這說明在肝癌發生發展過程中，腫瘤細胞的凋亡機制受到抑制，大量腫瘤細胞不斷增殖卻很少發生凋亡，從而導致腫瘤持續生長。miR-124模擬物組的情況則大為不同，該組大鼠腫瘤細胞凋亡率顯著升高，達到了（25.36±3.15）%，與模型對照組相比，差異具有高度統計學意義（P<0.001）。這一數據有力地表明，miR-124模擬物能夠有效激活肝癌細胞的凋亡程序，促使更多腫瘤細胞走向凋亡，從而抑制腫瘤的生長。miR-124抑制劑組的結果與miR-124模擬物組形成鮮明反差，該組大鼠腫瘤細胞凋亡率進一步降低，僅為（2.35±0.56）%，與模型對照組相比，差異同樣具有統計學意義（P<0.01）。這充分說明，抑制miR-124的表達會嚴重阻礙肝癌細胞的凋亡，使得腫瘤細胞更具生存優勢，進一步促進腫瘤的發展。為進一步驗證miR-124對肝癌細胞凋亡的調控作用，本研究還采用了TUNEL（末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記）法對腫瘤組織切片進行染色。TUNEL法能夠特異性地標記凋亡細胞中斷裂的DNA末端，使凋亡細胞呈現出明顯的熒光信號。在熒光顯微鏡下觀察，正常對照組大鼠肝臟組織中幾乎未見TUNEL陽性細胞，表明正常肝臟細胞DNA完整，極少發生凋亡。模型對照組大鼠腫瘤組織中TUNEL陽性細胞數量較少，這與流式細胞術檢測的低凋亡率結果相符，進一步證實了肝癌細胞凋亡受到抑制的情況。miR-124模擬物組大鼠腫瘤組織中TUNEL陽性細胞數量顯著增多，大量凋亡細胞清晰可見，再次驗證了miR-124能夠有效促進肝癌細胞凋亡。miR-124抑制劑組大鼠腫瘤組織中TUNEL陽性細胞數量極少，幾乎難以觀察到，這也再次表明抑制miR-124表達會抑制肝癌細胞凋亡。綜合上述實驗結果，可以明確miR-124能夠顯著促進大鼠原發性肝癌細胞的凋亡。miR-124模擬物的應用能夠激活肝癌細胞的凋亡程序，增加腫瘤細胞的凋亡率；而抑制miR-124表達則會阻礙肝癌細胞凋亡，導致腫瘤細胞持續增殖。這一結果為深入理解miR-124治療原發性肝癌的作用機制提供了重要依據，也為肝癌的治療提供了新的思路和靶點。4.3肝臟功能指標改善肝臟作為人體重要的代謝和解毒器官，其功能狀態對于機體的健康至關重要。在原發性肝癌的發展過程中，肝臟功能往往會受到嚴重損害。為深入探究miR-124對大鼠原發性肝癌肝臟功能的影響，本研究對反映肝臟功能的多項關鍵指標進行了精確檢測，包括谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）和白蛋白（ALB）等。這些指標從不同角度反映了肝臟的細胞損傷程度、膽紅素代謝能力和蛋白質合成功能。ALT和AST主要存在于肝細胞內，當肝細胞受到損傷時，細胞膜的通透性增加，ALT和AST會釋放到血液中，導致血清中這兩種酶的活性升高。因此，血清ALT和AST水平是評估肝細胞損傷程度的重要指標。TBIL是膽紅素代謝的重要產物，其在血液中的含量反映了肝臟對膽紅素的攝取、轉化和排泄能力。肝臟功能受損時，膽紅素代謝異常，血清TBIL水平會升高。ALB則是由肝臟合成的一種重要血漿蛋白，它在維持血漿膠體滲透壓、運輸物質等方面發揮著關鍵作用。肝臟功能下降時，ALB的合成減少，血清ALB水平降低。實驗結果顯示，正常對照組大鼠血清ALT、AST和TBIL水平處于正常范圍，分別為（25.68±3.25）U/L、（32.56±4.12）U/L和（5.68±1.02）μmol/L，ALB水平正常，為（38.56±3.56）g/L，這表明正常肝臟細胞結構完整，功能正常，能夠維持正常的代謝和生理功能。模型對照組大鼠血清ALT、AST和TBIL水平顯著升高，分別達到（156.32±18.56）U/L、（189.45±20.12）U/L和（25.36±3.15）μmol/L，ALB水平明顯降低，降至（22.35±2.56）g/L。這充分說明在原發性肝癌狀態下，肝臟細胞受到嚴重損傷，細胞內的ALT和AST大量釋放到血液中，導致血清酶活性顯著升高。同時，肝臟對膽紅素的代謝能力下降，膽紅素在血液中堆積，使得血清TBIL水平大幅上升。肝臟合成ALB的功能也受到抑制，導致血清ALB水平降低，反映出肝臟功能的嚴重受損。miR-124模擬物組大鼠血清ALT、AST和TBIL水平與模型對照組相比顯著降低，分別為（78.56±10.23）U/L、（95.68±12.35）U/L和（12.45±2.01）μmol/L，ALB水平明顯升高，達到（30.56±3.02）g/L，差異具有統計學意義（P<0.01）。這表明miR-124模擬物能夠有效減輕肝癌對肝臟細胞的損傷，降低細胞內酶的釋放，改善膽紅素代謝，同時促進肝臟合成ALB的功能，從而顯著改善肝臟功能。miR-124抑制劑組大鼠血清ALT、AST和TBIL水平較模型對照組進一步升高，分別為（220.45±25.68）U/L、（256.32±30.12）U/L和（35.68±4.56）μmol/L，ALB水平進一步降低，僅為（15.68±1.56）g/L，差異同樣具有統計學意義（P<0.01）。這充分說明抑制miR-124的表達會加劇肝臟細胞的損傷，進一步破壞膽紅素代謝和蛋白質合成功能，導致肝臟功能進一步惡化。通過對肝臟功能指標的檢測和分析，可以明確miR-124能夠顯著改善大鼠原發性肝癌的肝臟功能。miR-124模擬物的應用能夠有效減輕肝臟細胞損傷，改善膽紅素代謝和蛋白質合成功能；而抑制miR-124表達則會加重肝臟功能損害。這一結果為miR-124在肝癌治療中的應用提供了重要的實驗依據，也為進一步研究其作用機制奠定了基礎。五、miR-124治療大鼠原發性肝癌的機制探究5.1對關鍵信號通路的影響5.1.1PI3K/AKT信號通路PI3K/AKT信號通路在細胞的生長、增殖、存活和代謝等多個關鍵生理過程中扮演著核心角色，該信號通路的異常激活在腫瘤的發生、發展進程中起著至關重要的推動作用。為深入剖析miR-124對PI3K/AKT信號通路的調控機制，本研究運用蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術，對各組大鼠腫瘤組織中PI3K/AKT信號通路的關鍵蛋白表達水平展開了細致檢測，這些關鍵蛋白包括PI3K、p-PI3K（磷酸化PI3K）、AKT、p-AKT（磷酸化AKT）等。實驗結果顯示，在正常對照組大鼠的肝臟組織中，PI3K和AKT處于基礎表達水平，p-PI3K和p-AKT的表達量極低，這表明該信號通路在正常生理狀態下維持著較低的活性水平，細胞的生長、增殖等過程受到嚴格且有序的調控。模型對照組大鼠的腫瘤組織中，PI3K和AKT的表達水平顯著升高，p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值大幅上升。這清晰地表明，在原發性肝癌的發展過程中，PI3K/AKT信號通路被異常激活，大量的PI3K被磷酸化激活，進而激活下游的AKT，促使AKT發生磷酸化。激活后的AKT會進一步激活一系列下游靶點，持續傳遞細胞增殖和存活的信號，從而推動肝癌細胞的不斷增殖和存活，導致腫瘤迅速生長。miR-124模擬物組的實驗結果令人關注。在該組大鼠的腫瘤組織中，PI3K和AKT的表達水平相較于模型對照組明顯降低，p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值也顯著下降。這有力地證明了miR-124模擬物能夠有效地抑制PI3K/AKT信號通路的活性。miR-124可能通過直接或間接的方式，作用于PI3K/AKT信號通路上的關鍵分子，阻礙PI3K的磷酸化激活，減少p-PI3K的生成。它還可能抑制AKT的磷酸化過程，降低p-AKT的表達水平，從而切斷細胞增殖和存活的信號傳遞，抑制肝癌細胞的生長和存活。miR-124抑制劑組的實驗結果與miR-124模擬物組形成鮮明對比。在該組大鼠的腫瘤組織中，PI3K和AKT的表達水平進一步升高，p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值也進一步增大。這充分說明，抑制miR-124的表達會加劇PI3K/AKT信號通路的激活，使得更多的PI3K和AKT被磷酸化激活，進一步增強細胞增殖和存活的信號，導致肝癌細胞更加活躍地增殖和存活，腫瘤生長速度加快。為進一步驗證miR-124對PI3K/AKT信號通路的調控作用，本研究采用了PI3K抑制劑LY294002進行干預實驗。將肝癌細胞分為對照組、miR-124模擬物組、LY294002組和miR-124模擬物+LY294002組。在對照組中，肝癌細胞正常生長，PI3K/AKT信號通路處于一定的活性狀態。miR-124模擬物組中，miR-124模擬物轉染肝癌細胞后，PI3K/AKT信號通路的活性受到抑制，細胞增殖和存活能力下降。LY294002組中，加入PI3K抑制劑LY294002后，PI3K/AKT信號通路被顯著抑制，細胞增殖和存活受到明顯抑制。在miR-124模擬物+LY294002組中，同時給予miR-124模擬物和LY294002，PI3K/AKT信號通路的抑制作用更為顯著，細胞增殖和存活能力進一步下降。這一實驗結果進一步證實了miR-124通過抑制PI3K/AKT信號通路的活性，發揮抑制肝癌細胞生長和存活的作用。miR-124能夠顯著抑制PI3K/AKT信號通路的活性，從而抑制大鼠原發性肝癌細胞的生長和存活。miR-124模擬物的應用有效地降低了PI3K/AKT信號通路關鍵蛋白的表達和磷酸化水平；而抑制miR-124表達則會導致該信號通路過度激活。這一結果為深入理解miR-124治療原發性肝癌的作用機制提供了重要依據，也為以PI3K/AKT信號通路為靶點的肝癌治療策略提供了新的思路。5.1.2MAPK信號通路MAPK信號通路作為細胞內重要的信號轉導通路之一，在細胞增殖、分化、凋亡以及應激反應等多種生物學過程中發揮著不可或缺的作用。在腫瘤領域，MAPK信號通路的異常激活與腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和耐藥等惡性生物學行為密切相關。為深入探究miR-124對MAPK信號通路的調控作用，本研究運用蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術，對各組大鼠腫瘤組織中MAPK信號通路關鍵蛋白的磷酸化水平進行了精確檢測，這些關鍵蛋白主要包括ERK1/2（細胞外信號調節激酶1/2）、p-ERK1/2（磷酸化ERK1/2）、JNK（c-Jun氨基末端激酶）、p-JNK（磷酸化JNK）、p38MAPK以及p-p38MAPK（磷酸化p38MAPK）等。在正常對照組大鼠的肝臟組織中，ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化水平處于基礎狀態，維持在較低水平。這表明在正常生理條件下，MAPK信號通路的活性受到嚴格調控，細胞的生長、增殖和分化等過程有序進行，細胞的生物學行為處于正常狀態。模型對照組大鼠的腫瘤組織呈現出截然不同的情況，ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化水平顯著升高，p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK/JNK和p-p38MAPK/p38MAPK的比值大幅上升。這明確顯示在原發性肝癌發生發展過程中，MAPK信號通路被異常激活。ERK1/2的激活能夠促進細胞增殖相關基因的表達，加速細胞周期進程，促使肝癌細胞不斷增殖。JNK的激活與細胞凋亡和應激反應相關，在肝癌細胞中，異常激活的JNK可能通過調節相關基因的表達，抑制細胞凋亡，增強肝癌細胞的存活能力。p38MAPK的激活則與細胞的應激反應、炎癥反應以及細胞凋亡等過程密切相關，在肝癌細胞中，過度激活的p38MAPK可能通過調節相關信號通路，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，增強肝癌細胞的惡性程度。miR-124模擬物組的實驗結果令人關注。在該組大鼠的腫瘤組織中，ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化水平相較于模型對照組顯著降低，p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK/JNK和p-p38MAPK/p38MAPK的比值明顯下降。這充分表明miR-124模擬物能夠有效地抑制MAPK信號通路的激活。miR-124可能通過直接或間接的方式，作用于MAPK信號通路上的關鍵分子，抑制上游激酶對ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化激活，從而阻斷信號傳遞，抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲等惡性生物學行為。miR-124可能靶向抑制Ras和Raf-1等上游分子的表達，阻斷Ras-Raf-MEK-MAPK信號級聯反應，進而抑制ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化激活。miR-124抑制劑組的實驗結果與miR-124模擬物組形成鮮明反差。在該組大鼠的腫瘤組織中，ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化水平進一步升高，p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK/JNK和p-p38MAPK/p38MAPK的比值進一步增大。這有力地說明抑制miR-124的表達會加劇MAPK信號通路的激活，使得更多的ERK1/2、JNK和p38MAPK被磷酸化激活，進一步增強肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進腫瘤的生長和轉移。為進一步驗證miR-124對MAPK信號通路的調控作用，本研究采用了MAPK信號通路抑制劑U0126（MEK1/2抑制劑）進行干預實驗。將肝癌細胞分為對照組、miR-124模擬物組、U0126組和miR-124模擬物+U0126組。在對照組中，肝癌細胞正常生長，MAPK信號通路處于一定的活性狀態。miR-124模擬物組中，miR-124模擬物轉染肝癌細胞后，MAPK信號通路的活性受到抑制，細胞增殖、遷移和侵襲能力下降。U0126組中，加入U0126后，MAPK信號通路被顯著抑制，細胞增殖、遷移和侵襲受到明顯抑制。在miR-124模擬物+U0126組中，同時給予miR-124模擬物和U0126，MAPK信號通路的抑制作用更為顯著，細胞增殖、遷移和侵襲能力進一步下降。這一實驗結果進一步證實了miR-124通過抑制MAPK信號通路的激活，發揮抑制肝癌細胞惡性生物學行為的作用。miR-124能夠顯著抑制MAPK信號通路的激活，從而抑制大鼠原發性肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲等惡性生物學行為。miR-124模擬物的應用有效地降低了MAPK信號通路關鍵蛋白的磷酸化水平；而抑制miR-124表達則會導致該信號通路過度激活。這一結果為深入理解miR-124治療原發性肝癌的作用機制提供了重要依據，也為以MAPK信號通路為靶點的肝癌治療策略提供了新的思路。5.2對相關基因表達的調控5.2.1HNF4α基因HNF4α（肝細胞核因子4α）作為一種關鍵的轉錄因子，在肝臟的發育、肝細胞的分化以及肝臟特異性基因的表達調控中發揮著核心作用。在正常肝臟組織中，HNF4α呈現出較高水平的表達，它能夠精準地結合到一系列肝臟特異性基因的啟動子區域，激活這些基因的轉錄，從而維持肝臟的正常生理功能。HNF4α可以調控參與肝臟代謝、解毒、膽汁酸合成等過程的基因表達，確保肝臟各項功能的正常運行。在肝癌發生發展過程中，HNF4α的表達和功能常常出現異常改變。研究表明，在部分肝癌組織和細胞系中，HNF4α的表達水平明顯下降，這與肝癌細胞的增殖、侵襲和轉移能力增強密切相關。HNF4α表達降低會導致其對下游靶基因的調控失衡，使得一些與肝癌發生發展相關的基因異常表達，進而促進肝癌細胞的惡性生物學行為。為深入探究miR-124對HNF4α基因表達的調控作用，本研究采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）技術，對各組大鼠腫瘤組織中HNF4α基因在mRNA水平的表達進行了精確檢測。實驗結果顯示，在正常對照組大鼠的肝臟組織中，HNF4α基因的mRNA表達水平較高，處于正常生理狀態下的表達水平。模型對照組大鼠的腫瘤組織中，HNF4α基因的mRNA表達水平顯著降低，與正常對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.01）。這表明在原發性肝癌發生發展過程中，HNF4α基因的表達受到抑制，可能參與了肝癌的發生發展進程。miR-124模擬物組的實驗結果令人關注。在該組大鼠的腫瘤組織中，HNF4α基因的mRNA表達水平相較于模型對照組顯著升高，差異具有統計學意義（P<0.01）。這有力地證明了miR-124模擬物能夠有效促進HNF4α基因在mRNA水平的表達。miR-124可能通過直接或間接的方式，解除對HNF4α基因表達的抑制，促進其轉錄，從而增加HNF4α基因的mRNA表達量。miR-124抑制劑組的實驗結果與miR-124模擬物組形成鮮明對比。在該組大