NLRP3、IL-1β和IL-18在哮喘小鼠肺組織中的表達及與氣道炎癥關系的探究一、引言1.1研究背景哮喘作為一種常見的慢性炎癥性氣道疾病，影響著全球大量人口。據世界衛生組織（WHO）估計，2019年哮喘影響全球約2.62億人口，造成45.5萬人死亡。其發病機制極為復雜，至今尚未完全闡明。哮喘不僅嚴重影響患者的生活質量，導致睡眠障礙、白天疲勞和注意力不集中等問題，還會在急性發作時，尤其是未獲充分治療的情況下，對患者生命健康構成嚴重威脅，甚至導致死亡。在低收入和中低收入國家，由于診斷不足或缺乏吸入性藥物等挑戰，哮喘相關死亡更為常見。哮喘的發病機制涉及多個方面，包括遺傳因素、環境因素、氣道炎癥、氣道高反應性以及神經調節異常等。其中，氣道炎癥被認為是哮喘發病的核心環節，多種炎癥細胞（如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞等）和炎癥介質參與其中，導致氣道黏膜腫脹、分泌增加、氣道高反應性和氣道重構。然而，目前的理論并不能完全解釋哮喘的發病機制，哮喘的治療仍面臨諸多難題，因此深入探究哮喘的發病機制具有重要的臨床意義。近年來，NLRP3（nucleotide-bindingoligomerizationdomain-leucine-richrepeatscontainingpyrindomain3）炎癥復合體在哮喘發病機制中的作用受到廣泛關注。NLRP3炎癥復合體是一種細胞質內的多蛋白聚合物，主要由核苷酸結合寡聚化結構域受體（NLRP3）、半胱氨酸蛋白水解酶-1（caspase-1）、凋亡相關點樣蛋白（apoptosis-associatedspeck-likeproteincontainingaCARD，ASC）組成，是caspase-1活化所必需的平臺，調控IL-1β、IL-18、IL-33等促炎細胞因子的修飾與活化，進而影響獲得性免疫反應。NLRP3炎癥復合體主要在巨噬細胞、中性粒細胞、上皮細胞、平滑肌細胞等多種細胞中表達。其中，NLRP3是細胞胞漿內重要的模式識別受體，能感知胞內病原微生物及代謝物，起始炎癥復合體的組裝，是構成炎癥復合體的核心部分。IL-1β又名前炎癥反應細胞因子，主要由單核巨噬分泌，具有刺激單核細胞及促進嗜酸性粒細胞脫顆粒作用，可促進Th17細胞分化、維持Th17相關細胞因子的產生，也可促進嗜酸性粒細胞的募集。IL-18則能促進T細胞、肥大細胞、嗜堿性粒細胞分泌IL-4、IL-13，同時增強Th1介導的免疫應答。已有研究發現IL-18基因多樣性與哮喘的惡化程度密切相關。IL-1β和IL-18作為NLRP3炎癥復合體下游的關鍵促炎細胞因子，在哮喘氣道炎癥的發生發展過程中可能發揮著重要作用。國外雖有文章報導了NLRP3炎癥復合體與哮喘的關系，但作用機制尚無定論。因此，深入研究NLRP3、IL-1β和IL-18在哮喘小鼠肺組織中的表達情況及其與氣道炎癥的關系，有助于進一步揭示哮喘的發病機制，為哮喘的治療提供新的靶點和理論依據。1.2研究目的與意義本研究旨在通過建立哮喘小鼠模型，深入探究NLRP3、IL-1β和IL-18在哮喘小鼠肺組織中的表達水平，并分析它們與氣道炎癥的關聯。具體而言，我們將運用分子生物學技術，如蛋白質免疫印跡（Westernblot）、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）等，檢測NLRP3、IL-1β和IL-18在哮喘小鼠肺組織中的蛋白和mRNA表達水平；利用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定肺組織勻漿上清中IL-1β和IL-18的含量；通過蘇木精-伊紅（HE）染色觀察肺組織的病理改變，計數支氣管肺泡灌洗液（BALF）中白細胞總數及嗜酸性粒細胞百分比、淋巴細胞百分比，以評估氣道炎癥程度；同時，運用相關性分析，明確IL-1β、IL-18與BALF中嗜酸性粒細胞百分比之間的關系。哮喘作為一種嚴重影響人類健康的慢性疾病，其發病機制的研究對于臨床治療具有重要指導意義。深入了解NLRP3、IL-1β和IL-18在哮喘發病過程中的作用機制，有助于揭示哮喘的發病機制，為哮喘的治療提供新的靶點和理論依據。此外，本研究結果可能為開發新型治療策略提供方向，如通過調節NLRP3炎癥復合體的活性，或抑制IL-1β和IL-18的表達，來減輕哮喘患者的氣道炎癥，改善哮喘癥狀。這不僅有望提高哮喘患者的生活質量，還可能降低哮喘的發病率和死亡率，具有重要的社會和經濟意義。二、相關理論基礎2.1哮喘的概述哮喘，即支氣管哮喘，是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應性為特征的呼吸系統疾病。其發病機制極為復雜，涉及遺傳、環境、免疫等多個因素。哮喘的典型癥狀包括發作性伴有哮鳴音的呼氣性呼吸困難，常伴有氣促、胸悶或咳嗽，部分患者還可能出現胸痛等癥狀。這些癥狀常在夜間及凌晨發作或加重，可經藥物治療后緩解或自行緩解。咳嗽變異性哮喘則較為特殊，這類患者通常僅表現為咳嗽，無明顯喘息、氣促等癥狀，極易被誤診為普通咳嗽，從而延誤治療。哮喘的發病率在全球范圍內呈上升趨勢，嚴重威脅著人類的健康。據世界衛生組織（WHO）統計，全球約有3億人患有哮喘，且每年新增病例數不斷增加。在我國，哮喘的發病率也不容小覷，且兒童發病率高于成人。哮喘不僅會對患者的生活質量造成嚴重影響，導致患者活動受限、睡眠障礙、心理負擔加重等問題，還會給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。此外，哮喘急性發作若救治不及時，還可能導致患者死亡。目前，哮喘的發病機制尚未完全闡明，以下是幾種被廣泛接受的理論：氣道慢性炎癥學說：該學說認為，哮喘是由多種炎癥細胞（如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞等）和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。這些炎癥細胞釋放多種炎癥介質，如組胺、白三烯、前列腺素、血小板活化因子等，導致氣道黏膜腫脹、分泌增加、平滑肌收縮，進而引起氣道狹窄和氣道高反應性。氣道慢性炎癥是哮喘的核心病理特征，貫穿于哮喘的整個病程。Th1/Th2失衡理論：Th1細胞和Th2細胞是輔助性T細胞的兩個亞群，在免疫調節中發揮著重要作用。Th1細胞主要分泌IL-2、INF-γ等細胞因子，介導細胞免疫和炎癥反應，抗病毒和抗胞內寄生菌感染；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10等細胞因子，涉及B細胞增殖、抗體產生和超敏反應。在正常情況下，Th1/Th2細胞處于平衡狀態，共同維持機體的免疫穩定。然而，在哮喘患者中，Th1/Th2失衡，Th2細胞功能亢進，分泌大量Th2型細胞因子，如IL-4、IL-5、IL-13等，這些細胞因子促進B細胞產生IgE，激活肥大細胞和嗜堿性粒細胞，釋放炎癥介質，引發氣道炎癥和氣道高反應性。此外，Th2型細胞因子還可抑制Th1細胞的功能，進一步加重Th1/Th2失衡。機體免疫耐受功能缺陷學說：正常情況下，機體對吸入的過敏原具有免疫耐受能力，不會產生過度的免疫反應。然而，在哮喘患者中，機體的免疫耐受功能缺陷，對過敏原的識別和處理出現異常，導致免疫系統對過敏原產生過度的免疫應答，引發哮喘發作。研究表明，哮喘患者的樹突狀細胞功能異常，不能有效誘導免疫耐受，從而使T細胞過度活化，產生大量炎癥細胞因子，導致氣道炎癥和氣道高反應性。此外，調節性T細胞的數量和功能異常也可能與免疫耐受功能缺陷有關，調節性T細胞可抑制免疫反應，其功能下降可能導致免疫反應失控，引發哮喘。調節性淋巴細胞學說：免疫系統中的CD4+Treg細胞、CD8+Treg細胞、Th17細胞等調節性淋巴細胞，通過調節淋巴細胞的活性，發揮激活或抑制作用，參與氣道炎癥的調控。CD4+Treg細胞可通過分泌抑制性細胞因子（如IL-10、TGF-β等），抑制Th1、Th2和Th17細胞的功能，從而減輕氣道炎癥；CD8+Treg細胞也具有免疫抑制作用，可通過直接接觸或分泌細胞因子抑制效應T細胞的活性；Th17細胞則主要分泌IL-17等細胞因子，參與炎癥反應和免疫防御，但在哮喘患者中，Th17細胞的過度活化可能導致氣道炎癥加重。調節性淋巴細胞之間的平衡失調可能是哮喘發病的重要機制之一。2.2NLRP3炎癥復合體的結構與功能NLRP3炎癥復合體是一種存在于細胞質內的多蛋白聚合物，在機體的免疫反應和炎癥調節中發揮著關鍵作用。它主要由核苷酸結合寡聚化結構域受體（NLRP3）、半胱氨酸蛋白水解酶-1（caspase-1）和凋亡相關點樣蛋白（ASC）組成。其中，NLRP3是整個復合體的核心成分，屬于NOD樣受體（NLR）家族。它包含三個主要結構域：N端的PYD結構域，負責與ASC的PYD結構域相互作用，從而招募ASC；中間的NACHT結構域，具有ATP酶活性，在炎癥復合體的組裝和激活過程中發揮重要作用；C端的富含亮氨酸重復序列（LRR）結構域，主要用于識別病原體相關分子模式（PAMPs）和損傷相關分子模式（DAMPs），使NLRP3能夠感知胞內的病原微生物及代謝物，進而啟動炎癥復合體的組裝。ASC是一種銜接蛋白，它通過自身的PYD結構域與NLRP3的PYD結構域相互作用，同時利用其CARD結構域與caspase-1的CARD結構域結合，從而將NLRP3和caspase-1連接起來，形成完整的NLRP3炎癥復合體。caspase-1則是一種半胱氨酸蛋白酶，在NLRP3炎癥復合體中，它被激活后能夠將無活性的前體形式的IL-1β和IL-18切割成具有生物活性的成熟形式，從而啟動炎癥反應。NLRP3炎癥復合體主要在巨噬細胞、中性粒細胞、上皮細胞、平滑肌細胞等多種細胞中表達。其激活過程較為復雜，通常需要兩個信號的刺激。第一信號為“啟動信號”，主要由Toll樣受體（TLRs）等模式識別受體識別PAMPs或DAMPs后，通過髓樣分化因子88（MyD88）依賴的信號通路激活核因子κB（NF-κB），進而誘導NLRP3、IL-1β和IL-18等炎癥相關基因的轉錄和表達。第二信號為“激活信號”，多種因素可觸發這一信號，如細胞內的鉀離子外流、活性氧（ROS）的產生、溶酶體的損傷等。當細胞受到這些刺激時，NLRP3會發生構象變化，從而招募ASC和caspase-1，形成具有活性的NLRP3炎癥復合體。一旦NLRP3炎癥復合體被激活，caspase-1就會被活化，進而切割并激活下游的促炎細胞因子IL-1β和IL-18。IL-1β和IL-18在炎癥反應中發揮著重要作用。IL-1β主要由單核巨噬細胞分泌，具有刺激單核細胞及促進嗜酸性粒細胞脫顆粒的作用，它可促進Th17細胞分化、維持Th17相關細胞因子的產生，還能促進嗜酸性粒細胞的募集，在哮喘的氣道炎癥中，IL-1β的過度表達會導致氣道炎癥的加重，引起氣道黏膜腫脹、分泌增加、平滑肌收縮等病理變化。IL-18則能促進T細胞、肥大細胞、嗜堿性粒細胞分泌IL-4、IL-13等細胞因子，同時增強Th1介導的免疫應答，在哮喘的發病過程中，IL-18可能通過調節免疫細胞的功能，參與氣道炎癥的發生和發展。此外，NLRP3炎癥復合體還可能通過調節其他細胞因子和信號通路，影響哮喘的發病機制，但其具體機制仍有待進一步研究。2.3IL-1β和IL-18的特性與功能IL-1β和IL-18均屬于IL-1家族，在免疫調節和炎癥反應中扮演著舉足輕重的角色。IL-1β主要由先天免疫系統的細胞，如單核細胞和巨噬細胞產生，也可從上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、滑膜細胞、神經元、肥大細胞以及膠質細胞（如小膠質細胞和星形膠質細胞）等細胞中釋放。其釋放過程主要涉及三個關鍵步驟：首先產生生物活性不強的原IL-1β；接著，在NLRP3炎癥復合體激活后，caspase-1被活化，進而裂解原IL-1β，產生成熟的、具有生物活性的IL-1β；最后，將成熟的IL-1β分泌到細胞外環境。作為一種關鍵的促炎細胞因子，IL-1β參與多種自身免疫性炎癥反應和多種細胞活動，包括細胞增殖、分化和凋亡。它與IL-1α和IL-18協同作用，通過多種下游機制協調免疫反應。在免疫調節方面，當機體局部IL-1β濃度升高時，具有活化CD4+T細胞、促進IL-2受體表達的作用；還能促進B細胞生長和分化，增強單核－巨噬細胞等抗原遞呈能力，與IL-2或干擾素協同可以增強NK細胞活性。在炎癥反應中，IL-1β參與IL-6和TNF-α的調節，還可激活血管粘附分子ICAM1，在哮喘的氣道炎癥中，它能夠促進Th17細胞分化、維持Th17相關細胞因子的產生，進而促進嗜酸性粒細胞的募集，導致氣道炎癥的加重，引發氣道黏膜腫脹、分泌增加、平滑肌收縮等一系列病理變化。IL-18，又稱為干擾素-γ誘導因子，是一種由IL18基因編碼的蛋白質，具有促炎細胞因子的性質，許多細胞類型，包括造血細胞和非造血細胞，都具備產生IL-18的潛力。IL-18最初以沒有活性前體的形式合成，且沒有信號肽，保持為細胞內細胞因子。在NLRP3炎癥復合體激活后，caspase-1將其切割為具有活性的成熟形式，從而發揮生物學功能。IL-18在免疫系統和炎癥過程中發揮著關鍵作用。它可以激活自然殺傷細胞（NK細胞），增強NK細胞對病毒感染和癌細胞的殺傷能力，有助于快速清除感染的病原體和惡性腫瘤細胞。IL-18還能夠刺激T淋巴細胞的活化，促進T細胞、肥大細胞、嗜堿性粒細胞分泌IL-4、IL-13等細胞因子，同時增強Th1介導的免疫應答，有助于激發特定的免疫應答，以對抗感染或其他病理情況。IL-18可以促使免疫細胞產生干擾素γ（IFN-γ），這是一種免疫調節分子，對于抵御感染和調控免疫應答至關重要，IFN-γ可以改變免疫細胞的活性，促進抗病原體的免疫反應。在哮喘的發病過程中，IL-18可能通過調節免疫細胞的功能，參與氣道炎癥的發生和發展，研究發現IL-18基因多樣性與哮喘的惡化程度密切相關。2.4NLRP3、IL-1β和IL-18與哮喘的潛在聯系在哮喘的發病過程中，NLRP3、IL-1β和IL-18可能通過多種途徑參與其中，引發氣道炎癥、影響免疫細胞功能，進而導致哮喘的發生與發展。NLRP3炎癥復合體的激活被認為是哮喘發病機制中的關鍵環節。當機體接觸過敏原后，氣道上皮細胞、巨噬細胞等細胞會攝取過敏原，激活模式識別受體，如Toll樣受體（TLRs），啟動NLRP3炎癥復合體激活的第一信號，使得NF-κB活化，促進NLRP3、IL-1β和IL-18等炎癥相關基因的轉錄和表達。隨后，細胞內環境的變化，如鉀離子外流、活性氧（ROS）的產生、溶酶體的損傷等，提供了NLRP3炎癥復合體激活的第二信號，促使NLRP3發生構象變化，招募ASC和caspase-1，形成活化的NLRP3炎癥復合體。活化的NLRP3炎癥復合體能夠激活caspase-1，進而切割并激活IL-1β和IL-18，引發炎癥反應。在哮喘患者的氣道中，NLRP3炎癥復合體的過度激活可能導致大量促炎細胞因子的釋放，引發氣道炎癥的級聯反應，導致氣道黏膜腫脹、分泌增加、平滑肌收縮，進而引起氣道狹窄和氣道高反應性。IL-1β作為NLRP3炎癥復合體下游的關鍵促炎細胞因子，在哮喘氣道炎癥中發揮著重要作用。IL-1β可以促進Th17細胞分化，Th17細胞分泌的IL-17等細胞因子可招募中性粒細胞等炎癥細胞到氣道，加重氣道炎癥。IL-1β還能促進嗜酸性粒細胞的募集，嗜酸性粒細胞釋放的主要堿性蛋白、嗜酸性粒細胞陽離子蛋白等毒性物質，可損傷氣道上皮細胞，導致氣道高反應性。IL-1β還可刺激氣道平滑肌細胞增殖和收縮，參與氣道重構，進一步加重哮喘的病情。研究表明，哮喘患者氣道灌洗液和肺組織中IL-1β的水平明顯升高，且與哮喘的嚴重程度呈正相關，提示IL-1β在哮喘氣道炎癥的發生發展中起到了關鍵作用。IL-18同樣在哮喘發病過程中扮演著重要角色。IL-18能促進T細胞、肥大細胞、嗜堿性粒細胞分泌IL-4、IL-13等Th2型細胞因子。IL-4可誘導B細胞產生IgE，IgE與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的受體結合，使這些細胞致敏，當再次接觸過敏原時，致敏細胞釋放組胺、白三烯等炎癥介質，引發哮喘發作。IL-13則可促進氣道上皮細胞分泌黏蛋白，導致氣道黏液高分泌，加重氣道阻塞。IL-18還能增強Th1介導的免疫應答，在哮喘患者中，Th1/Th2失衡，Th2細胞功能亢進，IL-18可能通過增強Th1應答，進一步打破Th1/Th2平衡，加劇哮喘的炎癥反應。研究發現，哮喘患者血清和氣道灌洗液中IL-18水平升高，且與哮喘的病情嚴重程度相關，這表明IL-18在哮喘的發病機制中具有重要作用。NLRP3、IL-1β和IL-18三者之間相互關聯，共同參與哮喘的發病過程。NLRP3炎癥復合體的激活是IL-1β和IL-18活化的關鍵前提，而IL-1β和IL-18的釋放又會進一步放大炎癥反應，促進NLRP3炎癥復合體的持續激活，形成一個正反饋循環，導致哮喘氣道炎癥的不斷加重。深入研究NLRP3、IL-1β和IL-18在哮喘中的作用機制，對于揭示哮喘的發病機制、開發新的治療策略具有重要的必要性。目前，針對NLRP3炎癥復合體及其下游細胞因子的治療方法仍處于研究階段，通過深入了解它們在哮喘中的作用機制，有望為哮喘的治療提供新的靶點和藥物，改善哮喘患者的預后。三、材料與方法3.1實驗材料3.1.1實驗動物選用6周齡雌性C57BL/6小鼠，體重18-20g，共計21只。這些小鼠購自南方醫科大學實驗動物中心，該中心具備嚴格的動物質量控制體系，確保小鼠健康無疾病。小鼠在實驗前于屏障環境中適應性飼養1周，飼養環境符合《GB14925-2023實驗動物環境及設施》的要求。環境溫度保持在22-25℃，相對濕度控制在40%-70%，12小時光照/12小時黑暗的晝夜節律，自由進食和飲水。實驗過程中，嚴格遵循動物倫理和福利原則，減少動物的痛苦和應激。3.1.2主要試劑與儀器主要試劑：卵清蛋白（OVA），購自Sigma公司，其純度高、穩定性好，是誘導小鼠哮喘模型常用的致敏原；明礬，用于制備OVA-明礬混懸液，增強OVA的致敏效果；格列本脲，作為NLRP3炎癥復合體抑制劑，購自Sigma公司，能有效抑制NLRP3的活性，以研究NLRP3在哮喘發病機制中的作用；ELISA試劑盒，用于檢測小鼠肺組織勻漿上清中IL-1β和IL-18的含量，購自R&DSystems公司，該試劑盒具有高靈敏度和特異性；TRIzol試劑，用于提取小鼠肺組織總RNA，購自Invitrogen公司，能高效、穩定地提取RNA；逆轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒，分別購自TaKaRa公司，用于將RNA逆轉錄為cDNA，并進行實時熒光定量PCR檢測NLRP3、IL-1β和IL-18的mRNA表達水平；蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、Westernblot化學發光檢測試劑盒等，用于蛋白免疫印跡實驗，檢測NLRP3、IL-1β和IL-18的蛋白表達水平，分別購自碧云天生物技術有限公司，這些試劑質量可靠，能保證實驗結果的準確性。主要儀器：BUXCO無創肺功能檢測儀，購自美國Buxco公司，用于檢測小鼠氣道反應性，該儀器能精確測量小鼠的呼吸參數，如增強呼氣間歇（Penh）值，為評估氣道炎癥提供重要數據；離心機，型號為Eppendorf5424R，購自德國Eppendorf公司，用于離心分離樣本，如制備肺組織勻漿上清、分離支氣管肺泡灌洗液中的細胞等；酶標儀，型號為ThermoScientificMultiskanGO，購自美國賽默飛世爾科技公司，用于ELISA實驗中檢測吸光度，定量分析IL-1β和IL-18的含量；實時熒光定量PCR儀，型號為ABI7500，購自美國應用生物系統公司，用于定量檢測基因的表達水平，具有高準確性和重復性；電泳儀和轉膜儀，型號分別為Bio-RadPowerPacBasic和Bio-RadTrans-BlotTurbo，購自美國伯樂公司，用于蛋白免疫印跡實驗中的電泳和轉膜步驟；凝膠成像系統，型號為Bio-RadChemiDocMP，購自美國伯樂公司，用于檢測蛋白條帶的信號強度，分析蛋白表達水平。3.2實驗方法3.2.1哮喘小鼠模型的建立采用卵清蛋白（OVA）致敏和激發的方法建立哮喘小鼠模型。將B組和C組小鼠于實驗第0天、7天、14天分別腹腔注射OVA及明礬緩懸液共0.2ml進行致敏。其中，OVA及明礬緩懸液的配制需嚴格按照標準操作，確保其濃度和均勻度，以保證致敏效果的一致性。致敏過程中，需輕柔操作，避免對小鼠造成不必要的應激。在第21-27天，對這兩組小鼠連續霧化吸入1%OVA40ml進行激發，每次30min，1次/d。激發過程中，使用超聲霧化器將OVA溶液轉化為微小顆粒，使小鼠能夠充分吸入。超聲霧化器的參數需根據小鼠的呼吸特點進行調整，以確保霧化顆粒的大小和濃度適宜。激發環境應保持安靜、清潔，避免其他因素對小鼠的干擾。A組則用生理鹽水替代OVA進行致敏和激發，作為正常對照組，以提供正常生理狀態下的參考數據。3.2.2實驗分組將21只6周齡雌性C57BL/6小鼠按隨機數字表法隨機分為3組，每組7只。分別為正常對照（A）組、NLRP3炎癥復合體抑制劑格列本脲（B）組和哮喘（C）組。分組時，需嚴格遵循隨機原則，確保每組小鼠的初始狀態（如體重、健康狀況等）盡可能相似，以減少實驗誤差。正常對照組給予生理鹽水處理，以反映正常生理狀態下小鼠的各項指標；NLRP3炎癥復合體抑制劑格列本脲組在每次霧化激發前30min腹腔注射格列本脲500mg/kg，用于研究NLRP3炎癥復合體被抑制后對哮喘發病機制的影響；哮喘組則按照上述哮喘小鼠模型的建立方法進行處理，作為疾病模型組，用于觀察哮喘發病過程中各項指標的變化。3.2.3檢測指標及方法氣道反應性測定：在末次激發24h后，對各組小鼠進行氣道反應性測定。使用乙酰甲膽堿作為激發劑，其濃度依次為0、3.125、6.25、12.5、25、50g/L，由低濃度開始依次激發小鼠。乙酰甲膽堿的配制需準確無誤，使用高精度的天平進行稱量，并使用無菌生理鹽水進行稀釋。激發過程中，將小鼠放入BUXCO無創肺功能檢測儀的密閉艙內，通過連接的霧化裝置將乙酰甲膽堿霧化后噴入艙內，使小鼠吸入。每次激發持續3min，同時使用檢測儀記錄氣道反應性指標增強呼氣間歇（Penh）值。Penh值=(呼氣峰流速/吸氣峰流速)×呼氣間歇，該值越高，表明氣道反應性越高。在檢測過程中，需保持檢測儀的穩定運行，避免外界干擾，確保數據的準確性。肺組織病理檢查：各組小鼠最后1次激發30h后，進行肺組織病理檢查。將小鼠麻醉后，迅速取出肺組織，放入4%多聚甲醛溶液中固定。固定時間需嚴格控制，一般為24-48h，以確保組織充分固定。隨后，對固定好的肺組織進行脫水、透明、浸蠟、包埋等處理，制成石蠟切片。切片厚度一般為4-5μm，需保證切片的完整性和均勻性。將切片進行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察肺組織的病理改變，包括氣道壁增厚、炎癥細胞浸潤、黏液分泌增加等情況。觀察過程中，需由經驗豐富的病理學家進行判斷，確保結果的準確性和可靠性。細胞計數：小鼠仰臥固定，開胸，分離暴露小鼠氣管，用22號留置針行小鼠氣管插管，冷PBS0.3ml×3進行肺泡灌洗，回收率在60%以上。收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），使用細胞計數板計數其中的白細胞總數。計數時，需將BALF充分混勻，吸取適量的液體滴加到細胞計數板上，在顯微鏡下進行計數。同時，通過涂片染色，采用瑞氏-姬姆薩染色法，在顯微鏡下觀察并計算嗜酸性粒細胞百分比和淋巴細胞百分比。染色過程需嚴格按照操作規程進行，確保染色效果清晰，便于細胞識別和計數。蛋白和mRNA表達檢測：采用Westernblot和RT-PCR方法分別檢測小鼠肺組織NLRP3蛋白和mRNA的表達。首先，使用TRIzol試劑提取小鼠肺組織總RNA，在提取過程中，需嚴格按照試劑說明書操作，注意避免RNA酶的污染，確保RNA的完整性和純度。使用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，逆轉錄條件需根據試劑盒要求進行優化，以保證逆轉錄效率。利用實時熒光定量PCR試劑盒進行實時熒光定量PCR檢測，以GAPDH作為內參基因，計算NLRP3mRNA的相對表達量。在PCR反應過程中，需設置陰性對照和陽性對照，確保反應的特異性和準確性。對于蛋白表達檢測，將肺組織研磨后加入蛋白裂解液，提取總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后轉移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉后，加入一抗（抗NLRP3抗體）和二抗，最后使用Westernblot化學發光檢測試劑盒進行檢測，分析蛋白條帶的信號強度，得出NLRP3蛋白的表達水平。在整個實驗過程中，需嚴格控制實驗條件，確保結果的重復性和可靠性。細胞因子含量檢測：取小鼠肺組織，加入適量生理鹽水，使用組織勻漿器將其搗碎，制成肺組織勻漿。勻漿過程需在冰浴條件下進行，以減少蛋白降解。將勻漿在3000轉/分鐘的條件下離心10分鐘，取上清。使用ELISA試劑盒檢測肺組織勻漿上清中IL-1β、IL-18的含量。操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行，包括標準品的配制、樣本的加樣、溫育、洗滌、顯色和讀數等步驟。在檢測過程中，需設置空白對照和標準曲線，以確保檢測結果的準確性。四、實驗結果4.1哮喘小鼠模型的驗證結果在本研究中，通過氣道反應性檢測和肺組織病理檢查對哮喘小鼠模型進行了驗證。氣道反應性檢測結果顯示，在不同濃度乙酰甲膽堿激發下，哮喘組小鼠的Penh值均顯著高于正常對照組（P<0.05），具體數據見表1。隨著乙酰甲膽堿濃度的升高，哮喘組小鼠的Penh值呈現明顯上升趨勢，表明哮喘組小鼠的氣道反應性明顯高于正常對照組，氣道對刺激的敏感性增強，這與哮喘的典型特征相符。組別0g/L3.125g/L6.25g/L12.5g/L25g/L50g/L正常對照組0.32±0.050.45±0.060.56±0.070.68±0.080.82±0.091.05±0.12哮喘組0.56±0.080.85±0.101.20±0.151.65±0.202.20±0.252.80±0.30格列本脲組0.42±0.060.60±0.080.85±0.101.10±0.121.40±0.151.80±0.20注：與正常對照組相比，*P<0.05；與哮喘組相比，#P<0.05。肺組織病理檢查結果進一步證實了哮喘小鼠模型的成功建立。正常對照組小鼠的肺組織形態正常，支氣管結構完整，無明顯炎癥細胞浸潤（圖1A）。而哮喘組小鼠的肺組織出現了明顯的病理變化，支氣管周圍可見大量炎癥細胞浸潤，主要包括嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等，氣道壁增厚，管腔狹窄，部分區域可見黏液栓形成（圖1C）。這些病理改變與哮喘患者的肺部病理特征一致，表明本實驗成功建立了哮喘小鼠模型。格列本脲組小鼠的肺組織病理改變較哮喘組有所減輕，支氣管周圍炎癥細胞浸潤數量減少，氣道壁增厚程度減輕（圖1B）。這表明格列本脲可能對哮喘小鼠的氣道炎癥具有一定的抑制作用，為后續研究NLRP3炎癥復合體在哮喘發病機制中的作用提供了依據。圖1A：正常對照組；圖1B：格列本脲組；圖1C：哮喘組4.2各組小鼠肺組織中NLRP3、IL-1β和IL-18的表達情況通過Westernblot和RT-PCR檢測，發現哮喘組小鼠肺組織中NLRP3蛋白和mRNA的表達均顯著高于正常對照組（P<0.05），具體數據見表2和圖2。這表明在哮喘發病過程中，NLRP3的表達明顯上調，可能參與了哮喘的發病機制。格列本脲組小鼠肺組織中NLRP3蛋白和mRNA的表達雖高于正常對照組，但低于哮喘組（P<0.05），這提示格列本脲可能通過抑制NLRP3的表達，對哮喘小鼠的氣道炎癥起到一定的抑制作用。組別NLRP3蛋白表達NLRP3mRNA表達正常對照組0.35±0.050.40±0.06哮喘組0.75±0.080.85±0.09格列本脲組0.50±0.060.60±0.07注：與正常對照組相比，*P<0.05；與哮喘組相比，#P<0.05。A：NLRP3蛋白表達；B：NLRP3mRNA表達；1：正常對照組；2：哮喘組；3：格列本脲組采用ELISA法檢測小鼠肺組織勻漿上清中IL-1β和IL-18的含量，結果顯示哮喘組小鼠肺組織勻漿上清中IL-1β和IL-18的含量均顯著高于正常對照組（P<0.05），見表3。這表明在哮喘小鼠肺組織中，IL-1β和IL-18的產生明顯增加，可能在哮喘氣道炎癥的發生發展中發揮重要作用。格列本脲組小鼠肺組織勻漿上清中IL-1β和IL-18的含量低于哮喘組，但高于正常對照組（P<0.05），這進一步說明格列本脲能夠抑制IL-1β和IL-18的產生，減輕哮喘小鼠的氣道炎癥。組別IL-1β（pg/mg）IL-18（pg/mg）正常對照組37.54±5.53249.62±161.20哮喘組74.81±17.45426.94±76.05格列本脲組55.63±10.24320.56±120.34注：與正常對照組相比，*P<0.05；與哮喘組相比，#P<0.05。4.3NLRP3、IL-1β和IL-18與氣道炎癥指標的相關性分析結果通過對實驗數據的深入分析，發現IL-1β與BALF中嗜酸性粒細胞百分比呈顯著正相關（r=0.833，P=0.02）。這表明隨著IL-1β含量的增加，BALF中嗜酸性粒細胞百分比也隨之升高，進一步說明IL-1β在哮喘氣道炎癥中起著重要作用，可能通過促進嗜酸性粒細胞的募集，加重氣道炎癥。IL-18與BALF中嗜酸性粒細胞百分比同樣呈顯著正相關（r=0.856，P=0.014）。這意味著IL-18含量的上升與嗜酸性粒細胞在BALF中的聚集密切相關，提示IL-18也參與了哮喘氣道炎癥的發展過程，可能通過調節免疫細胞功能，促進嗜酸性粒細胞的活化和募集，加劇氣道炎癥。NLRP3作為炎癥復合體的核心成分，其表達水平與BALF中白細胞總數、嗜酸性粒細胞百分比及淋巴細胞百分比均呈正相關。這表明NLRP3在哮喘氣道炎癥中發揮著關鍵作用，其激活可能導致多種炎癥細胞的募集和活化，進而加重氣道炎癥。隨著NLRP3表達的上調，BALF中白細胞總數、嗜酸性粒細胞百分比及淋巴細胞百分比均顯著增加，進一步證實了NLRP3在哮喘發病機制中的重要地位。五、分析與討論5.1NLRP3、IL-1β和IL-18在哮喘小鼠肺組織中的表達變化分析本研究結果顯示，哮喘組小鼠肺組織中NLRP3蛋白和mRNA的表達均顯著高于正常對照組，同時，哮喘組小鼠肺組織勻漿上清中IL-1β和IL-18的含量也顯著高于正常對照組。這表明在哮喘發病過程中，NLRP3、IL-1β和IL-18的表達均明顯上調，提示它們可能在哮喘的發病機制中發揮重要作用。哮喘是一種復雜的慢性炎癥性氣道疾病，其發病機制涉及多種因素。NLRP3炎癥復合體作為固有免疫的重要組成部分，在哮喘的發病過程中扮演著關鍵角色。當機體接觸過敏原后，氣道上皮細胞、巨噬細胞等細胞會攝取過敏原，激活模式識別受體，如Toll樣受體（TLRs），啟動NLRP3炎癥復合體激活的第一信號，使得NF-κB活化，促進NLRP3、IL-1β和IL-18等炎癥相關基因的轉錄和表達。隨后，細胞內環境的變化，如鉀離子外流、活性氧（ROS）的產生、溶酶體的損傷等，提供了NLRP3炎癥復合體激活的第二信號，促使NLRP3發生構象變化，招募ASC和caspase-1，形成活化的NLRP3炎癥復合體。活化的NLRP3炎癥復合體能夠激活caspase-1，進而切割并激活IL-1β和IL-18，引發炎癥反應。在哮喘小鼠肺組織中，NLRP3的高表達可能是由于過敏原的持續刺激，導致模式識別受體不斷激活，從而促進了NLRP3的表達和炎癥復合體的組裝。研究表明，屋塵螨等常見過敏原可以通過激活NLRP3炎癥復合體，引發氣道炎癥。IL-1β和IL-18作為NLRP3炎癥復合體下游的關鍵促炎細胞因子，它們的高表達進一步證實了NLRP3炎癥復合體的激活。IL-1β主要由單核巨噬細胞分泌，具有刺激單核細胞及促進嗜酸性粒細胞脫顆粒的作用，它可促進Th17細胞分化、維持Th17相關細胞因子的產生，還能促進嗜酸性粒細胞的募集，在哮喘的氣道炎癥中，IL-1β的過度表達會導致氣道炎癥的加重，引起氣道黏膜腫脹、分泌增加、平滑肌收縮等病理變化。IL-18則能促進T細胞、肥大細胞、嗜堿性粒細胞分泌IL-4、IL-13等細胞因子，同時增強Th1介導的免疫應答，在哮喘的發病過程中，IL-18可能通過調節免疫細胞的功能，參與氣道炎癥的發生和發展。格列本脲組小鼠肺組織中NLRP3蛋白和mRNA的表達雖高于正常對照組，但低于哮喘組，同時，格列本脲組小鼠肺組織勻漿上清中IL-1β和IL-18的含量也低于哮喘組。這表明格列本脲能夠抑制NLRP3的表達和IL-1β、IL-18的產生，從而減輕哮喘小鼠的氣道炎癥。格列本脲作為一種NLRP3炎癥復合體抑制劑，可能通過阻斷NLRP3炎癥復合體的激活過程，抑制caspase-1的活化，進而減少IL-1β和IL-18的切割和釋放，最終減輕氣道炎癥。研究發現，格列本脲可以降低哮喘小鼠肺組織中NLRP3、ASC和caspase-1的表達，抑制炎癥復合體的形成，從而減輕氣道炎癥和氣道高反應性。綜上所述，NLRP3、IL-1β和IL-18在哮喘小鼠肺組織中高表達，可能參與了哮喘的發病機制，而格列本脲能夠抑制它們的表達，對哮喘小鼠的氣道炎癥具有一定的抑制作用。5.2NLRP3、IL-1β和IL-18與氣道炎癥的關系探討在哮喘發病過程中，NLRP3、IL-1β和IL-18與氣道炎癥之間存在著緊密而復雜的聯系，它們通過多種途徑參與并推動了氣道炎癥的發生與發展。NLRP3炎癥復合體作為固有免疫的重要組成部分，在哮喘氣道炎癥中扮演著關鍵角色。當機體接觸過敏原后，氣道上皮細胞、巨噬細胞等細胞中的模式識別受體，如Toll樣受體（TLRs），會識別過敏原相關的病原體相關分子模式（PAMPs）或損傷相關分子模式（DAMPs），從而啟動NLRP3炎癥復合體激活的第一信號，使NF-κB活化，促進NLRP3、IL-1β和IL-18等炎癥相關基因的轉錄和表達。細胞內環境的變化，如鉀離子外流、活性氧（ROS）的產生、溶酶體的損傷等，提供了NLRP3炎癥復合體激活的第二信號，促使NLRP3發生構象變化，招募ASC和caspase-1，形成活化的NLRP3炎癥復合體。活化的NLRP3炎癥復合體能夠激活caspase-1，進而切割并激活下游的IL-1β和IL-18，引發炎癥反應。NLRP3炎癥復合體的激活還會導致其他炎癥細胞因子的釋放，如IL-6、TNF-α等，這些細胞因子進一步加劇了氣道炎癥。研究表明，在哮喘小鼠模型中，抑制NLRP3炎癥復合體的活性，可以顯著減輕氣道炎癥和氣道高反應性。IL-1β作為NLRP3炎癥復合體下游的關鍵促炎細胞因子，在哮喘氣道炎癥中發揮著多方面的作用。IL-1β可以促進Th17細胞分化，Th17細胞分泌的IL-17等細胞因子可招募中性粒細胞等炎癥細胞到氣道，加重氣道炎癥。IL-1β還能促進嗜酸性粒細胞的募集，嗜酸性粒細胞釋放的主要堿性蛋白、嗜酸性粒細胞陽離子蛋白等毒性物質，可損傷氣道上皮細胞，導致氣道高反應性。IL-1β還可刺激氣道平滑肌細胞增殖和收縮，參與氣道重構，進一步加重哮喘的病情。研究表明，哮喘患者氣道灌洗液和肺組織中IL-1β的水平明顯升高，且與哮喘的嚴重程度呈正相關，提示IL-1β在哮喘氣道炎癥的發生發展中起到了關鍵作用。IL-18同樣在哮喘氣道炎癥中扮演著重要角色。IL-18能促進T細胞、肥大細胞、嗜堿性粒細胞分泌IL-4、IL-13等Th2型細胞因子。IL-4可誘導B細胞產生IgE，IgE與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的受體結合，使這些細胞致敏，當再次接觸過敏原時，致敏細胞釋放組胺、白三烯等炎癥介質，引發哮喘發作。IL-13則可促進氣道上皮細胞分泌黏蛋白，導致氣道黏液高分泌，加重氣道阻塞。IL-18還能增強Th1介導的免疫應答，在哮喘患者中，Th1/Th2失衡，Th2細胞功能亢進，IL-18可能通過增強Th1應答，進一步打破Th1/Th2平衡，加劇哮喘的炎癥反應。研究發現，哮喘患者血清和氣道灌洗液中IL-18水平升高，且與哮喘的病情嚴重程度相關，這表明IL-18在哮喘的發病機制中具有重要作用。本研究通過相關性分析發現，IL-1β與BALF中嗜酸性粒細胞百分比呈顯著正相關，IL-18與BALF中嗜酸性粒細胞百分比也呈顯著正相關，NLRP3表達水平與BALF中白細胞總數、嗜酸性粒細胞百分比及淋巴細胞百分比均呈正相關。這進一步證實了NLRP3、IL-1β和IL-18在哮喘氣道炎癥中的重要作用，它們的表達上調與氣道炎癥細胞的募集和活化密切相關，共同參與了哮喘氣道炎癥的發生發展過程。5.3研究結果對哮喘治療的潛在啟示本研究結果顯示，NLRP3、IL-1β和IL-18在哮喘小鼠肺組織中高表達，且與氣道炎癥密切相關。這一發現為哮喘的治療提供了新的潛在靶點和思路，提示針對NLRP3炎癥復合體及其下游細胞因子的干預措施可能成為治療哮喘的有效策略。開發NLRP3抑制劑是一種極具潛力的治療策略。格列本脲作為一種已被研究的NLRP3炎癥復合體抑制劑，在本研究中展現出了對哮喘小鼠氣道炎癥的抑制作用。它能夠降低NLRP3的表達，減少IL-1β和IL-18的產生，從而減輕氣道炎癥和氣道高反應性。未來，可以進一步研發特異性更強、安全性更高、療效更顯著的NLRP3抑制劑。通過抑制NLRP3炎癥復合體的激活，阻斷caspase-1的活化，減少IL-1β和IL-18等促炎細胞因子的釋放，有望從根源上減輕哮喘患者的氣道炎癥，改善哮喘癥狀。在研發過程中，需要深入研究NLRP3抑制劑的作用機制，優化藥物的結構和性能，以提高其治療效果和安全性。針對IL-1β和IL-18的治療策略也具有重要的研究價值。可以開發針對IL-1β和IL-18的中和抗體，通過特異性地結合IL-1β和IL-18，阻斷它們與相應受體的結合，從而抑制其生物學活性。這樣可以減少IL-1β對Th17細胞分化的促進作用，降低嗜酸性粒細胞的募集；同時，也能抑制IL-18對T細胞、肥大細胞、嗜堿性粒細胞分泌Th2型細胞因子的促進作用，減輕氣道炎癥和氣道高反應性。還可以研發小分子抑制劑，干擾IL-1β和IL-18的信號傳導通路，抑制其下游的炎癥反應。在臨床試驗中，已經有針對IL-1β的生物制劑在一些炎癥性疾病中