生物分離與純化技術生物分離純化的一般步驟是什么？復習回顧發酵液預處理

初步純化高度純化成品加工目標產物目錄1、預處理概述2、發酵液過濾特性的改變3、發酵液的相對純化4、凝聚與絮凝1預處理概述導入預處理固液分離初步提取高度純化成品加工改善發酵液過濾特性、細胞破碎、過濾、離心分離、膜分離沉淀、吸附、萃取、超濾、結晶重結晶、色譜分離、膜分離濃縮、無菌過濾、干燥、成型藥物分離純化的一般工藝步驟發酵液產品主要內容何為發酵液預處理，目的是什么？預處理的主要任務是什么？主要內容何為發酵液預處理，目的是什么？胞內產物和胞外產物胞外產物：

抗生素、胞外酶、一些多糖、氨基酸等發酵產物。胞內產物：

由基因工程菌產生的大多數蛋白質是在細胞內沉積。一些抗生素和酯類物質包含在細胞內。預處理目的1：將胞內目標產物轉移到溶液中（細胞破碎）主要內容何為發酵液預處理，目的是什么？發酵液的組成水、菌體及碎片、培養基殘渣、金屬離子、雜蛋白、其他雜質何為發酵液預處理，目的是什么？發酵液的組成目標產物水、菌體及碎片、培養基殘渣、金屬離子、雜蛋白、其他雜質顆粒小，可壓縮粘性大影響過濾效率改善過濾特性，去除顆粒性雜質預處理目的何為發酵液預處理，目的是什么？發酵液的組成目標產物水、菌體及碎片、培養基殘渣、金屬離子、雜蛋白、其他雜質影響離子交換效率影響萃取分層去除雜蛋白；去除金屬離子預處理目的2：預處理概述：1、預處理定義：采用物理、化學的方法，使目標產物轉移到溶液中，同時去除發酵液中的金屬離子、懸浮性顆粒雜質，改善溶液的性狀，以利于后續各步操作進行的過程。何為發酵液預處理？預處理概述：2、預處理的目的和作用：1）使目標產物轉移到溶液中；2）去除發酵液中的金屬離子、雜蛋白、懸浮性顆粒雜質；3）改善過濾特性；利于后續各步操作進行的過程。何為發酵液預處理？預處理概述：何為發酵液預處理？1.改善過濾特性；2.去除金屬離子；3.去除雜蛋白；4.使目標產物轉移到溶液中；5.去除懸浮性顆粒雜質；1.改善過濾特性；2.去除金屬離子；3.去除雜蛋白；4.細胞破碎（使目標產物轉移到溶液中）；5.固液分離（過濾、離心）；預處理的目的預處理的主要任務內容小結《現代藥物分離與純化技術》何為發酵液預處理發酵液預處理的目的是什么？預處理的任務？內容小結《現代藥物分離與純化技術》2發酵液過濾特性的改變【學習目標】1.熟悉發酵液過濾特性的改變方法2.掌握發酵液的相對純化方法微生物發酵液的特性發酵產物濃度較低，懸浮液中大部分是水；懸浮物顆粒小，相對密度與液相相差不大；固體粒子可壓縮性大；液相粘度大，大多為非牛頓型流體性質不穩定，隨時間變化，易受空氣氧化、微生物污染等作用影響。成分復雜雜質較多發酵液的特性過濾特性：影響過濾效率的發酵液的性質發酵液的組成不利于過濾的特性利于過濾的特性預處理前的特性：粘度大、顆粒小、密度小、呈穩定的膠體狀態預處理后的特性：粘度小、顆粒大、密度大、不穩定、易沉淀過濾速度慢，濾液質量差。過濾速度快，濾液質量好。水、菌體及碎片、培養基殘渣、金屬離子、雜蛋白、其他雜質發酵液過濾特性的改變改善發酵液過濾特性的方法1、降低液體黏度：濾液通過濾餅的速率與液體的粘度成反比。

2、調整pH：pH直接影響發酵液中某些物質的電離度和電荷性質，適當調節pH可改善過濾特性3、加入反應劑：加入反應劑可和某些可溶性鹽類發生反應生成不溶性沉淀4、加入助濾劑：這是一種不可壓縮的多空微粒，能使濾餅疏松，濾速增大改善發酵液過濾特性的方法——降低液體黏度降低液體黏度常用的方法有加水稀釋法和加熱法（2）加水稀釋法

操作：加水，發酵液被稀釋，流動性變好。注意：加水之后，溶液被稀釋，溶液體積變大，過濾時間加長。適用性：加水一倍，粘度下降大于50%。

后續處理適合稀釋的場合。

改善發酵液過濾特性的方法——降低液體黏度降低液體黏度常用的方法有加水稀釋法和加熱法（2）加熱法（Heating）操作：通過換熱器、通入蒸汽或熱水。適用性：熱穩定的產物。注意：嚴格控制加熱溫度與時間，防止目標產物失活、細胞溶解，增加后續分離的復雜性。例：含麥芽汁12%的發酵液，在40℃時黏度為1.2*10-3Pa.S，溫度升至75℃，濾速可加倍。

改善發酵液過濾特性的方法——調節PH調節pH（RegulationofPH）：發酵工業中發酵液預處理較常用的方法之一操作：加入酸、堿或緩沖溶液原理：pH值改變懸浮物的電荷性質，改變膠體物質的電離度，進而影響膠體穩定性，其中的雜蛋白容易沉淀注意：防止pH導致蛋白質等生物藥物變性。應用：在味精生產中，利用等電點沉淀法提取谷氨酸。（1）反應劑可和某些可溶性鹽類（如CaSO4、CaCl2

、AlPO4等）發生反應生成不溶性沉淀，如新生霉素發酵液中加入氯化鈣和磷酸鈉，生成磷酸鈣沉淀。生成的沉淀能防止菌絲體黏結，使菌絲具有塊狀結構；沉淀本身可作為助濾劑，并且能使膠體物和懸浮物凝固，從而改善過濾性能。（2）若發酵液中含不溶性多糖物質，則最好用酶將其轉化為單糖，提高過濾速率。如萬古霉素用淀粉作培養基，發酵液過濾前先加淀粉酶消化后再加硅藻土助濾劑。（3）正確選擇反應劑和反應條件，能使過濾速率提高3-10倍。改善發酵液過濾特性的方法——加入反應劑加入的反應劑不同，對發酵液的作用也不同，常見的原理有兩種新生霉素發酵液氯化鈣磷酸鈉磷酸鈣沉淀反應劑：氯化鈣和磷酸鈉原理：生成的沉淀起助濾作用，同時使發酵液中蛋白質凝固結塊，將濾速提高3-10倍改善發酵液過濾特性的方法——加入反應劑例：萬古霉素的淀粉發酵液0.025%的淀粉酶

攪拌30min濾速提高5倍加2.5%硅藻土改善發酵液過濾特性的方法——加入反應劑例：淀粉酶：將多糖轉化為溶解度較大的單糖，降低粘度。硅藻土：起助濾作用改善發酵液過濾特性的方法——加入反應劑1）生成的能防止菌絲體黏結的沉淀2）沉淀本身可作為助濾劑3）溶性將多糖轉化為溶解度較大的單糖加入反應劑的原理改善發酵液過濾特性的方法——加入助濾劑加助濾劑（Filteraids）助濾劑：是一種顆粒均勻、質地堅硬、不可壓縮的多孔微粒，能使濾餅疏松，濾速增大。硅藻土有較高的惰性和不溶性，能形成堅硬的不可壓縮的濾餅，是最常用的助濾劑，此外還有纖維素、石棉粉等，最常用的是硅藻土。操作方法：一種是在過濾介質表面預涂助濾劑；另一種是直接加入發酵液；也可兩種方法同時使用內容小結《現代藥物分離與純化技術》發酵液過濾特性改變的方法有：降低液體粘度調整pH加入反應劑加入助濾劑3發酵液的相對純化發酵液的相對純化發酵液的相對純化

1.

高價無機離子的去除（Removalofinorganicion）：在采用離子交換法提取時，會影響樹脂對生化物質的交換容量。2.雜蛋白的去除方法：不僅在采用離子交換和吸附法提取時會降低其交換容量和吸附能力，而且在使用有機溶劑法或雙水相萃取時，易發生乳化現象，使兩相分離不清。常用方法有：?發酵液中的主要無機離子有Ca2+、Mg2+、Fe3+?除去的方法主要是生成沉淀或者絡合物，消除金屬離子對后續分離過程的影響或過濾除去。1）沉淀法；2）變性法；3)吸附法發酵液的相對純化——高價無機離子的去除鈣離子的去除草酸的回收：四環類抗生素廢液硫酸鉛60℃草酸90-95℃，用硫酸分解過濾、冷卻、結晶草酸鉛草酸鈣沉淀（注意回收草酸）Ca2+草酸/草酸納+Ca2+的去除通常使用草酸，但草酸溶解度較小，故用量大時，可用其可溶性鹽（如草酸鈉）。反應生成的草酸鈣還能使蛋白質凝固，改善發酵液的過濾性能。但草酸價格較貴，應注意回收。發酵液的相對純化——高價無機離子的去除鎂離子的去除三聚磷酸鈉鎂(MgNa3P3O10)可溶性絡合物Mg2+三聚磷酸鈉(Na5P3O10)+草酸鎂的溶解度較大，雖然發酵液中Mg2+的濃度一般不是很高，但加入草酸不能除盡Mg2+，可以加入三聚磷酸鈉，它和Mg2+形成可溶性絡合物。用磷酸鹽處理，也能大大降低Mg2+和Ca2+的濃度。發酵液的相對純化——高價無機離子的去除鐵離子的去除：要除去Fe3+，可加入黃血鹽，使形成普魯士藍沉淀。普魯士藍(Fe4[Fe(CN)6]3)沉淀Fe3+黃血鹽(K4Fe(CN)6)+3K4Fe(CN)6+42Fe3+

=Fe4[Fe(CN)6]3↓

+12K+高價無機離子的去除——內容小結《現代藥物分離與純化技術》發酵液中的金屬離子有：Ca2+、Mg2+、Fe3+去除方法：加反應劑使其沉淀發酵液的相對純化——雜蛋白的去除雜蛋白的去除（Removalofuselessprotein）雜蛋白的存在對后續分離的影響：在采用離子交換和吸附法提取時會降低其交換容量和吸附能力；在有機溶劑法或雙水相萃取時，易產生乳化現象，使兩相分離不清；

在常規過濾或膜過濾時，易使過濾介質堵塞或受污染，影響過濾效率。變性、沉淀、與固形物一起除去蛋白質膠粒沉淀變性吸附發酵液的相對純化——雜蛋白的去除雜蛋白的去除方法變性、沉淀、與固形物一起除去蛋白質膠粒沉淀變性吸附1.沉淀法2.變性法3.吸附法發酵液的相對純化——雜蛋白的去除1.雜蛋白去除的方法——沉淀法（蛋白質的兩性）在不同的pH下，蛋白質會帶有不同種類的電荷酸性溶液中，蛋白質帶正電荷，與一些陰離子，如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽、過氯酸鹽等形成沉淀；堿性溶液中，蛋白質帶負電荷，與一些陽離子，如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。1.沉淀法發酵液的相對純化——雜蛋白的去除2.雜蛋白去除的方法——變性法（降低蛋白質的溶解度）加熱（最常用）：加熱不僅使蛋白質變性，同時降低液體粘度，提高過濾速率。如將檸檬酸發酵液加熱至80℃大幅度調節pH值，如將發酵液pH值調至偏酸性或偏堿性范圍加酒精、丙酮等有機溶劑或表面活性劑等加熱法只適合于對熱較穩定的目的產物；極端pH值也會導致某些目的產物失活，且要消耗大量酸堿；有機溶劑易燃易爆，因此有機溶劑法通常只適用于所處理的液體數量較少的場合。不足之處發酵液的相對純化——雜蛋白的去除2.雜蛋白去除的方法——變性法檸檬酸發酵液加熱至80℃濾液黏度降低濾速提高雜蛋白變性凝固例：原理：加熱使蛋白質凝固變性適用性：適用于熱穩定的藥物。要嚴格控制加熱的溫度和時間。發酵液的相對純化——雜蛋白的去除2.雜蛋白去除的方法——變性法

要嚴格控制加熱的溫度和時間抗生素生產pH=2-3濾液黏度降低濾速提高雜蛋白變性凝固例：原理：強酸性環境使蛋白質凝固、變性注意：極端pH值會導致某些目的產物失活，且要消耗大量酸堿。發酵液的相對純化——雜蛋白的去除2.雜蛋白去除的方法——變性法

要嚴格控制加熱的溫度和時間例：原理：加酒精、丙酮等有機溶劑或表面活性劑會使蛋白質變性沉淀。注意：通常只適用于所處理的液體數量較少的場合。核酸抽提氯仿濾液黏度降低濾速提高雜蛋白變性為絮狀發酵液的相對純化——雜蛋白的去除3.雜蛋白去除的方法——吸附法加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白質而除去例：在四環素類抗生素中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協同作用生成亞鐵氰化鋅鉀的膠狀沉淀來吸附蛋白質，此法去蛋白已取得很好的效果。例：在枯草桿菌發酵液中，加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去四環素類抗生素黃血鹽和硫酸鋅濾液吸附蛋白黏度降低濾速提高亞鐵氰化鋅鉀的膠狀沉淀雜蛋白的去除——內容小結《現代藥物分離與純化技術》去除雜蛋白的方法：沉淀法變性法吸附法4凝聚與絮凝【學習目標】1.熟悉凝聚的概念和原理2.掌握凝聚的基本原理和影響因素3.掌握絮凝劑的選擇方法產品開發數據分析市場份額項目名稱系統設置商務交流工作流程產品設計文案交付向懸浮液中加入某種電解質，在電解質的作用下，懸浮液體系不穩定，膠粒間吸引作用加強，相互碰撞而產生聚集的過程，稱為凝聚。凝聚的定義：對象：穩定分散的懸浮液（發酵液）方法：加入電解質目標：聚集、沉淀

結果：發酵液過濾特性改善凝聚技術(coagulation)交付凝聚的作用：凝聚的作用：改善發酵液過濾特性的方法之一。用于菌體細小而且粘度大的發酵液的預處理。凝聚的效果：有效改變懸浮性顆粒雜質的分散狀態，提高過濾效率，提高濾液質量。凝聚技術(coagulation)固液分離發酵液特征：菌體細小、粘稠、呈膠體狀態存在問題：過濾速度慢，濾液質量差交付凝聚的原理--------菌體1、斥力阻止靠近。發酵液中細胞或菌體帶有負電荷，由于靜電引力作用使溶液中帶相反電荷的粒子被吸附在其周圍，在其界面上形成了雙電子層。這種雙電層的結構使膠粒之間不易聚集而保持穩定的分散狀體。2、水化膜阻礙聚沉。多數膠體表面有很多極性基團，易吸附水分子，形成水化層。它既使蛋白溶于水，又可隔離蛋白，使其不易沉淀。--------蛋白質發酵液中膠體顆粒穩定的原因：穩定分散在同電相斥和水化膜的作用下，發酵液中的顆粒處于穩定的懸浮狀態。--------菌體1、水化膜變薄。電解質搶奪顆粒表面的水膜，使水化膜變薄或消失；2、斥力減弱。電解質中和電荷，使膠粒間斥力減弱--------蛋白質

凝聚的原理：電解質（氫氧化鈣）穩定性破壞凝聚技術(coagulation)電解質破壞了膠體的兩個穩定因素，發酵液中的膠體離子產生聚集、沉淀。凝聚劑：FeSO4.7H2O、ZnSO4

、MgCO3、Ca(OH)2或石灰等常用的凝聚電解質有：Al2(SO4)3.18H2O(明礬)、AlCl3.6H2O、FeCl3.6H2O凝聚技術(coagulation)一、凝聚技術(coagulation)凝聚值Cf：使膠粒發生凝聚的最小電解質濃度（mmol/L）稱為凝聚值。電解質的凝聚能力可用凝聚值來表示。一般來說，電解質的凝聚值越小，凝聚能力越強。凝聚能力大小原則：陽離子>陰離子；價數高>價數低；水化半徑小>水化半徑大的。發酵液中膠體粒子的凝聚能力次序：

Al3+>Fe3+

>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+凝聚能力(coagulation)凝聚因素：實驗確定合適的參數：凝聚劑種類；用量；pH、溫度、攪拌時間和強度凝聚技術(coagulation)凝聚效果：可以使得細胞、菌體或蛋白質等凝聚（１mm），沉淀細小，有時不能有效分離。凝聚作用的局限：采用凝聚方法得到的凝聚體，顆粒常常比較細小，有時還不能有效地進行分離。凝聚技術(coagulation)采用絮凝法常可形成粗大的絮凝體，使發酵液較易分離。使用絮凝技術預處理發酵液的優點不僅在于提高固-液分離速度，分離菌體、細胞和細胞碎片等，還在于能有效除去雜蛋白和固體雜質，提高濾液質量。凝聚與絮凝加氧化鈣聚丙烯酰胺模擬實驗用于菌體細小而且粘度大的發酵液的預處理。有效改變懸浮性顆粒雜質的分散狀態，提高過濾效率。凝聚和絮凝技術作用效果類似:凝聚和絮凝技術作用原理不同絮凝技術(flocculation)聚丙烯酰胺指在高分子絮凝劑的作用下，懸浮粒子之間通過架橋作用，使膠粒形成粗大的絮凝團的過程。10mm。

絮凝的定義：絮凝技術(flocculation)用途：用于菌體細小而且粘度大的發酵液的預處理。以改善過濾特性，提高過濾效率和濾液質量。能溶于水的高分子聚合物，分子量可達數萬至千萬以上，它們具有長鏈結構，其鏈節上含有許多活性官能團，可以帶有多價電荷，也可以不帶電性。

絮凝劑：2、活性官能團1、具有長鏈結構絮凝技術(flocculation)例：實驗中的聚丙烯酰胺結構特點

絮凝劑：非離子型根據活性基團在水中解離情況不同，可分為三類：陰離子型（含有羧基）陽離子型（含有胺基）CONH3+絮凝技術(flocculation)CONH3+

絮凝劑：根據來源不同，工業常用絮凝劑分為三類：絮凝技術(flocculation)1）有機高分子聚合物：如聚丙烯酰胺類、聚苯乙烯類。2）無機高分子聚合物：如聚合鋁鹽(PAC)、聚合鐵鹽等。3）天然有機高分子絮凝劑：如淀粉、明膠、殼多糖等；

微生物代謝物。難降解，有些有毒性難操作、難控制、效果差易降解、無毒、發展快優點用量少，一般以mg/L計量；絮凝體粗大，分離效果好；絮凝速度快；種類多，適用范圍廣。缺點存在一定的毒性，特別是陽離子型聚丙烯酰胺，用于食品和醫藥工業時應謹慎。

最常用絮凝劑聚丙烯酰胺類絮凝劑：絮凝技術(flocculation)吸附（靜電引力、范德華力或氫鍵的作用）架橋作用2、活性官能團1、高相對分子量、長鏈、線性結構

絮凝的原理：絮凝技術(flocculation)絮凝劑通過靜電引力、范德華力或氫鍵的作用，強烈地吸附在膠粒地表面，當一個高分子聚合物的許多鏈節分別吸附在不同膠粒表面上產生架橋連接時，就形成了較大的絮團。

絮凝的原理：混合吸附菌體細胞蛋白質絮凝劑不穩定微粒絮凝技術(flocculation)絮凝劑通過靜電引力、范德華力或氫鍵的作用，強烈地吸附在膠粒的表面

絮凝的原理：架橋不穩定微粒不規則絮團絮凝技術(flocculation)當一個高分子聚合物的許多鏈節分別吸附在不同膠粒表面上產生架橋連接時，就形成了較大的絮團。

絮凝的原理：壓縮、重排不規則絮團絮團小球（10mm）（體積增大，聚結、沉降穩定性下降，從發酵液中沉淀出來）絮凝技術(flocculation)

絮凝的原理：絮凝劑在吸附、架橋作用下，沉降穩定性消失，合并為較粗大的絮團。（10mm）。使發酵液過濾特性改善。絮凝技術(flocculation)影響因素1）絮凝劑的結構和性質4）攪拌時間和強度2）絮凝劑的用量5）溫度3）pH絮凝技術(flocculation)1）絮凝劑的結構和性質支鏈結構環狀結構分子量大、長鏈、線性結構且溶解度大利于絮凝小分子鏈狀結構絮凝技術(flocculation)對絮凝劑化學結構的要求：（1）分子必須含有相當多的活性官能團，使之能和膠粒表面相結合；（2）另一方面要求必須具有長鏈的線性結構，以便同時與多個膠粒吸附形成較大的絮團，但相對分子質量不能超過一定的限度，以使其具有良好的溶解性。2）絮凝劑的用量過量絮凝劑絮凝劑過量吸附無空余表面的穩定微粒不可過量絮凝技術(flocculation)若絮凝劑用量過大，每個微粒表面均被絮凝劑分子所飽和，不再有吸附空位，絮凝劑不可能再實現架橋作用，反而，因為空間位阻效應使分散體系穩定。2）絮凝劑的用量絮凝劑的用量存在一個適當的濃度范圍；一般通過實驗確定。淀粉酶發酵液中絮凝劑濃度太小，無法完成吸附、架橋絮凝技術(flocculation)3）pH：pH影響功能團的電離度絮凝劑分子不帶電荷——卷曲狀態H3+絮凝劑分子帶電荷——伸展狀態++影響功能團電離度，分子鏈的伸展度，影響架橋能力絮凝技術(flocculation)根據絮凝劑性質，調至適合活性基團電離的pH，利于絮凝。3）pH：例：發酵液的絮凝過程中，pH=8.4時，濾速最大絮凝技術(flocculation)此時，有利于絮凝效果的pH為8.4，一般通過實驗確定。4）攪拌強度和時間：初期高速，使其均勻分布；接著應延長攪拌時間，降低攪拌速度，利于其成團。同一個顆粒絮凝劑吸附、纏繞再次穩定的碎散絮團碎散絮團絮凝技術(flocculation)攪拌有利于懸浮顆粒與絮凝劑的吸附4）攪拌強度和時間：不規則絮團絮團破裂劇烈、長期攪拌碎散絮團絮凝技術(flocculation)高速攪拌易將絮凝團打碎，影響絮凝效果，所以應采用變速攪拌。即絮凝初期短時間內應高速攪拌，絮凝后期應降低攪拌速度。5）溫度：一般為20～30℃

菌體細胞蛋白質混合溫度升高，絮凝V加快；但高溫影響目標物活性。絮凝技術(flocculation)絮凝劑對膠體分散系的絮凝過程，實質上是“絮凝劑-溶劑-膠體”這三種關系綜合作用的結果。為了提高絮凝效果，就必須根據發酵液中細微懸浮物的性質和濃度，正確地控制絮凝過程的工藝條件。包括：絮凝劑種類、用量、pH、攪拌時間和強度、溫度等。絮凝技術(flocculation)例如：甘油發酵液預處理時，首先選擇合適的絮凝劑，通過實驗，確定適宜的絮凝條件為：pH=5-10，溫度30-40℃，絮凝劑用量0.6-0.8g/L。此時，菌體去除率達100%，濾速提高2.5-4.5倍。絮凝技術(flocculation)例如：對于透明質酸發酵液，實驗發現陰離子型聚丙烯酰胺效果優于殼聚糖。并確定最佳絮凝條件為：絮凝劑