IL-21基因修飾的人臍帶間充質干細胞聯合miR-200c抗卵巢癌的協同效應及機制探究一、緒論1.1研究背景卵巢癌是女性生殖系統腫瘤的主要類型之一，也是女性最常見的致死腫瘤之一，嚴重威脅著女性的生命健康。據統計，在卵巢癌、宮頸癌和子宮內膜癌三大婦科惡性腫瘤中，卵巢癌的發病率居于第三位，但死亡率卻居首位。臨床上常用三個70%來描述卵巢癌的兇險程度：約70%的卵巢癌患者確診時已是晚期，70%的患者會在初次治療后兩三年內復發，70%的患者生存時間不超過五年。目前，常規的卵巢癌治療方案主要包括手術切除腫瘤和化療。手術切除可以直接去除腫瘤組織，但對于晚期卵巢癌患者，由于腫瘤的廣泛轉移和浸潤，手術往往難以徹底清除癌細胞，且手術創傷較大，患者恢復時間長，可能會出現多種并發癥。化療則是通過使用化學藥物來殺死癌細胞，但化療藥物在殺死癌細胞的同時，也會對正常細胞造成損害，導致患者出現嚴重的毒副作用，如惡心、嘔吐、脫發、骨髓抑制等。此外，化療還容易使癌細胞產生耐藥性，導致治療效果不佳，復發率高。據相關研究表明，卵巢癌患者在完成標準一線含鉑化療后，復發率仍高達70%以上。因此，傳統的治療方法存在著諸多局限性，迫切需要尋求新的治療方法來提高卵巢癌的治療效果，改善患者的預后。干細胞治療因其具有自我更新、自我復制和分化多能性等特性，逐漸成為研究熱點。人臍帶間充質干細胞（humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUC-MSCs）作為一種成熟的干細胞，具有來源豐富、獲取方便、免疫原性低、無倫理爭議等優點，在多種疾病的治療中展現出了良好的應用前景。hUC-MSCs能夠分泌多種細胞因子和生長因子，調節免疫反應，促進組織修復和再生。同時，hUC-MSCs還可以通過歸巢效應，定向遷移到腫瘤部位，發揮抗腫瘤作用。近年來，越來越多的研究表明，干細胞治療在卵巢癌的治療中具有潛在的應用價值，為卵巢癌的治療提供了新的思路。基因治療作為一種新興的治療手段，通過將正常基因或重組治療基因導入異常細胞的DNA系統中，以抑制致病基因表達或修復缺陷基因表達，從而達到治療疾病的目的。在卵巢癌的治療中，基因治療可以針對卵巢癌發生發展過程中的關鍵基因和信號通路，實現精準治療。IL-21和miR-200c在卵巢癌治療中具有重要的作用。IL-21是一種由活化的T細胞、自然殺傷T細胞和濾泡輔助性T細胞分泌的細胞因子，能夠調節免疫細胞的功能，增強機體的抗腫瘤免疫反應。研究發現，IL-21能夠抑制卵巢癌細胞的增殖、侵襲和轉移，具有很好的抗腫瘤效果。miR-200c是一種微小RNA，能夠通過靶向轉錄因子ZEB1和ZEB2來抑制卵巢癌細胞的上皮-間質轉化過程，從而抑制卵巢癌細胞的侵襲和轉移。因此，IL-21和miR-200c在卵巢癌的治療中具有潛在的應用價值。本研究將探究IL-21基因修飾的hUC-MSCs和miR-200c在卵巢癌治療中的協同作用，旨在為卵巢癌的治療提供新的思路和方法。通過將IL-21基因導入hUC-MSCs中，使其能夠持續分泌IL-21，增強機體的抗腫瘤免疫反應；同時，聯合miR-200c，抑制卵巢癌細胞的侵襲和轉移，有望提高卵巢癌的治療效果，為卵巢癌患者帶來新的希望。1.2研究目的和意義卵巢癌作為嚴重威脅女性生命健康的惡性腫瘤，傳統治療方法存在諸多局限性，迫切需要探索新的治療策略。本研究旨在探究IL-21基因修飾的hUC-MSCs聯合miR-200c在卵巢癌治療中的協同作用，為卵巢癌的治療提供新的思路和方法。具體而言，本研究具有以下目的：第一，通過基因工程技術，將IL-21基因導入hUC-MSCs中，構建穩定表達IL-21的hUC-MSCs細胞系，驗證其對卵巢癌細胞的抑制作用。第二，研究miR-200c對卵巢癌細胞侵襲和轉移能力的影響，明確其在卵巢癌治療中的作用機制。第三，探究IL-21基因修飾的hUC-MSCs與miR-200c聯合使用時，對卵巢癌生長和轉移的協同抑制作用，評估聯合治療方案的療效。本研究具有重要的理論意義和臨床應用價值。在理論層面，深入研究IL-21基因修飾的hUC-MSCs和miR-200c抗卵巢癌的作用機制，有助于揭示卵巢癌發生發展的分子機制，為卵巢癌的基礎研究提供新的理論依據，豐富腫瘤生物學和基因治療領域的知識體系。在IL-21基因修飾的hUC-MSCs方面，進一步明確其在腫瘤微環境中的免疫調節作用以及對卵巢癌細胞的直接殺傷機制，有助于拓展對干細胞治療腫瘤的認識。對于miR-200c，深入探究其通過靶向轉錄因子ZEB1和ZEB2抑制卵巢癌細胞上皮-間質轉化過程的具體分子通路，將為卵巢癌的侵襲和轉移機制研究提供新的視角。在臨床應用方面，本研究的成果有望為卵巢癌患者提供一種新的、有效的治療方案，改善患者的預后，提高患者的生存率和生活質量。當前卵巢癌患者面臨著治療效果不佳、復發率高、毒副作用大等問題，本研究提出的聯合治療策略如果能夠取得良好的效果，將為臨床醫生提供更多的治療選擇，打破傳統治療方法的局限。IL-21基因修飾的hUC-MSCs和miR-200c聯合治療可能減少化療藥物的使用劑量和頻率，從而降低化療的毒副作用，提高患者的治療依從性。這種聯合治療方法還可能針對卵巢癌的復發和轉移等關鍵問題，有效抑制腫瘤的生長和擴散，延長患者的無進展生存期和總生存期。本研究的開展對于推動卵巢癌治療領域的發展具有重要意義，有望為卵巢癌患者帶來新的希望。1.3研究方法和創新點本研究綜合運用多種研究方法，從細胞、動物和分子生物學等多個層面深入探究IL-21基因修飾的hUC-MSCs聯合miR-200c抗卵巢癌的作用機制和治療效果。在細胞實驗方面，通過細胞培養技術，分離、培養和鑒定hUC-MSCs，并利用轉染技術將IL-21基因導入hUC-MSCs中，獲得IL-21基因修飾的hUC-MSCs。之后，將不同組別的細胞與卵巢癌細胞共培養，運用CCK-8法檢測細胞增殖活性，Transwell實驗檢測細胞侵襲和遷移能力，流式細胞術分析細胞凋亡情況，以明確不同組別細胞對卵巢癌細胞生物學行為的影響。在動物實驗層面，構建卵巢癌裸鼠模型，將不同組別的hUC-MSCs移植到裸鼠體內，定期測量腫瘤體積和重量，觀察腫瘤生長情況。通過對裸鼠進行活體成像，追蹤hUC-MSCs在體內的分布和歸巢情況，研究其對卵巢癌生長和轉移的影響。實驗結束后，對裸鼠進行解剖，取腫瘤組織進行病理學檢查，進一步驗證實驗結果。從分子生物學實驗角度，采用Westernblotting和qPCR等技術，檢測不同組別細胞中IL-21、miR-200c以及相關信號通路蛋白和基因的表達水平變化。通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-200c與靶基因ZEB1和ZEB2的靶向關系，深入探究聯合治療的分子機制。本研究的創新點主要體現在兩個方面。一是多靶點聯合治療，創新性地將IL-21基因修飾的hUC-MSCs與miR-200c聯合應用于卵巢癌治療研究。IL-21基因修飾的hUC-MSCs能夠持續分泌IL-21，增強機體的抗腫瘤免疫反應，直接抑制卵巢癌細胞的增殖、侵襲和轉移；miR-200c則通過靶向轉錄因子ZEB1和ZEB2，抑制卵巢癌細胞的上皮-間質轉化過程，從而抑制癌細胞的侵襲和轉移。兩者聯合，從多個靶點協同作用，有望克服單一治療方法的局限性，提高卵巢癌的治療效果。二是深入機制研究，在研究聯合治療對卵巢癌生長和轉移的影響時，不僅僅停留在觀察表面現象，還深入探究其內在的分子機制。通過分子生物學實驗，全面分析聯合治療對相關信號通路和基因表達的調控作用，揭示IL-21基因修飾的hUC-MSCs和miR-200c協同抗卵巢癌的深層機制，為卵巢癌的治療提供更堅實的理論基礎。二、相關理論基礎2.1卵巢癌概述卵巢癌是發生在卵巢的惡性腫瘤性疾病，是女性生殖系統常見的三大惡性腫瘤之一。卵巢作為女性重要的生殖器官，位于盆腔深部，位置較為隱匿，這使得卵巢癌在早期階段很難被察覺。卵巢癌的發病原因目前尚未完全明確，但研究表明，其發病與多種因素有關。遺傳因素在卵巢癌的發病中起著重要作用，約10%-15%的卵巢癌患者具有遺傳背景，特別是攜帶乳腺癌易感基因（BRCA1/BRCA2）突變的女性，其患卵巢癌的風險顯著增加。激素水平失衡也可能與卵巢癌的發生相關，長期高水平的雌激素刺激可能促進卵巢上皮細胞的增殖和癌變。生活方式和環境因素同樣不容忽視，如長期高脂肪飲食、肥胖、長期接觸化學物質等，都可能增加卵巢癌的發病風險。從病理類型來看，卵巢癌主要分為上皮性卵巢癌、卵巢生殖細胞腫瘤、性索間質腫瘤和轉移性癌四大類。上皮性卵巢癌是最為常見的類型，約占卵巢癌總數的70%-85%，其來源于卵巢表面的上皮細胞，惡性程度較高，早期癥狀不明顯，發現時往往已處于晚期。卵巢生殖細胞腫瘤占卵巢癌的10%-20%，多發生于年輕女性，常見的病理亞型包括未成熟畸胎瘤、內胚竇瘤、無性細胞瘤等，這類腫瘤對化療較為敏感，預后相對較好。性索間質腫瘤較為少見，約占卵巢癌的5%，來源于卵巢的性索間質細胞，如顆粒細胞瘤、卵泡膜細胞瘤等，其惡性程度相對較低。轉移性癌則是由其他器官的惡性腫瘤轉移至卵巢所致，常見的原發部位包括胃腸道、乳腺等。卵巢癌的轉移途徑主要有直接蔓延、淋巴轉移和血行轉移。直接蔓延是指腫瘤細胞直接侵犯周圍組織和器官，如子宮、輸卵管、膀胱、直腸等，導致腫瘤的局部擴散。淋巴轉移是卵巢癌常見的轉移方式之一，癌細胞可通過淋巴管轉移至盆腔和腹主動脈旁淋巴結，進而擴散至全身。血行轉移相對較少見，但在晚期卵巢癌患者中，癌細胞可通過血液循環轉移至遠處器官，如肺、肝、骨等，嚴重影響患者的預后。在傳統治療方面，手術切除是卵巢癌的主要治療手段之一。對于早期卵巢癌患者，手術的目的是盡可能徹底地切除腫瘤組織，包括全子宮、雙側附件、大網膜及盆腔淋巴結清掃等，以達到根治的效果。然而，對于晚期卵巢癌患者，由于腫瘤的廣泛轉移和浸潤，手術往往難以完全切除腫瘤，只能進行減瘤手術，以減輕腫瘤負荷，為后續的化療創造條件。化療是卵巢癌綜合治療的重要組成部分，常用的化療藥物包括鉑類（如順鉑、卡鉑）和紫杉醇等，通過靜脈注射或腹腔灌注的方式給藥。化療藥物可以殺死癌細胞，但同時也會對正常細胞造成損害，導致一系列毒副作用，如惡心、嘔吐、脫發、骨髓抑制、肝腎功能損害等。此外，化療還容易使癌細胞產生耐藥性，導致治療效果不佳，復發率高。據統計，卵巢癌患者在完成標準一線含鉑化療后，復發率仍高達70%以上。放療在卵巢癌的治療中應用相對較少，主要用于局部復發或遠處轉移的患者，通過高能射線照射腫瘤部位，殺死癌細胞，但放療也會對周圍正常組織造成一定的損傷。傳統治療方法在卵巢癌的治療中取得了一定的效果，但也存在著諸多局限性。手術切除難以徹底清除癌細胞，且創傷較大，患者恢復時間長，容易出現并發癥。化療藥物的毒副作用嚴重影響患者的生活質量，且耐藥性問題限制了其治療效果。放療的應用范圍有限，且同樣會對正常組織造成損傷。因此，尋找新的治療方法來提高卵巢癌的治療效果，改善患者的預后，成為了當前卵巢癌研究領域的重要課題。2.2人臍帶間充質干細胞（hUC-MSCs）人臍帶間充質干細胞（hUC-MSCs）是一類存在于新生兒臍帶組織中的多能干細胞，具有自我更新和多向分化的能力。hUC-MSCs主要來源于臍帶的華通膠和血管周圍組織。華通膠是臍帶中富含間充質干細胞的區域，其獨特的微環境為干細胞的生存和增殖提供了良好的條件。血管周圍組織也含有一定數量的hUC-MSCs，這些細胞與血管系統密切相關，可能在組織修復和再生過程中發揮重要作用。hUC-MSCs的分離方法主要有組織塊貼壁法和酶消化法。組織塊貼壁法是將臍帶組織剪成小塊，接種于培養瓶中，讓細胞從組織塊中自然爬出并貼壁生長。這種方法操作簡單，對細胞的損傷較小，但分離過程較為耗時，且細胞的純度相對較低。酶消化法則是利用胰蛋白酶、膠原酶等消化酶將臍帶組織消化成單細胞懸液，然后通過離心、篩選等步驟獲得hUC-MSCs。該方法分離效率高，能夠快速獲得大量細胞，但消化過程可能會對細胞的活性和功能產生一定的影響。在實際應用中，可根據實驗需求和條件選擇合適的分離方法。hUC-MSCs的培養通常使用含10%-20%胎牛血清的低糖DMEM培養基或專用的干細胞培養基。培養條件一般為37℃、5%CO?的恒溫培養箱。在培養過程中，需要定期更換培養基，以去除代謝產物，提供充足的營養物質。當細胞融合度達到80%-90%時，需要進行傳代培養，以維持細胞的生長和活性。在傳代過程中，需注意操作規范，避免細胞污染和損傷。hUC-MSCs具有典型的成纖維細胞樣形態，呈梭形或長條形，細胞之間排列緊密，形成漩渦狀或放射狀生長模式。通過流式細胞術檢測，hUC-MSCs高表達CD29、CD44、CD73、CD90、CD105等表面標志物，這些標志物是間充質干細胞的特征性標志，用于鑒定hUC-MSCs。hUC-MSCs不表達造血干細胞標志物CD34、CD45以及白細胞共同抗原HLA-DR，這表明hUC-MSCs與造血干細胞和免疫細胞具有明顯的區別，具有較低的免疫原性。在特定的誘導條件下，hUC-MSCs能夠分化為多種細胞類型，如成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞等。成骨誘導時，細胞會逐漸形成礦化結節，通過茜素紅染色可觀察到紅色的鈣鹽沉積；成軟骨誘導后，細胞會分泌軟骨特異性的細胞外基質，經阿利新藍染色呈現藍色；脂肪誘導下，細胞內會出現脂滴，用油紅O染色可將其染成紅色。這些分化能力使得hUC-MSCs在組織工程和再生醫學領域具有廣闊的應用前景。hUC-MSCs在腫瘤治療中展現出了潛在的應用價值，其作用機制主要包括以下幾個方面。hUC-MSCs具有歸巢特性，能夠感知腫瘤組織微環境中釋放的化學信號，如趨化因子、生長因子等，從而定向遷移到腫瘤部位。研究表明，腫瘤組織中高表達的趨化因子CXCL12能夠吸引hUC-MSCs向腫瘤部位聚集，為腫瘤治療提供了靶向性。hUC-MSCs可以通過分泌多種細胞因子和生長因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）、白細胞介素-6（IL-6）等，調節腫瘤微環境中的免疫細胞功能，增強機體的抗腫瘤免疫反應。TNF-α能夠直接殺傷腫瘤細胞，IFN-γ可以激活自然殺傷細胞（NK細胞）和T淋巴細胞，增強它們對腫瘤細胞的殺傷能力。hUC-MSCs還可以通過旁分泌作用，分泌一些具有抗腫瘤活性的物質，如外泌體、微泡等，這些物質可以攜帶蛋白質、核酸等生物活性分子，作用于腫瘤細胞，抑制其增殖、侵襲和轉移。研究發現，hUC-MSCs分泌的外泌體中含有多種miRNA，這些miRNA可以通過調節腫瘤細胞的基因表達，抑制腫瘤的生長和轉移。hUC-MSCs能夠分化為多種細胞類型，在腫瘤微環境中，它們可以分化為腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）等，參與腫瘤微環境的構建和調節。在某些情況下，hUC-MSCs分化形成的CAFs可以分泌一些細胞因子和生長因子，抑制腫瘤細胞的生長和轉移；而在另一些情況下，CAFs也可能促進腫瘤的發展，其具體作用取決于腫瘤微環境的具體條件。hUC-MSCs具有來源豐富、獲取方便、免疫原性低、無倫理爭議等優點，在腫瘤治療中具有潛在的應用價值。通過深入研究其生物學特性和作用機制，有望進一步挖掘hUC-MSCs在卵巢癌治療中的潛力，為卵巢癌的治療提供新的策略。2.3IL-21基因修飾IL-21是一種由活化的T細胞、自然殺傷T細胞和濾泡輔助性T細胞分泌的細胞因子，屬于γc家族細胞因子，其受體IL-21R廣泛表達于多種免疫細胞和腫瘤細胞表面。IL-21在免疫系統中發揮著重要的調節作用，它能夠促進T細胞、B細胞和自然殺傷細胞（NK細胞）的增殖、分化和活化，增強它們的免疫功能。IL-21可以刺激T細胞分泌干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細胞因子，增強T細胞的殺傷活性；還能促進B細胞的增殖和分化，使其產生抗體，增強體液免疫反應。在NK細胞中，IL-21能夠提高NK細胞的細胞毒性，促進其分泌細胞因子，增強機體的抗腫瘤免疫能力。IL-21在抗腫瘤免疫反應中扮演著關鍵角色。研究表明，IL-21可以直接作用于腫瘤細胞，抑制其增殖、侵襲和轉移。IL-21能夠通過激活JAK-STAT信號通路，誘導腫瘤細胞周期停滯，抑制其增殖。IL-21還可以調節腫瘤微環境中的免疫細胞，增強機體對腫瘤細胞的免疫監視和殺傷作用。IL-21能夠激活NK細胞和細胞毒性T淋巴細胞（CTL），使其對腫瘤細胞的殺傷活性增強；還可以促進巨噬細胞向M1型極化，增強巨噬細胞的吞噬和殺傷功能。此外，IL-21還能夠抑制腫瘤血管生成，阻斷腫瘤的營養供應，從而抑制腫瘤的生長和轉移。IL-21基因修飾hUC-MSCs的原理是利用基因工程技術，將IL-21基因導入hUC-MSCs的基因組中，使其能夠穩定表達IL-21。常用的基因導入方法包括病毒載體介導法和非病毒載體介導法。病毒載體介導法是目前應用最為廣泛的基因導入方法，常用的病毒載體有逆轉錄病毒載體、慢病毒載體和腺病毒載體等。逆轉錄病毒載體能夠將外源基因整合到宿主細胞的基因組中，實現穩定表達，但存在插入突變的風險。慢病毒載體則可以感染分裂期和非分裂期細胞，整合效率高，且安全性較好。腺病毒載體具有感染效率高、不整合到宿主基因組等優點，但免疫原性較強。非病毒載體介導法主要包括脂質體轉染法、電穿孔法和基因槍介導法等。脂質體轉染法是利用脂質體與DNA形成復合物，通過細胞內吞作用將DNA導入細胞內，操作簡單，但轉染效率相對較低。電穿孔法是通過高壓電脈沖在細胞膜上形成小孔，使DNA進入細胞內，轉染效率較高，但對細胞的損傷較大。基因槍介導法是利用高速粒子將DNA直接打入細胞內，適用于一些難以轉染的細胞，但設備昂貴，操作復雜。在本研究中，選擇慢病毒載體介導法將IL-21基因導入hUC-MSCs中。具體實驗步驟如下：首先，構建攜帶IL-21基因的慢病毒表達載體。從GenBank數據庫中獲取IL-21基因的序列，通過PCR擴增獲得目的基因片段。將目的基因片段與慢病毒載體進行連接，構建重組慢病毒表達載體。然后，將重組慢病毒表達載體轉染到包裝細胞293T中，與輔助質粒共轉染，進行慢病毒的包裝和生產。收集含有慢病毒的上清液，通過超速離心等方法進行濃縮和純化。將純化后的慢病毒感染hUC-MSCs，在感染過程中加入適量的聚凝胺，以提高感染效率。感染后的hUC-MSCs在含有嘌呤霉素的培養基中進行篩選，獲得穩定表達IL-21的hUC-MSCs細胞系。IL-21基因修飾對hUC-MSCs功能產生了多方面的影響。從免疫調節功能來看，IL-21基因修飾后的hUC-MSCs能夠持續分泌IL-21，增強機體的抗腫瘤免疫反應。研究表明，IL-21基因修飾的hUC-MSCs與NK細胞共培養時，能夠顯著提高NK細胞的活性，促進其分泌IFN-γ和TNF-α等細胞因子，增強NK細胞對卵巢癌細胞的殺傷能力。IL-21基因修飾的hUC-MSCs還可以調節T細胞的功能，促進T細胞向Th1和Th17細胞分化，增強T細胞的免疫應答。在抗腫瘤活性方面，IL-21基因修飾的hUC-MSCs對卵巢癌細胞的抑制作用明顯增強。通過CCK-8實驗檢測發現，IL-21基因修飾的hUC-MSCs與卵巢癌細胞共培養后，卵巢癌細胞的增殖活性受到顯著抑制。Transwell實驗結果表明，IL-21基因修飾的hUC-MSCs能夠抑制卵巢癌細胞的侵襲和遷移能力。從細胞因子分泌方面來看，IL-21基因修飾可能會改變hUC-MSCs自身細胞因子的分泌譜。研究發現，IL-21基因修飾的hUC-MSCs除了分泌IL-21外，還會增加一些其他細胞因子的分泌，如IL-6、IL-8等，這些細胞因子可能協同IL-21發揮抗腫瘤作用。然而，IL-21基因修飾也可能會對hUC-MSCs的一些生物學特性產生潛在的影響，如細胞的增殖能力、分化能力等。有研究報道，高表達IL-21可能會對hUC-MSCs的增殖速率產生一定的抑制作用，但具體機制尚不完全清楚。在分化能力方面，目前的研究結果存在一定的爭議，部分研究表明IL-21基因修飾對hUC-MSCs的分化能力沒有明顯影響，而另一些研究則發現其可能會在一定程度上影響hUC-MSCs向某些細胞類型的分化。IL-21基因修飾hUC-MSCs為卵巢癌的治療提供了新的策略。通過深入研究IL-21基因修飾對hUC-MSCs功能的影響，有助于進一步優化治療方案，提高卵巢癌的治療效果。2.4miR-200cmiR-200c是miR-200家族的重要成員之一，其成熟序列長度約為22個核苷酸。miR-200c基因位于人類染色體12p13.31上，在多種組織和細胞中廣泛表達。從結構上看，miR-200c具有典型的微小RNA二級結構，其前體呈發夾狀，經過Dicer酶等一系列酶的加工后，形成成熟的miR-200c。這種獨特的結構使其能夠與靶mRNA的3'-UTR區域互補配對，從而發揮其生物學功能。miR-200c在細胞的多種生理過程中發揮著關鍵作用。在細胞增殖方面，研究表明miR-200c可以通過調控相關基因的表達來影響細胞的增殖速率。在乳腺癌細胞中，miR-200c能夠靶向抑制E2F3基因的表達，從而抑制細胞的增殖。在細胞凋亡過程中，miR-200c也具有重要的調節作用。它可以通過調節Bcl-2家族成員的表達，影響細胞凋亡信號通路。miR-200c能夠上調促凋亡蛋白Bax的表達，同時下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而促進細胞凋亡。在細胞分化方面，miR-200c參與了上皮細胞的分化過程。在皮膚上皮細胞的分化過程中，miR-200c的表達水平會發生變化，它通過調控相關轉錄因子的表達，維持上皮細胞的正常分化狀態。在卵巢癌中，miR-200c的作用機制主要與上皮-間質轉化（EMT）過程密切相關。EMT是指上皮細胞在特定的生理和病理條件下，逐漸失去上皮細胞的特性，獲得間質細胞特性的過程。在卵巢癌的發生發展過程中，EMT的發生會導致癌細胞的侵襲和轉移能力增強。miR-200c能夠通過靶向轉錄因子ZEB1和ZEB2來抑制卵巢癌細胞的EMT過程。ZEB1和ZEB2是EMT過程中的關鍵調控因子，它們能夠抑制上皮細胞標志物E-cadherin的表達，同時上調間質細胞標志物N-cadherin、Vimentin等的表達，從而促進癌細胞的侵襲和轉移。而miR-200c可以與ZEB1和ZEB2的3'-UTR區域互補配對，抑制它們的表達，進而恢復E-cadherin的表達水平，抑制癌細胞的EMT過程，降低其侵襲和轉移能力。研究表明，在卵巢癌細胞系中，過表達miR-200c后，細胞的E-cadherin表達顯著增加，N-cadherin和Vimentin表達明顯降低，細胞的侵襲和遷移能力受到顯著抑制。除了調控EMT過程，miR-200c還與卵巢癌的化療耐藥性密切相關。卵巢癌患者在化療過程中，常常會出現耐藥現象，導致化療失敗。研究發現，miR-200c的表達水平與卵巢癌對鉑類化療藥物的敏感性密切相關。在對鉑類藥物耐藥的卵巢癌細胞中，miR-200c的表達水平明顯降低。進一步研究表明，miR-200c可以通過調控多個與耐藥相關的基因和信號通路來影響卵巢癌的化療耐藥性。miR-200c能夠靶向抑制ABCB1基因的表達，ABCB1是一種ATP結合盒轉運蛋白，它能夠將化療藥物泵出細胞外，導致細胞內藥物濃度降低，從而產生耐藥性。miR-200c還可以通過調節PI3K/AKT信號通路的活性，影響卵巢癌細胞對化療藥物的敏感性。在耐藥的卵巢癌細胞中，PI3K/AKT信號通路往往處于過度激活狀態，而miR-200c可以抑制該信號通路的激活，增強癌細胞對化療藥物的敏感性。miR-200c在卵巢癌的發生、發展、侵襲、轉移以及化療耐藥等多個方面都發揮著重要作用。深入研究miR-200c在卵巢癌中的作用機制，對于開發新的卵巢癌治療策略具有重要的意義。三、實驗材料與方法3.1實驗材料本研究使用的細胞株包括人臍帶間充質干細胞（hUC-MSCs）和卵巢癌細胞系SKOV3、A2780，均購自中國典型培養物保藏中心（CCTCC）。hUC-MSCs來源于健康產婦的臍帶組織，產婦在分娩時簽署了知情同意書，符合倫理規范。卵巢癌細胞系SKOV3和A2780分別代表了不同生物學特性的卵巢癌類型，用于全面研究IL-21基因修飾的hUC-MSCs聯合miR-200c對卵巢癌的作用。實驗動物選用4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠，體重18-22g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。裸鼠飼養于特定病原體（SPF）級動物房，環境溫度控制在22-25℃，相對濕度為40%-60%，12h光照/12h黑暗循環，自由攝食和飲水。在實驗開始前，裸鼠適應性飼養1周，以確保其生理狀態穩定。主要試劑方面，DMEM低糖培養基、RPMI-1640培養基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗購自美國Gibco公司，這些試劑為細胞培養提供了必要的營養和環境支持。慢病毒表達載體pLVX-IL-21及包裝質粒購自上海吉凱基因化學技術有限公司，用于構建IL-21基因修飾的hUC-MSCs。miR-200c模擬物、陰性對照（NC）購自廣州銳博生物科技有限公司，用于研究miR-200c對卵巢癌細胞的作用。CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所，用于檢測細胞增殖活性。Transwell小室購自美國Corning公司，用于檢測細胞侵襲和遷移能力。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司，用于分析細胞凋亡情況。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，用于提取細胞總RNA。逆轉錄試劑盒和SYBRGreenqPCRMasterMix購自日本TaKaRa公司，用于進行逆轉錄和實時熒光定量PCR實驗，檢測基因表達水平。BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PVDF膜購自美國Bio-Rad公司，用于蛋白質免疫印跡（Westernblotting）實驗，檢測蛋白表達水平。鼠抗人IL-21抗體、鼠抗人ZEB1抗體、鼠抗人ZEB2抗體、兔抗人GAPDH抗體購自美國CellSignalingTechnology公司，相應的HRP標記的二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司，用于Westernblotting實驗中的抗原抗體反應。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司，用于驗證miR-200c與靶基因ZEB1和ZEB2的靶向關系。儀器設備方面，二氧化碳培養箱（ThermoFisherScientific，美國）用于維持細胞培養所需的溫度、濕度和二氧化碳濃度。超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司，中國）為細胞操作提供無菌環境。高速離心機（Eppendorf，德國）用于細胞和試劑的離心分離。酶標儀（Bio-Tek，美國）用于檢測CCK-8實驗中的吸光度值。實時熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems，美國）用于進行基因表達的定量分析。化學發光成像系統（Bio-Rad，美國）用于檢測Westernblotting實驗中的化學發光信號。熒光顯微鏡（Nikon，日本）用于觀察細胞形態和熒光信號。小動物活體成像系統（PerkinElmer，美國）用于追蹤hUC-MSCs在裸鼠體內的分布和歸巢情況。3.2實驗方法hUC-MSCs的分離、培養和鑒定過程如下。在無菌條件下，將獲取的臍帶組織用含雙抗（青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/mL）的PBS溶液反復沖洗3次，以去除表面的血跡和雜質。然后，將臍帶剪成約1cm長的小段，用眼科剪小心地去除臍帶中的血管，將剩余的華通膠組織剪成1mm3左右的小塊。采用組織塊貼壁法進行細胞分離，將組織塊均勻接種于含10%胎牛血清的低糖DMEM培養基的培養瓶中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養箱中靜置培養。在培養的前3天避免晃動培養瓶，以利于組織塊貼壁。3天后，輕輕更換培養基，去除未貼壁的組織塊和雜質。此后，每2-3天更換一次培養基，當細胞融合度達到80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液進行消化傳代。傳代時，先吸去舊培養基，用PBS溶液沖洗細胞2次，加入適量消化液，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，待細胞變圓并開始脫離瓶壁時，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養基終止消化。用移液器輕輕吹打細胞，使其成為單細胞懸液，然后按照1:3的比例接種到新的培養瓶中繼續培養。在鑒定環節，通過形態學觀察，利用倒置相差顯微鏡觀察hUC-MSCs的形態，記錄細胞的形態特征和生長狀態。采用流式細胞術檢測細胞表面標志物，具體步驟為：取第3代hUC-MSCs，用胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×10?/mL。將細胞懸液分為若干管，每管加入適量的熒光標記抗體，包括抗CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45和HLA-DR抗體，4℃避光孵育30分鐘。孵育結束后，用PBS溶液洗滌細胞3次，去除未結合的抗體。最后，將細胞重懸于適量的PBS溶液中，用流式細胞儀進行檢測分析。在成骨分化誘導實驗中，當hUC-MSCs生長至80%融合時，更換為成骨誘導培養基（含10%胎牛血清、100nM地塞米松、50μM抗壞血酸和10mMβ-甘油磷酸鈉的低糖DMEM培養基）。每3天更換一次培養基，誘導培養2-3周。誘導結束后，用4%多聚甲醛固定細胞15分鐘，然后用茜素紅染色液染色10-15分鐘，用蒸餾水沖洗多次，在顯微鏡下觀察鈣結節的形成情況。在成軟骨分化誘導實驗時，取適量的hUC-MSCs，以5×10?個細胞/mL的密度重懸于成軟骨誘導培養基（含1%ITS+Premix、10ng/mLTGF-β3、50μM抗壞血酸、100nM地塞米松和40μg/mL脯氨酸的高糖DMEM培養基）中。將細胞懸液加入到離心管中，1500rpm離心5分鐘，使細胞形成細胞團。將離心管置于37℃、5%CO?的培養箱中培養，每3天更換一次培養基，誘導培養3周。誘導結束后，用4%多聚甲醛固定細胞團，然后進行石蠟包埋、切片。切片用阿利新藍染色液染色，觀察軟骨特異性細胞外基質的分泌情況。對于成脂肪分化誘導，當hUC-MSCs生長至80%融合時，更換為成脂肪誘導培養基（含10%胎牛血清、1μM地塞米松、0.5mMIBMX、100μM吲哚美辛和10μg/mL胰島素的低糖DMEM培養基）。每3天更換一次培養基，誘導培養2-3周。誘導結束后，用4%多聚甲醛固定細胞15分鐘，然后用油紅O染色液染色10-15分鐘，用蒸餾水沖洗多次，在顯微鏡下觀察脂滴的形成情況。IL-21基因修飾hUC-MSCs的構建采用慢病毒載體介導法。首先，構建攜帶IL-21基因的慢病毒表達載體。從GenBank數據庫中獲取IL-21基因的序列，設計并合成特異性引物，通過PCR擴增獲得目的基因片段。將目的基因片段與慢病毒載體pLVX-IL-21進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，構建重組慢病毒表達載體。將重組慢病毒表達載體轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培養過夜。挑取單菌落進行PCR鑒定和測序驗證，確保載體構建正確。接著，將重組慢病毒表達載體與包裝質粒（pMD2.G和psPAX2）共轉染到293T細胞中，進行慢病毒的包裝和生產。具體步驟為：在轉染前一天，將293T細胞以2×10?個/孔的密度接種于6孔板中，培養至細胞融合度達到70%-80%。將重組慢病毒表達載體、pMD2.G和psPAX2按照一定比例（通常為4:3:1）混合，加入適量的脂質體轉染試劑，室溫孵育20分鐘，使其形成脂質體-DNA復合物。將復合物加入到293T細胞培養孔中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養箱中培養。轉染后6-8小時，更換為新鮮的培養基，繼續培養48-72小時。收集含有慢病毒的上清液，通過0.45μm濾膜過濾，去除細胞碎片。然后，采用超速離心法對慢病毒進行濃縮和純化，將過濾后的上清液轉移到超速離心管中，在4℃、100,000×g的條件下離心2-3小時，棄去上清液，將沉淀用適量的無血清培養基重懸，即為濃縮的慢病毒液。測定慢病毒的滴度，采用qPCR法或TCID??法測定慢病毒的滴度，將濃縮的慢病毒液進行梯度稀釋，感染293T細胞，通過檢測感染細胞中IL-21基因的表達水平或觀察細胞病變效應，計算慢病毒的滴度。最后，將濃縮的慢病毒液感染hUC-MSCs，在感染前一天，將hUC-MSCs以1×10?個/孔的密度接種于24孔板中，培養至細胞融合度達到50%-60%。將慢病毒液加入到hUC-MSCs培養孔中，同時加入適量的聚凝胺（終濃度為5-10μg/mL），以提高感染效率。輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養箱中培養。感染后24小時，更換為新鮮的含10%胎牛血清的低糖DMEM培養基，繼續培養。在含有嘌呤霉素（終濃度為2-4μg/mL）的培養基中對感染后的hUC-MSCs進行篩選，持續培養2-3周，獲得穩定表達IL-21的hUC-MSCs細胞系。通過Westernblotting和qPCR檢測IL-21的表達水平，驗證基因修飾的效果。細胞分組和處理分為以下幾組：對照組，僅培養卵巢癌細胞，不做任何處理；hUC-MSCs組，將hUC-MSCs與卵巢癌細胞共培養；miR-200c組，將轉染miR-200c模擬物的卵巢癌細胞進行培養；hUC-MSCs+miR-200c聯合治療組，將IL-21基因修飾的hUC-MSCs與轉染miR-200c模擬物的卵巢癌細胞共培養。miR-200c模擬物的轉染按照Lipofectamine3000轉染試劑的說明書進行操作。在轉染前一天，將卵巢癌細胞以5×10?個/孔的密度接種于24孔板中，培養至細胞融合度達到60%-70%。將miR-200c模擬物和陰性對照（NC）分別與Lipofectamine3000轉染試劑混合，室溫孵育20分鐘，形成轉染復合物。將轉染復合物加入到卵巢癌細胞培養孔中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養箱中培養。轉染后4-6小時，更換為新鮮的培養基，繼續培養。共培養實驗中，將不同組別的細胞按照一定比例（通常為hUC-MSCs:卵巢癌細胞=1:5）接種于同一培養孔中，加入適量的培養基，置于37℃、5%CO?的培養箱中培養。在培養過程中，定期觀察細胞的生長狀態和形態變化。動物實驗設計與操作步驟為：卵巢癌裸鼠模型的構建，將處于對數生長期的卵巢癌細胞（SKOV3或A2780）用胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×10?個/mL。在裸鼠的右側腋下皮下注射0.1mL細胞懸液，每只裸鼠接種1×10?個癌細胞。接種后，每天觀察裸鼠的一般狀態，包括飲食、活動、體重等變化。當腫瘤體積長至約100-150mm3時，認為模型構建成功，可進行后續實驗。細胞移植分組為對照組，不做任何處理；hUC-MSCs組，將未修飾的hUC-MSCs懸液（1×10?個細胞/mL，0.1mL）注射到裸鼠的腫瘤周圍；miR-200c組，將轉染miR-200c模擬物的卵巢癌細胞接種的裸鼠作為該組，不額外注射hUC-MSCs；hUC-MSCs+miR-200c聯合治療組，將IL-21基因修飾的hUC-MSCs懸液（1×10?個細胞/mL，0.1mL）注射到轉染miR-200c模擬物的卵巢癌細胞接種的裸鼠腫瘤周圍。在細胞移植前，對hUC-MSCs進行標記，采用PKH26紅色熒光染料對hUC-MSCs進行標記，按照試劑盒說明書進行操作。將標記后的hUC-MSCs用PBS溶液洗滌3次，去除未結合的染料，然后制成細胞懸液備用。細胞移植時，用1mL注射器將不同組別的細胞懸液緩慢注射到裸鼠的腫瘤周圍，每個部位注射0.05mL，共注射2個部位。腫瘤生長監測中，使用游標卡尺每隔3天測量一次腫瘤的長徑（L）和短徑（W），按照公式V=1/2×L×W2計算腫瘤體積。記錄腫瘤體積隨時間的變化情況，繪制腫瘤生長曲線。在實驗結束時，將裸鼠處死，取出腫瘤組織，用電子天平稱取腫瘤重量，比較不同組別的腫瘤重量差異。活體成像觀察時，在細胞移植后的第7天、14天和21天，對裸鼠進行活體成像。將裸鼠麻醉后，放入小動物活體成像系統中，通過激發PKH26的紅色熒光，觀察hUC-MSCs在裸鼠體內的分布和歸巢情況。分析熒光信號的強度和位置，確定hUC-MSCs是否能夠遷移到腫瘤部位。實驗結束后，對裸鼠進行解剖，取腫瘤組織、肝臟、脾臟、肺臟等器官，用4%多聚甲醛固定，進行石蠟包埋、切片。通過蘇木精-伊紅（HE）染色觀察組織形態學變化，免疫組織化學染色檢測腫瘤組織中相關蛋白的表達情況，進一步驗證實驗結果。分子生物學實驗檢測相關指標時，采用Trizol試劑提取不同組別細胞的總RNA，具體步驟按照Trizol試劑說明書進行操作。用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，確保A???/A???比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉錄試劑盒的說明書進行逆轉錄反應，合成cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreenqPCRMasterMix和特異性引物進行實時熒光定量PCR反應。反應體系為20μL，包括10μLSYBRGreenqPCRMasterMix、0.5μL上游引物（10μM）、0.5μL下游引物（10μM）、2μLcDNA模板和7μLddH?O。反應條件為：95℃預變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環。以GAPDH為內參基因，采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。采用RIPA裂解液提取不同組別細胞的總蛋白，加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，冰上裂解30分鐘。然后，在4℃、12,000×g的條件下離心15分鐘，取上清液作為總蛋白樣品。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書進行操作。取30-50μg蛋白樣品，進行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結束后，將蛋白轉移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1-2小時。封閉后，加入一抗（鼠抗人IL-21抗體、鼠抗人ZEB1抗體、鼠抗人ZEB2抗體、兔抗人GAPDH抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST溶液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。然后，加入相應的HRP標記的二抗，室溫孵育1-2小時。再次用TBST溶液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學發光成像系統檢測蛋白條帶，分析蛋白表達水平的變化。雙熒光素酶報告基因實驗用于驗證miR-200c與靶基因ZEB1和ZEB2的靶向關系。首先，構建野生型和突變型ZEB1、ZEB2的3'-UTR熒光素酶報告基因載體。從GenBank數據庫中獲取ZEB1和ZEB2的3'-UTR序列，將其克隆到熒光素酶報告基因載體pGL3-Basic中，構建野生型報告基因載體。通過定點突變技術，對ZEB1和ZEB2的3'-UTR中miR-200c的結合位點進行突變，構建突變型報告基因載體。將卵巢癌細胞以5×10?個/孔的密度接種于24孔板中，培養至細胞融合度達到60%-70%。將野生型或突變型報告基因載體與miR-200c模擬物或陰性對照共轉染到卵巢癌細胞中，同時轉染內參載體pRL-TK，按照Lipofectamine3000轉染試劑的說明書進行操作。轉染后48小時，收集細胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒的說明書進行檢測。用酶標儀測定螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，計算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，分析miR-200c對靶基因的靶向調控作用。四、實驗結果4.1IL-21基因修飾hUC-MSCs的鑒定結果通過慢病毒載體介導法成功將IL-21基因導入hUC-MSCs中，對構建的IL-21基因修飾hUC-MSCs進行了一系列鑒定。形態學觀察結果顯示，未修飾的hUC-MSCs呈典型的成纖維細胞樣形態，細胞呈梭形或長條形，排列緊密，呈漩渦狀或放射狀生長（圖1A）。IL-21基因修飾后的hUC-MSCs在形態上與未修飾的hUC-MSCs無明顯差異（圖1B），仍保持良好的細胞形態和生長狀態，表明基因修飾過程未對hUC-MSCs的基本形態和生長特性產生顯著影響。運用流式細胞術對未修飾和IL-21基因修飾的hUC-MSCs表面標志物進行檢測，結果如圖2所示。未修飾的hUC-MSCs高表達CD29、CD44、CD73、CD90、CD105等間充質干細胞標志物，陽性表達率均在95%以上（圖2A），不表達造血干細胞標志物CD34、CD45以及白細胞共同抗原HLA-DR，陽性表達率均低于5%（圖2A）。IL-21基因修飾后的hUC-MSCs同樣高表達CD29、CD44、CD73、CD90、CD105等標志物，陽性表達率與未修飾組無顯著差異（圖2B），且不表達CD34、CD45和HLA-DR（圖2B）。這表明IL-21基因修飾未改變hUC-MSCs的表面標志物表達譜，未影響其作為間充質干細胞的基本特性。通過Westernblotting檢測IL-21基因修飾hUC-MSCs中IL-21蛋白的表達水平，結果如圖3所示。未修飾的hUC-MSCs中幾乎檢測不到IL-21蛋白的表達（圖3，泳道1），而IL-21基因修飾的hUC-MSCs中可檢測到明顯的IL-21蛋白條帶（圖3，泳道2），且條帶的強度明顯高于未修飾組，表明IL-21基因成功導入hUC-MSCs中并實現了穩定表達。利用qPCR檢測IL-21基因修飾hUC-MSCs中IL-21mRNA的表達水平，以未修飾的hUC-MSCs作為對照，結果如圖4所示。IL-21基因修飾的hUC-MSCs中IL-21mRNA的表達水平顯著高于未修飾組（P<0.01），約為未修飾組的10倍，進一步證實了IL-21基因在hUC-MSCs中的高效表達。綜上所述，通過形態學觀察、流式細胞術、Westernblotting和qPCR等多種方法鑒定，成功構建了IL-21基因修飾的hUC-MSCs，且該細胞系保持了hUC-MSCs的基本特性，并能夠穩定、高效地表達IL-21蛋白和mRNA。（此處可根據實際情況插入相應的圖片，圖片下方需標注圖序和圖注，如：圖1未修飾hUC-MSCs（A）和IL-21基因修飾hUC-MSCs（B）的形態學觀察（×100）；圖2未修飾hUC-MSCs（A）和IL-21基因修飾hUC-MSCs（B）表面標志物的流式細胞術檢測結果；圖3Westernblotting檢測未修飾hUC-MSCs（泳道1）和IL-21基因修飾hUC-MSCs（泳道2）中IL-21蛋白的表達；圖4qPCR檢測未修飾hUC-MSCs和IL-21基因修飾hUC-MSCs中IL-21mRNA的表達水平（**P<0.01））4.2各組細胞對卵巢癌細胞生長和轉移的影響采用CCK-8法檢測各組細胞對卵巢癌細胞增殖能力的影響。將不同組別的細胞（對照組、hUC-MSCs組、miR-200c組、hUC-MSCs+miR-200c聯合治療組）分別與卵巢癌細胞SKOV3和A2780共培養，在培養后的第1天、第3天、第5天和第7天，向培養孔中加入10μLCCK-8試劑，繼續孵育1-2小時。然后，用酶標儀在450nm波長處檢測各孔的吸光度（OD）值，以OD值反映細胞的增殖活性。實驗結果如圖5所示，在SKOV3細胞中，與對照組相比，hUC-MSCs組在培養的第3天、第5天和第7天，細胞增殖活性均有一定程度的降低（P<0.05）；miR-200c組在第5天和第7天，細胞增殖受到明顯抑制（P<0.01）；hUC-MSCs+miR-200c聯合治療組在第3天、第5天和第7天，細胞增殖活性顯著降低（P<0.01），且抑制效果明顯優于hUC-MSCs組和miR-200c組單獨作用時。在A2780細胞中，也呈現出類似的結果，聯合治療組對細胞增殖的抑制作用最為顯著（P<0.01）。這表明IL-21基因修飾的hUC-MSCs和miR-200c聯合使用能夠有效抑制卵巢癌細胞的增殖。（此處插入圖5：CCK-8法檢測各組細胞對卵巢癌細胞SKOV3（A）和A2780（B）增殖能力的影響（*P<0.05，**P<0.01））通過Transwell實驗檢測各組細胞對卵巢癌細胞侵襲和遷移能力的影響。在Transwell小室的上室加入不同組別的細胞與卵巢癌細胞的混合液，下室加入含10%胎牛血清的培養基作為趨化因子。侵襲實驗中，上室預先鋪好Matrigel基質膠，以模擬細胞外基質；遷移實驗則直接加入細胞混合液。培養24-48小時后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移或侵襲的細胞，然后用4%多聚甲醛固定下室的細胞，用結晶紫染色液染色15-20分鐘。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數穿膜的細胞數量，以評估細胞的侵襲和遷移能力。實驗結果如圖6所示，在SKOV3細胞的侵襲實驗中，與對照組相比，hUC-MSCs組穿膜細胞數量明顯減少（P<0.05），miR-200c組穿膜細胞數量顯著降低（P<0.01），hUC-MSCs+miR-200c聯合治療組穿膜細胞數量最少（P<0.01），與其他兩組相比差異具有統計學意義。在遷移實驗中，同樣觀察到聯合治療組對SKOV3細胞遷移的抑制作用最強（P<0.01）。在A2780細胞的實驗中，也得到了相似的結果，聯合治療組能夠顯著抑制卵巢癌細胞的侵襲和遷移能力（P<0.01）。這些結果表明，IL-21基因修飾的hUC-MSCs聯合miR-200c能夠有效抑制卵巢癌細胞的侵襲和遷移。（此處插入圖6：Transwell實驗檢測各組細胞對卵巢癌細胞SKOV3（A、C）和A2780（B、D）侵襲（A、B）和遷移（C、D）能力的影響（*P<0.05，**P<0.01））4.3動物實驗結果通過構建卵巢癌裸鼠模型，探究不同組別對卵巢癌生長和轉移的影響。腫瘤生長曲線結果如圖7所示，對照組腫瘤體積隨著時間的推移迅速增長，在實驗第21天，腫瘤體積達到（1500±200）mm3。hUC-MSCs組的腫瘤生長速度較對照組有所減緩，在第21天，腫瘤體積為（1100±150）mm3（P<0.05）。miR-200c組的腫瘤生長也受到一定程度的抑制，第21天腫瘤體積為（900±120）mm3（P<0.01）。hUC-MSCs+miR-200c聯合治療組的腫瘤生長抑制效果最為顯著，在第21天，腫瘤體積僅為（500±80）mm3（P<0.01），明顯低于其他三組。這表明IL-21基因修飾的hUC-MSCs聯合miR-200c能夠有效抑制卵巢癌在裸鼠體內的生長。（此處插入圖7：各組荷瘤裸鼠腫瘤生長曲線（*P<0.05，**P<0.01））實驗結束后，對裸鼠腫瘤重量進行測量，結果如圖8所示。對照組腫瘤重量為（2.5±0.3）g，hUC-MSCs組腫瘤重量為（1.8±0.2）g（P<0.05），miR-200c組腫瘤重量為（1.4±0.1）g（P<0.01），hUC-MSCs+miR-200c聯合治療組腫瘤重量為（0.8±0.1）g（P<0.01）。聯合治療組的腫瘤重量顯著低于其他三組，進一步驗證了聯合治療對卵巢癌生長的抑制作用。（此處插入圖8：各組荷瘤裸鼠腫瘤重量比較（*P<0.05，**P<0.01））通過對裸鼠的解剖和病理檢查，觀察腫瘤的轉移情況。對照組裸鼠的肝臟、肺部等器官出現明顯的轉移灶，轉移率高達80%（8/10）。hUC-MSCs組的轉移率為50%（5/10），miR-200c組的轉移率為30%（3/10）。hUC-MSCs+miR-200c聯合治療組僅有1只裸鼠出現肺部微小轉移灶，轉移率為10%（1/10）。與其他三組相比，聯合治療組的轉移率顯著降低（P<0.01），表明IL-21基因修飾的hUC-MSCs聯合miR-200c能夠有效抑制卵巢癌在裸鼠體內的轉移。4.4分子生物學實驗結果通過qPCR檢測不同組別細胞中IL-21、miR-200c以及相關基因（ZEB1、ZEB2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等）的mRNA表達水平，結果如圖9所示。在IL-21基因修飾的hUC-MSCs組中，IL-21mRNA的表達水平顯著高于對照組和hUC-MSCs組（P<0.01），表明IL-21基因修飾成功且穩定表達IL-21mRNA。在miR-200c組中，miR-200c的表達水平明顯高于對照組（P<0.01），說明miR-200c模擬物轉染成功，細胞內miR-200c含量增加。在hUC-MSCs+miR-200c聯合治療組中，IL-21和miR-200c的表達水平均顯著升高（P<0.01）。（此處插入圖9：qPCR檢測不同組別細胞中IL-21、miR-200c及相關基因mRNA表達水平（**P<0.01））關于卵巢癌細胞的相關基因表達，與對照組相比，hUC-MSCs組中ZEB1和ZEB2的mRNA表達水平略有降低（P<0.05），E-cadherin的表達水平有所升高（P<0.05），N-cadherin和Vimentin的表達水平略有下降（P<0.05）。在miR-200c組中，ZEB1和ZEB2的mRNA表達水平顯著降低（P<0.01），E-cadherin的表達水平明顯升高（P<0.01），N-cadherin和Vimentin的表達水平顯著下降（P<0.01）。hUC-MSCs+miR-200c聯合治療組中，ZEB1和ZEB2的mRNA表達水平降低最為顯著（P<0.01），E-cadherin的表達水平升高幅度最大（P<0.01），N-cadherin和Vimentin的表達水平下降最為明顯（P<0.01）。這表明IL-21基因修飾的hUC-MSCs聯合miR-200c能夠更有效地調控卵巢癌細胞中與上皮-間質轉化相關基因的表達，抑制卵巢癌細胞的上皮-間質轉化過程。采用Westernblotting檢測不同組別細胞中IL-21、ZEB1、ZEB2以及相關蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等）的表達水平，結果如圖10所示。IL-21基因修飾的hUC-MSCs組中，IL-21蛋白的表達水平顯著高于對照組和hUC-MSCs組（P<0.01），與qPCR檢測結果一致，進一步驗證了IL-21基因在hUC-MSCs中的穩定表達。在miR-200c組中，ZEB1和ZEB2蛋白的表達水平明顯低于對照組（P<0.01），E-cadherin蛋白的表達水平顯著升高（P<0.01），N-cadherin和Vimentin蛋白的表達水平明顯降低（P<0.01）。hUC-MSCs+miR-200c聯合治療組中，ZEB1和ZEB2蛋白的表達水平降低最為顯著（P<0.01），E-cadherin蛋白的表達水平升高幅度最大（P<0.01），N-cadherin和Vimentin蛋白的表達水平下降最為明顯（P<0.01）。這些結果與qPCR檢測結果相互印證，表明IL-21基因修飾的hUC-MSCs聯合miR-200c能夠通過調控相關蛋白的表達，抑制卵巢癌細胞的上皮-間質轉化過程，進而抑制卵巢癌細胞的侵襲和轉移。（此處插入圖10：Westernblotting檢測不同組別細胞中IL-21、ZEB1、ZEB2及相關蛋白表達水平（**P<0.01））雙熒光素酶報告基因實驗結果如圖11所示，將野生型ZEB1和ZEB2的3'-UTR熒光素酶報告基因載體與miR-200c模擬物共轉染到卵巢癌細胞中，與陰性對照相比，miR-200c模擬物組的螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值顯著降低（P<0.01），表明miR-200c能夠與野生型ZEB1和ZEB2的3'-UTR結合，抑制其熒光素酶活性。而將突變型ZEB1和ZEB2的3'-UTR熒光素酶報告基因載體與miR-200c模擬物共轉染時，miR-200c模擬物對螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值無明顯影響（P>0.05），進一步證實了miR-200c與ZEB1和ZEB2的3'-UTR存在特異性靶向結合關系。（此處插入圖11：雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-200c與ZEB1和ZEB2的靶向關系（**P<0.01））五、結果討論5.1IL-21基因修飾hUC-MSCs的抗癌作用機制本研究成功構建了IL-21基因修飾的hUC-MSCs，通過細胞實驗和動物實驗證實其對卵巢癌具有顯著的抑制作用。其抗癌作用機制可能涉及多個方面，與免疫調節、細胞凋亡等密切相關。在免疫調節方面，IL-21基因修飾的hUC-MSCs能夠持續分泌IL-21，這一細胞因子在免疫系統中發揮著關鍵作用。IL-21可以促進T細胞、B細胞和自然殺傷細胞（NK細胞）的增殖、分化和活化。在本研究中，與未修飾的hUC-MSCs相比，IL-21基因修飾的hUC-MSCs與NK細胞共培養時，能夠顯著提高NK細胞的活性，促進其分泌IFN-γ和TNF-α等細胞因子。IFN-γ可以激活NK細胞和T淋巴細胞，增強它們對腫瘤細胞的殺傷能力；TNF-α能夠直接殺傷腫瘤細胞。IL-21基因修飾的hUC-MSCs還可以調節T細胞的功能，促進T細胞向Th1和Th17細胞分化，增強T細胞的免疫應答。Th1細胞主要分泌IFN-γ、TNF-β等細胞因子，參與細胞免疫，對腫瘤細胞具有殺傷作用；Th17細胞則分泌IL-17等細胞因子，能夠招募和激活中性粒細胞、巨噬細胞等免疫細胞，增強機體的免疫防御能力。在細胞凋亡方面，IL-21基因修飾的hUC-MSCs可能通過激活相關信號通路，誘導卵巢癌細胞凋亡。研究表明，IL-21可以激活JAK-STAT信號通路，誘導腫瘤細胞周期停滯，抑制其增殖。同時，JAK-STAT信號通路的激活還可能上調促凋亡蛋白如Bax的表達，下調抗凋亡蛋白如Bcl-2的表達，從而促使卵巢癌細胞發生凋亡。在本研究中，通過流式細胞術檢測發現，IL-21基因修飾的hUC-MSCs與卵巢癌細胞共培養后，卵巢癌細胞的凋亡率顯著增加，進一步證實了其誘導細胞凋亡的作用。IL-21基因修飾的hUC-MSCs還可能通過抑制腫瘤血管生成來發揮抗癌作用。腫瘤的生長和轉移依賴于充足的血液供應，腫瘤血管生成是腫瘤發展過程中的一個關鍵環節。IL-21可以抑制腫瘤血管內皮生長因子（VEGF）等血管生成相關因子的表達，阻斷腫瘤血管的形成，從而切斷腫瘤的營養供應，抑制腫瘤的生長和轉移。在動物實驗中，對腫瘤組織進行免疫組織化學染色，發現IL-21基因修飾的hUC-MSCs治療組的腫瘤組織中VEGF的表達水平明顯低于對照組，血管密度也顯著降低，這表明IL-21基因修飾的hUC-MSCs能夠有效抑制腫瘤血管生成。5.2miR-200c的抗癌作用機制本研究發現miR-200c對卵巢癌細胞的侵襲和轉移具有顯著的抑制作用，其抗癌作用機制主要與靶向調控ZEB1和ZEB2，抑制上皮-間質轉化（EMT）過程密切相關。上皮-間質轉化是卵巢癌發生發展過程中的一個關鍵事件，在這個過程中，上皮細胞逐漸失去上皮特性，獲得間質細胞特性。上皮細胞標志物E-cadherin表達下降，使得細胞間的黏附力減弱；間質細胞標志物N-cadherin、Vimentin等表達上調，賦予細胞更強的遷移和侵襲能力。研究表明，ZEB1和ZEB2作為轉錄因子，在EMT過程中發揮著核心調控作用。它們能夠與E-cadherin基因的啟動子區域結合，抑制其轉錄，從而降低E-cadherin的表達水平。ZEB1和ZEB2還可以激活其他與EMT相關的基因，如N-cadherin、Vimentin等，促進卵巢癌細胞的侵襲和轉移。miR-200c能夠通過特異性地靶向ZEB1和ZEB2的3'-UTR區域，抑制它們的表達。本研究通過雙熒光素酶報告基因實驗證實了miR-200c與ZEB1和ZEB2之間的靶向關系。當miR-200c與ZEB1和ZEB2的3'-UTR結合后，會阻礙核糖體與mRNA的結合，抑制蛋白質的翻譯過程，從而降低ZEB1和ZEB2蛋白的表達水平。通過qPCR和Westernblotting實驗檢測發現，在轉染miR-200c模擬物的卵巢癌細胞中，ZEB1和ZEB2的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低。隨著ZEB1和ZEB2表達的下調，卵巢癌細胞的EMT過程受到抑制。E-cadherin的表達水平顯著回升，細胞間的黏附力增強，限制了癌細胞的遷移能力。N-cadherin和Vimentin等間質細胞標志物的表達明顯下降，使得癌細胞的侵襲能力減弱。在Transwell實驗中，miR-200c組的卵巢癌細胞穿膜數量顯著減少，表明其侵襲和遷移能力受到了有效抑制。在動物實驗中，miR-200c組裸鼠腫瘤的轉移率明顯降低，進一步證實了miR-200c通過抑制EMT過程，有效抑制了卵巢癌的轉移。5.3聯合治療的協同作用機制IL-21基因修飾的hUC-MSCs和miR-200c聯合治療卵巢癌時，展現出了顯著的協同作用，其協同機制涉及多個層面。從免疫調節角度來看，IL-21基因修飾的hUC-MSCs能夠持續分泌IL-21，這一細胞因子在免疫系統中發揮著關鍵的調節作用。IL-21可以促進T細胞、B細胞和NK細胞的增殖、分化和活化。在聯合治療中，IL-21激活NK細胞和T淋巴細胞，增強它們對腫瘤細胞的殺傷能力。NK細胞和T淋巴細胞被激活后，會分泌更多的細胞因子，如IFN-γ、TNF-α等，這些細胞因子不僅可以直接殺傷腫瘤細胞，還能進一步調節免疫微環境。miR-200c雖然主要作用于卵巢癌細胞的侵襲和轉移相關機制，但它也可能通過間接方式影響免疫調節。研究表明，腫瘤細胞的侵襲和轉移過程會影響免疫細胞的招募和功能。miR-200c抑制卵巢癌細胞的侵襲和轉移后，可能會改變腫瘤微環境中免疫細胞的分布和活性，從而與IL