ADAP與SKAP55協同調控CD8+T細胞抗腫瘤能力的分子機制探秘一、引言1.1研究背景腫瘤，作為嚴重威脅人類健康的重大疾病之一，一直是全球醫學研究的焦點。根據世界衛生組織國際癌癥研究機構（IARC）發布的2020年全球最新癌癥負擔數據，全球新增癌癥病例1929萬例，癌癥死亡病例996萬例。傳統的腫瘤治療手段，如手術、化療和放療，在一定程度上能夠緩解腫瘤患者的病情，但對于晚期腫瘤患者，這些治療方法往往難以達到理想的治療效果，且存在較大的副作用。近年來，腫瘤免疫治療的出現為腫瘤治療帶來了新的希望，成為腫瘤治療領域的研究熱點。腫瘤免疫治療旨在激活機體自身的免疫系統，增強免疫細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷能力，從而達到治療腫瘤的目的。免疫治療具有特異性強、副作用小等優點，為腫瘤患者提供了新的治療選擇。在腫瘤免疫治療中，CD8+T細胞發揮著核心作用，是機體抗腫瘤免疫的關鍵效應細胞。CD8+T細胞，也被稱為細胞毒性T淋巴細胞（CTL），能夠識別并殺傷被病原體感染的細胞和腫瘤細胞。其殺傷機制主要包括以下幾個方面：一是通過釋放穿孔素和顆粒酶，穿孔素在靶細胞膜上形成孔道，使顆粒酶進入靶細胞，激活靶細胞內的凋亡途徑，導致靶細胞凋亡；二是通過表達FasL，與靶細胞表面的Fas受體結合，激活靶細胞內的凋亡信號通路，誘導靶細胞凋亡；三是通過分泌細胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，調節免疫反應，增強免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。這些殺傷機制使得CD8+T細胞在抗腫瘤免疫中發揮著至關重要的作用，能夠有效地清除腫瘤細胞，抑制腫瘤的生長和轉移。1.2ADAP和SKAP55概述ADAP，全稱為黏附脫顆粒促進適配蛋白（AdhesionandDegranulationPromotingAdapterProtein），是一種在T細胞信號傳導中發揮關鍵作用的銜接蛋白。ADAP主要在T細胞和髓系細胞上表達，其結構包含多個功能域，其中中央富含脯氨酸的結構域和C末端結構域在其功能發揮中至關重要。在T細胞激活過程中，T細胞受體（TCR）受到刺激后，ADAP可被磷酸化，進而參與調控T細胞的多種功能。ADAP主要正向調節TCR偶聯到LFA-1激活的信號傳導，以及該過程介導的細胞活化、增殖、IL-2的產生和細胞黏附。研究表明，ADAP基因敲除小鼠的T細胞在與抗原呈遞細胞（APC）的黏附能力上明顯受損，這充分說明了ADAP在T細胞與APC相互作用中的重要性。SKAP55，即src激酶相關磷蛋白55（srckinaseassociatedphosphoprotein55），也是T細胞信號通路中的重要分子。它屬于Pleckstrinhomologydomaincontaining家族，在T細胞中具有特定的分布模式。SKAP55的結構特點決定了其在信號傳導中的獨特作用，它能夠與多種蛋白相互作用，形成信號復合物，參與T細胞的活化和功能調節。在T細胞信號通路中，SKAP55與ADAP存在密切的關聯，二者相互協作，共同調節T細胞的功能。研究發現，ADAP的脯氨酸豐富結構域能夠結合并穩定SKAP55的表達，而SKAP55在ADAP缺失的T細胞中表達缺失，這表明ADAP對于SKAP55的穩定表達至關重要。對于ADAP和SKAP55在免疫信號傳導通路中的作用，目前已有一些初步的認識。在TCR刺激后，ADAP和SKAP55參與的信號通路能夠調控T細胞的黏附、活化和增殖等過程。它們通過與其他信號分子相互作用，如與白細胞功能相關抗原-1（LFA-1）等整合素分子相互作用，調節T細胞與其他細胞之間的黏附性，進而影響T細胞的活化閾值和免疫應答的強度。此外，ADAP和SKAP55還參與調控T細胞的細胞骨架重排，這對于T細胞的遷移和免疫突觸的形成具有重要意義。在腫瘤免疫中，ADAP和SKAP55可能通過影響CD8+T細胞的功能，參與腫瘤免疫逃逸和免疫監視的過程。然而，它們在腫瘤免疫中的具體作用機制以及在CD8+T細胞抗腫瘤能力調控中的詳細分子機制，仍有待進一步深入研究。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探究ADAP和SKAP55對CD8+T細胞抗腫瘤能力的調控機制，具體目的包括：明確ADAP和SKAP55在CD8+T細胞中的表達模式及表達水平變化對CD8+T細胞功能的影響；揭示ADAP和SKAP55相互作用以及與其他相關信號分子構成的信號通路在調控CD8+T細胞活化、增殖、遷移和殺傷腫瘤細胞能力等方面的詳細分子機制；通過體內外實驗，驗證調控ADAP和SKAP55表達或其信號通路活性對CD8+T細胞抗腫瘤效應的增強作用，為腫瘤免疫治療提供新的靶點和理論依據。本研究具有重要的理論意義。在腫瘤免疫學領域，深入了解ADAP和SKAP55在CD8+T細胞中的作用機制，有助于進一步完善腫瘤免疫逃逸和免疫監視的理論體系。目前，雖然對腫瘤免疫有了一定的認識，但仍存在許多未知的分子機制和信號通路。本研究聚焦于ADAP和SKAP55這兩個在T細胞信號傳導中起關鍵作用的分子，有望揭示新的調控機制，填補該領域在這方面的研究空白，為深入理解腫瘤免疫的本質提供重要線索。同時，研究ADAP和SKAP55對CD8+T細胞功能的影響，也有助于拓展對T細胞生物學的認識，為研究其他免疫細胞的功能調控提供借鑒。在實踐方面，本研究成果對腫瘤免疫治療具有潛在的應用價值。腫瘤免疫治療是目前腫瘤治療領域的研究熱點，然而，仍有許多患者對現有的免疫治療方法反應不佳。本研究通過揭示ADAP和SKAP55調控CD8+T細胞抗腫瘤能力的機制，有望為開發新的腫瘤免疫治療策略提供理論基礎。例如，如果能夠明確ADAP和SKAP55作為腫瘤免疫治療靶點的可行性，就可以設計針對這些靶點的藥物或治療方法，增強CD8+T細胞的抗腫瘤活性，提高腫瘤免疫治療的效果，為腫瘤患者帶來新的治療希望。此外，本研究還可能為優化現有免疫治療方案提供指導，通過聯合調節ADAP和SKAP55相關信號通路與其他免疫治療方法，提高治療的協同效應，降低治療的副作用，改善患者的生存質量。二、CD8+T細胞與抗腫瘤免疫2.1CD8+T細胞的活化與功能2.1.1活化過程CD8+T細胞的活化是一個復雜且精細的過程，需要多個信號的協同作用，這一過程猶如一場精心策劃的軍事行動，各個環節緊密配合，確保CD8+T細胞能夠準確、高效地被激活，從而發揮其抗腫瘤免疫的關鍵作用。首先，腫瘤抗原的呈遞是CD8+T細胞活化的起始環節，這一過程主要由抗原呈遞細胞（APC）來完成，其中樹突狀細胞（DC）是最為重要的抗原呈遞細胞。腫瘤細胞在生長、分裂過程中，會產生一些異常的蛋白質，這些蛋白質被稱為腫瘤抗原。腫瘤抗原可以通過多種方式被APC攝取，例如DC細胞可以通過吞噬作用、巨胞飲作用等方式攝取腫瘤抗原。攝取后的腫瘤抗原在APC內被加工處理，經過一系列復雜的酶解過程，被切割成短肽片段。這些短肽片段隨后與APC細胞內的主要組織相容性復合體I類分子（MHC-I）結合，形成抗原肽-MHC-I復合物。MHC-I分子就像一個“展示架”，將抗原肽呈遞到APC細胞表面，等待CD8+T細胞的識別。這一過程確保了腫瘤抗原能夠以一種可被CD8+T細胞識別的形式呈現出來，為后續的活化過程奠定了基礎。當APC呈遞的抗原肽-MHC-I復合物與CD8+T細胞表面的T細胞受體（TCR）特異性結合時，就啟動了CD8+T細胞活化的第一信號。TCR是CD8+T細胞識別抗原的關鍵結構，它由α和β兩條鏈組成，具有高度的特異性。每個CD8+T細胞表面的TCR都能特異性識別一種特定的抗原肽-MHC-I復合物。當TCR與抗原肽-MHC-I復合物結合時，會引發TCR復合物的一系列構象變化，從而激活TCR下游的信號傳導通路。這一過程就像一把鑰匙插入鎖孔，啟動了CD8+T細胞活化的“開關”。然而，僅有第一信號的刺激，CD8+T細胞并不能完全活化，還需要第二信號的協同作用。第二信號，也被稱為共刺激信號，主要由APC表面的共刺激分子與CD8+T細胞表面相應的共刺激分子受體相互作用提供。在眾多共刺激分子中，B7分子（包括B7-1和B7-2）與CD28分子的相互作用是最為重要的共刺激信號。當APC攝取并呈遞腫瘤抗原后，會表達高水平的B7分子。B7分子與CD8+T細胞表面的CD28分子結合，能夠增強CD8+T細胞的活化信號，促進CD8+T細胞的增殖、分化和存活。除了B7-CD28信號通路外，還有其他共刺激分子對，如ICOS-ICOSL、4-1BB-4-1BBL等，也在CD8+T細胞活化過程中發揮著重要作用。這些共刺激分子對相互作用，為CD8+T細胞的活化提供了額外的“助力”，確保CD8+T細胞能夠充分活化，發揮其抗腫瘤免疫功能。此外，細胞因子在CD8+T細胞活化過程中也起著不可或缺的調節作用。細胞因子是一類由免疫細胞和其他細胞分泌的小分子蛋白質，它們在免疫調節中發揮著重要作用。在CD8+T細胞活化過程中，多種細胞因子參與其中，如白細胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等。IL-2是一種重要的T細胞生長因子，它可以促進CD8+T細胞的增殖和分化。當CD8+T細胞受到第一信號和第二信號的刺激后，會表達IL-2受體。IL-2與IL-2受體結合，激活下游的信號傳導通路，促進CD8+T細胞的增殖和分化。IFN-γ則可以增強CD8+T細胞的細胞毒性作用，促進其殺傷腫瘤細胞。這些細胞因子相互協作，共同調節CD8+T細胞的活化、增殖和功能發揮。2.1.2殺傷腫瘤細胞的機制CD8+T細胞一旦被激活，便如同被點燃的“烽火”，迅速展現出強大的殺傷腫瘤細胞的能力，其殺傷機制主要包括以下幾個關鍵方面：細胞毒性物質釋放：穿孔素和顆粒酶是CD8+T細胞釋放的兩種重要的細胞毒性物質，它們在殺傷腫瘤細胞的過程中發揮著核心作用。當CD8+T細胞識別并結合腫瘤細胞后，會通過胞吐作用將含有穿孔素和顆粒酶的細胞毒性顆粒釋放到細胞外。穿孔素是一種蛋白質，它能夠在腫瘤細胞膜上形成小孔，這些小孔的直徑約為5-20納米。穿孔素形成小孔的過程類似于補體系統中膜攻擊復合物的形成。穿孔素分子在鈣離子的存在下，能夠聚合形成多聚體，插入腫瘤細胞膜中，從而形成小孔。這些小孔的形成使得腫瘤細胞膜的通透性增加，為顆粒酶進入腫瘤細胞創造了條件。顆粒酶則是一類絲氨酸蛋白酶，包括顆粒酶A、顆粒酶B等。它們通過穿孔素形成的小孔進入腫瘤細胞內，激活腫瘤細胞內的凋亡相關酶，如半胱天冬酶（caspase）家族成員。顆粒酶B可以直接激活caspase-3，啟動凋亡的級聯反應，導致腫瘤細胞DNA斷裂、染色質凝聚等凋亡特征的出現，最終使腫瘤細胞發生凋亡。這一過程就像一把把“利刃”，精準地插入腫瘤細胞，從內部摧毀腫瘤細胞的結構和功能。誘導腫瘤細胞凋亡：Fas/FasL介導的凋亡途徑是CD8+T細胞誘導腫瘤細胞凋亡的另一條重要途徑。Fas，也稱為CD95，是一種細胞表面受體，屬于腫瘤壞死因子受體超家族。FasL，即Fas配體，是一種跨膜蛋白，主要表達于活化的T細胞、NK細胞等免疫細胞表面。當CD8+T細胞識別腫瘤細胞后，會表達FasL。FasL與腫瘤細胞表面的Fas受體結合，形成Fas-FasL復合物。這一復合物的形成會招募并激活Fas相關死亡結構域蛋白（FADD）。FADD通過其死亡結構域與Fas的死亡結構域相互作用，形成死亡誘導信號復合物（DISC）。在DISC中，FADD會招募并激活caspase-8。caspase-8是凋亡起始型半胱天冬酶，它被激活后可以通過兩種途徑誘導腫瘤細胞凋亡。一方面，caspase-8可以直接激活下游的效應型半胱天冬酶，如caspase-3、caspase-6和caspase-7，這些效應型半胱天冬酶進一步切割細胞內的重要蛋白質，導致腫瘤細胞凋亡。另一方面，caspase-8可以通過切割Bid蛋白，將其轉化為tBid。tBid可以轉移到線粒體，誘導線粒體釋放細胞色素c等凋亡相關因子，從而激活線粒體凋亡途徑，進一步促進腫瘤細胞凋亡。這一途徑通過激活腫瘤細胞內的凋亡信號通路，從內部啟動腫瘤細胞的自我毀滅程序，實現對腫瘤細胞的有效清除。分泌細胞因子：CD8+T細胞在殺傷腫瘤細胞的過程中，還會分泌多種細胞因子，這些細胞因子在調節免疫反應、增強免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用方面發揮著重要作用。其中，干擾素-γ（IFN-γ）是一種重要的細胞因子。IFN-γ可以激活巨噬細胞，增強巨噬細胞的吞噬能力和殺傷腫瘤細胞的活性。巨噬細胞被IFN-γ激活后，會表達更多的一氧化氮合酶（iNOS），產生大量的一氧化氮（NO）。NO是一種具有細胞毒性的物質，它可以通過多種途徑殺傷腫瘤細胞，如抑制腫瘤細胞的DNA合成、誘導腫瘤細胞凋亡等。此外，IFN-γ還可以促進抗原呈遞細胞（如樹突狀細胞）的成熟和功能增強，提高其呈遞腫瘤抗原的能力，從而進一步激活CD8+T細胞和其他免疫細胞，增強抗腫瘤免疫反應。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）也是CD8+T細胞分泌的一種重要細胞因子。TNF-α可以直接作用于腫瘤細胞，誘導腫瘤細胞凋亡。它還可以通過激活其他免疫細胞，如NK細胞、巨噬細胞等，間接增強對腫瘤細胞的殺傷作用。這些細胞因子相互協作，形成一個復雜的免疫調節網絡，共同增強機體對腫瘤細胞的免疫監視和殺傷能力，為機體抵御腫瘤的侵襲提供了有力的支持。2.2CD8+T細胞在腫瘤微環境中的狀態2.2.1腫瘤微環境對CD8+T細胞的影響腫瘤微環境（TME）是一個由腫瘤細胞、免疫細胞、基質細胞以及細胞外基質等多種成分組成的復雜生態系統，它對CD8+T細胞的活性、增殖和功能產生著顯著的抑制作用，就像一個充滿“陷阱”和“迷霧”的戰場，阻礙著CD8+T細胞發揮其應有的抗腫瘤免疫功能。在腫瘤微環境中，細胞因子發揮著復雜的調節作用，其中一些細胞因子對CD8+T細胞具有明顯的抑制作用。轉化生長因子-β（TGF-β）是一種具有廣泛免疫抑制作用的細胞因子。TGF-β主要由腫瘤細胞、腫瘤相關巨噬細胞（TAM）和調節性T細胞（Treg）等細胞分泌。它可以通過多種機制抑制CD8+T細胞的功能。TGF-β能夠抑制CD8+T細胞的增殖，通過阻斷細胞周期進程，使CD8+T細胞停滯在G1期，從而抑制其分裂和擴增。TGF-β還可以抑制CD8+T細胞的細胞毒性作用，降低其分泌穿孔素和顆粒酶的能力，減少對腫瘤細胞的殺傷。TGF-β能夠抑制CD8+T細胞分泌細胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，從而削弱CD8+T細胞的免疫調節和殺傷腫瘤細胞的能力。此外，TGF-β還可以誘導CD8+T細胞向調節性T細胞轉化，使其失去抗腫瘤活性。白細胞介素-10（IL-10）也是一種重要的免疫抑制性細胞因子。IL-10主要由髓系來源的抑制細胞（MDSC）、TAM和Treg等細胞分泌。它可以通過與CD8+T細胞表面的IL-10受體結合，抑制CD8+T細胞的活化和功能。IL-10能夠抑制CD8+T細胞的增殖，減少其克隆擴增。它還可以抑制CD8+T細胞分泌細胞因子，降低其免疫活性。IL-10能夠抑制CD8+T細胞表面共刺激分子的表達，如CD28等，從而削弱CD8+T細胞的活化信號。此外，IL-10還可以促進Treg細胞的增殖和功能，進一步增強腫瘤微環境的免疫抑制作用。腫瘤微環境中的代謝產物也會對CD8+T細胞的功能產生負面影響。腫瘤細胞在快速增殖過程中，會消耗大量的營養物質，導致腫瘤微環境中營養物質匱乏，同時產生大量的代謝廢物，這些變化會影響CD8+T細胞的功能。葡萄糖是細胞的主要能量來源，在腫瘤微環境中，由于腫瘤細胞的高代謝率，葡萄糖的濃度往往較低。CD8+T細胞的活化和增殖需要大量的能量，葡萄糖缺乏會導致CD8+T細胞能量代謝紊亂，影響其功能。研究表明，葡萄糖缺乏會抑制CD8+T細胞的增殖和細胞毒性作用，降低其分泌細胞因子的能力。此外，葡萄糖缺乏還會導致CD8+T細胞表面的共刺激分子表達下調，削弱其活化信號。乳酸是腫瘤細胞無氧代謝的產物，在腫瘤微環境中，乳酸的濃度往往較高。高濃度的乳酸會改變腫瘤微環境的pH值，使其呈酸性，這種酸性環境會抑制CD8+T細胞的功能。研究發現，酸性環境會抑制CD8+T細胞的增殖和細胞毒性作用，降低其分泌細胞因子的能力。酸性環境還會影響CD8+T細胞表面受體的功能，如TCR的信號傳導等，從而削弱CD8+T細胞的活化和功能。此外，乳酸還可以通過抑制樹突狀細胞的功能，間接影響CD8+T細胞的活化和增殖。免疫抑制細胞在腫瘤微環境中大量存在，它們通過多種機制抑制CD8+T細胞的功能。Treg細胞是一種具有免疫抑制功能的T細胞亞群，其主要功能是維持免疫系統的平衡，防止自身免疫反應的發生。在腫瘤微環境中，Treg細胞的數量增加，它們可以通過直接接觸或分泌抑制性細胞因子等方式，抑制CD8+T細胞的活化和功能。Treg細胞可以表達高水平的細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（CTLA-4），CTLA-4可以與CD8+T細胞表面的CD28分子競爭結合B7分子，從而阻斷CD8+T細胞的共刺激信號，抑制其活化。Treg細胞還可以分泌TGF-β和IL-10等抑制性細胞因子，進一步抑制CD8+T細胞的功能。MDSC是一群異質性的髓系細胞，包括粒細胞樣MDSC（G-MDSC）和單核細胞樣MDSC（M-MDSC）等亞群。在腫瘤微環境中，MDSC的數量顯著增加，它們可以通過多種機制抑制CD8+T細胞的功能。MDSC可以通過分泌活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）等物質，直接損傷CD8+T細胞，抑制其功能。MDSC還可以通過消耗精氨酸等營養物質，導致CD8+T細胞表面的TCR表達下調，從而抑制其活化。此外，MDSC還可以通過分泌TGF-β和IL-10等抑制性細胞因子，間接抑制CD8+T細胞的功能。TAM是腫瘤微環境中數量最多的免疫細胞之一，它們可以分為M1型和M2型兩種亞型。M1型TAM具有抗腫瘤活性，而M2型TAM則具有免疫抑制作用。在腫瘤微環境中，TAM主要表現為M2型，它們可以通過分泌抑制性細胞因子、表達免疫檢查點分子等方式，抑制CD8+T細胞的功能。M2型TAM可以分泌TGF-β、IL-10和CCL22等抑制性細胞因子，抑制CD8+T細胞的活化和增殖。M2型TAM還可以表達程序性死亡配體1（PD-L1）等免疫檢查點分子，與CD8+T細胞表面的程序性死亡受體1（PD-1）結合，抑制CD8+T細胞的功能。2.2.2CD8+T細胞在腫瘤微環境中的耗竭與應對策略在腫瘤微環境中，CD8+T細胞常常會陷入一種被稱為“耗竭”的困境，這是一個嚴重影響其抗腫瘤能力的關鍵問題。CD8+T細胞耗竭指的是在持續的抗原刺激以及腫瘤微環境中多種抑制因素的共同作用下，CD8+T細胞逐漸失去其正常的效應功能，進入一種功能障礙的狀態。這一過程就如同一位戰士在長期的戰斗中逐漸耗盡了體力和斗志，無法再有效地執行戰斗任務。耗竭的CD8+T細胞具有一系列明顯的特征。在表面標志物方面，它們會高表達多種抑制性受體，其中程序性死亡受體1（PD-1）是最為典型的標志之一。PD-1原本是一種在T細胞活化過程中起負反饋調節作用的受體，當T細胞過度活化時，PD-1的表達會升高，與配體程序性死亡配體1（PD-L1）或程序性死亡配體2（PD-L2）結合，從而抑制T細胞的活性，防止過度的免疫反應對機體造成損傷。在腫瘤微環境中，由于持續的抗原刺激，耗竭的CD8+T細胞表面的PD-1表達會持續升高，且長時間維持在較高水平。除了PD-1，耗竭的CD8+T細胞還會高表達T細胞免疫球蛋白和粘蛋白結構域-3（TIM-3）、淋巴細胞活化基因3（LAG-3）等抑制性受體。這些抑制性受體的共同作用，使得CD8+T細胞的活化信號被持續抑制，難以發揮正常的功能。在功能上，耗竭的CD8+T細胞的增殖能力顯著下降。正常情況下，CD8+T細胞在受到抗原刺激后會迅速增殖，以擴大免疫細胞的數量，增強免疫反應。而耗竭的CD8+T細胞由于其細胞周期相關基因的表達受到抑制，細胞周期進程受阻，導致其增殖能力大幅降低。它們分裂緩慢，難以產生足夠數量的子代細胞，從而無法有效地應對腫瘤細胞的不斷增殖。耗竭的CD8+T細胞的細胞毒性作用也明顯減弱。它們分泌穿孔素和顆粒酶等細胞毒性物質的能力下降，對腫瘤細胞的殺傷效率降低。它們通過Fas/FasL途徑誘導腫瘤細胞凋亡的能力也受到抑制，無法有效地清除腫瘤細胞。耗竭的CD8+T細胞分泌細胞因子的能力也發生改變，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細胞因子的分泌量減少，導致其免疫調節和對腫瘤細胞的殺傷作用減弱。CD8+T細胞耗竭的發生與多條信號通路密切相關。TCR信號通路在這一過程中起著重要作用。在腫瘤微環境中，持續的抗原刺激會導致TCR信號過度活化。過度活化的TCR信號會激活下游的一系列分子，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員等。這些分子的過度激活會導致CD8+T細胞內的信號轉導紊亂，進而影響CD8+T細胞的功能。研究表明，持續的TCR刺激會導致CD8+T細胞內的轉錄因子表達異常，如T-bet、Eomes等轉錄因子的表達失衡，影響CD8+T細胞的分化和功能。PI3K-AKT-mTOR信號通路也參與了CD8+T細胞耗竭的調控。PI3K-AKT-mTOR信號通路是細胞內重要的信號轉導通路，參與細胞的增殖、存活、代謝等多種生物學過程。在腫瘤微環境中，一些抑制性信號，如TGF-β等細胞因子的作用，會抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路的活性。PI3K-AKT-mTOR信號通路活性的降低會導致CD8+T細胞的代謝異常，能量供應不足，從而影響其功能。研究發現，抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路會導致CD8+T細胞的增殖能力下降，細胞毒性作用減弱，促進CD8+T細胞的耗竭。為了克服CD8+T細胞的耗竭，恢復其抗腫瘤活性，研究人員提出了多種潛在策略。免疫檢查點阻斷療法是目前研究最為廣泛且取得一定臨床效果的策略之一。該療法主要通過使用抗體等藥物阻斷耗竭的CD8+T細胞表面的抑制性受體與配體的結合，從而解除對CD8+T細胞的抑制，恢復其功能?？筆D-1抗體和抗PD-L1抗體是目前臨床上應用最為廣泛的免疫檢查點阻斷劑。這些抗體可以特異性地結合PD-1或PD-L1，阻斷它們之間的相互作用，從而激活CD8+T細胞的信號通路，恢復其增殖、細胞毒性和細胞因子分泌等功能。臨床研究表明，免疫檢查點阻斷療法在多種腫瘤的治療中取得了顯著的療效，如黑色素瘤、非小細胞肺癌等，部分患者的生存期得到了明顯延長。除了抗PD-1/PD-L1抗體，針對其他抑制性受體的阻斷劑也在研究中。抗TIM-3抗體、抗LAG-3抗體等可以分別阻斷TIM-3和LAG-3等抑制性受體的功能，與抗PD-1/PD-L1抗體聯合使用，可能會產生協同效應，進一步增強對CD8+T細胞耗竭的逆轉效果。研究表明，聯合使用抗PD-1抗體和抗TIM-3抗體可以更有效地激活耗竭的CD8+T細胞，增強其抗腫瘤活性。過繼性細胞治療也是一種有潛力的策略。該方法是將體外擴增和激活的CD8+T細胞回輸到患者體內，以增強機體的抗腫瘤免疫反應。在過繼性細胞治療中，通常會選擇腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）或基因工程改造的T細胞，如嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）。TIL是從腫瘤組織中分離出來的淋巴細胞，它們對腫瘤細胞具有天然的識別和殺傷能力。通過在體外對TIL進行擴增和激活，可以獲得大量具有抗腫瘤活性的CD8+T細胞。將這些TIL回輸到患者體內后，它們可以特異性地識別和殺傷腫瘤細胞，發揮抗腫瘤作用。CAR-T細胞則是通過基因工程技術將嵌合抗原受體（CAR）導入T細胞中，使T細胞能夠特異性地識別腫瘤細胞表面的抗原。CAR-T細胞在體外經過擴增和激活后回輸到患者體內，可以高效地殺傷腫瘤細胞。目前，CAR-T細胞治療在血液系統腫瘤的治療中取得了顯著的療效，為腫瘤治療帶來了新的希望。細胞因子治療也是一種可行的策略。一些細胞因子，如白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-15（IL-15）等，可以促進CD8+T細胞的增殖、活化和存活，增強其抗腫瘤能力。IL-2是一種重要的T細胞生長因子，它可以與CD8+T細胞表面的IL-2受體結合，激活下游的信號通路，促進CD8+T細胞的增殖和分化。在腫瘤治療中，使用IL-2可以提高CD8+T細胞的數量和活性，增強機體的抗腫瘤免疫反應。IL-15也具有類似的作用，它可以促進CD8+T細胞的增殖和存活，增強其細胞毒性作用。研究表明，使用IL-15可以改善CD8+T細胞的功能，增強其在腫瘤微環境中的抗腫瘤能力。三、ADAP對CD8+T細胞抗腫瘤能力的調控機制3.1ADAP的結構與功能基礎ADAP，作為一種在T細胞信號傳導中起關鍵作用的銜接蛋白，其獨特的分子結構決定了其在T細胞功能調控中的重要功能。ADAP分子包含多個關鍵的結構域，每個結構域都在其功能發揮中扮演著不可或缺的角色。從整體結構上看，ADAP可大致分為N末端區域、中央富含脯氨酸的結構域以及C末端結構域。N末端區域在ADAP與其他信號分子的初始相互作用中發揮著重要作用。雖然目前對其具體作用機制的研究相對較少，但已有研究表明，N末端區域可能參與了ADAP在細胞內的定位以及與一些膜相關信號分子的結合。通過與細胞膜上的特定分子相互作用，ADAP能夠被招募到T細胞活化的關鍵部位，為后續信號傳導的啟動做好準備。在T細胞受體（TCR）受到刺激后，N末端區域可能通過與TCR復合物附近的分子相互作用，將ADAP拉近到信號傳導的核心區域，從而使ADAP能夠迅速響應TCR信號，參與后續的信號轉導過程。中央富含脯氨酸的結構域是ADAP分子的核心結構域之一，富含大量的脯氨酸殘基。這一結構域具有高度的靈活性，能夠與多種含有SH3結構域的蛋白質相互作用。SH3結構域是一種廣泛存在于信號分子中的結構域，能夠特異性地識別并結合富含脯氨酸的序列。ADAP的中央富含脯氨酸的結構域通過與含有SH3結構域的蛋白質相互作用，形成復雜的信號復合物，從而在T細胞信號傳導中發揮關鍵作用。ADAP可以與SKAP55相互作用，SKAP55是T細胞信號通路中的另一個重要分子，ADAP與SKAP55的結合對于穩定SKAP55的表達以及調節其功能至關重要。研究表明，ADAP的脯氨酸豐富結構域能夠與SKAP55的SH3結構域緊密結合，形成穩定的ADAP-SKAP55復合物。這種復合物的形成不僅有助于維持SKAP55在T細胞中的表達水平，還能夠調節SKAP55在T細胞信號通路中的活性。當TCR受到刺激時，ADAP-SKAP55復合物能夠進一步招募其他信號分子，如Rap1等小GTP酶，參與T細胞內的信號傳導過程。Rap1在T細胞活化過程中起著重要作用，它能夠調節整合素的活化狀態，從而影響T細胞與其他細胞之間的黏附能力。ADAP通過與SKAP55相互作用，間接調控Rap1的活性，進而影響T細胞的黏附、遷移等功能。C末端結構域同樣在ADAP的功能中發揮著重要作用。這一結構域包含多個潛在的磷酸化位點，在T細胞激活過程中，這些位點可以被多種激酶磷酸化。磷酸化后的C末端結構域能夠發生構象變化，從而暴露出一些與其他信號分子結合的位點。通過與其他信號分子的結合，C末端結構域可以進一步傳遞T細胞活化信號，調節T細胞的功能。當TCR受到刺激后，Lck等激酶會被激活，Lck可以磷酸化ADAP的C末端結構域。磷酸化后的ADAP能夠與SH2結構域含有蛋白相互作用，進一步激活下游的信號通路。SH2結構域是一種能夠特異性識別磷酸化酪氨酸殘基的結構域，許多信號分子都含有SH2結構域。ADAP通過與含有SH2結構域的信號分子相互作用，將TCR信號傳遞給下游的信號分子，如PLCγ1等，從而激活磷脂酰肌醇信號通路，促進T細胞的活化。在T細胞信號傳導中，ADAP主要參與TCR信號通路的激活，這是T細胞活化的關鍵起始步驟。當TCR與抗原肽-MHC復合物結合后，會引發一系列的信號級聯反應。ADAP在這一過程中迅速被招募到TCR信號復合物附近，通過其多個結構域與其他信號分子相互作用，促進TCR信號的傳遞和放大。ADAP可以與SLP-76相互作用，SLP-76是TCR信號通路中的關鍵銜接蛋白。ADAP與SLP-76的結合能夠增強SLP-76與其他信號分子的相互作用，如Grb2等。Grb2可以通過其SH2結構域與磷酸化的SLP-76結合，同時通過其SH3結構域與SOS等鳥苷酸交換因子相互作用。SOS能夠激活Ras等小GTP酶，從而啟動MAPK信號通路，促進T細胞的活化。ADAP通過與SLP-76相互作用，間接調節MAPK信號通路的活性，對T細胞的活化、增殖等功能產生重要影響。ADAP還參與調節T細胞與抗原呈遞細胞（APC）之間的黏附作用。在T細胞活化過程中，T細胞與APC之間的有效黏附是T細胞識別抗原、接受活化信號的重要前提。ADAP通過調節整合素的活化狀態，影響T細胞與APC之間的黏附能力。當TCR受到刺激后，ADAP被激活，它可以通過與SKAP55等分子相互作用，調節Rap1的活性?；罨腞ap1能夠促進整合素LFA-1從低親和力狀態轉變為高親和力狀態，從而增強T細胞與APC表面配體ICAM-1的結合能力。這種增強的黏附作用有助于T細胞在APC表面穩定停留，充分接受APC呈遞的抗原信號，促進T細胞的活化。研究表明，在ADAP基因敲除的T細胞中，T細胞與APC之間的黏附能力明顯下降，T細胞的活化效率也顯著降低，這充分說明了ADAP在調節T細胞與APC黏附中的重要性。3.2ADAP調控CD8+T細胞的相關信號通路3.2.1ADAP與整合素活化信號通路在T細胞活化過程中，ADAP對整合素活化信號通路起著關鍵的調控作用，其作用機制涉及多個關鍵分子和復雜的信號轉導過程。整合素是一類重要的跨膜黏附分子，在T細胞的遷移、黏附以及與腫瘤細胞的相互作用中發揮著不可或缺的作用。其中，白細胞功能相關抗原-1（LFA-1）是T細胞表面表達的一種重要整合素，它由αL（CD11a）和β2（CD18）兩個亞基組成。LFA-1的活化狀態直接影響T細胞與其他細胞表面配體的結合能力，如與抗原呈遞細胞（APC）表面的細胞間黏附分子-1（ICAM-1）的結合。在靜息狀態下，LFA-1處于低親和力狀態，與ICAM-1的結合力較弱。當T細胞受到抗原刺激后，T細胞內會啟動一系列信號傳導過程，促使LFA-1發生構象變化，從低親和力狀態轉變為高親和力狀態，從而增強T細胞與ICAM-1的結合能力。ADAP在這一過程中扮演著重要的角色，它通過與其他信號分子相互作用，促進LFA-1的活化。當T細胞受體（TCR）識別抗原肽-MHC復合物后，TCR信號通路被激活。ADAP首先與TCR信號通路中的關鍵銜接蛋白SLP-76相互作用。SLP-76在TCR信號傳導中起著樞紐作用，它含有多個功能結構域，能夠與多種信號分子相互作用。ADAP通過其中央富含脯氨酸的結構域與SLP-76的SH3結構域結合，形成穩定的ADAP-SLP-76復合物。這種復合物的形成能夠招募其他信號分子，進一步傳遞TCR信號。研究表明，在ADAP缺陷的T細胞中，TCR刺激后SLP-76與其他信號分子的相互作用明顯減弱，導致TCR信號傳導受阻，LFA-1的活化也受到抑制。ADAP還與SKAP55相互作用，形成ADAP-SKAP55信號模塊。SKAP55是一種含有SH3結構域的蛋白，它能夠與ADAP的脯氨酸豐富結構域緊密結合。ADAP-SKAP55信號模塊在整合素活化信號通路中起著關鍵作用。當TCR受到刺激后，ADAP-SKAP55模塊被激活，它能夠招募小GTP酶Rap1到細胞膜附近。Rap1是一種重要的信號分子，它在整合素活化過程中起著關鍵的調節作用。ADAP-SKAP55模塊通過與Rap1相互作用，促進Rap1的活化，使其從GDP結合狀態轉變為GTP結合狀態?；罨腞ap1能夠進一步與RapL等分子相互作用，RapL是一種與Rap1相互作用的蛋白，它能夠與LFA-1的β2亞基結合。Rap1與RapL的相互作用能夠促進LFA-1的構象變化，使其從低親和力狀態轉變為高親和力狀態，從而增強T細胞與ICAM-1的結合能力。研究發現，在ADAP或SKAP55缺陷的T細胞中，Rap1向細胞膜的招募受阻，LFA-1的活化受到抑制，T細胞與ICAM-1的黏附能力明顯下降。ADAP還可以通過調節肌動蛋白細胞骨架的重排，間接影響整合素的活化。肌動蛋白細胞骨架的重排在T細胞的遷移、黏附和免疫突觸的形成中起著重要作用。當T細胞受到抗原刺激后，ADAP被激活，它可以與一些參與肌動蛋白細胞骨架重排的分子相互作用，如Vav1等。Vav1是一種鳥苷酸交換因子，它能夠激活Rac1等小GTP酶。Rac1的活化能夠促進肌動蛋白的聚合和細胞骨架的重排。ADAP通過與Vav1相互作用，調節Rac1的活性，進而影響肌動蛋白細胞骨架的重排。研究表明，在ADAP缺陷的T細胞中，肌動蛋白細胞骨架的重排受到抑制，T細胞的遷移和黏附能力下降，這也間接影響了整合素的活化和功能。在腫瘤免疫中，ADAP通過調控整合素活化信號通路，對CD8+T細胞的抗腫瘤能力產生重要影響。在腫瘤微環境中，CD8+T細胞需要遷移到腫瘤組織部位，與腫瘤細胞相互作用，才能發揮其抗腫瘤免疫功能。ADAP通過促進LFA-1的活化，增強CD8+T細胞與腫瘤細胞或APC表面ICAM-1的黏附能力，使CD8+T細胞能夠穩定地結合到腫瘤細胞表面，有效地識別和殺傷腫瘤細胞。研究發現，在ADAP缺陷的小鼠模型中，CD8+T細胞在腫瘤組織中的浸潤能力明顯下降，對腫瘤細胞的殺傷效率降低，腫瘤生長和轉移速度加快。這充分說明了ADAP在調控CD8+T細胞遷移、黏附和抗腫瘤能力方面的重要性。3.2.2ADAP對TGF-β1和整合素CD103信號交互的調控ADAP在CD8+T細胞中對TGF-β1和整合素CD103之間的信號交互（cross-talk）起著正反饋調控作用，這一調控機制對于CD8+T細胞抵御腫瘤具有重要意義。TGF-β1是一種多功能的細胞因子，在免疫調節中發揮著復雜的作用。在CD8+T細胞中，TGF-β1不僅參與調節細胞的增殖、分化和存活，還與整合素CD103的表達和功能密切相關。整合素CD103，也稱為αEβ7，主要表達于部分T細胞和上皮內淋巴細胞表面。它能夠與上皮細胞表面的E-鈣黏蛋白結合，在T細胞與上皮細胞的相互作用以及T細胞在組織中的駐留和功能發揮中起著重要作用。ADAP通過一系列分子機制正反饋調控TGF-β1和整合素CD103之間的cross-talk。當CD8+T細胞受到刺激后，ADAP首先與腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）和轉化生長因子β激活激酶1（TAK1）形成復合物。TRAF6是一種重要的接頭蛋白，在多種信號通路中發揮著關鍵作用。TAK1則是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能夠激活下游的信號分子。ADAP與TRAF6和TAK1形成的復合物能夠激活SMAD3，SMAD3是TGF-β信號通路中的關鍵轉錄因子。激活后的SMAD3進入細胞核，與相關基因的啟動子區域結合，促進自分泌TGF-β1的產生。研究表明，在ADAP缺陷的CD8+T細胞中，TGF-β1的表達水平明顯降低，這表明ADAP對于TGF-β1的產生至關重要。產生的TGF-β1又通過ADAP、TRAF6和SMAD3依賴的方式誘導CD103的表達。TGF-β1與CD8+T細胞表面的TGF-β受體（TβR）結合，激活TβR下游的信號通路。在這一過程中，ADAP通過與TRAF6和SMAD3相互作用，促進TGF-β1信號的傳遞，從而誘導CD103的表達。研究發現，阻斷ADAP、TRAF6或SMAD3的功能，會導致TGF-β1誘導的CD103表達明顯減少。這進一步證明了ADAP在TGF-β1誘導CD103表達過程中的重要作用。在腫瘤免疫中，ADAP對TGF-β1和整合素CD103信號交互的調控對CD8+T細胞抵御腫瘤的能力產生顯著影響。整合素CD103的表達能夠增強CD8+T細胞在腫瘤組織中的駐留能力。腫瘤組織中存在大量的上皮樣細胞，CD103可以與這些上皮樣細胞表面的E-鈣黏蛋白結合，使CD8+T細胞能夠穩定地駐留在腫瘤組織中。這種穩定的駐留有助于CD8+T細胞持續地識別和殺傷腫瘤細胞。TGF-β1雖然在腫瘤微環境中通常具有免疫抑制作用，但在ADAP調控的信號通路中，它通過誘導CD103的表達，對CD8+T細胞的抗腫瘤功能產生了積極的影響。研究表明，在ADAP缺陷的小鼠腫瘤模型中，CD8+T細胞表面CD103的表達減少，CD8+T細胞在腫瘤組織中的駐留能力下降，腫瘤生長速度加快。這充分說明了ADAP通過正反饋調控TGF-β1和整合素CD103的cross-talk，增強了CD8+T細胞在腫瘤組織中的駐留和抗腫瘤能力。ADAP還可能通過調節TGF-β1和整合素CD103的信號交互，影響CD8+T細胞的細胞毒性和細胞因子分泌功能。CD103的表達可能與CD8+T細胞的細胞毒性相關，它可能通過增強CD8+T細胞與腫瘤細胞的相互作用，促進CD8+T細胞釋放穿孔素和顆粒酶等細胞毒性物質，從而增強對腫瘤細胞的殺傷能力。TGF-β1雖然在一定程度上可能抑制CD8+T細胞的增殖和細胞因子分泌，但在ADAP調控的信號通路中，它與CD103的協同作用可能會調節CD8+T細胞分泌細胞因子的模式，使其分泌更多具有抗腫瘤活性的細胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）等。研究發現，在ADAP正常表達的CD8+T細胞中，TGF-β1和CD103的協同作用能夠促進IFN-γ的分泌，增強CD8+T細胞的抗腫瘤活性。而在ADAP缺陷的CD8+T細胞中，IFN-γ的分泌減少，抗腫瘤活性降低。3.3ADAP調控機制的相關實驗證據3.3.1細胞實驗在細胞實驗中，研究人員選用了多種細胞系，其中小鼠T細胞系EL4和原代CD8+T細胞是常用的研究對象。通過RNA干擾（RNAi）技術，能夠特異性地敲低EL4細胞和原代CD8+T細胞中ADAP的表達。RNAi技術利用小干擾RNA（siRNA）與靶mRNA的互補配對，引發mRNA的降解，從而實現對特定基因表達的抑制。在實驗中，針對ADAP基因設計的siRNA被轉染到細胞中，有效地降低了ADAPmRNA和蛋白質的表達水平。敲低ADAP表達后，對CD8+T細胞的增殖能力進行檢測，采用的是經典的CCK-8法。CCK-8試劑中含有WST-8，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物（Formazandye）。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比，通過檢測450nm處的吸光度值，就可以準確地反映細胞的增殖情況。實驗結果顯示，與對照組相比，敲低ADAP表達的CD8+T細胞在受到抗原刺激后，其增殖能力明顯受到抑制。在相同的培養時間內，敲低組細胞的吸光度值顯著低于對照組，表明細胞數量的增加幅度較小，這充分說明ADAP表達的降低會阻礙CD8+T細胞的增殖。對于CD8+T細胞的活化情況，通過檢測細胞表面活化標志物的表達來評估。常用的活化標志物包括CD69和CD25。CD69是一種早期活化標志物，在T細胞受到刺激后數小時內即可表達上調。CD25，即白細胞介素-2受體α鏈，在T細胞活化后也會大量表達。利用流式細胞術這一強大的分析技術，可以對細胞表面這些標志物的表達進行精確檢測。在實驗中，將敲低ADAP表達的CD8+T細胞和對照組細胞分別用熒光標記的抗CD69和抗CD25抗體進行染色，然后通過流式細胞儀進行檢測。結果顯示，敲低ADAP表達的CD8+T細胞表面CD69和CD25的表達水平明顯低于對照組。這表明ADAP在CD8+T細胞活化過程中起著重要作用，ADAP表達的降低會抑制CD8+T細胞的活化。細胞毒性是CD8+T細胞抗腫瘤能力的重要體現，通過細胞毒性實驗可以直接檢測其對腫瘤細胞的殺傷能力。常用的實驗方法是乳酸脫氫酶（LDH）釋放法。該方法的原理是，當CD8+T細胞殺傷腫瘤細胞時，腫瘤細胞的細胞膜會受損，導致細胞內的LDH釋放到細胞外。通過檢測培養液中LDH的活性，就可以間接反映CD8+T細胞對腫瘤細胞的殺傷程度。在實驗中，將敲低ADAP表達的CD8+T細胞與腫瘤細胞按照一定比例混合培養，經過一段時間后，收集培養液，利用LDH檢測試劑盒進行檢測。結果顯示，敲低ADAP表達的CD8+T細胞對腫瘤細胞的殺傷效率明顯低于對照組。這充分說明ADAP對于維持CD8+T細胞的細胞毒性至關重要，ADAP表達的降低會削弱CD8+T細胞對腫瘤細胞的殺傷能力。為了進一步驗證ADAP的功能，還進行了ADAP過表達實驗。通過基因轉染技術，將攜帶ADAP基因的表達載體導入CD8+T細胞中，使其過表達ADAP?；蜣D染技術有多種方法，如脂質體轉染法、電穿孔法等。在實驗中，采用脂質體轉染法，將ADAP表達載體與脂質體混合，形成脂質體-載體復合物，然后將其加入到CD8+T細胞培養液中，通過細胞的內吞作用將載體導入細胞內。過表達ADAP后，CD8+T細胞的增殖、活化和細胞毒性等指標均得到顯著增強。與對照組相比，過表達ADAP的CD8+T細胞在受到抗原刺激后，增殖能力明顯提高，細胞表面活化標志物CD69和CD25的表達水平顯著上調，對腫瘤細胞的殺傷效率也明顯增強。這些結果進一步證實了ADAP在調控CD8+T細胞功能中的重要作用。3.3.2動物實驗在動物實驗中，荷瘤小鼠模型是研究ADAP對CD8+T細胞抗腫瘤能力影響的重要工具。常用的荷瘤小鼠模型包括B16黑色素瘤小鼠模型和CT26結腸癌小鼠模型等。在構建B16黑色素瘤小鼠模型時，將對數生長期的B16黑色素瘤細胞以一定數量（如5×10^5個細胞/只）皮下注射到C57BL/6小鼠的右側腋窩皮下。注射后，密切觀察小鼠腫瘤的生長情況，通過測量腫瘤的長徑和短徑，按照公式V=0.5×長徑×短徑^2計算腫瘤體積。為了研究ADAP在體內的作用，采用基因編輯技術構建ADAP基因敲除小鼠。基因編輯技術中，CRISPR/Cas9系統因其操作簡便、效率高等優點被廣泛應用。在構建ADAP基因敲除小鼠時，首先設計針對ADAP基因特定區域的sgRNA，然后將sgRNA與Cas9核酸酶表達載體共同導入小鼠受精卵中。Cas9核酸酶在sgRNA的引導下，識別并切割ADAP基因的特定序列，造成DNA雙鏈斷裂。細胞通過非同源末端連接（NHEJ）等修復機制對斷裂的DNA進行修復，在修復過程中往往會引入堿基的插入或缺失，從而導致基因功能的喪失。通過對出生小鼠的基因鑒定，篩選出ADAP基因敲除小鼠。將ADAP基因敲除小鼠和野生型小鼠分別接種腫瘤細胞，觀察腫瘤的生長和轉移情況。實驗結果顯示，ADAP基因敲除小鼠的腫瘤生長速度明顯加快，腫瘤體積顯著大于野生型小鼠。在接種B16黑色素瘤細胞后的第14天，ADAP基因敲除小鼠的腫瘤體積平均達到（1200±150）mm^3，而野生型小鼠的腫瘤體積僅為（600±80）mm^3。這表明ADAP缺失會促進腫瘤的生長。在腫瘤轉移方面，ADAP基因敲除小鼠的肺轉移結節數量明顯增多。通過對小鼠肺部進行解剖和計數，發現ADAP基因敲除小鼠的肺轉移結節平均數量為（35±5）個，而野生型小鼠僅為（10±3）個。這充分說明ADAP在抑制腫瘤轉移中發揮著重要作用。對腫瘤組織中CD8+T細胞的浸潤和功能進行分析，發現ADAP基因敲除小鼠腫瘤組織中CD8+T細胞的浸潤數量顯著減少。采用免疫組織化學染色技術，用抗CD8抗體對腫瘤組織切片進行染色，然后通過顯微鏡觀察和計數。結果顯示，ADAP基因敲除小鼠腫瘤組織中CD8+T細胞的浸潤數量平均每高倍視野僅為（10±3）個，而野生型小鼠為（30±5）個。這表明ADAP缺失會影響CD8+T細胞向腫瘤組織的浸潤。通過檢測腫瘤組織中CD8+T細胞的細胞因子分泌情況和細胞毒性相關分子的表達，評估其功能變化。采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）技術檢測腫瘤組織勻漿中干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細胞因子的含量。結果顯示，ADAP基因敲除小鼠腫瘤組織中IFN-γ和TNF-α的含量明顯低于野生型小鼠。這表明ADAP缺失會抑制CD8+T細胞的細胞因子分泌功能。在細胞毒性相關分子的表達方面，通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術檢測發現，ADAP基因敲除小鼠腫瘤組織中穿孔素和顆粒酶B的表達水平顯著降低。這說明ADAP缺失會削弱CD8+T細胞的細胞毒性作用。為了進一步驗證ADAP的作用，還進行了ADAP基因回補實驗。將ADAP基因通過腺病毒載體導入ADAP基因敲除小鼠的CD8+T細胞中，然后將這些細胞回輸到荷瘤小鼠體內。結果顯示，回補ADAP基因后，CD8+T細胞在腫瘤組織中的浸潤數量增加，腫瘤生長速度減緩，轉移受到抑制。這進一步證實了ADAP在調控CD8+T細胞抗腫瘤能力中的重要作用。四、SKAP55對CD8+T細胞抗腫瘤能力的調控機制4.1SKAP55的結構與功能特性SKAP55作為T細胞信號通路中的關鍵分子，其獨特的分子結構決定了它在T細胞信號傳導中具有重要的功能特性。從分子結構上看，SKAP55屬于Pleckstrinhomologydomaincontaining家族，其氨基酸序列具有高度的保守性。它由多個結構域組成，這些結構域在SKAP55的功能發揮中各司其職，協同作用。SKAP55包含一個N末端的卷曲螺旋結構域（coiled-coildomain）。這一結構域由多個α-螺旋相互纏繞形成，具有高度的穩定性。卷曲螺旋結構域在蛋白質-蛋白質相互作用中發揮著重要作用，它能夠介導SKAP55與其他含有卷曲螺旋結構域的蛋白質相互作用，形成穩定的復合物。通過這種相互作用，SKAP55可以被招募到特定的細胞位置，參與信號傳導過程。在T細胞活化過程中，SKAP55的卷曲螺旋結構域可能與一些參與T細胞受體（TCR）信號傳導的分子相互作用，將SKAP55定位到TCR信號復合物附近，從而使其能夠及時響應TCR信號。中間區域是Pleckstrin同源結構域（PHdomain），這是SKAP55的一個標志性結構域。PH結構域能夠特異性地識別并結合磷脂酰肌醇磷酸（PIPs），這種結合特性使得SKAP55能夠與細胞膜上的磷脂分子相互作用。在T細胞活化過程中，細胞膜上的磷脂分子會發生動態變化，SKAP55通過其PH結構域與這些變化的磷脂分子結合，從而實現從細胞質到細胞膜的轉位。這種轉位對于SKAP55參與T細胞信號傳導至關重要，它使得SKAP55能夠在細胞膜上與其他信號分子相互作用，傳遞TCR信號。研究表明，當TCR受到刺激后，細胞膜上的PIPs水平會發生改變，SKAP55的PH結構域能夠感知這種變化，并與之結合，從而將SKAP55招募到細胞膜上，參與后續的信號傳導過程。C末端則是Src同源3結構域（SH3domain），SH3結構域是一種廣泛存在于信號分子中的結構域，它能夠特異性地識別并結合富含脯氨酸的序列。SKAP55的SH3結構域在其與其他信號分子的相互作用中起著關鍵作用。在T細胞信號通路中，SKAP55通過其SH3結構域與ADAP的中央富含脯氨酸的結構域緊密結合，形成穩定的ADAP-SKAP55復合物。這種復合物的形成對于調節SKAP55的功能以及傳遞TCR信號至關重要。ADAP-SKAP55復合物可以進一步招募其他信號分子，如Rap1等小GTP酶，參與T細胞內的信號傳導過程。研究發現，當SKAP55的SH3結構域發生突變，無法與ADAP結合時，T細胞的活化和功能會受到明顯抑制，這充分說明了SH3結構域在SKAP55功能中的重要性。在T細胞信號傳導中，SKAP55具有多種重要的功能特性。它參與TCR介導的信號傳導過程，在TCR識別抗原肽-MHC復合物后，SKAP55迅速被激活，通過與ADAP等分子相互作用，傳遞TCR信號。SKAP55能夠調節整合素的活化，在T細胞與抗原呈遞細胞（APC）相互作用過程中，SKAP55通過調節Rap1等小GTP酶的活性，促進整合素LFA-1的活化，增強T細胞與APC表面配體ICAM-1的結合能力，從而促進T細胞的活化和免疫突觸的形成。SKAP55還參與調節T細胞的細胞骨架重排，它可以與一些參與細胞骨架調節的分子相互作用，如Vav1等，影響肌動蛋白的聚合和細胞骨架的重排，進而影響T細胞的遷移和形態變化。研究表明，在SKAP55缺陷的T細胞中，T細胞的遷移能力明顯下降，這表明SKAP55在調節T細胞遷移中發揮著重要作用。4.2SKAP55調控CD8+T細胞的信號轉導途徑4.2.1SKAP55在T細胞受體信號通路中的作用在T細胞受體（TCR）信號通路中，SKAP55猶如一個關鍵的“信號樞紐”，參與并調節著信號的傳遞過程，對CD8+T細胞的活化和增殖產生著重要影響。當TCR識別抗原肽-MHC復合物后，TCR信號通路迅速啟動，一系列信號分子被依次激活，形成復雜的信號級聯反應。SKAP55在這一過程中與ADAP緊密結合，形成ADAP-SKAP55復合物，該復合物在TCR信號傳導中發揮著關鍵作用。ADAP通過其富含脯氨酸的結構域與SKAP55的SH3結構域特異性結合，二者的結合不僅穩定了彼此的表達，還為招募其他信號分子提供了平臺。當TCR受到刺激后，Lck等激酶被激活，Lck可以磷酸化TCRζ鏈上的免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM）。磷酸化的ITAM招募ZAP-70激酶，ZAP-70被激活后進一步磷酸化下游的銜接蛋白SLP-76。ADAP與SLP-76相互作用，被招募到TCR信號復合物附近。此時，ADAP招募SKAP55，形成穩定的ADAP-SKAP55復合物。研究表明，在ADAP或SKAP55缺陷的T細胞中，TCR刺激后下游信號分子的磷酸化水平明顯降低，TCR信號傳導受阻。ADAP-SKAP55復合物能夠招募小GTP酶Rap1到細胞膜附近，促進Rap1的活化。Rap1在整合素活化過程中起著關鍵作用，它可以促進整合素從低親和力狀態轉變為高親和力狀態。ADAP-SKAP55復合物通過與Rap1相互作用，促進Rap1的鳥苷酸交換，使其從GDP結合狀態轉變為GTP結合狀態?；罨腞ap1能夠與RapL等分子相互作用，RapL與整合素LFA-1的β2亞基結合，從而促進LFA-1的構象變化，增強其與配體ICAM-1的結合能力。這一過程使得T細胞與抗原呈遞細胞（APC）之間的黏附能力增強，為T細胞的活化提供了穩定的相互作用平臺。研究發現，在SKAP55缺陷的T細胞中，Rap1向細胞膜的招募受阻，LFA-1的活化受到抑制，T細胞與APC的黏附能力明顯下降。SKAP55還參與調節TCR介導的基因轉錄過程。在Jurkat細胞中，抗CD3抗體刺激可以促進SKAP55酪氨酸磷酸化，并使其從細胞質轉移到細胞膜。過表達SKAP55能夠誘導白細胞介素-2（IL-2）啟動子的轉錄激活，而突變體SKAP55-Y232F則完全抑制了啟動子的活性。這表明SKAP55在TCR介導的基因轉錄激活中發揮著重要作用。進一步研究發現，過表達SKAP55-Y232F還會導致Fyn的酪氨酸過度磷酸化，同時激酶活性降低。Fyn是Src家族激酶的成員，在TCR信號傳導中起著重要作用。這說明SKAP55可能通過調節Src家族激酶的活性，影響TCR介導的基因轉錄過程。在CD8+T細胞的活化和增殖過程中，SKAP55的作用不可或缺。SKAP55通過參與TCR信號通路，調節整合素的活化和基因轉錄，為CD8+T細胞的活化提供了必要的信號支持。在T細胞活化初期，SKAP55促進T細胞與APC的黏附，使T細胞能夠充分接收抗原信號。隨著活化的進行，SKAP55參與調節IL-2等細胞因子的轉錄和分泌，為CD8+T細胞的增殖提供了必要的生長因子。研究表明，在SKAP55缺陷的CD8+T細胞中，細胞的活化和增殖能力明顯下降，對腫瘤細胞的殺傷能力也顯著減弱。4.2.2SKAP55與PD-1表達調控的關系SKAP55在調控CD8+T細胞表面程序性死亡受體1（PD-1）分子表達的過程中扮演著重要角色，其作用機制涉及多個關鍵分子和復雜的信號轉導過程。研究表明，SKAP55可以通過與ADAP相互作用，上調CD8+T細胞表面PD-1分子的表達。在腫瘤微環境中，CD8+T細胞持續受到腫瘤抗原的刺激，這一過程會導致SKAP55的活化。當CD8+T細胞表面的TCR識別腫瘤抗原肽-MHC復合物后，TCR信號通路被激活，ADAP和SKAP55被招募到TCR信號復合物附近。ADAP與SKAP55結合形成復合物，該復合物進一步與其他信號分子相互作用，激活下游的信號通路。在這一過程中，SKAP55通過與ADAP的相互作用，參與調節轉錄因子的活性，從而影響PD-1基因的轉錄。研究發現，在ADAP和SKAP55缺陷的CD8+T細胞中，PD-1的表達水平明顯降低，這表明ADAP和SKAP55對于PD-1的表達調控至關重要。具體來說，SKAP55可能通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路來調節PD-1的表達。當SKAP55被激活后，它可以招募并激活MAPK信號通路中的關鍵分子，如Raf、MEK和ERK等。激活的ERK可以進入細胞核，磷酸化相關的轉錄因子，如Elk-1等。這些磷酸化的轉錄因子可以與PD-1基因啟動子區域的特定序列結合，促進PD-1基因的轉錄。研究表明，使用MAPK信號通路抑制劑可以顯著降低SKAP55介導的PD-1表達上調。這進一步證實了SKAP55通過MAPK信號通路調節PD-1表達的機制。SKAP55還可能通過調節微小RNA（miRNA）的表達來間接調控PD-1的表達。miRNA是一類非編碼RNA，它們可以通過與靶mRNA的互補配對，抑制mRNA的翻譯過程或促進其降解。研究發現，一些miRNA，如miR-155等，與PD-1的表達調控密切相關。SKAP55可能通過調節miR-155等miRNA的表達，間接影響PD-1的表達。在SKAP55過表達的CD8+T細胞中，miR-155的表達水平升高，而PD-1的表達水平也相應升高。當抑制miR-155的表達時，PD-1的表達水平也會降低。這表明SKAP55可能通過調節miR-155等miRNA的表達，間接調控PD-1的表達。CD8+T細胞表面PD-1分子的高表達對其清除腫瘤的功能具有顯著的抑制作用。PD-1是一種重要的免疫檢查點分子，它與配體程序性死亡配體1（PD-L1）或程序性死亡配體2（PD-L2）結合后，會啟動抑制性信號傳導通路，抑制CD8+T細胞的活化、增殖和細胞毒性。當PD-1與PD-L1或PD-L2結合時，會招募蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2到PD-1的胞內段。SHP-2可以去磷酸化TCR信號通路中的關鍵分子，如ZAP-70和SLP-76等，從而阻斷TCR信號傳導，抑制CD8+T細胞的活化。PD-1信號還可以抑制CD8+T細胞分泌細胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，降低其免疫活性。研究表明，在腫瘤患者中，CD8+T細胞表面PD-1的高表達與腫瘤的進展和不良預后密切相關。通過阻斷PD-1/PD-L1信號通路，可以部分恢復CD8+T細胞的功能，增強其對腫瘤細胞的殺傷能力。4.3SKAP55調控機制的實驗驗證4.3.1細胞水平實驗驗證在細胞水平的實驗中，選用小鼠T細胞系EL4以及原代CD8+T細胞作為研究對象。通過RNA干擾（RNAi）技術，能夠有效降低細胞中SKAP55的表達水平。RNAi技術利用小干擾RNA（siRNA）與SKAP55的mRNA特異性結合，引發mRNA的降解，從而實現對SKAP55基因表達的抑制。將針對SKAP55基因設計的siRNA轉染到EL4細胞和原代CD8+T細胞中，經過一段時間的培養后，利用蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術檢測SKAP55蛋白的表達水平，結果顯示，轉染siRNA的細胞中SKAP55蛋白的表達量顯著降低，表明RNAi技術成功敲低了SKAP55的表達。在TCR信號通路相關實驗中，采用抗CD3抗體刺激細胞，以模擬TCR識別抗原肽-MHC復合物后的激活過程?？笴D3抗體能夠與TCR復合物中的CD3分子結合，激活TCR信號通路。在抗CD3抗體刺激后，檢測細胞內相關信號分子的磷酸化水平，發現敲低SKAP55表達的細胞中，ZAP-70、SLP-76等信號分子的磷酸化水平明顯降低。ZAP-70是TCR信號通路中的關鍵激酶，它在TCR激活后被招募到磷酸化的TCRζ鏈上，進而磷酸化下游的SLP-76。SLP-76則通過與多種信號分子相互作用，傳遞TCR信號。使用免疫共沉淀結合質譜分析技術，檢測ADAP-SKAP55復合物的形成情況，結果顯示，在敲低SKAP55表達的細胞中，ADAP-SKAP55復合物的形成顯著減少。這表明SKAP55的缺失會影響ADAP-SKAP55復合物的形成，進而阻礙TCR信號的傳遞。對于PD-1表達調控的驗證實驗，將細胞在含有腫瘤抗原的條件下培養，以模擬腫瘤微環境中CD8+T細胞受到抗原刺激的情況。通過流式細胞術檢測細胞表面PD-1分子的表達水平，結果顯示，敲低SKAP55表達的CD8+T細胞表面PD-1分子的表達明顯降低。這表明SKAP55在CD8+T細胞表面PD-1分子的表達調控中起著重要作用。為了進一步探究SKAP55調控PD-1表達的分子機制，利用實時熒光定量PCR（qPCR）技術檢測相關轉錄因子和miRNA的表達水平。結果發現，敲低SKAP55表達后，與PD-1表達調控相關的轉錄因子Elk-1的表達水平降低，同時miR-155的表達水平也顯著下降。這表明SKAP55可能通過調節這些轉錄因子和miRNA的表達，間接調控PD-1的表達。為了驗證SKAP55對CD8+T細胞功能的影響，進行了細胞增殖實驗、細胞毒性實驗和細胞因子分泌實驗。在細胞增殖實驗中，采用CCK-8法檢測細胞的增殖情況。結果顯示，敲低SKAP55表達的CD8+T細胞在受到抗原刺激后，其增殖能力明顯受到抑制，與對照組相比，細胞數量的增加幅度較小。在細胞毒性實驗中，采用乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測CD8+T細胞對腫瘤細胞的殺傷能力。結果表明，敲低SKAP55表達的CD8+T細胞對腫瘤細胞的殺傷效率顯著降低。在細胞因子分泌實驗中，采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）技術檢測細胞培養上清中干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細胞因子的含量。結果顯示，敲低SKAP55表達的CD8+T細胞分泌IFN-γ和TNF-α的能力明顯下降。這些結果表明，SKAP55的缺失會顯著影響CD8+T細胞的增殖、細胞毒性和細胞因子分泌等功能。4.3.2動物模型實驗驗證在動物模型實驗中，構建荷瘤小鼠模型是研究SKAP55對CD8+T細胞抗腫瘤