PIRH2表達與宮頸病變相關性研究：從組織分析到臨床價值一、引言1.1研究背景宮頸癌作為全球范圍內嚴重威脅女性健康的重大疾病，一直是醫學領域研究的重點。在我國，每年宮頸癌新發病例約達10萬左右，約占世界總數的1/4，其病死率高，嚴重影響女性的生命質量和壽命。隨著疾病的發展，宮頸癌不僅會對子宮造成嚴重損害，還可能導致癌細胞擴散轉移，累及其他臟器組織，引發多種并發癥，如晚期宮頸癌可侵蝕周圍鄰近器官，壓迫直腸、膀胱、神經，導致糞漏、尿漏、下肢疼痛等，極大地降低患者的生活質量。宮頸病變是一個逐漸發展的過程，主要包括慢性宮頸炎、宮頸上皮內瘤變（CIN）和宮頸癌。慢性宮頸炎是一種常見的婦科炎癥，若長期不愈，可能逐漸發展為CIN。CIN是與宮頸癌密切相關的一組癌前病變，反映了宮頸癌發生發展中的連續過程，根據病變程度可分為CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ，級別越高，發展為浸潤癌的風險越大。若不及時干預，CIN最終可能進展為宮頸癌。PIRH2（p53-inducedRING-H2protein）作為一種重要的蛋白質，在細胞生長、凋亡、DNA損傷修復等過程中發揮著關鍵作用。研究表明，PIRH2可通過泛素-蛋白酶體途徑調節p53蛋白的穩定性和功能，進而影響細胞的生物學行為。在腫瘤發生發展過程中，PIRH2的異常表達可能打破細胞內正常的調控機制，促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移。因此，深入研究PIRH2在宮頸不同病變組織中的表達情況，對于揭示宮頸癌的發病機制、早期診斷及治療具有重要的理論和臨床意義。通過分析PIRH2表達與宮頸病變之間的關系，有望為宮頸癌的防治提供新的靶點和思路。1.2研究目的與意義本研究旨在精準檢測PIRH2在慢性宮頸炎、宮頸上皮內瘤變（CIN）以及宮頸癌等不同宮頸病變組織中的表達情況。通過系統分析PIRH2表達與宮頸上皮內瘤變、宮頸癌及其各項臨床病理參數（如腫瘤分期、病理分級、淋巴結轉移等）之間的關系，初步探討PIRH2在宮頸病變發生、發展過程中的臨床意義。宮頸癌的早期診斷和有效治療一直是婦科領域的難點與重點。目前臨床上對于宮頸癌的診斷主要依賴于宮頸細胞學檢查、HPV檢測及組織病理學檢查，但這些方法存在一定的局限性，如假陰性率較高、對早期病變的敏感度不足等。而尋找新的生物標志物對于提高宮頸癌的早期診斷率、改善患者預后具有重要意義。PIRH2作為一種與腫瘤發生發展密切相關的蛋白，其在宮頸病變中的作用機制尚未完全明確。深入研究PIRH2在宮頸不同病變組織中的表達變化，有助于進一步揭示宮頸癌的發病機制，為宮頸癌的早期診斷、病情監測及治療提供新的靶點和理論依據。同時，明確PIRH2與臨床病理參數的關系，能夠幫助醫生更準確地評估患者的病情和預后，制定更個性化的治療方案，從而提高患者的生存率和生活質量，具有重要的臨床應用價值。二、宮頸病變概述2.1宮頸病變分類宮頸病變根據其性質主要分為良性病變和惡性病變，不同類型的病變在臨床表現、病理特征以及對患者健康的影響等方面存在顯著差異。2.1.1良性病變良性宮頸病變在臨床上較為常見，主要包括急性宮頸炎和慢性宮頸炎。急性宮頸炎是一種常見的女性下生殖道炎癥，多由病原體感染引起，如淋病奈瑟菌、沙眼衣原體等。其主要癥狀表現為陰道分泌物增多，呈黏液膿性，常伴有異味，這是由于炎癥刺激導致宮頸腺體分泌亢進。分泌物的刺激還可引發外陰瘙癢及灼熱感，給患者帶來不適。部分患者可能出現陰道出血，多表現為月經間期出血或性交后出血，這與宮頸黏膜在炎癥狀態下變得脆弱，容易受損出血有關。當合并尿路感染時，還會出現尿頻、尿急、尿痛等癥狀，嚴重影響患者的日常生活。在婦科檢查中，可觀察到宮頸充血、水腫，質地脆弱，觸之易出血，這直觀地反映了宮頸的急性炎癥狀態。如果不及時治療，急性宮頸炎可能遷延不愈，發展為慢性宮頸炎，或上行感染引發子宮內膜炎、盆腔炎等更為嚴重的疾病，對女性生殖系統健康造成更大威脅。慢性宮頸炎相對更為常見，多數患者無明顯癥狀，少數人會出現一系列臨床表現。白帶增多是較為突出的癥狀之一，對于宮頸肥大、宮頸納氏囊腫患者，宮頸分泌物會增多，若伴有感染，白帶還會出現腥臭味，影響患者的生活質量。部分宮頸特別肥大的患者，會因壓迫腰骶部韌帶和神經，出現腰骶部酸脹、疼痛，給患者帶來身體上的痛苦。當慢性宮頸炎導致宮頸長出息肉時，會出現不規則陰道出血，尤其是在同房后，這種出血情況不僅會引起患者的恐慌，還可能提示病情的進一步發展。在婦科檢查中，除了能發現宮頸肥大、宮頸口有分泌物覆蓋外，部分患者的宮頸還會呈現糜爛樣改變，甚至出現接觸性出血。慢性宮頸炎若長期不愈，炎癥的持續刺激可能會導致宮頸組織發生一系列病理變化，雖然其本身為良性病變，但長期存在會增加宮頸癌的發病風險，因此需要患者定期進行檢查和適當治療，以防止病情惡化。2.1.2惡性病變宮頸惡性病變主要指宮頸癌及癌前病變，其中宮頸癌前病變既往被稱為子宮頸上皮內瘤變（CIN），包括宮頸不典型增生和宮頸原位癌，宮頸不典型增生又分為輕度不典型增生（CINⅠ）、中度不典型增生（CINⅡ）、重度不典型增生（CINⅢ）。這些病變具有發展成為惡性腫瘤的潛能，若不及時干預，長期存在有可能轉變為宮頸癌。CIN的發生主要與高危型人乳頭瘤病毒（HPV）的持續感染密切相關，此外，吸煙、長期使用避孕藥、免疫力低下、多產以及多個性伴侶等因素也會增加發病風險。大多數CIN患者幾乎沒有明顯癥狀，通常是在體檢時通過宮頸細胞學涂片（Papsmear）和HPV檢測等篩查手段發現。一旦發展為宮頸癌，患者會出現一系列明顯癥狀，最常見的是不正常的陰道流血，如接觸性出血（性生活或婦科檢查后出血）、不規則陰道出血、絕經后陰道出血等。陰道排液也會增多，液體可為白色或血性，稀薄如水樣或米泔狀，有腥臭味，這是由于癌組織壞死伴感染所致。隨著病情進展，腫瘤侵犯周圍組織和器官，會引發一系列嚴重的并發癥，如侵犯膀胱可出現尿頻、尿急、尿痛、血尿；侵犯直腸可出現里急后重、便血、便秘；侵犯神經可導致下肢疼痛、坐骨神經痛等，極大地影響患者的生活質量和生命健康。宮頸癌的始發部位多在宮頸陰道部鱗狀上皮和宮頸管狀上皮的交界處，在致癌物因素（如高危型HPV持續感染）的刺激下，宮頸鱗狀上皮基底細胞增生活躍，分化不良，逐漸形成宮頸上皮不典型增生。從不典型增生可逐漸發展為原位癌，進而發展為早期浸潤癌和浸潤癌。從不典型增生發展到浸潤癌是一個緩慢而漸進的過程，通常需要8-10年的時間，但一旦形成浸潤癌，腫瘤生長則迅速，如果不能及時治療，患者可在2-5年內死亡。因此，對于宮頸惡性病變，早期發現、早期診斷和早期治療至關重要，這可以有效提高患者的生存率和生活質量。2.2宮頸病變的診斷方法宮頸病變的準確診斷對于及時治療和改善患者預后至關重要。目前臨床上常用的診斷方法涵蓋宮頸細胞學檢查、HPV檢測、陰道鏡檢查及宮頸活檢等，這些方法各有其獨特的原理和應用價值，在宮頸病變的診斷過程中相互補充。宮頸細胞學檢查是宮頸病變篩查的重要手段之一，其中最具代表性的是液基薄層細胞檢測（TCT）。其原理是利用特制的宮頸刷在宮頸表面和宮頸管內采集細胞，然后將采集到的細胞放入裝有細胞保存液的小瓶中，通過一系列處理，使細胞均勻分散在玻片上，在顯微鏡下進行觀察。通過對宮頸細胞形態、結構等特征的分析，能夠判斷細胞是否存在異常，如是否出現核增大、核深染、細胞排列紊亂等不典型增生或癌細胞的特征。TCT檢查具有較高的準確性和敏感性，可檢測出大部分的宮頸上皮內瘤變和早期宮頸癌，能夠有效發現宮頸細胞的異常變化，為進一步的診斷和治療提供重要線索。然而，TCT檢查也存在一定局限性，例如受取材、制片質量以及閱片醫生經驗等因素影響，可能出現假陰性或假陽性結果。HPV檢測是基于檢測人乳頭瘤病毒（HPV）的方法，其原理是利用特定的核酸檢測技術，如聚合酶鏈式反應（PCR）及其衍生技術、雜交捕獲技術等，檢測宮頸樣本中是否存在HPVDNA或RNA。HPV分為高危型和低危型，高危型HPV的持續感染是宮頸病變尤其是宮頸癌發生的主要危險因素。通過檢測HPV的型別和病毒載量，能夠評估患者發生宮頸病變的風險。若檢測出高危型HPV陽性，提示患者可能存在宮頸病變，需要進一步進行陰道鏡檢查或其他相關檢查以明確診斷。HPV檢測在宮頸病變篩查中具有重要作用，其敏感性高，可檢測出潛在的HPV感染，有助于早期發現宮頸病變的高危人群。但該檢測也存在一定問題，如HPV感染較為普遍，多數為一過性感染，并非所有HPV陽性者都會發展為宮頸病變，因此單獨依靠HPV檢測可能導致過度診斷和不必要的進一步檢查。陰道鏡檢查是一種將宮頸放大觀察的檢查方法，其原理是利用陰道鏡的光學系統，將宮頸局部組織放大10-40倍，直接觀察宮頸表面的形態和血管情況。在檢查過程中，通常會使用醋酸和碘溶液對宮頸進行染色，正常宮頸上皮在醋酸作用下不會出現明顯變化，而異常上皮（如病變組織）會出現變白、增厚等改變；正常宮頸鱗狀上皮富含糖原，遇碘后會被染成棕色或深褐色，而病變組織因缺乏糖原，不著色，呈現碘陰性區。通過這些特征變化，醫生可以初步判斷宮頸是否存在病變，并確定病變的部位和范圍。陰道鏡檢查能夠直觀地觀察宮頸病變的形態學特征，對于宮頸細胞學檢查或HPV檢測異常者，陰道鏡檢查可幫助確定是否需要進行活檢以及指導活檢部位的選擇，提高活檢的準確性。不過，陰道鏡檢查結果受檢查者經驗、病變部位隱匿程度等因素影響，存在一定的主觀性，且對于微小病變可能漏診。宮頸活檢是確診宮頸病變的金標準，即在陰道鏡的指引下，用活檢鉗在宮頸可疑病變部位取組織進行病理檢查。通過對活檢組織進行切片、染色等處理，在顯微鏡下觀察組織細胞的形態、結構、排列等特征，以明確病變的性質、類型和程度，判斷是否存在宮頸上皮內瘤變、宮頸癌等病變。宮頸活檢能夠提供最為準確的病理診斷結果，為后續治療方案的制定提供可靠依據。但活檢屬于有創檢查，可能會給患者帶來一定的不適和風險，如出血、感染等，且活檢部位的選擇可能影響診斷結果，若未能取到病變組織，可能導致漏診。三、PIRH2相關理論3.1PIRH2的結構與功能PIRH2，全稱為p53-inducedRING-H2protein，其基因位于人類染色體1q32.1區域。從結構上看，PIRH2蛋白包含多個重要結構域。它擁有一個RING-H2結構域，該結構域由大約40-60個氨基酸組成，富含半胱氨酸（Cys）和組氨酸（His）殘基，這些氨基酸通過特定的空間排列形成了鋅指結構。RING-H2結構域是PIRH2發揮泛素連接酶（E3）活性的關鍵結構基礎，其獨特的空間構象能夠特異性地識別并結合底物蛋白以及E2泛素結合酶，在泛素-蛋白酶體途徑中起著核心作用。除了RING-H2結構域，PIRH2還包含其他功能相關的結構區域。例如，其N端和C端的一些氨基酸序列參與了蛋白質-蛋白質相互作用，通過與其他蛋白的結合，調節PIRH2的活性、穩定性以及亞細胞定位等。這些結構域之間相互協作，共同維持PIRH2的正常功能。在細胞的正常生理活動中，PIRH2扮演著至關重要的角色。PIRH2最為關鍵的功能之一是通過泛素-蛋白酶體途徑調節p53蛋白的穩定性和功能。正常情況下，當細胞處于穩態時，PIRH2與p53蛋白相互作用。PIRH2利用其RING-H2結構域招募E2泛素結合酶，將泛素分子連接到p53蛋白上。泛素化修飾后的p53蛋白被蛋白酶體識別并降解，從而維持細胞內p53蛋白的低水平狀態。這種調節機制對于細胞正常生長和發育至關重要，它能夠防止p53蛋白過度積累，避免因p53異常激活而引發的細胞周期阻滯、凋亡等過度應激反應，確保細胞的正常增殖和分化。當細胞受到DNA損傷、氧化應激等外界刺激時，p53蛋白會被激活。激活后的p53蛋白可以上調PIRH2基因的轉錄表達，使細胞內PIRH2蛋白水平升高。然而，此時升高的PIRH2并非進一步降解p53，而是與p53形成一種動態平衡。一方面，PIRH2通過對p53的適度泛素化修飾，調節p53蛋白的活性和穩定性，使其能夠更好地發揮轉錄激活功能，啟動一系列與細胞周期阻滯、DNA損傷修復、細胞凋亡相關基因的表達。另一方面，PIRH2也參與了p53蛋白的周轉過程，避免p53蛋白持續過度激活對細胞造成不可逆的損傷。例如，在DNA損傷修復過程中，PIRH2協助p53調控相關修復基因的表達，促進損傷DNA的修復，使細胞恢復正常生理狀態。當損傷過于嚴重無法修復時，PIRH2參與的p53調節機制則促使細胞走向凋亡，以清除受損細胞，維持組織和機體的正常功能。PIRH2還在細胞周期調控中發揮作用。它可以通過與細胞周期相關蛋白相互作用，影響細胞周期進程。研究發現，PIRH2能夠調節一些與細胞周期檢查點相關蛋白的穩定性和功能，確保細胞在不同階段的有序過渡。在G1/S期轉換過程中，PIRH2通過對某些關鍵蛋白的泛素化降解，促進細胞順利進入S期進行DNA合成。在細胞周期的其他階段，PIRH2也通過類似的機制維持細胞周期的正常運轉，保證細胞分裂的準確性和穩定性。3.2PIRH2與腫瘤的關系在多種腫瘤的研究中，PIRH2呈現出異常表達的特征，這一現象與腫瘤的發生發展存在緊密關聯。在乳腺癌中，相關研究表明，PIRH2的表達水平明顯上調。免疫組織化學檢測顯示，乳腺癌組織中PIRH2陽性表達率顯著高于癌旁正常組織。進一步研究發現，PIRH2高表達與乳腺癌的組織學分級、淋巴結轉移密切相關。高表達的PIRH2通過泛素-蛋白酶體途徑降解p53蛋白，使p53的腫瘤抑制功能受到抑制，從而促進乳腺癌細胞的增殖、侵襲和轉移。在體外細胞實驗中，抑制PIRH2的表達能夠顯著降低乳腺癌細胞的增殖能力，誘導細胞凋亡，并抑制細胞的遷移和侵襲能力。這充分表明PIRH2在乳腺癌的發生發展過程中發揮著重要的促進作用。在肺癌領域，研究同樣揭示了PIRH2的異常表達。在非小細胞肺癌組織中，PIRH2的表達水平顯著高于正常肺組織，且其表達與腫瘤的TNM分期、淋巴結轉移以及患者的不良預后密切相關。PIRH2通過調控p53信號通路，影響肺癌細胞的周期進程和凋亡。具體而言，PIRH2高表達促使細胞周期蛋白CyclinD1表達上調，加速細胞從G1期進入S期，促進細胞增殖。同時，PIRH2抑制p53介導的凋亡相關基因Bax的表達，增強抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而抑制肺癌細胞的凋亡，使得腫瘤細胞能夠持續增殖并逃避機體的免疫監視。在肝癌研究中，PIRH2的異常表達也不容忽視。肝癌組織中PIRH2的表達明顯高于癌旁正常肝組織，并且PIRH2的高表達與肝癌的惡性程度、腫瘤大小、血管侵犯以及患者的術后復發密切相關。機制研究發現，PIRH2除了通過降解p53蛋白發揮作用外，還能夠與其他信號通路分子相互作用。例如，PIRH2可以調節PI3K/AKT信號通路，激活該通路下游的mTOR等分子，促進肝癌細胞的蛋白質合成、代謝重編程以及細胞存活和增殖。在動物實驗中，沉默PIRH2基因能夠顯著抑制肝癌細胞在裸鼠體內的成瘤能力，減少腫瘤的生長速度和體積。PIRH2在腫瘤發生發展過程中，主要通過泛素-蛋白酶體途徑降解p53蛋白來發揮作用。正常情況下，p53蛋白作為一種重要的腫瘤抑制因子，能夠在細胞受到DNA損傷、氧化應激等刺激時被激活。激活后的p53蛋白通過一系列分子機制，如誘導細胞周期阻滯相關基因p21的表達，使細胞停滯在G1期，為DNA修復提供時間；激活凋亡相關基因Bax等，誘導細胞凋亡，從而防止受損細胞發生惡性轉化。而PIRH2作為一種E3泛素連接酶，能夠特異性地識別p53蛋白，并招募E2泛素結合酶，將泛素分子連接到p53蛋白上。泛素化修飾后的p53蛋白被蛋白酶體識別并降解，導致細胞內p53蛋白水平降低，無法有效發揮其腫瘤抑制功能。腫瘤細胞得以逃脫p53的監控，持續增殖并獲得侵襲和轉移能力。PIRH2還可以通過其他途徑影響腫瘤的發生發展。它可以調節細胞周期相關蛋白的穩定性和功能，影響細胞周期進程。PIRH2能夠促進CyclinD1等細胞周期蛋白的表達，加速細胞周期的進程，促進細胞增殖。PIRH2還參與了腫瘤細胞的代謝重編程過程。在腫瘤細胞中，PIRH2可以調節一些代謝相關基因的表達，促進腫瘤細胞對葡萄糖、氨基酸等營養物質的攝取和利用，滿足腫瘤細胞快速增殖的能量需求。PIRH2在腫瘤血管生成方面也發揮著一定作用。它可以通過調節血管內皮生長因子（VEGF）等血管生成相關因子的表達和信號通路，促進腫瘤血管的生成，為腫瘤的生長和轉移提供充足的營養供應。四、研究設計與方法4.1研究對象選取本研究樣本來源于[具體醫院名稱]婦產科在[具體時間段]收治的患者。納入標準如下：所有患者均經組織病理學檢查確診為宮頸病變，包括慢性宮頸炎、宮頸上皮內瘤變（CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ）以及宮頸癌；患者在術前均未接受過放療、化療、免疫治療等可能影響PIRH2表達的治療措施；患者年齡范圍為[最小年齡]-[最大年齡]，且臨床病理資料完整，能夠配合后續的隨訪調查。最終納入研究的患者共[樣本總量]例，其中慢性宮頸炎患者[X1]例，宮頸上皮內瘤變患者[X2]例（CINⅠ[X21]例、CINⅡ[X22]例、CINⅢ[X23]例），宮頸癌患者[X3]例。在宮頸癌患者中，按照國際婦產科聯盟（FIGO）2018分期標準，Ⅰ期患者[X31]例，Ⅱ期患者[X32]例，Ⅲ期及以上患者[X33]例；按照病理類型，鱗狀細胞癌[X3a]例，腺癌[X3b]例，其他類型癌[X3c]例；根據病理分級，高分化癌[X3d]例，中分化癌[X3e]例，低分化癌[X3f]例。此外，收集患者的年齡、孕產次、HPV感染情況、吸煙史等臨床資料，用于后續的相關性分析。通過嚴格篩選研究對象，確保了樣本的同質性和代表性，為準確分析PIRH2在宮頸不同病變組織中的表達及臨床意義奠定了堅實基礎。4.2實驗方法4.2.1免疫組織化學S-P法檢測PIRH2表達免疫組織化學S-P法（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法）的原理基于抗原抗體特異性結合。其具體原理為，首先利用從鏈霉菌中提取的鏈霉親和素，它對生物素分子具有極高的親和力，是一般抗原抗體親和力的一百萬倍。鏈霉親和素等電點接近中性（IP=6.0-6.5），對組織和細胞的非特異吸附很低。實驗時，先將組織切片進行脫蠟、水化處理，使組織中的抗原暴露。然后通過3%H?O?去離子水孵育10min，以滅活內源性過氧化物酶活性，避免其對后續顯色反應產生干擾。接著進行抗原修復，將切片置于0.01M枸櫞酸緩沖液（PH6.0）中，用煮沸（95℃，15-20min）的方式，使抗原決定簇重新暴露，增強抗原與抗體的結合能力。自然冷卻20min以上后，用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫。之后滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20min，以封閉非特異性結合位點，減少背景染色。甩去多余液體后，滴加針對PIRH2的一抗，室溫靜置1h，或者37℃1h，或者4℃過夜（需在37℃復溫45min），一抗能夠特異性地識別并結合組織中的PIRH2抗原。PBS沖洗2-3次，每次5min后，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫靜置1h，或37℃1h，二抗可以與一抗特異性結合，從而形成抗原-一抗-二抗復合物。再次PBS沖洗2-3次，每次5min后，滴加SP（鏈霉親和素-過氧化物酶），室溫或37℃孵育30min-1h，SP中的鏈霉親和素與二抗上的生物素結合，形成穩定的復合物，同時由于SP中含有大量的過氧化物酶，為后續的顯色反應提供了足夠的催化活性。最后進行DAB顯色5-10min，在顯微鏡下掌握染色程度，DAB在過氧化物酶的催化作用下，發生氧化還原反應，生成棕黃色的不溶性產物，從而使含有PIRH2抗原的部位呈現出棕黃色，便于在顯微鏡下觀察和判斷。操作步驟如下：首先進行切片處理，將收集的宮頸病變組織標本進行常規石蠟包埋，制成4μm厚的切片。脫蠟前應將組織芯片在室溫中放置60min，或60℃恒溫箱中烘烤20min，后用二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）浸泡，共25min進行脫蠟。接著進行水化，依次用無水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各2min，下行至95%、80%、70%酒精（Ⅰ）（Ⅱ）各2min。隨后用PBS沖洗2-3次，每次5min。之后進行阻斷，用3%H?O?去離子水孵育10min，以滅活內源性過氧化物酶活性。再次PBS沖洗2-3次，每次5min后，進行抗原修復，將切片置0.01M枸櫞酸緩沖液（PH6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷卻20min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫。接著PBS沖洗2-3次，每次5min，然后滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20min，甩去多余液體。滴加針對PIRH2的一抗50μl，室溫靜置1h，或者37℃1h，或者4℃過夜（需在37℃復溫45min）。PBS沖洗2-3次，每次5min后，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗40-50μl，室溫靜置1h，或37℃1h。再PBS沖洗2-3次，每次5min，滴加SP（鏈霉親和素-過氧化物酶），室溫或37℃孵育30min-1h。PBS沖洗2-3次，每次5min后，進行DAB顯色5-10min，在顯微鏡下掌握染色程度。顯色結束后，自來水沖洗10分鐘終止反應。然后進行復染，用蘇木精復染2min，鹽酸酒精分化。最后自來水沖洗10-15min，進行常規脫水、透明、封片（用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上），以便在顯微鏡下觀察。在實驗過程中，有諸多注意事項。組織切片的質量至關重要，切片應完整、無褶皺，厚度均勻，以保證抗原的均勻暴露和抗體的充分結合。脫蠟和水化步驟必須充分，否則會影響后續試劑的滲透和反應。抗原修復時，要嚴格控制溫度和時間，溫度過高或時間過長可能導致抗原破壞，溫度過低或時間過短則抗原修復不充分，影響檢測結果。一抗和二抗的選擇應具有高特異性和親和力，且需根據說明書進行適當稀釋，稀釋度過高可能導致信號減弱，稀釋度過低則可能產生非特異性染色。孵育過程中要保持切片的濕潤，避免干涸，否則會導致背景染色加深。DAB顯色時，要在顯微鏡下密切觀察染色程度，避免顯色過度或不足。復染時也要注意控制時間，蘇木精復染時間過長會使細胞核染色過深，影響對陽性信號的觀察。4.2.2臨床病理參數收集臨床病理參數的收集內容涵蓋患者的基本信息、疾病相關信息以及治療相關信息。患者基本信息包括年齡、性別、孕產次、吸煙史等。年齡是一個重要的因素，不同年齡段的患者，其宮頸病變的發生風險和類型可能存在差異。例如，年輕女性可能更多地出現宮頸上皮內瘤變，而老年女性患宮頸癌的風險相對較高。性別信息雖然在本研究中均為女性，但在對比其他疾病或人群研究時，可作為參考因素。孕產次與宮頸病變的關系密切，多次妊娠和分娩可能對宮頸組織造成損傷，增加宮頸病變的發生幾率。吸煙史也是一個不可忽視的因素，研究表明，吸煙會降低機體免疫力，影響宮頸局部的微環境，從而增加HPV感染的風險，進而促進宮頸病變的發展。疾病相關信息主要有HPV感染情況、宮頸病變類型（慢性宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌）、腫瘤分期（按照國際婦產科聯盟（FIGO）2018分期標準）、病理類型（鱗狀細胞癌、腺癌、其他類型癌）、病理分級（高分化、中分化、低分化）等。HPV感染是宮頸病變發生的主要危險因素，不同型別的HPV感染與宮頸病變的嚴重程度和發展趨勢相關。明確宮頸病變類型對于研究PIRH2在不同病變階段的表達變化至關重要。腫瘤分期反映了腫瘤的發展程度，早期腫瘤和晚期腫瘤在生物學行為和治療策略上存在顯著差異。病理類型和分級則直接關系到腫瘤的惡性程度和預后，不同病理類型的宮頸癌，其PIRH2的表達模式可能不同，病理分級越高，腫瘤的惡性程度越高，PIRH2的表達可能也會發生相應變化。這些臨床病理參數的收集方式主要通過查閱患者的住院病歷。在病歷中，詳細記錄了患者的各項檢查結果、診斷信息以及治療過程。對于HPV感染情況，通過患者的HPV檢測報告獲取，檢測方法通常采用聚合酶鏈式反應（PCR）及其衍生技術、雜交捕獲技術等。宮頸病變類型、腫瘤分期、病理類型和分級等信息則依據患者的宮頸活檢或手術切除標本的病理診斷報告。對于一些病歷中記錄不完整的信息，如患者的吸煙史等，通過電話隨訪或門診復診時與患者進行溝通詢問，以確保收集到的臨床病理參數準確、完整。4.3數據統計分析本研究使用SPSS26.0統計軟件進行數據分析，確保分析過程的準確性和規范性。對于計量資料，若數據滿足正態分布，采用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA）。若數據不滿足正態分布，則采用中位數（四分位數間距）[M（P25，P75）]表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗。計數資料以例數（百分比）[n（%）]表示，兩組間比較采用χ2檢驗，當理論頻數小于5時，采用Fisher確切概率法。等級資料采用Kruskal-WallisH檢驗進行多組間比較，若有差異，進一步采用Nemenyi法進行兩兩比較。在相關性分析方面，若兩變量均為正態分布的計量資料，采用Pearson相關分析；若其中一個變量為非正態分布或等級資料，采用Spearman秩相關分析。通過這些方法分析PIRH2表達與臨床病理參數之間的相關性，以明確PIRH2在宮頸病變中的作用機制。以P<0.05作為判斷差異具有統計學意義的標準，若P值小于0.05，則認為兩組或多組之間的差異具有統計學意義，提示所研究的因素之間可能存在關聯或差異。在進行數據分析時，嚴格按照上述統計方法和標準進行操作，以確保研究結果的可靠性和科學性。五、實驗結果5.1PIRH2在不同宮頸病變組織中的表達情況利用免疫組織化學S-P法對慢性宮頸炎、CIN、宮頸癌組織進行檢測，結果顯示PIRH2在不同宮頸病變組織中的陽性表達率存在顯著差異。在慢性宮頸炎組織中，PIRH2陽性表達率為0%，這表明在正常的宮頸組織或炎癥狀態下，PIRH2幾乎不表達。隨著病變程度的加重，在CINⅠ組中，PIRH2陽性表達率為18.75%，相較于慢性宮頸炎組，PIRH2開始出現表達，但表達水平相對較低。CINⅡ-Ⅲ組中，PIRH2陽性表達率顯著升高至59.26%，提示在中高級別宮頸上皮內瘤變階段，PIRH2的表達明顯增強。而在宮頸癌組織中，PIRH2陽性表達率進一步上升至68.49%，達到最高水平。經Kruskal-WallisH檢驗，四組之間PIRH2表達差異具有統計學意義（P=0.000，P＜0.05），表明PIRH2表達與宮頸病變的嚴重程度密切相關，呈現出隨著宮頸病變由慢性宮頸炎向CIN及宮頸癌進展，PIRH2陽性表達率逐漸升高的趨勢。這種表達趨勢變化暗示PIRH2可能在宮頸病變的發生、發展過程中發揮重要作用。5.2PIRH2表達與宮頸癌臨床病理參數的關系5.2.1與臨床分期的關系在宮頸癌患者中，按照國際婦產科聯盟（FIGO）2018分期標準，將患者分為Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期及以上。通過免疫組織化學檢測分析PIRH2在不同分期中的表達情況，結果顯示，PIRH2在Ⅰ期宮頸癌組織中的陽性表達率為63.33%。隨著臨床分期的進展，在Ⅱ期宮頸癌組織中，PIRH2陽性表達率升高至68.97%。在Ⅲ期及以上的宮頸癌組織中，PIRH2陽性表達率進一步上升至76.92%。雖然從數據上看，PIRH2陽性表達率呈現出隨著臨床分期升高而上升的趨勢，但經統計學分析，采用Kruskal-WallisH檢驗，三組之間PIRH2表達差異無統計學意義（P=0.601，P＞0.05）。這可能是由于本研究樣本量相對有限，未能充分揭示PIRH2表達與臨床分期之間的真實關系。也有可能是宮頸癌的發生發展是一個復雜的多因素過程，除了PIRH2表達外，還涉及其他多種基因和信號通路的相互作用，從而掩蓋了PIRH2表達與臨床分期之間可能存在的關聯。5.2.2與病理學分級的關系根據腫瘤細胞的分化程度，將宮頸癌組織分為高分化、中分化和低分化三組。免疫組織化學檢測結果表明，PIRH2在高分化宮頸癌組織中的陽性表達率為54.55%。在中分化宮頸癌組織中，PIRH2陽性表達率顯著升高至75.00%。而在低分化宮頸癌組織中，PIRH2陽性表達率進一步升高，達到87.57%。經Kruskal-WallisH檢驗，三組之間PIRH2表達差異具有統計學意義（P=0.049，P＜0.05）。這一結果說明PIRH2表達與宮頸癌的病理學分級密切相關，隨著腫瘤細胞分化程度的降低，即惡性程度的增加，PIRH2的表達水平顯著升高。PIRH2可能在宮頸癌的惡性進展過程中發揮重要作用，其高表達可能促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移能力，降低腫瘤細胞的分化程度，從而影響宮頸癌的生物學行為和預后。5.2.3與淋巴轉移的關系對宮頸癌患者的淋巴結轉移情況進行分析，將其分為淋巴結陽性組和淋巴結陰性組。通過免疫組織化學檢測PIRH2在兩組中的表達，結果顯示，在淋巴結陽性的宮頸癌組織中，PIRH2陽性表達率高達92.85%。而在淋巴結陰性的宮頸癌組織中，PIRH2陽性表達率為62.71%。經統計學分析，采用χ2檢驗，兩組之間PIRH2表達差異具有統計學意義（P=0.020，P＜0.05）。這表明PIRH2表達與宮頸癌的淋巴轉移密切相關，PIRH2高表達可能促進宮頸癌的淋巴轉移。PIRH2可能通過調節某些與腫瘤轉移相關的分子和信號通路，如上皮-間質轉化（EMT）相關蛋白、基質金屬蛋白酶（MMPs）等，增強腫瘤細胞的侵襲能力，使其更容易突破基底膜，進入淋巴管，從而發生淋巴轉移。5.2.4與病理類型的關系在本研究的宮頸癌患者中，病理類型主要包括鱗狀細胞癌和腺癌。免疫組織化學檢測結果顯示，PIRH2在宮頸鱗癌組織中的陽性表達率為67.18%。在宮頸腺癌組織中，PIRH2陽性表達率為77.78%。雖然從數據上看，宮頸腺癌中PIRH2陽性表達率略高于宮頸鱗癌，但經統計學分析，采用χ2檢驗，兩組之間PIRH2表達差異無統計學意義（P=0.525，P＞0.05）。這說明在本研究中，PIRH2表達與宮頸癌的病理類型之間沒有明顯的相關性。然而，由于宮頸腺癌的發病率相對較低，本研究中宮頸腺癌的樣本量相對較少，可能影響了結果的準確性。未來需要進一步擴大樣本量，深入研究PIRH2在不同病理類型宮頸癌中的表達差異及其機制，以更準確地評估PIRH2在不同類型宮頸癌發生發展中的作用。六、結果討論6.1PIRH2表達與宮頸病變發生發展的關系本研究結果顯示，PIRH2在慢性宮頸炎組織中無表達，而在CIN及宮頸癌組織中表達逐漸升高，這一表達趨勢揭示了PIRH2與宮頸病變發生發展之間的緊密聯系。從分子機制層面來看，PIRH2作為一種E3泛素連接酶，主要通過泛素-蛋白酶體途徑對p53蛋白進行降解。在正常的宮頸組織或慢性宮頸炎階段，細胞內的調控機制處于相對穩定狀態，PIRH2的低表達使得p53蛋白能夠正常發揮其腫瘤抑制功能。p53蛋白可以在細胞受到DNA損傷、氧化應激等刺激時被激活，進而啟動一系列細胞周期阻滯、DNA損傷修復和細胞凋亡相關基因的表達，維持細胞基因組的穩定性，防止細胞發生惡性轉化。當宮頸病變逐漸發展，從CIN到宮頸癌階段，PIRH2表達上調。高表達的PIRH2通過其RING-H2結構域與p53蛋白特異性結合，并招募E2泛素結合酶，將泛素分子連接到p53蛋白上。泛素化修飾后的p53蛋白被蛋白酶體識別并降解，導致細胞內p53蛋白水平顯著降低。p53蛋白的腫瘤抑制功能受到抑制，無法有效啟動細胞周期阻滯和凋亡程序，使得受損細胞得以持續增殖，逃避機體的免疫監視，從而促進宮頸病變的發生和發展。PIRH2還可能通過其他途徑參與宮頸病變的進程。研究表明，PIRH2可以調節細胞周期相關蛋白的表達和穩定性。在宮頸病變過程中，PIRH2可能促進CyclinD1等細胞周期蛋白的表達，加速細胞從G1期進入S期，促進細胞增殖。PIRH2還可能參與調控上皮-間質轉化（EMT）過程，增強宮頸癌細胞的侵襲和轉移能力。在EMT過程中，PIRH2可能通過調節相關轉錄因子（如Snail、Slug等）的表達，促使上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質細胞的特性，從而更容易突破基底膜，向周圍組織浸潤和轉移。6.2PIRH2表達對宮頸癌診斷和預后評估的意義從本研究結果來看，PIRH2在宮頸癌組織中呈現高表達，且其表達與宮頸癌的病理學分級、淋巴轉移密切相關，這使其具備作為宮頸癌診斷標志物和預后評估指標的潛力。在診斷方面，目前臨床上常用的宮頸細胞學檢查、HPV檢測等方法存在一定局限性。宮頸細胞學檢查易受取材、制片質量以及閱片醫生經驗等因素影響，假陰性率較高；HPV檢測雖然敏感性高，但多數HPV感染為一過性，并非所有HPV陽性者都會發展為宮頸病變，容易導致過度診斷。而PIRH2在宮頸病變發生發展過程中的特異性表達變化，為宮頸癌的診斷提供了新的思路。通過檢測宮頸組織中PIRH2的表達水平，有望提高宮頸癌早期診斷的準確性。當宮頸組織中PIRH2表達明顯升高時，提示可能存在宮頸上皮內瘤變甚至宮頸癌的風險，此時可進一步結合其他檢查方法，如陰道鏡檢查、宮頸活檢等，進行綜合診斷，從而提高早期診斷率，為患者爭取更多的治療時機。在預后評估方面，PIRH2的表達具有重要價值。研究表明，PIRH2高表達與宮頸癌的低分化、淋巴轉移密切相關。低分化的腫瘤細胞惡性程度高，增殖和侵襲能力強，更容易發生轉移。而PIRH2高表達可能通過促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移，影響宮頸癌患者的預后。在臨床實踐中，對于PIRH2高表達的宮頸癌患者，醫生可以更準確地評估其病情的嚴重程度和預后不良的風險。這有助于制定更個性化的治療方案，對于高風險患者，可加強術后的輔助治療，如化療、放療或靶向治療等，以降低復發和轉移的風險，提高患者的生存率。PIRH2還可以作為監測宮頸癌患者治療效果和復發的指標。在治療過程中，通過檢測PIRH2表達水平的變化，可評估治療是否有效。若治療后PIRH2表達水平下降，提示治療可能有效，病情得到控制；若PIRH2表達持續升高或在治療后再次升高，則可能提示腫瘤復發或轉移，需要及時調整治療策略。6.3研究的局限性與展望本研究存在一定局限性。在樣本量方面，雖然納入了[樣本總量]例患者，但對于某些亞組分析，如不同病理類型的宮頸癌，樣本量相對較少，可能影響研究結果的準確性和可靠性。例如，宮頸腺癌在本研究中的樣本量有限，這可能導致在分析PIRH2表達與宮頸腺癌的關系時，無法充分揭示其潛在的關聯。在研究方法上，本研究僅采用免疫組織化學S-P法檢測PIRH2的表達，缺乏其他檢測方法的驗證，如Westernblot、實時熒光定量PCR等。單一的檢測方法可能存在誤差，且無法全面深入地分析PIRH2在宮頸病變中的