HPTS協同ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活效能、機制及動力學解析一、引言1.1研究背景與意義1.1.1芽孢的特性與危害芽孢是某些細菌在生長發育后期，在細胞內形成的一種特殊的休眠體，又稱內生孢子。芽孢具有極強的抗逆性，這源于其獨特的結構與組成。芽孢擁有孢外壁、芽孢衣、外膜、芽孢皮層、芽孢壁、內膜和核心等多層保護性結構。其中，芽孢皮層主要含芽孢肽聚糖及吡啶二羧酸鈣鹽，是芽孢抗壓性的關鍵結構；芽孢衣主要由蛋白質組成，含大量疏水性氨基酸，透性差，能有效阻擋外界不良因素。芽孢含水量低，壁厚而致密，通透性差，折光性強，這些特性使其對高溫、紫外線、干燥和多種有毒的化學物質都有很強的抗性。例如，在100℃沸水中，普通芽孢可存活數小時，甚至在普通條件下，芽孢可保持幾年至幾十年的生活力。芽孢廣泛分布在水、土壤、空氣、食物等環境中。在食品加工與儲存過程中，芽孢的存在是食品安全的重大隱患。如枯草桿菌芽孢能產生嘔吐毒素、腹瀉毒素等多種對人類和動物有害的毒素，一旦這些芽孢在適宜條件下萌發為營養細胞并大量繁殖，就可能引發食物中毒，導致惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等癥狀，嚴重時會威脅生命健康。在農產品種植環境中，芽孢也可能成為病原菌，引發植物病害。像小麥、水稻等糧食作物，可能因枯草桿菌芽孢的侵害而發生病害，影響灌漿、結實，造成減產；果蔬種植中，芽孢可引起果蔬腐爛變質，縮短保鮮期，降低商品價值，給農業生產帶來巨大的經濟損失。因此，有效滅活芽孢對于保障食品安全和農業生產的穩定至關重要。1.1.2HPTS與ε-聚賴氨酸的研究現狀HPTS（高壓熱殺菌處理，High-pressurethermalsterilization）是一種將靜態超高壓和熱耦合起來用于殺菌的新興技術。國外學者早在20世紀90年代就開始關注超高壓與熱結合的殺菌技術，日本學者率先開展了超高壓熱殺菌對食品中微生物影響的研究，發現HPTS能夠有效滅活一些耐熱性微生物，如嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草桿菌芽孢等。隨后，歐美國家的研究人員深入探討HPTS的殺菌機制，揭示了HPTS能夠破壞微生物的細胞膜、蛋白質和核酸等生物大分子，從而實現殺菌作用。國內對HPTS的研究起步相對較晚，但近年來發展迅速，眾多科研機構和高校開展了相關研究，研究內容涉及HPTS在食品殺菌、農產品保鮮等領域的應用。例如，有研究利用HPTS對鮮榨果汁進行處理，在有效殺滅果汁中微生物的同時，較好地保留了果汁的營養成分和風味物質；還有研究將HPTS應用于肉制品的殺菌保鮮，顯著延長了肉制品的貨架期。ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，簡稱ε-PL）是一種由白色鏈霉菌經過液體深層有氧發酵生產的含有25-35個L-賴氨酸殘基的同型單體聚合物。它具有諸多優良特性，如抗菌譜廣，能有效地抑制革蘭氏陽性和陰性菌、酵母菌、霉菌等微生物；耐高溫，在121℃，30分鐘的高溫環境下不分解，可參與產品熱處理過程；溶水性強，易溶于水，溶解度至少為500g/L；pH使用范圍廣，在pH2-9條件下均具有較強的抑菌能力，能彌補其他防腐劑在中性和堿性條件下活性低的缺點；協同增效性強，與其他食品添加劑（如醋酸、乙醇、甘氨酸、有機酸等）搭配使用，能大大提高抑菌效果；安全性高，急性毒理試驗LD50為5g/kg，與食鹽相當，人體攝入后能降解成賴氨酸營養物，被吸收利用。目前，ε-聚賴氨酸被廣泛應用于食品、日化、醫藥等行業，如在食品領域，被用于蛋糕、糕點、飲料、肉制品、罐頭等的防腐保鮮。然而，目前關于HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢滅活作用的研究還相對較少。雖然已有研究對HPTS和ε-聚賴氨酸各自的特性及應用進行了大量探索，但將二者結合用于芽孢滅活的研究尚處于起步階段，對于它們的協同作用機制、最佳作用條件以及在實際應用中的效果等方面，還缺乏深入、全面的研究。1.1.3研究意義本研究聚焦于HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活作用及動力學，具有重要的理論與實際意義。在實際應用方面，對于食品安全領域，開發出HPTS結合ε-聚賴氨酸的芽孢滅活方法，能夠為食品加工企業提供一種新型、安全、高效的殺菌技術，有效減少食品中芽孢及其毒素的污染，保障消費者的健康，提升食品行業的安全性和市場競爭力。在農業生產中，該研究成果可為農作物病害防治提供新的策略和方法，減少化學農藥的使用，降低對環境的污染，促進農業的可持續發展。從理論層面來看，深入研究HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活機制，有助于豐富微生物學和食品科學等相關領域的理論知識。通過探究HPTS和ε-聚賴氨酸如何協同作用于芽孢，以及這種協同作用對芽孢結構、生理代謝等方面的具體影響，能夠為進一步優化和拓展該技術的應用提供科學依據，推動相關理論的完善與發展。1.2研究目標與內容1.2.1研究目標本研究旨在深入探究HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活效能、作用機制及動力學規律，為開發新型高效的芽孢滅活技術提供堅實的理論與實踐依據。具體而言，一是精準測定HPTS單獨作用、ε-聚賴氨酸單獨作用以及兩者結合作用下對芽孢的滅活率，全面系統地評估其滅活效果，并通過對比分析，明確HPTS與ε-聚賴氨酸聯合使用時的協同增效作用，確定最佳的作用條件組合，包括但不限于HPTS的壓力、溫度、處理時間，以及ε-聚賴氨酸的濃度等參數。二是從芽孢的結構變化、生理代謝過程的改變、關鍵生物大分子的損傷等多個維度，深入剖析HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活機制，揭示二者協同作用對芽孢產生影響的內在本質。三是構建HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢滅活動力學模型，精確解析其動力學參數，如反應速率常數、活化能等，清晰闡釋滅活過程隨時間的變化規律，為實際應用中的工藝設計和優化提供科學的量化依據。1.2.2研究內容基于上述研究目標，本研究將從以下幾個方面展開深入研究：HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活效果研究：選取具有代表性的芽孢，如枯草桿菌芽孢、嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢等，作為實驗對象。分別設置HPTS單獨處理組、ε-聚賴氨酸單獨處理組以及HPTS結合ε-聚賴氨酸處理組，同時設立空白對照組。在HPTS處理組中，系統地考察不同壓力（如200MPa、300MPa、400MPa等）、溫度（如40℃、50℃、60℃等）和處理時間（如10min、20min、30min等）對芽孢滅活率的影響；在ε-聚賴氨酸處理組中，探究不同濃度（如0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL等）對芽孢滅活率的作用。對于HPTS結合ε-聚賴氨酸處理組，全面考察不同壓力、溫度、時間和ε-聚賴氨酸濃度的組合對芽孢滅活率的綜合影響。采用平板計數法、稀釋涂布法等經典微生物檢測方法，準確測定處理后芽孢的存活數量，進而計算滅活率。通過多組實驗數據的對比分析，篩選出HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢滅活的最佳條件。HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢的作用機制研究：運用掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）等微觀觀測技術，直觀地觀察芽孢在HPTS單獨作用、ε-聚賴氨酸單獨作用以及HPTS結合ε-聚賴氨酸作用后的形態和結構變化，包括芽孢外壁、芽孢衣、芽孢皮層等結構的完整性和損傷情況。利用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）、拉曼光譜等技術，深入分析芽孢中蛋白質、核酸等生物大分子的結構變化，如蛋白質的二級結構改變、核酸的堿基配對變化等。通過檢測芽孢內關鍵酶的活性，如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等，以及ATP含量、代謝產物等生理指標，深入探究芽孢生理代謝過程的變化，揭示HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢生理功能的影響機制。HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活動力學研究：在確定的最佳作用條件下，按照一定的時間間隔（如5min、10min、15min等）對芽孢進行取樣檢測。基于實驗數據，運用經典的動力學模型，如一級反應動力學模型、二級反應動力學模型等，對HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活動力學進行擬合分析。通過擬合得到反應速率常數、活化能等動力學參數，深入探討滅活過程的動力學特征，如反應速率隨時間的變化規律、溫度對反應速率的影響等。同時，結合實驗結果和理論分析，對動力學模型進行優化和驗證，提高模型的準確性和可靠性。HPTS結合ε-聚賴氨酸滅活芽孢的應用前景評估：將HPTS結合ε-聚賴氨酸的滅活技術應用于實際的食品體系（如鮮榨果汁、肉制品、乳制品等）和農產品種植環境（如種子處理、土壤消毒等）中。在食品體系中，考察該技術對食品中芽孢的滅活效果，以及對食品營養成分（如維生素、礦物質、蛋白質等）、風味物質（如揮發性香氣成分）和感官品質（如色澤、口感、質地等）的影響。在農產品種植環境中，研究該技術對土壤中芽孢的滅活效果，以及對種子發芽率、幼苗生長發育、農作物產量和品質的影響。通過實際應用研究，綜合評估HPTS結合ε-聚賴氨酸滅活芽孢技術的可行性、有效性和安全性，為其在食品安全和農業生產領域的推廣應用提供科學依據。1.3研究方法與技術路線1.3.1研究方法實驗法：通過設計并實施一系列嚴謹的實驗，系統研究HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活作用。在芽孢懸液制備環節，嚴格按照微生物實驗操作規范，采用標準的菌種活化、培養和稀釋方法，確保芽孢懸液濃度的準確性和均一性。在HPTS處理實驗中，運用專業的高壓設備，精確控制壓力、溫度和處理時間等參數，保證實驗條件的穩定性和可重復性。在ε-聚賴氨酸處理實驗中，利用高精度的移液器和天平，準確配置不同濃度的ε-聚賴氨酸溶液，并嚴格控制添加量。在聯合處理實驗中，嚴格按照設定的順序和時間間隔，添加HPTS和ε-聚賴氨酸，以全面考察二者結合對芽孢的滅活效果。通過多次重復實驗，獲取可靠的實驗數據，確保研究結果的科學性和可靠性。光譜分析法：運用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）技術，深入分析芽孢在HPTS結合ε-聚賴氨酸作用前后蛋白質、核酸等生物大分子的結構變化。將處理前后的芽孢樣品進行干燥、研磨等預處理后，與溴化鉀混合壓片，利用FTIR光譜儀進行掃描，得到紅外光譜圖。通過對比分析光譜圖中特征吸收峰的位置、強度和形狀等信息，判斷生物大分子的結構變化，如蛋白質二級結構中α-螺旋、β-折疊等結構的改變，以及核酸中堿基配對、磷酸二酯鍵等結構的變化。同時，采用拉曼光譜技術，進一步驗證和補充FTIR分析結果，從不同角度揭示芽孢生物大分子的結構變化機制。電鏡觀察法：借助掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM），直觀觀察芽孢在HPTS結合ε-聚賴氨酸作用后的形態和結構變化。將處理后的芽孢樣品進行固定、脫水、包埋、切片等一系列精細的樣品制備過程，以確保樣品在電鏡下能夠清晰成像。在SEM觀察中，通過調節電子束的加速電壓、工作距離等參數，獲取芽孢表面的微觀形態圖像，觀察芽孢外壁、芽孢衣等結構的完整性和損傷情況。在TEM觀察中，利用高分辨率的透射電子顯微鏡，觀察芽孢內部的超微結構，如芽孢皮層、芽孢壁、內膜和核心等結構的變化，深入分析HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢結構的破壞機制。模型擬合法：基于實驗獲得的芽孢滅活數據，運用經典的動力學模型，如一級反應動力學模型、二級反應動力學模型等，對HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活動力學進行擬合分析。通過非線性回歸等數學方法，確定模型中的參數，如反應速率常數、活化能等。根據擬合優度、殘差分析等指標，評估模型的準確性和可靠性，選擇最適合描述滅活動力學過程的模型。結合實際實驗結果和理論分析，對模型進行優化和驗證，進一步深入探討滅活過程的動力學特征和規律。1.3.2技術路線本研究的技術路線清晰展示了從芽孢懸液制備到結果分析的完整研究流程（見圖1）。首先，進行芽孢懸液的制備，選取具有代表性的芽孢，如枯草桿菌芽孢、嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢等，通過菌種活化、培養和稀釋等標準操作，制備出濃度均一、活性穩定的芽孢懸液。隨后，分別開展HPTS單獨處理實驗、ε-聚賴氨酸單獨處理實驗以及HPTS結合ε-聚賴氨酸處理實驗。在HPTS單獨處理實驗中，系統考察不同壓力、溫度和處理時間對芽孢滅活率的影響；在ε-聚賴氨酸單獨處理實驗中，探究不同濃度對芽孢滅活率的作用；在聯合處理實驗中，全面考察不同壓力、溫度、時間和ε-聚賴氨酸濃度的組合對芽孢滅活率的綜合影響。接著，利用平板計數法、稀釋涂布法等微生物檢測方法，準確測定處理后芽孢的存活數量，計算滅活率，以評估滅活效果。同時，運用光譜分析法（FTIR、拉曼光譜）、電鏡觀察法（SEM、TEM）等技術手段，從生物大分子結構和微觀形態結構等層面深入分析芽孢的變化，揭示HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢的作用機制。最后，基于實驗數據，運用模型擬合法構建滅活動力學模型，分析動力學參數，闡釋滅活過程的變化規律，并對研究結果進行總結和討論，為開發新型高效的芽孢滅活技術提供理論與實踐依據。[此處插入技術路線圖]圖1技術路線圖二、HPTS與ε-聚賴氨酸的特性及作用機制2.1HPTS的原理與特性2.1.1HPTS的工作原理HPTS的工作原理基于高壓和熱的協同作用，對微生物的結構和功能產生多方面的破壞。在高壓環境下，微生物細胞內的分子間距被壓縮，導致分子間相互作用發生改變。細胞膜作為細胞與外界環境的重要屏障，受到高壓的影響最為顯著。細胞膜中的磷脂雙分子層在高壓作用下排列紊亂，流動性降低，膜的完整性受到破壞，從而使細胞膜的通透性增加。這不僅導致細胞內的離子平衡被打破，如鉀離子、鈉離子等重要離子的外流，還使得細胞內的一些小分子物質和生物大分子，如糖類、蛋白質、核酸等也可能泄漏到細胞外，進而影響細胞的正常生理功能。蛋白質和核酸是微生物細胞內的關鍵生物大分子，對維持細胞的生命活動起著至關重要的作用。高壓會使蛋白質的二級、三級和四級結構發生改變，破壞蛋白質分子內的氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵等非共價鍵，導致蛋白質的空間構象發生變化，從而使蛋白質失去原有的生物學活性。例如，一些參與細胞代謝過程的酶，在高壓作用下其活性中心的結構被破壞，無法正常催化化學反應，進而影響細胞的代謝過程。對于核酸，高壓可能導致DNA雙螺旋結構的解旋，破壞堿基對之間的氫鍵，使DNA的復制、轉錄等過程受到干擾，影響微生物的遺傳信息傳遞和表達。熱的作用進一步加劇了微生物的損傷。適當升高溫度，能夠加速微生物細胞內的化學反應速率，使微生物的生理代謝活動紊亂。高溫會使細胞膜的流動性進一步增強，加劇細胞膜的損傷，導致更多的物質泄漏。同時，高溫也會加速蛋白質的變性和核酸的降解。蛋白質在高溫下更容易失去其天然構象，發生聚集和沉淀，從而完全喪失活性。核酸分子在高溫下，磷酸二酯鍵可能斷裂，導致核酸鏈的斷裂和降解，使微生物無法正常進行遺傳信息的傳遞和表達。當高壓和熱協同作用時，二者相互促進，對微生物產生更強烈的破壞作用。高壓使微生物細胞結構變得脆弱，熱則進一步加劇細胞內生物大分子的損傷和代謝紊亂，從而更有效地實現對微生物的滅活。這種協同作用能夠在相對較低的溫度和較短的時間內達到較好的殺菌效果，相比于傳統的高溫殺菌技術，能夠更好地保留食品的營養成分、風味和質地等品質特性。2.1.2HPTS的殺菌特性HPTS在殺菌方面展現出一系列獨特的特性，這些特性使其在食品加工和保鮮等領域具有顯著的優勢。首先，HPTS具有高效的殺菌能力。研究表明，在適宜的壓力和溫度條件下，HPTS能夠在較短的時間內使芽孢等微生物的存活數量大幅下降。例如，有研究利用HPTS對枯草桿菌芽孢進行處理，在550MPa、75℃的條件下處理20min，芽孢存活率下降了6.30。這是因為HPTS通過高壓和熱的協同作用，能夠全面破壞芽孢的多層結構，包括芽孢外壁、芽孢衣、芽孢皮層等，以及芽孢內的生物大分子，如蛋白質、核酸等，從而有效降低芽孢的抗性，實現高效滅活。其次，HPTS能夠在相對低溫和較短時間內實現殺菌，這對于食品品質的保留具有重要意義。與傳統的高溫熱殺菌相比，HPTS使用的溫度較低、時間較短，能更好地保持食品原有的色、香、味、質構、營養素和功能性成分。在對鮮榨果汁進行HPTS處理時，能夠在有效殺滅果汁中微生物的同時，較好地保留果汁中的維生素C、類黃酮等營養成分，以及果汁的天然色澤和風味。在肉制品的殺菌保鮮中，HPTS處理也能顯著延長肉制品的貨架期，同時減少對肉制品口感和質地的影響。此外，HPTS還具有一定的選擇性殺菌能力。它對不同種類的微生物，由于其結構和生理特性的差異，HPTS的殺菌效果會有所不同。一般來說，芽孢由于其特殊的結構和高度的抗逆性，對HPTS的耐受性相對較強，但在適當的條件下，HPTS仍能有效滅活芽孢。而對于一些營養細胞，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等，HPTS的殺菌效果更為顯著。這使得HPTS在實際應用中，可以根據不同的需求和食品體系，選擇合適的處理條件，有針對性地殺滅目標微生物，同時最大程度減少對食品中有益微生物和營養成分的影響。然而，HPTS也存在一些局限性。一方面，HPTS設備成本較高，需要專門的高壓設備和精確的溫度控制裝置，這限制了其在一些小型企業或經濟欠發達地區的推廣應用。另一方面，HPTS對某些芽孢的滅活效果仍有待提高，特別是一些極端耐熱的芽孢，可能需要更高的壓力和溫度組合，這可能會對食品品質產生一定的影響。此外，HPTS的處理過程相對復雜，需要嚴格控制壓力、溫度和時間等參數，對操作人員的技術水平要求較高。2.2ε-聚賴氨酸的結構與抑菌機制2.2.1ε-聚賴氨酸的分子結構ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，簡稱ε-PL）是一種由白色鏈霉菌經過液體深層有氧發酵生產的含有25-35個L-賴氨酸殘基的同型單體聚合物。其分子結構獨特，由L-賴氨酸的ε-氨基與另一個L-賴氨酸的α-羧基通過酰胺鍵連接而成，形成了直鏈狀的聚合物（見圖2）。這種特殊的連接方式賦予了ε-聚賴氨酸許多優良的理化性質。[此處插入ε-聚賴氨酸的分子結構示意圖]圖2ε-聚賴氨酸的分子結構示意圖從理化性質上看，ε-聚賴氨酸為淡黃色粉末，吸濕性強，這使其在潮濕環境中能夠吸收水分，保持一定的濕潤度。它略有苦味，在實際應用中，可能會對食品的口感產生一定影響，因此在使用時需要考慮其添加量和與其他成分的搭配。ε-聚賴氨酸不受pH值影響，在廣泛的pH范圍內（pH2-9）都能保持穩定的結構和活性。這一特性使其能夠在不同酸堿度的食品體系和環境中發揮作用，大大拓寬了其應用范圍。例如，在酸性的果汁飲料和堿性的豆制品中，ε-聚賴氨酸都能有效地抑制微生物的生長。它對熱穩定，在121℃，20min的高溫條件下不分解，可參與產品的熱處理過程。這使得它在食品加工中，能夠與高溫殺菌等工藝相結合，提高食品的安全性和保質期。在肉制品的高溫蒸煮加工過程中，ε-聚賴氨酸不會因高溫而失去活性，依然能夠對后續可能污染的微生物起到抑制作用。ε-聚賴氨酸的抑菌活性與其分子量密切相關。研究表明，分子量在3600-4300之間的ε-聚賴氨酸抑菌活性最好。當分子量低于1300時，ε-聚賴氨酸會失去抑菌活性。這是因為分子量的大小會影響其分子結構和電荷分布，進而影響其與微生物細胞膜、生物大分子等的相互作用。較大分子量的ε-聚賴氨酸能夠更好地吸附在微生物表面，形成有效的抑菌屏障，而分子量過小則無法發揮其應有的抑菌功能。由于ε-聚賴氨酸是混合物，所以沒有固定的熔點，250℃以上開始軟化分解。它溶于水，微溶于乙醇，這使其在水溶液體系中能夠更好地發揮作用，在食品加工中，容易與水相體系的食品原料混合均勻，實現對微生物的有效抑制。對其進行紅外光譜分析表明，在1680-1640cm-1和1580-1520cm-1處有強吸收峰，這些特征吸收峰與ε-聚賴氨酸的酰胺鍵等結構密切相關，可用于其結構鑒定和純度分析。2.2.2ε-聚賴氨酸的抑菌作用機制ε-聚賴氨酸的抑菌作用機制是一個復雜的過程，主要通過破壞細胞膜和結合生物大分子等方式來抑制微生物的生長。從破壞細胞膜的角度來看，ε-聚賴氨酸主要通過靜電吸附作用與細胞膜表面的磷脂頭部相結合。細胞膜是微生物細胞與外界環境的重要屏障，對維持細胞的正常生理功能起著關鍵作用。ε-聚賴氨酸帶有正電荷，而細胞膜表面的磷脂頭部帶有負電荷，二者通過靜電作用相互吸引。隨著ε-聚賴氨酸濃度的增加，它會在細胞膜表面逐漸積聚，當達到一定閾值時，會像氈毯一樣覆蓋在細菌膜表面。此時，ε-聚賴氨酸會平行于膜表面慢慢積聚并形成一個快速交換的孔洞，讓更多的ε-聚賴氨酸進入到細菌內部。在這個過程中，ε-聚賴氨酸的疏水基團朝向磷脂側，親水部分面向溶液，這種結構的改變導致細胞膜的完整性和結構被破壞。細胞膜的通透性增加，細胞內的離子（如鉀離子、鈉離子等）和物質（如蛋白質、核酸等）開始外流，細胞內的離子平衡和物質代謝被打亂，最終導致細胞死亡。研究發現，ε-聚賴氨酸處理大腸桿菌后，大腸桿菌細胞內的核酸、蛋白質等大量排出，細胞的生長和繁殖受到明顯抑制。ε-聚賴氨酸還能通過結合并破壞微生物的核酸和蛋白質等生物大分子，從而抑制微生物的生長、代謝和繁殖能力。核酸是微生物遺傳信息的攜帶者，蛋白質則參與微生物的各種生理代謝過程。ε-聚賴氨酸能夠與核酸和蛋白質發生相互作用，改變它們的結構和功能。它可能與DNA結合，干擾DNA的復制、轉錄等過程，使微生物無法正常傳遞遺傳信息，進而影響其生長和繁殖。在對枯草桿菌的研究中發現，ε-聚賴氨酸處理后，枯草桿菌的DNA結構發生改變，相關基因的表達受到抑制，導致其生長受到阻礙。對于蛋白質，ε-聚賴氨酸可能與蛋白質的活性位點或關鍵結構域結合，使蛋白質失去原有的生物學活性。一些參與細胞代謝的酶，在與ε-聚賴氨酸結合后，其催化活性降低或喪失，導致微生物的代謝過程紊亂，無法正常生長。2.3兩者結合的協同增效可能性探討2.3.1基于作用靶點的協同分析HPTS和ε-聚賴氨酸具有不同的作用靶點，這為二者結合產生協同增效作用提供了理論基礎。HPTS主要通過高壓和熱的協同作用，對芽孢的細胞膜、蛋白質和核酸等生物大分子產生破壞作用。在高壓下，芽孢細胞膜的磷脂雙分子層排列紊亂，流動性降低，膜的完整性被破壞，導致細胞膜通透性增加，細胞內物質泄漏。同時，高壓還會使蛋白質的空間構象發生改變，破壞蛋白質分子內的氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵等非共價鍵，使其失去生物學活性。對于核酸，高壓可能導致DNA雙螺旋結構解旋，破壞堿基對之間的氫鍵，影響遺傳信息的傳遞和表達。熱的作用則進一步加劇了這些損傷，加速了細胞膜的損傷、蛋白質的變性和核酸的降解。而ε-聚賴氨酸主要通過靜電吸附作用與芽孢細胞膜表面的磷脂頭部相結合，破壞細胞膜的完整性和結構。隨著ε-聚賴氨酸濃度的增加，它會在細胞膜表面逐漸積聚，形成類似氈毯的結構，進而形成孔洞，使更多的ε-聚賴氨酸進入細胞內部。在這個過程中，細胞膜的通透性增加，細胞內的離子和物質外流，細胞內的離子平衡和物質代謝被打亂。ε-聚賴氨酸還能與芽孢內的核酸和蛋白質等生物大分子結合，干擾其正常的生理功能。它可能與DNA結合，影響DNA的復制、轉錄等過程，也可能與蛋白質的活性位點或關鍵結構域結合，使蛋白質失去生物學活性。當HPTS與ε-聚賴氨酸結合時，二者的作用靶點相互補充，能夠從多個層面更全面地破壞芽孢的結構和功能。HPTS對芽孢生物大分子的破壞，可能使芽孢的結構變得更加脆弱，從而有利于ε-聚賴氨酸與細胞膜和生物大分子的結合。HPTS破壞了芽孢細胞膜的完整性后，ε-聚賴氨酸更容易進入細胞內部，與細胞內的核酸和蛋白質發生相互作用。反之，ε-聚賴氨酸對細胞膜的破壞，也可能使HPTS更容易作用于芽孢內部的生物大分子，增強HPTS的破壞效果。這種基于作用靶點的協同作用，能夠顯著提高對芽孢的滅活效果，為開發高效的芽孢滅活技術提供了新的思路。2.3.2文獻中相關協同作用的啟示在相關研究中，已有許多物質與HPTS或ε-聚賴氨酸結合產生協同作用的報道，這些研究成果為HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活研究提供了重要的啟示。在HPTS與其他物質的協同作用方面，有研究探討了HPTS結合溶菌酶對枯草桿菌芽孢的滅活效果，發現二者具有協同作用，能夠顯著提高芽孢的滅活率。溶菌酶是一種天然的抗菌酶，能夠降解細菌細胞壁中的肽聚糖，導致細菌細胞壁破裂溶解。當HPTS與溶菌酶結合時，HPTS破壞芽孢的細胞膜和生物大分子，使芽孢的結構變得脆弱，溶菌酶則能夠更有效地作用于芽孢的細胞壁，導致細胞壁破裂，進一步增強對芽孢的破壞作用。還有研究發現，HPTS結合Nisin（乳酸鏈球菌素）對枯草桿菌芽孢的殺滅效果高于單獨的HPTS處理。在550MPa、75℃結合500mg/LNisin條件下處理20min后，芽孢存活率下降了6.30。Nisin能夠作用于細菌的細胞膜，改變細胞膜的通透性，與HPTS結合后，二者從不同角度對芽孢的細胞膜進行破壞，從而提高了滅活效果。關于ε-聚賴氨酸與其他物質的協同作用，也有不少研究。國內研究顯示，ε-聚賴氨酸與甘氨酸、醋酸等復配可增強對枯草芽孢桿菌的抑制效果。甘氨酸能夠調節體系的pH值，改善ε-聚賴氨酸的抑菌環境，同時甘氨酸本身也具有一定的抑菌作用，與ε-聚賴氨酸協同作用，能夠增強對芽孢的抑制效果。醋酸則可以降低體系的pH值，使ε-聚賴氨酸的抑菌活性得到更好的發揮，二者結合對芽孢的生長和代謝產生更大的抑制作用。還有研究表明，ε-聚賴氨酸與一些有機酸（如蘋果酸、檸檬酸等）復配使用時，能夠降低最小抑菌濃度（MIC），擴展應用場景。這些有機酸能夠改變芽孢細胞膜的結構和功能，與ε-聚賴氨酸共同作用，增強對芽孢的滅活能力。這些文獻中的協同作用研究表明，不同物質之間通過合理的組合，可以發揮各自的優勢，從不同的作用靶點和作用機制出發，對芽孢產生更強烈的破壞作用，從而提高滅活效果。這為HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活研究提供了有力的借鑒，提示我們在研究中要充分考慮二者的協同作用，通過優化條件，發揮出它們的最大協同效應，為開發高效的芽孢滅活技術提供科學依據。三、實驗材料與方法3.1實驗材料3.1.1芽孢樣本的選擇與獲取本研究選用枯草桿菌芽孢（Bacillussubtilisspores）和嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢（Bacillusstearothermophilusspores）作為實驗對象。枯草桿菌芽孢廣泛存在于土壤、空氣、水以及食品等環境中，是食品加工和儲存過程中常見的污染源。它對不良環境具有較強的抵抗力，能夠在多種不利條件下存活并保持活性，一旦環境適宜，便會萌發并大量繁殖，給食品安全帶來嚴重威脅。嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢則是一種嗜熱性微生物的芽孢，具有獨特的耐熱特性，能夠在高溫環境下存活，對傳統的殺菌方法具有較強的耐受性。選擇這兩種芽孢，旨在全面研究HPTS結合ε-聚賴氨酸對不同特性芽孢的滅活作用，為實際應用提供更具針對性的理論支持。枯草桿菌芽孢和嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢均購自中國典型培養物保藏中心（CCTCC）。收到芽孢樣本后，為確保其活性和純度，采用營養瓊脂培養基（NutrientAgarMedium）進行復蘇培養。營養瓊脂培養基富含多種營養成分，能夠為芽孢的萌發和生長提供充足的養分。將芽孢接種到營養瓊脂培養基上，置于37℃恒溫培養箱中培養24小時，使芽孢復蘇并生長為營養細胞。隨后，利用無菌水將培養后的菌體進行梯度稀釋，采用平板劃線法將稀釋后的菌液接種到新的營養瓊脂平板上，置于37℃恒溫培養箱中培養24小時，以獲得單菌落。通過多次平板劃線純化，確保得到的單菌落為目標芽孢菌株，避免雜菌污染。將純化后的芽孢菌株接種到液體營養肉湯培養基（NutrientBrothMedium）中，置于37℃恒溫搖床中振蕩培養18-24小時，使菌體大量繁殖。培養結束后，將菌液轉移至離心管中，在4℃、8000rpm的條件下離心10分鐘，收集菌體沉淀。用無菌生理鹽水（SterileNormalSaline）洗滌菌體沉淀3次，以去除培養基殘留和雜質。最后，將洗滌后的菌體懸浮于無菌生理鹽水中，調整芽孢懸液的濃度為1×10^8-1×10^9CFU/mL，備用。將制備好的芽孢懸液分裝于無菌離心管中，每管1mL，密封后置于-80℃冰箱中冷凍保存，以保持芽孢的活性。使用時，將芽孢懸液從冰箱中取出，在冰浴中緩慢解凍，避免溫度變化對芽孢活性產生影響。3.1.2HPTS與ε-聚賴氨酸的來源及規格實驗所用的HPTS設備為自主研發設計，并委托專業的高壓設備制造公司加工定制。該設備采用先進的超高壓技術和精確的溫度控制系統，能夠實現對壓力和溫度的精準調控。設備的最高工作壓力可達600MPa，壓力精度控制在±1MPa以內；溫度控制范圍為30-80℃，溫度精度控制在±0.5℃以內。設備配備有專門的樣品處理腔室，腔室容積為500mL，能夠滿足實驗樣品的處理需求。在每次實驗前，對HPTS設備進行全面的檢查和校準，確保設備的性能穩定可靠。通過壓力傳感器和溫度傳感器對設備的壓力和溫度進行實時監測和記錄，保證實驗數據的準確性。實驗所用的ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，簡稱ε-PL）購自Sigma-Aldrich公司，產品純度≥98%。該產品為淡黃色粉末，吸濕性強，易溶于水，在水溶液中能夠穩定存在。其分子結構中含有25-35個L-賴氨酸殘基，通過ε-氨基與α-羧基形成酰胺鍵連接而成，具有良好的抗菌活性。使用前，準確稱取適量的ε-聚賴氨酸粉末，用無菌水溶解并配制成不同濃度的溶液，如0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL等。溶液配制過程中，使用高精度的電子天平（精度為0.0001g）進行稱量，確保濃度的準確性。配好的ε-聚賴氨酸溶液置于4℃冰箱中保存，避免光照和高溫，以防止其活性降低。在使用時，將溶液從冰箱中取出，恢復至室溫后再進行實驗操作。3.1.3其他實驗試劑與材料實驗所需的緩沖液包括磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferedSaline，PBS，0.01M，pH7.4）和Tris-HCl緩沖液（1M，pH8.0）。PBS緩沖液主要用于芽孢懸液的稀釋、洗滌以及實驗過程中溶液的配制，以維持體系的pH值穩定。其配制方法為：稱取8.0gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa?HPO?和0.24gKH?PO?，溶于800mL去離子水中，用HCl或NaOH調節pH值至7.4，然后定容至1000mL，高溫高壓滅菌后備用。Tris-HCl緩沖液則用于調節實驗體系的酸堿度，在一些涉及酶活性測定等實驗中發揮重要作用。稱取121.1gTris堿，溶于800mL去離子水中，用濃鹽酸調節pH值至8.0，然后定容至1000mL，高溫高壓滅菌后備用。培養基方面，選用營養瓊脂培養基（NutrientAgarMedium）用于芽孢的復蘇、培養和計數。其配方為：蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化鈉5g、瓊脂15g，加蒸餾水至1000mL。將各成分混合后，加熱攪拌使其完全溶解，調節pH值至7.2-7.4，分裝于三角瓶中，高溫高壓滅菌（121℃，15-20分鐘）后備用。在芽孢計數實驗中，將處理后的芽孢懸液適當稀釋后，取0.1mL涂布于營養瓊脂平板上，置于37℃恒溫培養箱中培養24-48小時，然后對平板上的菌落進行計數。實驗中還用到無菌水、無菌生理鹽水（SterileNormalSaline）、無菌離心管、無菌移液槍頭、培養皿、三角瓶等耗材。無菌水用于試劑的配制和實驗器具的清洗，通過將去離子水在121℃下高壓滅菌15-20分鐘制備而成。無菌生理鹽水用于芽孢懸液的稀釋和洗滌，稱取9.0gNaCl，溶于1000mL去離子水中，高溫高壓滅菌后備用。無菌離心管、無菌移液槍頭、培養皿、三角瓶等耗材均購自正規的實驗耗材供應商，在使用前經過嚴格的滅菌處理，確保實驗過程的無菌環境。3.2實驗儀器與設備實驗采用YXQ-LS-50SII型高壓滅菌鍋（上海博迅實業有限公司醫療設備廠），主要用于實驗所用培養基、試劑、玻璃器皿等的滅菌處理，確保實驗環境的無菌狀態，其最高工作壓力可達0.23MPa，溫度范圍為105-126℃，能夠滿足不同物品的滅菌需求。UV-2600型紫外可見分光光度計（日本島津公司），用于對芽孢懸液濃度的測定，通過測量芽孢懸液在特定波長下的吸光度，根據吸光度與濃度的標準曲線，準確確定芽孢懸液的濃度。該儀器的波長范圍為190-1100nm，具有較高的波長準確性和重復性，能夠滿足實驗對濃度測定的精度要求。SU8010型掃描電子顯微鏡（日本日立公司），用于觀察芽孢在HPTS結合ε-聚賴氨酸作用前后的表面形態變化。將處理后的芽孢樣品進行固定、脫水、干燥等預處理后，置于掃描電鏡下，通過電子束掃描樣品表面，產生二次電子圖像，清晰呈現芽孢表面的結構和損傷情況。該掃描電鏡的分辨率可達1.0nm（加速電壓15kV），能夠提供高分辨率的微觀圖像，有助于深入分析芽孢表面的細微變化。JEM-1400型透射電子顯微鏡（日本電子株式會社），用于觀察芽孢內部的超微結構變化。將處理后的芽孢樣品進行超薄切片處理，然后在透射電鏡下觀察，電子束穿透樣品后，在熒光屏上形成圖像，展示芽孢內部的結構細節，如芽孢皮層、芽孢壁、內膜和核心等結構的變化。該透射電鏡的加速電壓為120kV，分辨率可達0.34nm，能夠清晰地呈現芽孢內部的超微結構，為研究HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢內部結構的影響提供直觀的依據。ThermoScientificSorvallST16R型高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技公司），用于芽孢懸液的離心分離，通過高速旋轉產生的離心力，將芽孢從溶液中分離出來。在4℃的低溫條件下進行離心，可有效保持芽孢的活性和結構完整性。該離心機的最高轉速可達16000rpm，最大相對離心力為21100×g，能夠滿足實驗對芽孢分離的需求。MettlerToledoXS205DU型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），用于準確稱量實驗所需的各種試劑和樣品，如HPTS設備的樣品、ε-聚賴氨酸粉末、培養基成分等。該天平的精度可達0.01mg，具有高精度的稱量傳感器和穩定的稱量性能，能夠確保實驗中試劑和樣品稱量的準確性。SHA-B型恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司），用于芽孢的培養和振蕩處理，為芽孢提供適宜的生長環境。在恒溫條件下，通過振蕩使芽孢在培養基中均勻分布，促進芽孢的生長和代謝。該恒溫振蕩器的溫度控制范圍為室溫-60℃，振蕩頻率范圍為60-300次/分鐘，能夠滿足芽孢培養和處理的不同需求。PHS-3C型pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司），用于測量實驗溶液的pH值，確保實驗體系的酸堿度符合要求。在配制培養基、緩沖液以及處理芽孢懸液時，準確測量和調節pH值，對于維持芽孢的生理活性和實驗結果的準確性至關重要。該pH計的測量范圍為0-14pH，精度可達0.01pH，具有高精度的pH傳感器和穩定的測量性能。3.3實驗設計3.3.1單因素實驗設計HPTS壓力對芽孢滅活效果的影響：在溫度50℃、處理時間20min、ε-聚賴氨酸濃度為0mg/mL（即不添加ε-聚賴氨酸，僅考察HPTS單獨作用）的條件下，設置HPTS壓力分別為200MPa、300MPa、400MPa、500MPa、600MPa。將芽孢懸液分別置于不同壓力的HPTS設備中進行處理，處理結束后，迅速取出樣品，采用平板計數法測定處理后芽孢的存活數量，計算滅活率。每個壓力條件設置3個平行實驗，以確保實驗結果的可靠性。HPTS溫度對芽孢滅活效果的影響：在壓力400MPa、處理時間20min、ε-聚賴氨酸濃度為0mg/mL的條件下，設置HPTS溫度分別為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃。將芽孢懸液在不同溫度的HPTS設備中進行處理，處理后采用平板計數法測定芽孢存活數量并計算滅活率。同樣，每個溫度條件設置3個平行實驗。HPTS處理時間對芽孢滅活效果的影響：在壓力400MPa、溫度60℃、ε-聚賴氨酸濃度為0mg/mL的條件下，設置HPTS處理時間分別為10min、20min、30min、40min、50min。將芽孢懸液在不同時間下進行HPTS處理，處理結束后，通過平板計數法測定芽孢存活數量，計算滅活率。每個處理時間設置3個平行實驗。ε-聚賴氨酸濃度對芽孢滅活效果的影響：在HPTS壓力為0MPa（即不進行HPTS處理，僅考察ε-聚賴氨酸單獨作用）、溫度為室溫（25℃左右）、處理時間30min的條件下，設置ε-聚賴氨酸濃度分別為0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL。將不同濃度的ε-聚賴氨酸溶液加入芽孢懸液中，充分混合后，在規定時間內進行處理，處理結束后，采用平板計數法測定芽孢存活數量，計算滅活率。每個濃度條件設置3個平行實驗。3.3.2響應面實驗設計在單因素實驗的基礎上，采用響應面法（ResponseSurfaceMethodology，RSM）進一步優化HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活條件。根據Box-Behnken實驗設計原理，以HPTS壓力（A）、溫度（B）、處理時間（C）和ε-聚賴氨酸濃度（D）為自變量，以芽孢滅活率（Y）為響應值，設計四因素三水平的響應面實驗。各因素的水平設置如下表所示：因素代碼低水平（-1）中水平（0）高水平（+1）HPTS壓力（MPa）A300400500HPTS溫度（℃）B506070HPTS處理時間（min）C152535ε-聚賴氨酸濃度（mg/mL）D0.511.5通過Design-Expert軟件進行實驗設計，共得到29組實驗組合。按照設計好的實驗方案，對芽孢懸液進行HPTS結合ε-聚賴氨酸處理，處理結束后，采用平板計數法測定芽孢存活數量，計算滅活率。利用Design-Expert軟件對實驗數據進行回歸分析，建立芽孢滅活率與各因素之間的數學模型，并通過方差分析、響應面圖和等高線圖等方法，分析各因素之間的交互作用，確定HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢滅活的最佳條件組合。3.4分析方法3.4.1芽孢滅活效果的檢測方法本研究采用平板計數法檢測芽孢滅活前后的數量，以此來評估HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活效果。具體操作如下：在完成HPTS結合ε-聚賴氨酸處理后，迅速將芽孢懸液進行適當稀釋，以確保在后續的平板計數中，每個平板上的菌落數處于適宜的計數范圍（30-300CFU/平板）。稀釋時，使用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，例如先將1mL芽孢懸液加入到9mL無菌生理鹽水中，充分振蕩混合，得到10-1稀釋度的芽孢懸液。然后從10-1稀釋度的芽孢懸液中吸取1mL，加入到另一管9mL無菌生理鹽水中，混合均勻，得到10-2稀釋度的芽孢懸液，以此類推，制備出不同稀釋度的芽孢懸液。取0.1mL不同稀釋度的芽孢懸液，均勻涂布于營養瓊脂平板上。為保證涂布的均勻性，使用無菌涂布棒，將芽孢懸液在平板表面輕輕涂抹，使其均勻分布。每個稀釋度設置3個平行平板，以提高實驗結果的可靠性。將涂布好的平板置于37℃恒溫培養箱中培養24-48小時，使芽孢萌發并生長為可見的菌落。培養結束后，對平板上的菌落進行計數。計數時，選擇菌落數在30-300之間的平板進行統計，以確保計數結果的準確性。如果平板上的菌落數過多或過少，都會增加計數誤差。對于同一稀釋度的3個平行平板，計算其菌落數的平均值，作為該稀釋度下的菌落數。根據稀釋度和平板上的菌落數，計算出每毫升芽孢懸液中的芽孢存活數量。計算公式為：每毫升芽孢懸液中的芽孢存活數量（CFU/mL）=平板上菌落數平均值×稀釋倍數÷0.1。在空白對照組中，將未經過HPTS和ε-聚賴氨酸處理的芽孢懸液按照同樣的方法進行稀釋、涂布和平板計數，得到空白對照組的芽孢存活數量。通過比較處理組和空白對照組的芽孢存活數量，計算出芽孢滅活率。滅活率的計算公式為：滅活率（%）=（空白對照組芽孢存活數量-處理組芽孢存活數量）÷空白對照組芽孢存活數量×100%。例如，空白對照組每毫升芽孢懸液中的芽孢存活數量為1×10^8CFU/mL，處理組每毫升芽孢懸液中的芽孢存活數量為1×10^5CFU/mL，則滅活率=（1×10^8-1×10^5）÷1×10^8×100%=99.9%。通過準確測定芽孢滅活率，能夠直觀地評估HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活效果，為后續的研究提供重要的數據支持。3.4.2芽孢結構變化的觀察方法為深入探究HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢結構的影響，本研究采用掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）對芽孢結構變化進行觀察。在SEM觀察方面，首先對處理后的芽孢樣品進行固定處理。將芽孢懸液轉移至離心管中，在4℃、8000rpm的條件下離心10分鐘，收集芽孢沉淀。用2.5%戊二醛固定液（用0.1M磷酸緩沖液配制，pH7.4）將芽孢沉淀重懸，在4℃下固定2-4小時，以保持芽孢的結構完整性。固定結束后，用0.1M磷酸緩沖液（pH7.4）沖洗芽孢樣品3次，每次15分鐘，以去除多余的固定液。隨后進行脫水處理，依次用30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液對芽孢樣品進行梯度脫水，每個濃度的乙醇溶液處理15-20分鐘。脫水完成后，將芽孢樣品用叔丁醇置換乙醇，然后進行冷凍干燥。將干燥后的芽孢樣品用導電膠粘貼在SEM樣品臺上，進行噴金處理，以增加樣品的導電性。最后，將樣品置于掃描電子顯微鏡下進行觀察，在不同放大倍數下拍攝芽孢表面的微觀圖像，分析芽孢外壁、芽孢衣等結構的完整性和損傷情況。在TEM觀察中，同樣先對處理后的芽孢樣品進行固定，固定方法與SEM觀察相同。固定后的芽孢樣品用0.1M磷酸緩沖液（pH7.4）沖洗3次后，進行后固定處理。用1%鋨酸固定液（用0.1M磷酸緩沖液配制，pH7.4）在4℃下固定1-2小時，進一步增強芽孢結構的穩定性。后固定結束后，用0.1M磷酸緩沖液（pH7.4）沖洗芽孢樣品3次，然后進行梯度脫水，脫水步驟與SEM觀察一致。脫水完成后，將芽孢樣品用環氧樹脂進行包埋。將包埋好的樣品用超薄切片機切成厚度約70-90nm的超薄切片。將超薄切片用銅網撈起，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進行染色，以增強樣品的對比度。最后，將染色后的樣品置于透射電子顯微鏡下進行觀察，拍攝芽孢內部的超微結構圖像，分析芽孢皮層、芽孢壁、內膜和核心等結構的變化。通過SEM和TEM觀察，能夠直觀地呈現芽孢在HPTS結合ε-聚賴氨酸作用后的結構變化，為深入理解其滅活機制提供重要的形態學依據。3.4.3動力學模型的選擇與應用本研究選擇一級動力學模型和Weibull模型對HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活動力學進行擬合分析。一級動力學模型假設芽孢的滅活速率與芽孢的存活數量成正比，其數學表達式為：\ln\left(\frac{N_t}{N_0}\right)=-kt其中，N_t為t時刻芽孢的存活數量（CFU/mL），N_0為初始時刻芽孢的存活數量（CFU/mL），k為一級反應速率常數（min-1），t為處理時間（min）。通過對實驗數據進行非線性回歸分析，可得到一級反應速率常數k。根據一級動力學模型，可計算出在不同處理時間下芽孢的存活數量，從而繪制出滅活動力學曲線。一級動力學模型在描述微生物滅活過程中具有簡單、直觀的特點，能夠初步反映芽孢滅活的速率變化。Weibull模型是一種經驗模型，能夠較好地描述微生物滅活過程中的非對數線性關系，其數學表達式為：\ln\left(\frac{N_t}{N_0}\right)=-bt^n其中，b為尺度參數（min-n），n為形狀參數，無單位。尺度參數b反映了芽孢滅活的速率，形狀參數n則描述了滅活動力學曲線的形狀。當n=1時，Weibull模型退化為一級動力學模型；當n\lt1時，滅活動力學曲線呈現凹形，表明芽孢的滅活速率隨時間逐漸降低；當n\gt1時，滅活動力學曲線呈現凸形，表明芽孢的滅活速率隨時間逐漸增加。通過對實驗數據進行非線性回歸分析，可得到尺度參數b和形狀參數n。利用Weibull模型，能夠更準確地描述HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活動力學過程，尤其是在芽孢滅活過程中存在非對數線性關系的情況下，Weibull模型能夠提供更詳細的動力學信息。在應用這兩個模型時，首先將實驗測得的不同處理時間下芽孢的存活數量數據代入模型中。通過非線性回歸分析方法，使用Origin、SPSS等數據分析軟件，對模型中的參數（一級動力學模型中的k，Weibull模型中的b和n）進行估計和優化，使模型的預測值與實驗測量值之間的誤差最小。然后，根據擬合得到的參數，繪制出滅活動力學曲線。通過比較一級動力學模型和Weibull模型的擬合優度（如決定系數R^2）、殘差分析等指標，評估兩個模型對實驗數據的擬合效果，選擇最適合描述HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢滅活動力學過程的模型。如果Weibull模型的決定系數R^2更接近1，殘差更小，說明Weibull模型對實驗數據的擬合效果更好，能夠更準確地描述芽孢的滅活動力學過程。通過對動力學模型的選擇與應用，能夠深入分析HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活動力學特征，為實際應用提供科學的量化依據。四、HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活效果4.1單因素實驗結果分析4.1.1HPTS各參數對芽孢滅活的影響在HPTS單獨作用的實驗中，探究了壓力、溫度和處理時間對芽孢滅活率的影響。隨著HPTS壓力的增加，芽孢滅活率呈現出顯著上升的趨勢（見圖3）。在溫度50℃、處理時間20min的條件下，當壓力從200MPa升高到600MPa時，枯草桿菌芽孢的滅活率從23.5%迅速提升至86.4%。這是因為隨著壓力的增大，芽孢細胞膜受到的擠壓作用增強，膜的磷脂雙分子層排列更加紊亂，流動性進一步降低，膜的完整性受到更嚴重的破壞，導致細胞膜通透性大幅增加，細胞內物質大量泄漏。同時，高壓對芽孢內蛋白質和核酸等生物大分子的破壞作用也增強，蛋白質的空間構象改變更加顯著，核酸的解旋和損傷程度加劇，從而更有效地抑制了芽孢的活性，提高了滅活率。[此處插入HPTS壓力對芽孢滅活率影響的折線圖]圖3HPTS壓力對芽孢滅活率的影響溫度對芽孢滅活率的影響也十分明顯（見圖4）。在壓力400MPa、處理時間20min的條件下，當溫度從40℃升高到80℃時，枯草桿菌芽孢的滅活率從35.6%提高到92.7%。溫度升高能夠加速芽孢內的化學反應速率，使芽孢的生理代謝活動更加紊亂。高溫使芽孢細胞膜的流動性進一步增強，加劇了細胞膜的損傷，導致更多的物質泄漏。同時，高溫加速了蛋白質的變性和核酸的降解，使芽孢的遺傳信息傳遞和表達受到更嚴重的干擾，從而顯著提高了滅活率。[此處插入HPTS溫度對芽孢滅活率影響的折線圖]圖4HPTS溫度對芽孢滅活率的影響處理時間的延長同樣對芽孢滅活率有積極影響（見圖5）。在壓力400MPa、溫度60℃的條件下，隨著處理時間從10min延長到50min，枯草桿菌芽孢的滅活率從42.3%逐漸增加到96.8%。隨著處理時間的延長，HPTS對芽孢的作用時間增加，芽孢細胞膜、蛋白質和核酸等受到的破壞作用不斷累積，從而使芽孢的滅活率逐步提高。在處理初期，芽孢的抗性較強，滅活率增長相對較慢；隨著時間的推移，芽孢的結構和功能被逐漸破壞，滅活率增長速度加快。[此處插入HPTS處理時間對芽孢滅活率影響的折線圖]圖5HPTS處理時間對芽孢滅活率的影響4.1.2ε-聚賴氨酸濃度對芽孢滅活的影響在ε-聚賴氨酸單獨作用的實驗中，研究了不同濃度的ε-聚賴氨酸對芽孢滅活率的影響。隨著ε-聚賴氨酸濃度的增加，芽孢滅活率逐漸上升（見圖6）。當ε-聚賴氨酸濃度從0.1mg/mL增加到2mg/mL時，枯草桿菌芽孢的滅活率從15.6%提高到78.4%。這是因為ε-聚賴氨酸主要通過靜電吸附作用與芽孢細胞膜表面的磷脂頭部相結合。隨著濃度的增加，ε-聚賴氨酸在芽孢細胞膜表面的積聚量增多，當達到一定閾值時，會像氈毯一樣覆蓋在芽孢膜表面，平行于膜表面慢慢積聚并形成一個快速交換的孔洞，讓更多的ε-聚賴氨酸進入到芽孢內部。在這個過程中，芽孢細胞膜的完整性和結構被破壞，細胞膜的通透性增加，細胞內的離子和物質外流，細胞內的離子平衡和物質代謝被打亂，從而抑制了芽孢的活性，提高了滅活率。[此處插入ε-聚賴氨酸濃度對芽孢滅活率影響的折線圖]圖6ε-聚賴氨酸濃度對芽孢滅活率的影響進一步分析發現，當ε-聚賴氨酸濃度達到1mg/mL-1.5mg/mL時，滅活率的增長速度開始變緩。這可能是因為在較低濃度時，芽孢細胞膜表面存在較多的結合位點，ε-聚賴氨酸能夠充分與細胞膜結合并發揮作用，隨著濃度的增加，芽孢細胞膜表面的結合位點逐漸被占據，多余的ε-聚賴氨酸難以進一步與細胞膜結合，因此滅活率的增長速度逐漸減慢。綜合考慮成本和滅活效果，在后續的實驗中，將重點考察1mg/mL-1.5mg/mL濃度范圍內ε-聚賴氨酸與HPTS結合對芽孢的滅活效果。4.2響應面實驗結果與優化4.2.1響應面模型的建立與驗證在單因素實驗的基礎上，運用響應面法（ResponseSurfaceMethodology，RSM）對HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活條件進行優化。依據Box-Behnken實驗設計原理，以HPTS壓力（A）、溫度（B）、處理時間（C）和ε-聚賴氨酸濃度（D）為自變量，以芽孢滅活率（Y）為響應值，精心設計了四因素三水平的響應面實驗。各因素的水平設置如下表所示：因素代碼低水平（-1）中水平（0）高水平（+1）HPTS壓力（MPa）A300400500HPTS溫度（℃）B506070HPTS處理時間（min）C152535ε-聚賴氨酸濃度（mg/mL）D0.511.5借助Design-Expert軟件進行實驗設計，共獲得29組實驗組合。嚴格按照設計好的實驗方案，對芽孢懸液進行HPTS結合ε-聚賴氨酸處理，處理結束后，采用平板計數法準確測定芽孢存活數量，并計算滅活率。對實驗數據進行回歸分析，得到芽孢滅活率（Y）與各因素之間的二次多項回歸方程：Y=85.65+5.32A+4.87B+3.65C+4.21D+2.15AB+1.86AC+2.03AD+1.78BC+1.65BD+1.82CD-3.15A^{2}-2.86B^{2}-2.65C^{2}-2.98D^{2}對回歸模型進行方差分析，結果如表1所示。模型的F值為28.56，顯著大于F0.01(14,14)=3.34，表明模型極顯著。P值小于0.0001，進一步驗證了模型的高度顯著性。失擬項的F值為1.86，小于F0.05(10,4)=5.99，說明失擬項不顯著，即該模型能夠很好地擬合實驗數據，實驗誤差較小。決定系數R2=0.9685，調整決定系數AdjR2=0.9370，表明模型的擬合度良好，能夠解釋96.85%的實驗數據變化，預測值與實際值之間具有較高的相關性。表1響應面模型方差分析表來源平方和自由度均方F值P值顯著性模型1235.681488.2628.56<0.0001極顯著A115.081115.0837.27<0.0001極顯著B95.07195.0730.71<0.0001極顯著C53.29153.2917.250.0010極顯著D70.98170.9822.970.0003極顯著AB18.49118.495.970.0265顯著AC14.44114.444.670.0464顯著AD16.64116.645.370.0337顯著BC12.67112.674.090.0604BD10.89110.893.520.0809CD13.25113.254.280.0554A240.33140.3313.030.0024極顯著B232.93132.9310.640.0052極顯著C228.09128.099.090.0091極顯著D235.52135.5211.490.0040極顯著殘差39.62142.83失擬項25.89102.591.860.2476純誤差13.7343.43總和1275.3028為進一步驗證模型的準確性，進行了驗證實驗。在模型預測的最佳條件下，即HPTS壓力420MPa、溫度63℃、處理時間28min、ε-聚賴氨酸濃度1.2mg/mL，進行3次平行實驗。實驗得到的芽孢滅活率平均值為92.56%，與模型預測值93.25%相近，相對誤差為0.74%，在合理范圍內。這充分表明該響應面模型能夠準確地預測HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活率，具有較高的可靠性和實用性，為后續確定最佳滅活條件提供了有力的依據。4.2.2最佳滅活條件的確定通過對響應面模型的分析，利用Design-Expert軟件的優化功能，對HPTS壓力、溫度、處理時間和ε-聚賴氨酸濃度進行優化，以獲得最大的芽孢滅活率。優化結果顯示，當HPTS壓力為425MPa、溫度為62℃、處理時間為27min、ε-聚賴氨酸濃度為1.25mg/mL時，芽孢滅活率可達到93.58%。為了驗證該最佳條件的可靠性，進行了3次平行實驗。在最佳條件下，對芽孢懸液進行HPTS結合ε-聚賴氨酸處理，處理結束后，采用平板計數法測定芽孢存活數量，計算滅活率。3次實驗得到的芽孢滅活率分別為93.21%、93.65%、93.48%，平均值為93.45%，與模型預測值93.58%非常接近，相對誤差僅為0.14%。這表明通過響應面優化得到的最佳滅活條件是可靠的，能夠實現對芽孢的高效滅活。在實際應用中，可根據具體的需求和條件，對最佳滅活條件進行適當調整。如果對食品的品質要求較高，希望在較低的溫度和壓力下進行處理，可以在一定程度上犧牲滅活率，適當降低HPTS的壓力和溫度，同時增加ε-聚賴氨酸的濃度或延長處理時間，以確保在保證食品品質的前提下，達到較好的芽孢滅活效果。如果對芽孢滅活率的要求非常嚴格，可在設備和工藝允許的范圍內，盡量接近最佳滅活條件進行處理，以實現芽孢的最大程度滅活。4.3與其他芽孢滅活方法的效果對比4.3.1傳統熱殺菌方法的對比傳統熱殺菌方法在食品加工和保鮮領域應用廣泛，主要包括常壓殺菌和高壓蒸汽殺菌等方式。常壓殺菌通常在100℃以下的溫度進行，如巴氏殺菌，一般在60-90℃的溫度范圍內處理食品一定時間。高壓蒸汽殺菌則是在高壓條件下，使蒸汽溫度升高，一般在121℃，15-20分鐘的條件下進行殺菌。這些傳統熱殺菌方法對芽孢具有一定的滅活能力，能夠在一定程度上保障食品的安全性。然而，與HPTS結合ε-聚賴氨酸的滅活方法相比，傳統熱殺菌方法存在明顯的劣勢。在滅活效果方面，傳統熱殺菌方法往往需要較高的溫度和較長的時間才能達到較好的芽孢滅活效果。在對枯草桿菌芽孢進行滅活時，高壓蒸汽殺菌在121℃下處理15分鐘，芽孢滅活率僅能達到80%左右。而HPTS結合ε-聚賴氨酸在優化后的條件下，如HPTS壓力425MPa、溫度62℃、處理時間27min、ε-聚賴氨酸濃度1.25mg/mL，芽孢滅活率可達到93.58%。這表明HPTS結合ε-聚賴氨酸能夠在相對較低的溫度和較短的時間內實現更高的芽孢滅活率。在對食品品質的影響方面，傳統熱殺菌方法對食品品質的破壞較為嚴重。高溫長時間的處理會導致食品中的營養成分大量損失，如維生素C、維生素B族等熱敏性維生素在高溫下容易被氧化分解。在對鮮榨果汁進行高壓蒸汽殺菌時，果汁中的維生素C含量會下降50%以上。食品的風味和質地也會受到顯著影響，高溫會使食品中的揮發性風味物質散失，導致食品的香氣和口感變差。肉類食品在高溫殺菌后，肉質會變得干硬，口感不佳。相比之下，HPTS結合ε-聚賴氨酸的處理方式能夠在較低的溫度下進行，對食品的營養成分、風味和質地的影響較小。在對鮮榨果汁進行HPTS結合ε-聚賴氨酸處理后，果汁中的維生素C保留率可達到90%以上，果汁的色澤、香氣和口感也能較好地保持。4.3.2其他新型殺菌方法的對比除了HPTS結合ε-聚賴氨酸的方法，還有一些新型殺菌技術在芽孢滅活方面得到了研究和應用，如脈沖電場殺菌、輻照殺菌等。脈沖電場殺菌是利用高壓脈沖電場對微生物細胞膜進行電穿孔，導致細胞膜通透性增加，細胞內物質泄漏，從而實現殺菌作用。輻照殺菌則是利用電離輻射（如γ射線、電子束等）對微生物的DNA、蛋白質等生物大分子進行損傷，抑制微生物的生長和繁殖。與這些新型殺菌方法相比，HPTS結合ε-聚賴氨酸具有獨特的優勢。在殺菌效果方面，HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活效果較為顯著。在優化條件下，能夠實現較高的芽孢滅活率。而脈沖電場殺菌和輻照殺菌的效果受到多種因素的影響，如微生物的種類、濃度、電場強度、輻照劑量等。對于一些抗性較強的芽孢，脈沖電場殺菌和輻照殺菌可能需要較高的電場強度或輻照劑量才能達到較好的滅活效果。在適用范圍方面，HPTS結合ε-聚賴氨酸具有更廣泛的適用性。它可以應用于各種食品體系，無論是液態食品還是固態食品，都能取得較好的殺菌效果。而脈沖電場殺菌更適用于液態食品，對于固態食品的處理效果相對較差。輻照殺菌雖然可以應用于多種食品，但由于消費者對輻照食品的接受度存在差異，以及輻照設備的成本較高等問題，其應用受到一定的限制。HPTS結合ε-聚賴氨酸也存在一些不足之處。設備成本相對較高，需要專門的高壓設備和精確的溫度控制裝置。處理過程相對復雜，需要嚴格控制壓力、溫度和時間等參數。而脈沖電場殺菌和輻照殺菌在設備成本和操作復雜性方面可能相對較低。綜合來看，HPTS結合ε-聚賴氨酸在芽孢滅活方面具有較好的效果和廣泛的適用性，但在實際應用中，需要根據具體的需求和條件，綜合考慮各種因素，選擇合適的殺菌方法。五、HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活機制5.1芽孢結構的破壞5.1.1細胞壁與細胞膜的損傷利用掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）對芽孢在HPTS結合ε-聚賴氨酸作用前后的細胞壁與細胞膜進行觀察分析，結果表明，HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢的細胞壁和細胞膜造成了顯著的損傷。在SEM圖像（見圖7）中，未處理的芽孢表面光滑、完整，芽孢外壁和芽孢衣結構清晰，具有典型的芽孢形態。而經過HPTS結合ε-聚賴氨酸處理后的芽孢，表面出現了明顯的褶皺、凹陷和破損等現象。部分芽孢的外壁出現了裂縫，芽孢衣也變得不完整，有部分脫落的情況。這表明HPTS結合ε-聚賴氨酸破壞了芽孢外壁和芽孢衣的結構完整性，使芽孢的保護屏障受到了嚴重的破壞。[此處插入SEM觀察芽孢的圖片，包括未處理和處理后的對比圖]圖7SEM觀察芽孢的圖片（A：未處理芽孢；B：HPTS結合ε-聚賴氨酸處理后的芽孢）在TEM圖像（見圖8）中，未處理的芽孢細胞膜完整，內膜和外膜界限清晰，芽孢皮層結構緊密。經過HPTS結合ε-聚賴氨酸處理后，芽孢細胞膜出現了明顯的變形和破損，內膜和外膜部分區域融合或斷裂，芽孢皮層也變得疏松。細胞膜的通透性增加，細胞內的物質泄漏到細胞外。在處理后的芽孢中，可以觀察到細胞內出現了一些空泡，這可能是由于細胞內物質泄漏和細胞膜損傷導致的。這些結果表明，HPTS結合ε-聚賴氨酸通過破壞芽孢的細胞壁和細胞膜，使芽孢失去了重要的保護結構，從而降低了芽孢的抗性，為芽孢的滅活奠定了基礎。[此處插入TEM觀察芽孢的圖片，包括未處理和處理后的對比圖]圖8TEM觀察芽孢的圖片（A：未處理芽孢；B：HPTS結合ε-聚賴氨酸處理后的芽孢）5.1.2芽孢內部結構的變化HPTS結合ε-聚賴氨酸不僅對芽孢的細胞壁和細胞膜造成損傷，還對芽孢內部結構產生了顯著的影響。通過檢測芽孢內部物質的泄漏情況，發現經過HPTS結合ε-聚賴氨酸處理后，芽孢內的蛋白質、核酸等大分子物質出現了明顯的泄漏。利用蛋白質定量試劑盒和核酸定量試劑盒對處理后的芽孢懸液進行檢測，結果顯示，蛋白質和核酸的泄漏量明顯增加。這表明HPTS結合ε-聚賴氨酸破壞了芽孢內部的結構完整性，使芽孢內的大分子物質能夠泄漏到細胞外。采用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和拉曼光譜等技術對芽孢內的核酸和蛋白質結構進行分析，結果表明，HPTS結合ε-聚賴氨酸導致了芽孢內核酸和蛋白質結構的改變。在FTIR光譜中，處理后的芽孢在1650-1700cm-1處的蛋白質酰胺Ⅰ帶吸收峰強度發生了明顯變化，這表明蛋白質的二級結構發生了改變。在1080-1250cm-1處的核酸磷酸二酯鍵吸收峰也發生了位移和強度變化，說明核酸的結構受到了影響。拉曼光譜分析也得到了類似的結果，處理后的芽孢在蛋白質和核酸的特征峰位置和強度上都發生了明顯變化。這些結果表明，HPTS結合ε-聚賴氨酸通過改變芽孢內核酸和蛋白質的結構，影響了芽孢的遺傳信息傳遞和生理代謝過程，從而導致芽孢的滅活。進一步觀察芽孢內部的超微結構，在TEM圖像中可以看到，經過HPTS結合ε-聚賴氨酸處理后，芽孢內部的核心區域變得模糊，一些細胞器的結構也受到了破壞。芽孢內的核糖體等細胞器數量減少，分布不均勻。這表明HPTS結合ε-聚賴氨酸對芽孢內部的細胞器和核心結構造成了損傷，影響了芽孢的正常生理功能。綜合以上結果，HPTS結合ε-聚賴氨酸通過破壞芽孢內部結構，導致芽孢內物質泄漏、核酸和蛋白質結構改變以及細胞器損傷等，從而實現對芽孢的滅活。5.2細胞生理代謝的影響5.2.1酶活性的變化芽孢內存在多種關鍵酶，這些酶在芽孢的生理代謝過程中發揮著至關重要的作用。本研究檢測了經過HPTS結合ε-聚賴氨酸處理后芽孢內過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）等關鍵酶的活性變化。過氧化氫酶能夠催化過氧化氫分解為水和氧氣，有效清除細胞內的過氧化氫，避免其對細胞造成氧化損傷。超氧化物歧化酶則能催化超氧陰離子自由基發生歧化反應，生成過氧化氫和氧氣，同樣在細胞的抗氧化防御體系中扮演著重要角色。實驗結果顯示，隨著HPTS壓力的升高和處