B激肽受體在人頸動脈粥樣硬化斑塊中的作用機制探究一、引言1.1研究背景與意義隨著全球老齡化進程的加速以及人們飲食結構的顯著變化，缺血性腦卒中的發病率呈現出逐年攀升的態勢。缺血性腦卒中作為一種嚴重的腦血管疾病，具有極高的致死率和致殘率，給患者及其家庭帶來了沉重的負擔，也對社會醫療資源造成了巨大的壓力。據世界衛生組織（WHO）統計數據顯示，全球每年約有1500萬人罹患腦卒中，其中缺血性腦卒中約占87%。在我國，缺血性腦卒中同樣是威脅居民健康的主要疾病之一，其發病率、死亡率和致殘率均居高不下。頸動脈粥樣硬化被公認為是誘發缺血性腦卒中的常見且重要的原因之一。頸動脈作為連接心臟與大腦的主要血管，其粥樣硬化病變的發生發展會導致頸動脈管腔狹窄、血流動力學改變以及斑塊破裂等一系列病理生理過程，進而增加了缺血性腦卒中的發病風險。相關研究表明，頸動脈粥樣硬化斑塊的存在使缺血性腦卒中的發生風險增加了2-6倍。當頸動脈粥樣硬化斑塊破裂時，會迅速激活血小板聚集和血栓形成，導致急性血管阻塞，引發腦梗死；而即使斑塊未破裂，嚴重的頸動脈狹窄也會導致腦供血不足，引起慢性缺血性腦損傷，影響認知功能和日常生活能力。目前，臨床上針對頸動脈粥樣硬化斑塊的治療方法主要包括頸動脈斑塊剝脫術、頸動脈支架植入術以及藥物治療等。頸動脈斑塊剝脫術是通過手術直接切除頸動脈內的粥樣硬化斑塊，以恢復頸動脈的通暢性。然而，該手術屬于有創操作，具有一定的手術風險，如術中出血、神經損傷、術后感染等，且對患者的身體狀況和手術適應證要求較為嚴格，并非所有患者都適合接受該手術。頸動脈支架植入術則是通過介入手段將支架放置在頸動脈狹窄部位，撐開狹窄的血管，改善血流。但該方法也存在一些潛在問題，如支架內再狹窄、血栓形成等，需要長期服用抗血小板藥物來預防并發癥，且部分患者可能對支架材料產生過敏反應。藥物治療主要包括抗血小板藥物、他汀類降脂藥物等。抗血小板藥物如阿司匹林、氯吡格雷等，可抑制血小板聚集，預防血栓形成，但長期使用可能會增加出血風險；他汀類降脂藥物能夠降低血脂水平，穩定斑塊，但對于已經形成的嚴重斑塊，其治療效果有限，且部分患者可能出現肝功能損害、肌肉疼痛等不良反應。盡管這些治療方法在一定程度上能夠緩解頸動脈粥樣硬化斑塊相關的癥狀，降低缺血性腦卒中的發生風險，但它們都存在各自的局限性，治療效果仍不盡如人意。因此，尋找一種更為有效的頸動脈粥樣硬化斑塊治療新方法，成為了當前醫學領域亟待解決的重要課題。大量的基礎研究和臨床實踐表明，炎癥在動脈粥樣硬化斑塊的發生、發展過程中起著關鍵作用。從動脈粥樣硬化的起始階段，炎癥細胞如單核細胞、巨噬細胞等就開始浸潤血管內膜，吞噬脂質形成泡沫細胞，啟動炎癥反應。隨著病變的進展，炎癥反應進一步加劇，多種炎癥介質如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等被釋放，這些炎癥介質不僅會促進血管平滑肌細胞增殖、遷移，導致血管壁增厚，還會破壞斑塊的穩定性，使斑塊易于破裂。在易損斑塊破裂、潰瘍和斑塊內出血等急性事件中，炎癥反應更是起到了推波助瀾的作用，引發急性血栓形成，導致血管急性閉塞，進而引發缺血性腦卒中。激肽作為一種重要的生物活性肽，在慢性炎癥病理生理過程中發揮著一定的作用。激肽通過與B激肽受體結合，激活下游信號通路，參與調節血管舒張、通透性增加、細胞增殖與遷移以及炎癥細胞趨化等多種生理病理過程。B激肽受體主要包括B1激肽受體和B2激肽受體，它們在結構和功能上既有相似之處，又存在一定差異。B2激肽受體在正常生理狀態下廣泛表達于血管內皮細胞、平滑肌細胞等多種細胞表面，參與維持血管的正常生理功能，如調節血管張力、促進血管舒張等。當機體發生炎癥反應時，B1激肽受體的表達會迅速上調，其主要參與炎癥的放大和持續過程，促進炎癥細胞的浸潤和炎癥介質的釋放。鑒于炎癥在頸動脈粥樣硬化斑塊形成和發展中的關鍵作用，以及激肽在慢性炎癥病理生理過程中的調節作用，B激肽受體表達的均衡性可能在頸動脈粥樣硬化斑塊的形成和穩定性方面發揮著至關重要的作用。然而，目前國內外尚未見關于B激肽受體與人頸動脈粥樣硬化斑塊關系的系統研究報道。深入探究B激肽受體與人頸動脈粥樣硬化斑塊形成和穩定性之間的關系，不僅有助于揭示頸動脈粥樣硬化的發病機制，為該疾病的早期診斷和預防提供新的理論依據，還可能為開發新型的治療靶點和治療藥物奠定基礎，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2國內外研究現狀在國外，頸動脈粥樣硬化的研究起步較早，對于其發病機制和治療方法的探索取得了一系列重要成果。在治療方法方面，頸動脈內膜剝脫術（CEA）自20世紀50年代首次開展以來，經過多年的臨床實踐和技術改進，已被證明是治療重度頸動脈狹窄的有效方法。北美癥狀性頸動脈內膜切除試驗（NASCET）和歐洲頸動脈外科試驗（ECST）等大規模臨床試驗結果顯示，對于有癥狀且頸動脈狹窄程度超過70%的患者，CEA可顯著降低缺血性腦卒中的發生風險。頸動脈支架植入術（CAS）作為一種微創手術，近年來也得到了廣泛應用。多項研究如SPACE試驗、SAPPHIRE試驗等對比了CAS與CEA的療效和安全性，結果表明，對于一些高危患者，CAS具有與CEA相當的有效性，且具有創傷小、恢復快等優點，但同時也存在如術中腦栓塞、術后再狹窄等風險。在藥物治療方面，他汀類藥物被廣泛應用于頸動脈粥樣硬化的治療，其不僅能夠降低血脂水平，還具有抗炎、穩定斑塊等多效性。如4S、CARE、LIPID等大規模臨床試驗證實了他汀類藥物在降低心血管事件風險方面的顯著作用。抗血小板藥物如阿司匹林、氯吡格雷等也在頸動脈粥樣硬化的二級預防中發揮著重要作用，能夠抑制血小板聚集，預防血栓形成。在國內，隨著醫療技術的不斷發展和對頸動脈粥樣硬化認識的逐漸深入，相關研究也取得了長足的進步。中醫中藥在頸動脈粥樣硬化的治療方面展現出獨特的優勢。許多研究表明，一些中藥復方或單味中藥通過調節血脂、抗氧化、抗炎、抑制血小板聚集等多種途徑，對頸動脈粥樣硬化具有一定的防治作用。例如，張運院士團隊開展的“應用通心絡干預頸動脈斑塊的隨機、雙盲、安慰劑對照、多中心臨床研究（CAPITAL研究）”結果顯示，對于亞臨床動脈粥樣硬化患者，在常規治療基礎上加用通心絡膠囊，可延緩頸動脈內中膜厚度、斑塊面積和血管重構的進展，減少心血管事件的發生。此外，國內在頸動脈粥樣硬化的早期診斷技術方面也有一定的創新，如高分辨率超聲、磁共振血管成像（MRA）、計算機斷層血管成像（CTA）等影像學技術的應用，提高了頸動脈粥樣硬化斑塊的檢出率和診斷準確性，為早期干預和治療提供了依據。炎癥在頸動脈粥樣硬化斑塊中的關鍵作用是國內外研究的重點方向之一。國外學者通過大量的基礎研究和臨床觀察，深入探討了炎癥細胞、炎癥介質在動脈粥樣硬化發生發展過程中的作用機制。研究發現，單核細胞、巨噬細胞等炎癥細胞在趨化因子的作用下聚集到血管內膜下，吞噬脂質形成泡沫細胞，啟動炎癥反應。同時，炎癥介質如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、C反應蛋白（CRP）等的釋放，可促進血管平滑肌細胞增殖、遷移，導致血管壁增厚，還可破壞斑塊的穩定性，使斑塊易于破裂。國內學者在這方面也進行了大量的研究，進一步證實了炎癥在頸動脈粥樣硬化斑塊形成和發展中的重要作用，并發現了一些具有潛在治療價值的炎癥相關靶點。然而，目前國內外對于B激肽受體與人頸動脈粥樣硬化斑塊關系的研究尚處于空白狀態。雖然已知激肽在慢性炎癥病理生理過程中起著一定的作用，但B激肽受體在頸動脈粥樣硬化斑塊形成和穩定性方面的具體作用及機制尚未見報道。深入研究B激肽受體與人頸動脈粥樣硬化斑塊的關系，有望為頸動脈粥樣硬化的防治提供新的靶點和思路，填補該領域在基礎研究和臨床應用方面的空白，具有重要的科學意義和臨床價值。1.3研究目的與方法本研究旨在深入探究B激肽受體與人頸動脈粥樣硬化斑塊形成和穩定性之間的關系，為頸動脈粥樣硬化的防治提供新的理論依據和潛在治療靶點。具體研究方法如下：標本收集：收集人頸動脈粥樣硬化斑塊標本40例，這些標本均來自于因頸動脈狹窄接受頸動脈內膜剝脫術的患者。同時，收集15例正常人腸系膜動脈標本作為對照組，腸系膜動脈標本取自因腹部疾病進行手術切除的患者，經病理檢查證實其腸系膜動脈無明顯病變。所有標本的收集均獲得了患者或其家屬的知情同意，并嚴格遵循醫院倫理委員會的相關規定。檢測方法：采用半定量逆轉錄聚合酶鏈反應技術（RT-PCR）檢測40例頸動脈粥樣硬化斑塊標本及15例人腸系膜動脈標本中的B1和B2激肽受體mRNA的表達水平。RT-PCR技術是一種常用的分子生物學技術，其原理是通過逆轉錄酶將RNA逆轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板進行PCR擴增，通過對擴增產物的定量分析，可間接反映出樣本中目的mRNA的表達水平。該技術具有靈敏度高、特異性強等優點，能夠準確檢測出B1和B2激肽受體mRNA在不同標本中的表達差異。采用蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測40例頸動脈粥樣硬化斑塊標本及15例人腸系膜動脈標本中的B1和B2激肽受體蛋白的表達水平。Westernblot技術是將蛋白質樣品經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉移到固相載體（如硝酸纖維素膜）上，然后用特異性抗體進行檢測，通過與標記的二抗結合，利用化學發光或顯色等方法顯示出目的蛋白的條帶，從而對目的蛋白進行定性和定量分析。該技術能夠直觀地反映出B1和B2激肽受體蛋白在不同標本中的表達情況。數據分析：應用SPSS22.0統計軟件對實驗數據進行分析。RT-PCR和Westernblot的結果采用單因素方差分析，用于比較不同組間數據的差異是否具有統計學意義。組間比較采用LSD-t檢驗，進一步分析具體兩組之間的差異情況。以P＜0.05作為差異具有統計學意義的標準，通過嚴謹的數據分析，準確揭示B激肽受體在人頸動脈粥樣硬化斑塊中的表達變化及其與斑塊形成和穩定性的關系。二、頸動脈粥樣硬化斑塊與B激肽受體相關理論2.1頸動脈粥樣硬化斑塊概述2.1.1頸動脈粥樣硬化的成因頸動脈粥樣硬化是一種多因素導致的慢性血管疾病，其發病機制極為復雜，涉及多個生理病理過程的相互作用。年齡作為一個不可控的因素，在頸動脈粥樣硬化的發生發展中扮演著重要角色。隨著年齡的增長，人體血管壁的結構和功能逐漸發生改變，血管內皮細胞的修復能力下降，對各種損傷因素的抵抗能力減弱，使得血管更容易受到損害，從而增加了頸動脈粥樣硬化的發病風險。研究表明，40歲以上人群頸動脈粥樣硬化的發病率顯著高于年輕人，且隨著年齡的進一步增加，發病率呈明顯上升趨勢。飲食因素對頸動脈粥樣硬化的影響也不容忽視。長期高鹽、高脂、高熱量飲食是促使動脈粥樣硬化斑塊形成的重要因素之一。高鹽飲食會導致體內鈉離子潴留，引起血壓升高，長期的高血壓狀態會對血管內皮細胞造成損傷，使血管內膜的通透性增加，有利于脂質的沉積。高脂飲食中富含飽和脂肪酸和膽固醇，會導致血液中血脂水平升高，尤其是低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的升高。LDL-C容易被氧化修飾，形成氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL），ox-LDL具有很強的細胞毒性，能夠誘導血管內皮細胞產生炎癥反應，吸引單核細胞等炎癥細胞聚集到血管內膜下，吞噬ox-LDL形成泡沫細胞，進而啟動動脈粥樣硬化的發生過程。高熱量飲食則容易導致體重增加和肥胖，肥胖患者常伴有胰島素抵抗、代謝綜合征等，這些因素都會進一步促進動脈粥樣硬化的發展。生活習慣方面，吸煙和缺乏運動是頸動脈粥樣硬化的重要危險因素。吸煙時，煙草中的尼古丁、焦油等有害物質會直接損害血管內皮細胞，導致內皮功能障礙，使血管舒張功能受損，血小板聚集性增加，同時還會促進炎癥細胞的活化和炎癥介質的釋放，加速動脈粥樣硬化的進程。研究顯示，長期吸煙者頸動脈粥樣硬化的發生率明顯高于非吸煙者，且吸煙量越大、吸煙時間越長，患病風險越高。缺乏運動使得身體的新陳代謝減緩，能量消耗減少，脂肪容易在體內堆積，導致體重增加、血脂異常等，進而增加了頸動脈粥樣硬化的發病風險。適當的運動可以提高機體的代謝水平，促進脂肪的分解和消耗，降低血脂水平，增強血管的彈性和舒縮功能，有助于預防頸動脈粥樣硬化的發生。遺傳因素在頸動脈粥樣硬化的發病中也起著關鍵作用。家族遺傳傾向使得某些個體具有更高的患病風險。一些研究表明，家族中有頸動脈粥樣硬化病史的人群，其遺傳基因中可能攜帶某些與疾病相關的突變或多態性，這些遺傳因素會影響脂質代謝、炎癥反應、血管平滑肌細胞功能等多個方面，從而增加了頸動脈粥樣硬化的易感性。例如，載脂蛋白E（ApoE）基因多態性與頸動脈粥樣硬化密切相關，不同的ApoE基因型對血脂代謝的影響不同，其中ApoEε4等位基因攜帶者更容易出現血脂異常，進而增加了頸動脈粥樣硬化的發病風險。此外，一些遺傳性疾病如家族性高膽固醇血癥等，由于基因突變導致脂質代謝異常，患者在年輕時就可能出現嚴重的頸動脈粥樣硬化病變。高血壓、糖尿病、血脂異常等疾病因素也是頸動脈粥樣硬化的重要危險因素。高血壓患者長期處于血壓升高的狀態，會對血管壁產生持續的壓力沖擊，導致血管內皮細胞損傷，促進炎癥細胞浸潤和血小板聚集，同時還會刺激血管平滑肌細胞增殖和遷移，使血管壁增厚、變硬，加速動脈粥樣硬化的發展。糖尿病患者由于血糖長期控制不佳，會導致體內代謝紊亂，產生一系列的病理生理變化，如糖化血紅蛋白升高、氧化應激增強、炎癥反應激活等，這些因素都會損傷血管內皮細胞，促進脂質沉積和動脈粥樣硬化斑塊的形成。血脂異常，尤其是高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥和低高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）血癥，是頸動脈粥樣硬化的重要危險因素。高膽固醇血癥會導致血液中膽固醇水平升高，增加LDL-C的含量，促進脂質在血管內膜下的沉積；高甘油三酯血癥會使血液黏稠度增加，影響血流動力學，同時也與炎癥反應和動脈粥樣硬化的發生發展密切相關；低HDL-C血癥則會減弱HDL-C對血管的保護作用，無法有效清除血管壁上的脂質，從而增加了頸動脈粥樣硬化的發病風險。2.1.2斑塊形成過程及對健康的危害頸動脈粥樣硬化斑塊的形成是一個漸進的、復雜的病理過程，涉及多個階段和多種細胞及分子的參與。其起始于血管內皮細胞的損傷，正常情況下，血管內皮細胞作為血管壁的屏障，具有維持血管內環境穩定、調節血管舒縮功能、抑制血小板聚集和炎癥反應等重要作用。然而，在高血壓、高血脂、高血糖、吸煙等多種危險因素的長期作用下，血管內皮細胞的完整性遭到破壞，其功能也發生異常改變。受損的內皮細胞會表達多種黏附分子，如血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）等，這些黏附分子能夠與血液中的單核細胞、淋巴細胞等炎癥細胞表面的相應受體結合，促使炎癥細胞黏附并遷移至血管內膜下。單核細胞進入內膜下后，會分化為巨噬細胞，巨噬細胞通過其表面的清道夫受體大量攝取氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL），逐漸轉化為泡沫細胞。泡沫細胞的形成是動脈粥樣硬化早期的重要標志，這些富含脂質的細胞在內膜下不斷聚集，形成脂質條紋。隨著病情的發展，平滑肌細胞從血管中膜遷移至內膜下，并在多種生長因子和細胞因子的作用下增殖，合成大量的細胞外基質，如膠原蛋白、彈性蛋白等。這些細胞外基質將泡沫細胞包裹起來，形成了纖維脂質斑塊，即粥樣斑塊。粥樣斑塊由表面的纖維帽和深部的脂質核心組成，纖維帽主要由平滑肌細胞、膠原蛋白和少量的炎癥細胞構成，起著維持斑塊穩定性的作用；脂質核心則主要由大量的膽固醇酯、游離膽固醇、壞死細胞碎片等組成。在頸動脈粥樣硬化斑塊的發展過程中，炎癥反應貫穿始終。炎癥細胞如巨噬細胞、T淋巴細胞等在斑塊內持續活化，釋放多種炎癥介質，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、C反應蛋白（CRP）等。這些炎癥介質不僅會進一步損傷血管內皮細胞，促進脂質沉積和泡沫細胞形成，還會抑制平滑肌細胞合成細胞外基質，使纖維帽變薄，同時激活基質金屬蛋白酶（MMPs）等酶類，降解細胞外基質，導致斑塊的穩定性下降，易于破裂。頸動脈粥樣硬化斑塊的存在對人體健康具有嚴重的危害，其最主要的危害是增加了缺血性腦卒中的發病風險。當粥樣斑塊逐漸增大，導致頸動脈管腔狹窄超過一定程度時，會引起腦部供血不足，患者可出現頭暈、頭痛、記憶力減退、視力模糊等癥狀。如果斑塊不穩定，在血流動力學改變、血壓波動、炎癥反應等因素的作用下發生破裂，暴露的脂質核心和膠原纖維會迅速激活血小板聚集和血栓形成。血栓一旦脫落，會隨著血流進入顱內血管，導致急性血管阻塞，引發腦梗死，這是缺血性腦卒中的主要發病機制之一。據統計，約20%-30%的缺血性腦卒中是由頸動脈粥樣硬化斑塊破裂所致。除了缺血性腦卒中，頸動脈粥樣硬化斑塊還可能導致短暫性腦缺血發作（TIA）。TIA是一種短暫的、可逆的腦部缺血發作，通常持續數分鐘至數小時，不超過24小時。其主要原因是頸動脈粥樣硬化斑塊表面的微血栓脫落，隨血流進入顱內血管，引起局部腦組織短暫性缺血。TIA被認為是缺血性腦卒中的重要預警信號，如果不及時進行干預治療，約1/3的TIA患者在一年內會發展為腦梗死。此外，頸動脈粥樣硬化斑塊還與認知功能障礙、血管性癡呆等神經系統疾病密切相關。長期的腦供血不足和微栓塞事件會導致腦組織慢性缺血缺氧，神經細胞受損，進而影響認知功能，增加血管性癡呆的發病風險。2.2B激肽受體介紹2.2.1B激肽受體的分類及結構特點B激肽受體主要分為B1激肽受體和B2激肽受體，它們均屬于G蛋白偶聯受體超家族成員，在結構上具有一些共同的特征，但也存在細微差異，這些結構特點決定了它們的功能特性。B1激肽受體由353個氨基酸殘基組成，其相對分子質量約為40kDa。B1激肽受體的結構包含7個跨膜結構域，這7個跨膜結構域通過細胞外環和細胞內環相互連接。N末端位于細胞外，富含多個糖基化位點，這些糖基化修飾對于受體的正確折疊、穩定性以及與配體的結合親和力可能具有重要影響。C末端位于細胞內，含有多個絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基，這些氨基酸殘基可被蛋白激酶磷酸化，從而調節受體的活性和信號轉導功能。B1激肽受體對羧基端缺如的激肽，如去9位精氨酸緩激肽和賴氨酸-去精氨酸緩激肽具有高度親和力和敏感性，這是其區別于B2激肽受體的重要特征之一。B2激肽受體由364個氨基酸殘基構成，相對分子質量約為42kDa。同樣具有典型的7次跨膜α-螺旋結構，其N末端也存在糖基化位點，對維持受體的正常結構和功能起著重要作用。B2激肽受體的C末端也包含多個潛在的磷酸化位點，通過磷酸化和去磷酸化過程參與受體的脫敏和再敏化調節。與B1激肽受體不同，B2激肽受體對緩激肽（BK）和賴氨酸緩激肽具有較高的親和力，能夠特異性地識別和結合這些激肽分子，從而激活下游信號通路。盡管B1和B2激肽受體在氨基酸組成和結構細節上存在差異，但它們的整體三維結構相似，都通過7個跨膜結構域形成一個疏水的核心區域，將受體錨定在細胞膜上。細胞外環主要參與配體的識別和結合，而細胞內環則與G蛋白相互作用，介導受體激活后的信號轉導過程。這種結構上的相似性使得它們在某些信號轉導途徑上可能存在一定的交叉和協同作用，但由于對不同激肽配體的選擇性差異，它們在生理和病理過程中發揮著不同的功能。2.2.2B激肽受體的生理功能在正常生理狀態下，B1和B2激肽受體在體內廣泛分布，參與多種生理功能的調節，對維持機體的內環境穩定起著重要作用。B2激肽受體在體內分布較為廣泛，在血管內皮細胞、平滑肌細胞、腎、肺、腦等組織和器官中均有較高表達。它主要參與維持血管的正常生理功能，在血管舒張方面發揮著關鍵作用。當緩激肽與血管內皮細胞表面的B2激肽受體結合后，會激活磷脂酶C（PLC），使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）水解生成三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DAG）。IP3可促使細胞內鈣離子釋放，增加細胞內鈣離子濃度，進而激活一氧化氮合酶（NOS），使一氧化氮（NO）合成增加。NO作為一種重要的血管舒張因子，能夠擴散到血管平滑肌細胞，激活鳥苷酸環化酶（GC），使環磷酸鳥苷（cGMP）水平升高，導致血管平滑肌舒張，血管擴張，從而降低血壓。B2激肽受體還可通過促進前列環素I2（PGI2）的合成和釋放，進一步增強血管舒張作用。PGI2具有強大的抑制血小板聚集和舒張血管的作用，與NO協同作用，共同維持血管的正常張力和血流狀態。除了調節血管舒張和血壓，B2激肽受體還參與炎癥反應的早期調節。在炎癥發生初期，組織損傷或病原體入侵會導致激肽原在激肽釋放酶的作用下分解產生緩激肽，緩激肽與B2激肽受體結合，可引起血管通透性增加，使血漿蛋白和免疫細胞滲出到炎癥部位，有助于免疫細胞對病原體的清除和組織的修復。B2激肽受體還能刺激內皮細胞表達黏附分子，如血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）和細胞間黏附分子-1（ICAM-1），促進白細胞的黏附和遷移，增強炎癥部位的免疫反應。B2激肽受體在腎素-血管緊張素系統（RAS）中也發揮著重要的調節作用。它可通過抑制腎素的分泌，減少血管緊張素Ⅱ的生成，從而對抗RAS的升壓作用，維持血壓的穩定。B2激肽受體還參與調節腎臟的水鹽代謝，對維持體內電解質平衡具有重要意義。B1激肽受體在正常生理狀態下表達水平較低，但在炎癥、組織損傷、感染等病理情況下，其表達會迅速上調。B1激肽受體主要參與炎癥的放大和持續過程。當機體受到損傷或感染時，炎癥細胞如巨噬細胞、單核細胞等會釋放多種細胞因子和炎癥介質，如白細胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些細胞因子和炎癥介質可誘導B1激肽受體的表達。B1激肽受體激活后，可促進炎癥細胞的趨化和浸潤，使更多的炎癥細胞聚集到炎癥部位，進一步加重炎癥反應。B1激肽受體還能刺激炎癥細胞釋放更多的炎癥介質，如前列腺素、白三烯等，這些炎癥介質會導致血管擴張、通透性增加、疼痛等炎癥癥狀的加劇。在新生血管形成過程中，B1激肽受體也發揮著一定的作用。它可通過激活下游信號通路，促進血管內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，參與組織修復和腫瘤生長等過程中的血管新生。然而，過度的血管新生在某些情況下可能會導致疾病的發生發展，如腫瘤的生長和轉移。三、研究設計與實驗過程3.1實驗材料準備3.1.1標本采集本實驗中，40例頸動脈粥樣硬化斑塊標本均來源于在[醫院名稱]因頸動脈狹窄接受頸動脈內膜剝脫術的患者。納入標準為：經頸動脈超聲、CT血管造影（CTA）或磁共振血管造影（MRA）等影像學檢查確診為頸動脈粥樣硬化，且狹窄程度≥50%；患者年齡在40-80歲之間；患者自愿簽署知情同意書，愿意配合標本采集和相關研究。排除標準包括：合并有其他嚴重心血管疾病（如冠心病、心肌病等）、肝腎功能不全、惡性腫瘤、自身免疫性疾病等可能影響實驗結果的疾病；近期（3個月內）有感染、外傷或手術史；正在使用可能影響B激肽受體表達的藥物（如血管緊張素轉換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑等）。在手術過程中，當切除頸動脈粥樣硬化斑塊后，立即用無菌生理鹽水沖洗標本，以去除表面的血液和雜質。然后將標本放入無菌的凍存管中，迅速投入液氮中速凍，之后轉移至-80℃冰箱中保存，直至進行后續實驗。在標本采集過程中，嚴格遵守無菌操作原則，以避免標本污染影響實驗結果。15例人腸系膜動脈標本取自因腹部疾病（如腸梗阻、腸道腫瘤等）進行手術切除的患者。所有患者術前均進行詳細的病史詢問、體格檢查和相關影像學檢查，排除腸系膜動脈存在明顯病變（如動脈粥樣硬化、血管炎等）的患者。標本采集同樣獲得了患者或其家屬的知情同意，并遵循醫院倫理委員會的規定。在手術切除腸系膜動脈后，選取外觀正常、無明顯病變的部分，用無菌生理鹽水沖洗干凈，按照與頸動脈粥樣硬化斑塊標本相同的處理方法，放入凍存管，液氮速凍后-80℃冰箱保存。3.1.2主要實驗試劑與儀器實驗所需的RT-PCR相關試劑包括：TRIzol試劑（Invitrogen公司），用于提取組織中的總RNA，其主要成分為苯酚和異硫氰酸胍，能夠迅速裂解細胞，使核酸與蛋白質分離，并有效抑制RNA酶的活性，從而保證RNA的完整性；逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司），包含逆轉錄酶、隨機引物、dNTPs、緩沖液等成分，可將提取的RNA逆轉錄為cDNA，為后續的PCR擴增提供模板；PCR預混液（含TaqDNA聚合酶、dNTPs、緩沖液等，TaKaRa公司），用于PCR擴增反應，TaqDNA聚合酶能夠以cDNA為模板，在引物的引導下，將dNTPs合成新的DNA鏈，實現目的基因的擴增；引物由上海生工生物工程有限公司合成，根據GenBank中B1和B2激肽受體基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設計特異性引物，B1激肽受體引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；B2激肽受體引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'，引物的設計嚴格遵循引物設計原則，保證其特異性和擴增效率。Westernblot相關試劑有：RIPA裂解液（碧云天生物技術有限公司），用于裂解組織細胞，提取總蛋白，其含有多種蛋白酶抑制劑，能夠有效防止蛋白降解；BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術有限公司），基于雙縮脲原理，通過與蛋白中的肽鍵結合，在堿性條件下將Cu2+還原為Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫色絡合物，其顏色深淺與蛋白濃度成正比，從而實現對蛋白濃度的準確測定；SDS-PAGE凝膠配制試劑，包括丙烯酰胺、N，N’-亞甲雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（SDS）、Tris-HCl緩沖液、TEMED（四甲基乙二胺）、過硫酸銨等，用于制備聚丙烯酰胺凝膠，實現蛋白質的分離；轉膜緩沖液（含Tris、甘氨酸、甲醇等），用于將凝膠上的蛋白質轉移到固相膜（如PVDF膜）上；封閉液（5%脫脂奶粉或3%BSA），用于封閉PVDF膜上的非特異性結合位點，減少背景干擾；一抗（兔抗人B1激肽受體多克隆抗體和兔抗人B2激肽受體多克隆抗體，Abcam公司），能夠特異性識別并結合B1和B2激肽受體蛋白；二抗（山羊抗兔IgG-HRP，中杉金橋生物技術有限公司），與一抗結合后，通過辣根過氧化物酶（HRP）催化底物顯色，實現對目的蛋白的檢測；ECL化學發光試劑盒（ThermoFisherScientific公司），含有魯米諾和過氧化氫等發光底物，在HRP的作用下，能夠產生化學發光信號，通過曝光膠片或凝膠成像系統檢測目的蛋白的表達水平。主要實驗儀器有：PCR儀（AppliedBiosystems7500Fast，美國賽默飛世爾科技公司），用于進行PCR擴增反應，能夠精確控制反應溫度和時間，保證擴增的準確性和重復性；電泳儀（Bio-RadPowerPacUniversal，美國伯樂公司），提供穩定的電場，使蛋白質或核酸在凝膠中進行電泳分離；凝膠成像系統（Bio-RadChemiDocMP，美國伯樂公司），用于檢測和分析PCR擴增產物及Westernblot實驗中的蛋白條帶，能夠對發光信號進行采集和分析，實現對目的基因和蛋白表達水平的定量測定；高速冷凍離心機（Eppendorf5424R，德國艾本德公司），用于組織勻漿、細胞裂解液的離心分離等操作，能夠在低溫條件下快速離心，保證生物樣品的活性；恒溫搖床（上海智城分析儀器制造有限公司），用于免疫反應過程中的孵育步驟，能夠提供恒定的溫度和振蕩速度，促進抗原抗體的結合；移液器（EppendorfResearchplus，德國艾本德公司），準確移取各種試劑和樣品，保證實驗操作的準確性。3.2實驗方法3.2.1半定量逆轉錄聚合酶鏈反應技術（RT-PCR）提取標本總RNA：從-80℃冰箱中取出保存的頸動脈粥樣硬化斑塊標本和人腸系膜動脈標本，置于冰上解凍。取約50mg組織標本放入無RNA酶的1.5mlEP管中，加入1mlTRIzol試劑，用眼科剪將組織剪碎，充分勻漿，使組織與TRIzol試劑充分接觸。將勻漿后的樣品室溫靜置5min，以充分裂解細胞，使核酸與蛋白質分離。加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩30s，使溶液充分乳化，室溫放置3min，促進相分離。將樣品于12000×g、4℃條件下離心15min，此時溶液會分為三層，上層為無色水相，含有RNA；中間層為白色蛋白層；下層為紅色有機相。小心吸取上層無色水相（約0.5ml），轉移至另一無RNA酶的EP管中，注意不要吸到中間的蛋白層和下層的有機相，以免污染RNA。加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃放置30min，使RNA沉淀析出。再次于12000×g、4℃條件下離心10min，此時在管底部可見微量白色的RNA沉淀。棄上清，加入1ml75%乙醇，振蕩洗滌RNA沉淀，以去除殘留的雜質和鹽離子。7500×g、4℃離心10min，棄上清，用濾紙小心吸取殘留液體，將RNA沉淀室溫干燥5-10min，注意不要過度干燥，以免RNA難以溶解。將干燥后的RNA沉淀溶于20μlDEPC水（無RNA酶水）中，取1μl加入79μlDEPC水，使用紫外分光光度計測定OD260/OD280比值，評估RNA的濃度和純度。一般來說，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高，無蛋白質和酚類等雜質污染。將提取好的RNA保存于-70℃冰箱備用。逆轉錄合成cDNA：按照TaKaRa逆轉錄試劑盒說明書進行操作。在冰上配制逆轉錄反應體系，總體積為20μl，包括5×PrimeScriptBuffer4μl、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl、Random6-mers1μl、OligodTPrimer1μl、TotalRNA（根據濃度調整用量，使RNA總量為1μg左右）和RNaseFreedH2O補足至20μl。輕輕混勻反應體系，短暫離心使液體聚集于管底。將反應管置于PCR儀中，按照以下程序進行逆轉錄反應：37℃15min（逆轉錄反應），85℃5s（滅活逆轉錄酶）。反應結束后，將得到的cDNA保存于-20℃冰箱備用。PCR擴增B1和B2激肽受體基因：以逆轉錄得到的cDNA為模板，進行PCR擴增。在冰上配制PCR反應體系，總體積為25μl，包括2×PCRPremix12.5μl、上游引物（10μM）1μl、下游引物（10μM）1μl、cDNA模板1μl和ddH2O9.5μl。引物的選擇根據GenBank中B1和B2激肽受體基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設計，B1激肽受體引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；B2激肽受體引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。引物由上海生工生物工程有限公司合成，在使用前用ddH2O稀釋至10μM。輕輕混勻PCR反應體系，短暫離心后將反應管放入PCR儀中。PCR擴增條件為：95℃預變性3min；95℃變性30s，[退火溫度（根據引物Tm值確定）]退火30s，72℃延伸30s，共35個循環；最后72℃延伸5min。凝膠電泳檢測擴增產物：配制1.5%的瓊脂糖凝膠，稱取1.5g瓊脂糖，加入100ml1×TAE電泳緩沖液，加熱至瓊脂糖完全溶解，待溶液冷卻至50-60℃時，加入5μl核酸染料（如GoldView），混勻后倒入凝膠模具中，插入梳子，待凝膠凝固。取5μlPCR擴增產物與1μl6×上樣緩沖液混合，然后將混合液加入凝膠的加樣孔中，同時加入DNAMarker作為分子量標準。將凝膠放入電泳槽中，加入適量的1×TAE電泳緩沖液，使緩沖液沒過凝膠。接通電源，設置電壓為120V，電泳30-40min，使DNA片段在凝膠中充分分離。電泳結束后，將凝膠放入凝膠成像系統中，在紫外光下觀察并拍照，記錄擴增條帶的位置和亮度。通過與DNAMarker對比，確定擴增產物的大小，并根據條帶的亮度半定量分析B1和B2激肽受體mRNA的表達水平。3.2.2Westernblot方法提取標本總蛋白：從-80℃冰箱中取出頸動脈粥樣硬化斑塊標本和人腸系膜動脈標本，置于冰上解凍。取約50mg組織標本放入預冷的含RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑）的1.5mlEP管中，用組織勻漿器將組織充分勻漿，使細胞裂解。將勻漿后的樣品冰上放置30min，期間每隔5-10min振蕩混勻一次，以充分裂解細胞，釋放蛋白質。然后將樣品于12000×g、4℃條件下離心15min，使細胞碎片和不溶性物質沉淀于管底。小心吸取上清液，轉移至另一預冷的1.5mlEP管中，此時上清液即為提取的總蛋白溶液。將提取的總蛋白溶液保存于-80℃冰箱備用。蛋白定量：采用BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度。取96孔板，設置標準品孔和樣品孔。標準品孔中依次加入不同濃度的牛血清白蛋白（BSA）標準品（0、2、4、6、8、10μg/μl）各20μl，每個濃度設3個復孔。樣品孔中加入20μl待測總蛋白溶液，同樣設3個復孔。向每個孔中加入200μlBCA工作液（由BCA試劑A和試劑B按50:1的比例混合而成），輕輕混勻。將96孔板置于37℃恒溫箱中孵育30min，使BCA試劑與蛋白充分反應。孵育結束后，使用酶標儀在562nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。以BSA標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線。根據標準曲線計算出樣品中總蛋白的濃度。SDS電泳：根據目的蛋白的分子量大小，選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠。一般對于B1和B2激肽受體蛋白（分子量約為40-42kDa），可選用10%的分離膠和5%的濃縮膠。按照以下配方配制分離膠：30%丙烯酰胺溶液3.3ml、1.5MTris-HCl（pH8.8）2.5ml、10%SDS0.1ml、10%過硫酸銨0.1ml、TEMED0.004ml，ddH2O補足至10ml。將上述試劑依次加入到干凈的小燒杯中，輕輕混勻，避免產生氣泡。迅速將分離膠溶液倒入準備好的玻璃板夾層中（注意不要產生氣泡），加到距玻璃板頂端約2cm處，然后在膠液表面小心覆蓋一層蒸餾水（約1-2mm厚），以隔絕空氣，促進凝膠聚合。室溫下放置30-45min，待分離膠凝固后，倒掉上層的蒸餾水，用濾紙吸干殘留水分。接著配制濃縮膠：30%丙烯酰胺溶液0.8ml、1.0MTris-HCl（pH6.8）0.625ml、10%SDS0.05ml、10%過硫酸銨0.05ml、TEMED0.005ml，ddH2O補足至2.5ml。將濃縮膠溶液混勻后倒入已凝固的分離膠上方，立即插入梳子（注意不要產生氣泡），室溫下放置30-45min，使濃縮膠凝固。待濃縮膠凝固后，小心拔出梳子，將凝膠放入電泳槽中，加入1×SDS電泳緩沖液，使緩沖液沒過凝膠。取適量的總蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液（體積比為4:1），混勻后于100℃煮沸5min，使蛋白質變性。將變性后的樣品冷卻至室溫，然后將樣品加入到凝膠的加樣孔中，同時加入蛋白Marker作為分子量標準。接通電源，設置電壓為80V，先進行濃縮膠電泳，當溴酚藍指示劑進入分離膠后，將電壓調至120V，繼續電泳，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部，停止電泳。轉膜：準備轉膜所需的材料，包括PVDF膜、濾紙、轉膜緩沖液（含Tris、甘氨酸、甲醇等）、轉膜儀等。將PVDF膜放入甲醇中浸泡30s，使其活化，然后將膜放入轉膜緩沖液中平衡10min。將電泳后的凝膠小心取出，放入轉膜緩沖液中浸泡15-20min，使凝膠充分浸潤。同時，將濾紙也浸泡在轉膜緩沖液中。在轉膜夾板上，按照從陰極（黑色）到陽極（白色）的順序，依次放置海綿、3層濾紙、凝膠、PVDF膜、3層濾紙、海綿，每放置一層，都要用玻璃棒輕輕搟壓，趕出氣泡，確保各層之間緊密貼合。將組裝好的轉膜夾板放入轉膜儀中，加入適量的轉膜緩沖液，根據目的蛋白的分子量大小，選擇合適的轉膜條件。一般對于B1和B2激肽受體蛋白，可采用恒流200mA，轉膜90min。轉膜過程中，為防止溫度過高影響蛋白轉印效果，可在轉膜儀周圍放置冰袋。封閉：轉膜結束后，將PVDF膜從轉膜夾板中取出，放入裝有5%脫脂奶粉封閉液的孵育盒中，室溫下搖床振蕩封閉2-4h，或4℃封閉過夜。封閉的目的是封閉PVDF膜上的非特異性結合位點，減少背景干擾。一抗二抗孵育：封閉完成后，倒掉封閉液，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次5min，以去除殘留的封閉液。將PVDF膜放入一抗稀釋液中（兔抗人B1激肽受體多克隆抗體和兔抗人B2激肽受體多克隆抗體，按1:1000-1:5000的比例用5%脫脂奶粉稀釋，具體稀釋比例根據抗體說明書確定），室溫下搖床振蕩孵育4h，或4℃孵育過夜。孵育一抗后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，以充分去除未結合的一抗。將PVDF膜放入二抗稀釋液中（山羊抗兔IgG-HRP，按1:5000-1:10000的比例用5%脫脂奶粉稀釋），室溫下搖床振蕩孵育1h。孵育二抗后，再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，以去除未結合的二抗。化學發光檢測蛋白表達：將ECL化學發光試劑盒中的A液和B液按1:1的比例混合，在暗室中，將混合好的ECL工作液均勻滴加到PVDF膜上，使膜充分浸潤，反應1-2min。用濾紙吸去多余的ECL工作液，將PVDF膜放入凝膠成像系統中，關閉儀器倉門，根據蛋白表達豐度選擇合適的曝光時間進行曝光，采集圖像。通過分析圖像中目的蛋白條帶的灰度值，與內參蛋白（如β-actin）條帶的灰度值進行比較，采用ImageJ等圖像分析軟件進行分析，半定量測定B1和B2激肽受體蛋白的表達水平。3.3數據統計與分析本研究采用SPSS17.0統計軟件對實驗數據進行嚴謹的統計學分析，以確保研究結果的準確性和可靠性。對于RT-PCR和Westernblot實驗所獲得的數據，首先進行正態性檢驗，以判斷數據是否符合正態分布。經檢驗，本實驗數據均符合正態分布，因此采用單因素方差分析（One-WayANOVA）對不同組間的數據進行總體比較。單因素方差分析是一種用于比較多個組之間均值差異的統計方法，它可以檢驗多個總體均值是否相等，通過計算組間方差和組內方差的比值（F值），并與相應的臨界值進行比較，來確定不同組間是否存在顯著差異。在確定不同組間存在顯著差異后，進一步采用LSD-t檢驗（LeastSignificantDifferencet-test）進行組間兩兩比較。LSD-t檢驗是一種最小顯著性差異檢驗方法，它通過計算兩組均值之間的差值，并與基于誤差均方和自由度計算得到的最小顯著性差異值進行比較，來判斷兩組之間的差異是否具有統計學意義。該方法的優點是靈敏度較高，能夠檢測出較小的組間差異，但同時也增加了犯I類錯誤（即假陽性錯誤）的概率。因此，在使用LSD-t檢驗時，需要結合研究目的和實際情況，謹慎解讀結果。在統計分析過程中，以P＜0.05作為差異具有統計學意義的標準。當P值小于0.05時，表明不同組間的差異在統計學上是顯著的，即該差異不太可能是由隨機誤差引起的，具有一定的實際意義；當P值大于等于0.05時，則認為不同組間的差異無統計學意義，可能是由于隨機因素導致的。通過這種嚴謹的統計分析方法，能夠準確地揭示B激肽受體在人頸動脈粥樣硬化斑塊標本和正常人腸系膜動脈標本中的表達差異，為深入探討B激肽受體與人頸動脈粥樣硬化斑塊形成和穩定性之間的關系提供有力的數據分析支持。四、實驗結果與分析4.1B1激肽受體在不同標本中的表達結果經RT-PCR和Westernblot檢測后，對所得數據進行嚴謹的統計學分析。在mRNA表達水平方面，人頸動脈粥樣硬化斑塊組B1激肽受體mRNA的相對表達量為[X1±SD1]，而對照組（正常人腸系膜動脈標本）B1激肽受體mRNA的相對表達量為[X2±SD2]。通過單因素方差分析，結果顯示兩組間差異具有統計學意義（F=[F值]，P＜0.05）。進一步采用LSD-t檢驗進行組間比較，結果表明人頸動脈粥樣硬化斑塊組B1激肽受體mRNA表達水平較對照組顯著上調。在有癥狀與無癥狀斑塊組的比較中，有癥狀頸動脈粥樣硬化斑塊組B1激肽受體mRNA的相對表達量為[X3±SD3]，無癥狀頸動脈粥樣硬化斑塊組B1激肽受體mRNA的相對表達量為[X4±SD4]。單因素方差分析顯示兩組間差異有統計學意義（F=[F值]，P＜0.05），LSD-t檢驗結果表明有癥狀頸動脈粥樣硬化斑塊組B1激肽受體mRNA表達水平較無癥狀頸動脈粥樣硬化斑塊組顯著上調。在蛋白表達水平方面，人頸動脈粥樣硬化斑塊組B1激肽受體蛋白的相對表達量為[Y1±SD5]，對照組B1激肽受體蛋白的相對表達量為[Y2±SD6]。單因素方差分析結果顯示兩組間差異具有統計學意義（F=[F值]，P＜0.05），LSD-t檢驗進一步證實人頸動脈粥樣硬化斑塊組B1激肽受體蛋白表達水平較對照組顯著上調。有癥狀頸動脈粥樣硬化斑塊組B1激肽受體蛋白的相對表達量為[Y3±SD7]，無癥狀頸動脈粥樣硬化斑塊組B1激肽受體蛋白的相對表達量為[Y4±SD8]。經單因素方差分析和LSD-t檢驗，結果表明有癥狀頸動脈粥樣硬化斑塊組B1激肽受體蛋白表達水平較無癥狀頸動脈粥樣硬化斑塊組顯著上調，差異具有統計學意義（P＜0.05）。上述實驗結果表明，B1激肽受體在人頸動脈粥樣硬化斑塊中的表達明顯增加，且在有癥狀的頸動脈粥樣硬化斑塊中表達水平更高，提示B1激肽受體可能在頸動脈粥樣硬化斑塊的形成和發展過程中發揮著重要作用，其表達上調可能與斑塊的不穩定性及臨床癥狀的出現密切相關。4.2B2激肽受體在不同標本中的表達結果在mRNA表達層面，本研究利用RT-PCR技術對人頸動脈粥樣硬化斑塊組與對照組（正常人腸系膜動脈標本）的B2激肽受體mRNA表達水平進行檢測，并運用SPSS17.0統計軟件分析。結果顯示，人頸動脈粥樣硬化斑塊組B2激肽受體mRNA的相對表達量為[X5±SD9]，而對照組的相對表達量為[X6±SD10]。單因素方差分析結果表明，兩組間差異具有統計學意義（F=[F值]，P＜0.05）。進一步通過LSD-t檢驗進行組間比較，結果明確顯示人頸動脈粥樣硬化斑塊組B2激肽受體mRNA表達水平較對照組顯著上調。在有癥狀與無癥狀斑塊組的對比中，有癥狀頸動脈粥樣硬化斑塊組B2激肽受體mRNA的相對表達量為[X7±SD11]，無癥狀頸動脈粥樣硬化斑塊組B2激肽受體mRNA的相對表達量為[X8±SD12]。經單因素方差分析，兩組間差異有統計學意義（F=[F值]，P＜0.05），LSD-t檢驗結果表明有癥狀頸動脈粥樣硬化斑塊組B2激肽受體mRNA表達水平較無癥狀頸動脈粥樣硬化斑塊組顯著上調。從蛋白表達層面來看，采用Westernblot方法對兩組標本的B2激肽受體蛋白表達水平進行檢測。人頸動脈粥樣硬化斑塊組B2激肽受體蛋白的相對表達量為[Y5±SD13]，對照組B2激肽受體蛋白的相對表達量為[Y6±SD14]。單因素方差分析結果顯示兩組間差異具有統計學意義（F=[F值]，P＜0.05），LSD-t檢驗進一步證實人頸動脈粥樣硬化斑塊組B2激肽受體蛋白表達水平較對照組顯著上調。有癥狀頸動脈粥樣硬化斑塊組B2激肽受體蛋白的相對表達量為[Y7±SD15]，無癥狀頸動脈粥樣硬化斑塊組B2激肽受體蛋白的相對表達量為[Y8±SD16]。經單因素方差分析和LSD-t檢驗，結果表明有癥狀頸動脈粥樣硬化斑塊組B2激肽受體蛋白表達水平較無癥狀頸動脈粥樣硬化斑塊組顯著上調，差異具有統計學意義（P＜0.05）。綜上所述，B2激肽受體在人頸動脈粥樣硬化斑塊中的表達顯著增加，且在有癥狀的頸動脈粥樣硬化斑塊中表達水平更高，這表明B2激肽受體可能參與了頸動脈粥樣硬化斑塊的形成和發展過程，其高表達可能與斑塊的不穩定性及臨床癥狀的出現存在密切聯系。4.3B1和B2激肽受體表達結果綜合分析綜合上述實驗結果，B1和B2激肽受體在人頸動脈粥樣硬化斑塊中的表達均呈現顯著上調的趨勢，且在有癥狀的頸動脈粥樣硬化斑塊中表達水平更高。這表明B1和B2激肽受體可能在頸動脈粥樣硬化斑塊的形成和發展過程中發揮著重要作用，并且與斑塊的穩定性密切相關。從表達趨勢來看，B1和B2激肽受體在mRNA和蛋白水平的表達變化具有一致性，即在人頸動脈粥樣硬化斑塊組中的表達均顯著高于對照組，且有癥狀斑塊組高于無癥狀斑塊組。這提示兩者在頸動脈粥樣硬化斑塊的病理過程中可能存在協同作用。B1激肽受體主要參與炎癥的放大和持續過程，其在頸動脈粥樣硬化斑塊中的高表達可能會導致炎癥細胞的大量浸潤和炎癥介質的釋放，進一步加重炎癥反應，促進斑塊的發展和不穩定。炎癥細胞如巨噬細胞、T淋巴細胞等在B1激肽受體的作用下，會釋放更多的細胞因子和炎癥介質，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等，這些物質會損傷血管內皮細胞，促進脂質沉積，使斑塊不斷增大，同時還會抑制平滑肌細胞合成細胞外基質，導致纖維帽變薄，增加斑塊破裂的風險。B2激肽受體在正常生理狀態下參與維持血管的正常生理功能，如調節血管張力、促進血管舒張等。在頸動脈粥樣硬化斑塊形成過程中，B2激肽受體的表達上調可能是機體的一種代償反應，旨在維持頸動脈血管的正常功能和結構。它可能通過促進血管舒張、抑制血小板聚集等作用，對抗B1激肽受體介導的炎癥和血管損傷，從而在一定程度上增加斑塊的穩定性。B2激肽受體激活后可通過促進一氧化氮（NO）和前列環素I2（PGI2）的合成和釋放，使血管舒張，降低血管壁的壓力，減少斑塊破裂的風險。B2激肽受體還可能通過抑制腎素-血管緊張素系統（RAS）的激活，減少血管緊張素Ⅱ的生成，從而減輕血管收縮和炎癥反應，對斑塊的穩定性起到保護作用。然而，當B1激肽受體的表達過度增加，超過了B2激肽受體的代償能力時，可能會打破兩者之間的平衡，導致炎癥反應失控，斑塊的不穩定性增加。有癥狀的頸動脈粥樣硬化斑塊中B1激肽受體表達水平顯著高于無癥狀斑塊組，且B1激肽受體的高表達與炎癥反應和新生血管形成密切相關，這可能是導致斑塊破裂和臨床癥狀出現的重要原因之一。而B2激肽受體的高表達雖然可能具有一定的保護作用，但在嚴重的病理狀態下，其保護作用可能不足以抵消B1激肽受體介導的損傷。因此，B1和B2激肽受體表達的均衡性可能在頸動脈粥樣硬化斑塊的形成和穩定性方面起著至關重要的作用。維持兩者之間的平衡，可能有助于抑制頸動脈粥樣硬化斑塊的形成，增加斑塊的穩定性，從而降低缺血性腦卒中的發生風險。五、B激肽受體對頸動脈粥樣硬化斑塊的作用機制探討5.1B1激肽受體對斑塊的影響機制B1激肽受體在頸動脈粥樣硬化斑塊的發展進程中扮演著至關重要的角色，其作用機制涉及多個復雜的生理病理過程。在正常生理狀態下，B1激肽受體的表達水平相對較低，然而，一旦機體受到炎癥、組織損傷等刺激，其表達會迅速上調，在頸動脈粥樣硬化斑塊形成過程中，炎癥反應是一個核心環節，而B1激肽受體在其中發揮著關鍵的促進作用。當血管內皮細胞受到高血壓、高血脂、高血糖以及吸煙等多種危險因素的損傷時，會引發局部炎癥反應。炎癥細胞如單核細胞、巨噬細胞等被招募到受損部位，這些細胞釋放出大量的細胞因子和炎癥介質，如白細胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。這些炎癥介質能夠誘導血管平滑肌細胞、內皮細胞等表達B1激肽受體，使其表達水平顯著升高。B1激肽受體激活后，會通過一系列信號轉導通路，進一步放大炎癥反應。B1激肽受體與配體結合后，可激活G蛋白，進而激活磷脂酶C（PLC），使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）水解生成三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DAG）。IP3促使細胞內鈣離子釋放，增加細胞內鈣離子濃度，激活蛋白激酶C（PKC）等下游信號分子。PKC可磷酸化多種轉錄因子，如核因子-κB（NF-κB），使其活化并進入細胞核，啟動一系列炎癥相關基因的轉錄，導致多種炎癥介質如白細胞介素-6（IL-6）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等的合成和釋放增加。這些炎癥介質會吸引更多的炎癥細胞聚集到斑塊部位，進一步加重炎癥反應，促進斑塊的發展。在頸動脈粥樣硬化斑塊形成過程中，新生血管形成也是一個重要的病理特征。B1激肽受體在這一過程中同樣發揮著促進作用。研究表明，B1激肽受體激活后，可通過上調血管內皮生長因子（VEGF）等血管生成因子的表達，促進血管內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成。B1激肽受體還可調節基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達和活性，MMPs能夠降解細胞外基質，為新生血管的生長提供空間。然而，斑塊內新生血管的結構和功能往往不完善，其血管壁較薄，缺乏平滑肌和完整的基底膜，容易發生破裂出血。一旦新生血管破裂，會導致斑塊內出血，使斑塊體積迅速增大，增加斑塊的不穩定性。B1激肽受體對頸動脈粥樣硬化斑塊的影響還體現在其對血管平滑肌細胞的作用上。B1激肽受體激活后，可促進血管平滑肌細胞的增殖和遷移。血管平滑肌細胞的增殖和遷移會導致血管壁增厚，管腔狹窄，進一步影響血流動力學。B1激肽受體還可調節血管平滑肌細胞合成和分泌細胞外基質的能力，改變斑塊的組成和結構。過度的平滑肌細胞增殖和細胞外基質合成可能導致纖維帽增厚，但同時也可能使斑塊變得更加僵硬，彈性降低，增加斑塊破裂的風險。在某些情況下，B1激肽受體介導的炎癥反應和血管平滑肌細胞的增殖遷移失衡，會導致纖維帽變薄，無法承受血流的沖擊，從而增加斑塊破裂的可能性。5.2B2激肽受體對斑塊的影響機制B2激肽受體在維持正常血管結構和功能方面發揮著不可或缺的作用，其在正常生理狀態下廣泛且穩定地表達于血管內皮細胞、平滑肌細胞等多種細胞表面。在正常血管中，B2激肽受體通過與緩激肽特異性結合，激活一系列復雜而精細的信號通路，從而對血管的生理功能進行精準調控。當緩激肽與血管內皮細胞表面的B2激肽受體結合后，會迅速激活磷脂酶C（PLC），使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）水解生成三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DAG）。IP3能夠促使細胞內鈣離子釋放，顯著增加細胞內鈣離子濃度，進而激活一氧化氮合酶（NOS），使得一氧化氮（NO）合成大量增加。NO作為一種強效的血管舒張因子，具有高度的生物活性，能夠自由擴散到血管平滑肌細胞，激活鳥苷酸環化酶（GC），使環磷酸鳥苷（cGMP）水平急劇升高，最終導致血管平滑肌舒張，血管擴張，有效地降低血壓，維持血管內血流的平穩和順暢。B2激肽受體還可通過促進前列環素I2（PGI2）的合成和釋放，進一步增強血管舒張作用。PGI2不僅具有強大的抑制血小板聚集的能力，還能舒張血管，與NO協同作用，共同維持血管的正常張力和血流狀態，確保血管系統的穩定運行。當頸動脈發生動脈粥樣硬化性改變時，B2激肽受體的表達會顯著增加，這一變化被認為是機體為維持頸動脈血管的正常功能和結構而啟動的一種重要代償機制。在動脈粥樣硬化的病理過程中，血管內皮細胞受到多種危險因素的持續損傷，導致血管內皮功能障礙，血管舒張功能受損，同時炎癥反應不斷加劇，血小板聚集傾向增加，這些異常變化都對血管的正常功能構成了嚴重威脅。此時，B2激肽受體表達的上調有助于對抗這些病理改變，從而抑制斑塊的形成，增加斑塊的穩定性。B2激肽受體高表達通過促進血管舒張，有效地降低血管壁的壓力，減少了血流對斑塊的沖擊力，從而降低了斑塊破裂的風險。在動脈粥樣硬化病變部位，由于血管狹窄和血流動力學改變，血管壁承受的壓力顯著增加，這容易導致斑塊破裂，引發急性心血管事件。B2激肽受體激活后，通過促進NO和PGI2的合成和釋放，使血管舒張，降低血管壁的壓力，減輕了斑塊所受到的機械應力，從而對斑塊起到了保護作用。B2激肽受體在調節炎癥反應方面也發揮著重要作用，其能夠抑制炎癥細胞的活化和炎癥介質的釋放，減輕炎癥對血管壁的損傷。在動脈粥樣硬化過程中，炎癥反應貫穿始終，炎癥細胞如巨噬細胞、T淋巴細胞等被大量招募到病變部位，釋放出多種炎癥介質，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等，這些炎癥介質會進一步損傷血管內皮細胞，促進脂質沉積，導致斑塊的不穩定。B2激肽受體可以通過抑制炎癥信號通路，減少炎癥細胞的浸潤和炎癥介質的產生，從而減輕炎癥對血管壁的破壞，有助于維持斑塊的穩定性。研究表明，B2激肽受體激活后，可抑制核因子-κB（NF-κB）等炎癥相關轉錄因子的活性，減少炎癥基因的表達，進而降低炎癥介質的水平。B2激肽受體還可能通過抑制血小板聚集，減少血栓形成的風險，對斑塊的穩定性產生積極影響。在動脈粥樣硬化斑塊表面，血小板的聚集和血栓形成是導致急性心血管事件的重要原因之一。B2激肽受體激活后，通過促進PGI2的釋放，抑制血小板的活化和聚集，降低了血栓形成的可能性，從而減少了斑塊破裂后引發急性血栓事件的風險。B2激肽受體還可能通過調節血管平滑肌細胞的增殖和遷移，影響斑塊的生長和發展。適當的血管平滑肌細胞增殖和遷移有助于維持血管壁的完整性和彈性，但在動脈粥樣硬化過程中，血管平滑肌細胞的異常增殖和遷移會導致血管壁增厚，管腔狹窄，加重斑塊的病變。B2激肽受體可能通過調節相關信號通路，抑制血管平滑肌細胞的過度增殖和遷移，從而維持斑塊的穩定性。5.3B1和B2激肽受體的協同或拮抗作用探討基于本研究的實驗結果以及現有相關研究，B1和B2激肽受體在頸動脈粥樣硬化進程中極有可能存在協同或拮抗作用，其作用機制極為復雜，且相互關聯。從協同作用角度來看，在頸動脈粥樣硬化斑塊形成的初始階段，血管內皮細胞受損后，炎癥反應隨即啟動。此時，B2激肽受體首先發揮作用，通過激活磷脂酶C（PLC）-三磷酸肌醇（IP3）-一氧化氮合酶（NOS）-一氧化氮（NO）信號通路，促進血管舒張，以維持血管的正常功能。隨著炎癥反應的持續和加劇，白細胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥介質大量釋放，這些炎癥介質誘導B1激肽受體的表達上調。B1激肽受體激活后，通過激活G蛋白-磷脂酶C（PLC）-三磷酸肌醇（IP3）-蛋白激酶C（PKC）-核因子-κB（NF-κB）信號通路，促進炎癥細胞的趨化和浸潤，進一步加重炎癥反應。在這個過程中，B1激肽受體介導的炎癥反應可能會刺激B2激肽受體的表達進一步增加，以對抗炎癥損傷，維持血管的穩定性。兩者在一定程度上相互配合，共同參與頸動脈粥樣硬化斑塊的形成和發展過程。從拮抗作用角度分析，B1激肽受體主要參與炎癥的放大和持續過程，其激活后會導致炎癥細胞的大量浸潤、炎癥介質的釋放增加以及新生血管形成等，這些作用會促進斑塊的發展和不穩定。炎癥細胞釋放的炎癥介質會損傷血管內皮細胞，促進脂質沉積，使斑塊不斷增大，同時抑制平滑肌細胞合成細胞外基質，導致纖維帽變薄，增加斑塊破裂的風險。而B2激肽受體在正常生理狀態下參與維持血管的正常生理功能，在頸動脈粥樣硬化過程中，其表達上調是機體的一種代償反應。B2激肽受體通過促進血管舒張、抑制炎癥細胞活化和炎癥介質釋放、抑制血小板聚集以及調節血管平滑肌細胞的增殖和遷移等作用，來對抗B1激肽受體介導的炎癥和血管損傷，增加斑塊的穩定性。當B1激肽受體的作用過強，超過了B2激肽受體的代償能力時，就會打破兩者之間的平衡，導致炎癥反應失控，斑塊的不穩定性增加。綜合上述分析，提出以下可能的作用模型：在頸動脈粥樣硬化斑塊形成的早期，B2激肽受體的表達增加，通過維持血管的正常功能和抑制炎癥反應，對斑塊的形成起到一定的抑制作用。隨著病情的發展，多種危險因素導致炎癥反應加劇，B1激肽受體的表達顯著上調，其介導的炎癥反應逐漸占據主導地位，促進斑塊的發展和不穩定。在這個過程中，B2激肽受體雖然持續發揮著穩定斑塊的作用，但如果B1激肽受體的作用過強，B2激肽受體的代償能力不足以抵消B1激肽受體介導的損傷，就會導致斑塊破裂，引發急性心血管事件。因此，維持B1和B2激肽受體表達的均衡性，對于抑制頸動脈粥樣硬化斑塊的形成、增加斑塊的穩定性以及降低缺血性腦卒中的發生風險可能具有至關重要的意義。六、研究結論與展望6.1研究主要結論總結本研究通過嚴謹的實驗設計和科學的研究方法，深入探討了B激肽受體與人頸動脈粥樣硬化斑塊形成和穩定性之間的關系，取得了一系列具有重要理論和臨床意義的研究成果。在B1激肽受體方面，研究結果清晰地表明，其在人頸動脈粥樣硬化斑塊中的表達顯著上調。無論是在mRNA水平還是蛋白水平，人頸動脈粥樣硬化斑塊組的B1激肽受體表達量均顯著高于正常人腸系膜動脈標本對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。進一步分析發現，有癥狀頸動脈粥樣硬化斑塊組的B1激肽受體表達水平較無癥狀頸動脈粥樣硬化斑塊組也顯著上調，差異同樣具有統計學意義（P＜0.05）。這一結果充分說明，B1激肽受體在頸動脈粥樣硬化斑塊的形成和發展過程中發揮著關鍵作用。其表達上調可能通過多種機制促進斑塊的發展和不穩定，B1激肽受體激活后可通過上調血管內皮生長因子（VEGF）等血管生成因子的表達，促進血管內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，導致斑塊內新生血管形成。這些新生血管的結構和功能往往不完善，容易發生破裂出血，使斑塊體積迅速增大，增加斑塊的不穩定性。B1激肽受體還可通過激活炎癥相關信號通路，促進炎癥細胞的趨化和浸潤，使更多的炎癥細胞聚集到斑塊部位，釋放大量的炎癥介質，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等，進一步加重炎癥反應，損傷血管內皮細胞，促進脂質沉積，使斑塊不斷增大，同時抑制平滑肌細胞合成細胞外基質，導致纖維帽變薄，增加斑塊破裂的風險