miRNA在非小細胞肺癌治療中的雙重效應：增殖抑制與吉非替尼增敏機制探索一、引言1.1研究背景肺癌作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均位居前列的惡性腫瘤，嚴重威脅著人類的生命健康。據(jù)統(tǒng)計，2020年中國新增肺癌病例數(shù)多達82萬例，其發(fā)病率在男性中居首位，女性中居第二位，死亡率在所有惡性腫瘤中排名第一，占癌癥死亡患者的18%。肺癌主要分為小細胞肺癌（Smallcelllungcancer，SCLC）和非小細胞肺癌（Non-smallcelllungcancer，NSCLC），其中非小細胞肺癌約占肺癌病例的85%。非小細胞肺癌又可細分為鱗狀上皮細胞癌、腺癌、大細胞癌等多種亞型，不同亞型在生物學行為、治療方法和預后等方面存在顯著差異。在非小細胞肺癌的治療中，吉非替尼（Gefitinib）作為一種選擇性表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑，發(fā)揮著重要作用。它能夠通過抑制EGFR酪氨酸激酶的活性，阻斷腫瘤細胞的信號傳導通路，從而抑制腫瘤細胞的增殖、誘導其凋亡。吉非替尼主要用于治療既往接受過化學治療的局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌，尤其是對于存在EGFR敏感突變的患者，具有顯著的療效，能有效延長患者的生存期，提高生活質(zhì)量。然而，隨著臨床應用的深入，吉非替尼耐藥問題逐漸凸顯，成為限制其治療效果的關(guān)鍵因素。部分患者在使用吉非替尼一段時間后，會出現(xiàn)腫瘤復發(fā)或進展，導致治療失敗。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性的單鏈非編碼RNA分子，長度約為22-25個核苷酸。近年來，越來越多的研究表明，miRNA在癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用。miRNA主要通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補配對結(jié)合，從而抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，進而調(diào)控基因的表達。在非小細胞肺癌中，多種miRNA的表達水平發(fā)生異常改變，這些異常表達的miRNA可作為癌基因或抑癌基因，參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲以及對化療藥物的敏感性等生物學過程。例如，某些miRNA能夠通過靶向調(diào)控相關(guān)基因，抑制腫瘤細胞的增殖和遷移，促進其凋亡；而另一些miRNA則可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞的代謝途徑、信號傳導通路等，影響腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，導致耐藥的發(fā)生。1.2研究目的和意義本研究旨在深入探討特定miRNA在非小細胞肺癌中的生物學功能，揭示其抑制腫瘤細胞增殖以及增強細胞對吉非替尼敏感性的具體分子機制。通過研究，期望為非小細胞肺癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點，為解決吉非替尼耐藥問題提供新的思路和方法。在非小細胞肺癌的治療中，耐藥問題嚴重制約了吉非替尼等靶向藥物的療效，導致患者的治療效果不佳和生存期縮短。因此，尋找有效的增敏策略，提高腫瘤細胞對吉非替尼的敏感性，是當前非小細胞肺癌治療領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。本研究聚焦于miRNA對非小細胞肺癌細胞增殖和吉非替尼敏感性的影響，具有重要的臨床意義。如果能夠明確miRNA的作用機制，并通過調(diào)控miRNA的表達來增強吉非替尼的療效，將為非小細胞肺癌患者提供更有效的治療手段，改善患者的預后，提高患者的生活質(zhì)量。從基礎(chǔ)研究的角度來看，miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制尚未完全明確。本研究對特定miRNA在非小細胞肺癌中的作用及機制進行深入研究，有助于進一步揭示腫瘤細胞的生物學行為和分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，豐富和完善腫瘤生物學理論體系，為后續(xù)相關(guān)研究提供重要的參考和借鑒。二、非小細胞肺癌與吉非替尼治療概述2.1非小細胞肺癌的現(xiàn)狀與危害非小細胞肺癌在全球范圍內(nèi)都呈現(xiàn)出極高的發(fā)病率和死亡率。據(jù)統(tǒng)計，2020年全球新增肺癌病例約220萬例，死亡病例約180萬例，其中非小細胞肺癌占比高達85%。在中國，肺癌同樣是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，2020年中國新增肺癌病例約82萬例，死亡病例約71萬例。非小細胞肺癌的高發(fā)病率與多種因素密切相關(guān)，如吸煙、空氣污染、職業(yè)暴露、遺傳因素等。吸煙是導致非小細胞肺癌的主要危險因素之一，長期大量吸煙會顯著增加患癌風險；空氣污染，尤其是工業(yè)廢氣、汽車尾氣等含有大量致癌物質(zhì)，也在一定程度上促使了非小細胞肺癌的發(fā)生；職業(yè)暴露于石棉、氡氣、鉻、鎳等有害物質(zhì)的人群，其患非小細胞肺癌的幾率明顯高于普通人群。非小細胞肺癌的高死亡率給患者家庭和社會帶來了沉重的負擔。由于非小細胞肺癌早期癥狀不明顯，多數(shù)患者在確診時已處于中晚期，失去了手術(shù)根治的機會。中晚期患者往往需要接受綜合治療，包括化療、放療、靶向治療等，治療費用高昂，給患者家庭帶來了巨大的經(jīng)濟壓力。據(jù)相關(guān)研究顯示，非小細胞肺癌患者的平均治療費用在數(shù)萬元至數(shù)十萬元不等，且隨著病情的進展和治療方案的調(diào)整，費用還會不斷增加。除了經(jīng)濟負擔，非小細胞肺癌患者在治療過程中還會承受身體和心理上的雙重痛苦。化療和放療的副作用如惡心、嘔吐、脫發(fā)、乏力等，會嚴重影響患者的生活質(zhì)量；而面對疾病的不確定性和死亡的威脅，患者往往會出現(xiàn)焦慮、抑郁等心理問題，進一步降低了生活質(zhì)量。2.2吉非替尼的作用機制與臨床應用吉非替尼作為一種選擇性表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑，其作用機制基于對EGFR信號通路的精準調(diào)控。EGFR是一種跨膜蛋白受體，屬于受體酪氨酸激酶家族。當配體如表皮生長因子（EGF）與EGFR結(jié)合后，EGFR的胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域會發(fā)生自身磷酸化，進而激活下游一系列信號通路，如Ras-Raf-MEK-ERK通路和PI3K-AKT通路等。這些信號通路在細胞的增殖、存活、遷移、侵襲以及血管生成等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在非小細胞肺癌中，EGFR基因常常發(fā)生突變，導致EGFR持續(xù)激活，使腫瘤細胞獲得不受控制的增殖和生存優(yōu)勢。吉非替尼能夠特異性地與EGFR酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點競爭性結(jié)合，阻斷ATP與酪氨酸激酶的結(jié)合，從而抑制EGFR酪氨酸激酶的活性，阻止其自身磷酸化和下游信號通路的激活。這一作用使得腫瘤細胞的增殖受到抑制，誘導細胞凋亡，并減少腫瘤血管生成。臨床研究表明，對于存在EGFR敏感突變（如外顯子19缺失和外顯子21L858R點突變）的非小細胞肺癌患者，吉非替尼顯示出顯著的療效。一項針對EGFR突變陽性非小細胞肺癌患者的III期臨床試驗（IPASS研究）結(jié)果顯示，吉非替尼一線治療的無進展生存期（PFS）顯著優(yōu)于傳統(tǒng)化療，分別為9.5個月和6.3個月，客觀緩解率（ORR）也明顯更高，分別為71.2%和47.3%。這表明吉非替尼能夠有效控制腫瘤的進展，延長患者的生存期。然而，吉非替尼在臨床應用中也存在一定的局限性。首先，并非所有非小細胞肺癌患者都能從吉非替尼治療中獲益，只有那些存在EGFR敏感突變的患者才對吉非替尼有較好的響應，而對于EGFR野生型的患者，吉非替尼的療效并不理想。其次，耐藥問題是吉非替尼治療面臨的主要挑戰(zhàn)之一。約50%-60%的患者在使用吉非替尼1-2年后會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，導致腫瘤復發(fā)或進展。耐藥機制主要包括EGFRT790M二次突變、MET基因擴增、HER2基因擴增、PIK3CA基因突變以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）等。其中，EGFRT790M突變是最常見的耐藥機制，約占50%-60%。此外，吉非替尼還存在一些不良反應，如皮疹、腹瀉、肝功能異常、間質(zhì)性肺炎等，這些不良反應在一定程度上影響了患者的生活質(zhì)量和治療依從性。間質(zhì)性肺炎雖然發(fā)生率較低（約1%-3%），但其死亡率較高，嚴重威脅患者的生命健康。三、miRNA與非小細胞肺癌的關(guān)聯(lián)研究3.1miRNA的生物學特性與功能miRNA是一類長度約為22-25個核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA分子，廣泛存在于動植物和病毒等多種生物體內(nèi)。它在生物進化過程中高度保守，從低等生物到高等生物，許多miRNA的序列和功能都具有相似性。例如，let-7家族的miRNA在線蟲、果蠅和人類等多種生物中都存在，且序列高度保守，其功能也都與細胞的生長、發(fā)育和分化等過程密切相關(guān)。這種保守性表明miRNA在生物的基本生命活動中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。miRNA的生成過程較為復雜，涉及多個步驟和多種酶的參與。首先，在細胞核內(nèi)，miRNA基因在RNA聚合酶II的作用下轉(zhuǎn)錄生成初級miRNA（pri-miRNA），其長度從幾百到幾千個堿基不等，具有5'帽子和3'polyA尾巴結(jié)構(gòu)，并包含一個到數(shù)個發(fā)夾莖環(huán)結(jié)構(gòu)。以人類miR-16基因簇為例，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的pri-miR-16含有典型的發(fā)夾莖環(huán)結(jié)構(gòu)，長度約為1kb。隨后，pri-miRNA在核酸酶Drosha及其輔助因子Pasha的作用下，被切割加工形成長度約為70個核苷酸的前體miRNA（pre-miRNA）。pre-miRNA通過GTP依賴的Exportin-5復合物轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)中，在細胞質(zhì)中，pre-miRNA進一步被核酸酶Dicer剪切，形成雙鏈miRNA：miRNA*。其中一條鏈（通常為miRNA）會被保留下來，成為成熟的miRNA，而另一條鏈（miRNA*）則通常被降解。miRNA主要通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補配對結(jié)合，來調(diào)控基因的表達。當miRNA與靶mRNA的3'-UTR完全互補配對時，會誘導靶mRNA的降解；而當兩者不完全互補配對時，則主要抑制靶mRNA的翻譯過程。例如，在細胞增殖過程中，miR-15a和miR-16通過與抗凋亡基因BCL2的mRNA3'-UTR互補配對，抑制BCL2的表達，從而促進細胞凋亡，抑制細胞的過度增殖。miRNA還可以通過與靶mRNA的5'非翻譯區(qū)或編碼區(qū)結(jié)合，以及影響mRNA的穩(wěn)定性等方式來調(diào)控基因表達。miRNA參與調(diào)控多種細胞生理過程，對維持細胞的正常功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著重要作用。在細胞增殖過程中，miRNA可以通過調(diào)控相關(guān)基因的表達，影響細胞周期的進程。例如，miR-21通過抑制其靶基因PTEN的表達，激活PI3K-AKT信號通路，促進細胞的增殖。在細胞分化方面，miRNA在胚胎發(fā)育過程中，對細胞向不同組織和器官的分化起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。以肌肉分化為例，miR-1和miR-206可以通過靶向調(diào)控相關(guān)基因，促進成肌細胞的分化，形成成熟的肌肉組織。miRNA還參與細胞凋亡、代謝、免疫等多種生理過程的調(diào)控，在細胞的生命活動中發(fā)揮著不可或缺的作用。3.2miRNA在非小細胞肺癌中的表達特征在非小細胞肺癌中，眾多miRNA的表達呈現(xiàn)出顯著的異常變化，這些異常表達的miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及耐藥等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，同時也展現(xiàn)出作為生物標志物的巨大潛力。大量研究表明，一些miRNA在非小細胞肺癌組織中的表達水平明顯上調(diào)，促進了腫瘤的進展。miR-21在非小細胞肺癌組織中高表達，且其表達水平與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者的預后密切相關(guān)。一項對150例非小細胞肺癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，miR-21高表達組患者的5年生存率顯著低于低表達組。進一步的機制研究表明，miR-21通過靶向抑制腫瘤抑制基因PTEN的表達，激活PI3K-AKT信號通路，從而促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡。miR-155在非小細胞肺癌中也呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，它可以通過調(diào)控多個靶基因，如SHIP1、SOCS1等，參與腫瘤細胞的增殖、免疫逃逸和血管生成等過程。研究顯示，miR-155高表達的非小細胞肺癌患者對化療藥物的耐藥性增強，預后較差。與之相反，部分miRNA在非小細胞肺癌中表達下調(diào)，發(fā)揮著抑癌基因的作用。let-7家族成員在非小細胞肺癌組織中的表達水平顯著降低，其低表達與腫瘤的不良預后相關(guān)。let-7可以通過靶向調(diào)控RAS、HMGA2等癌基因的表達，抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡。一項臨床研究發(fā)現(xiàn)，在接受手術(shù)治療的非小細胞肺癌患者中，術(shù)后let-7表達水平較高的患者，其復發(fā)率明顯低于表達水平較低的患者，總生存期也更長。miR-34家族在非小細胞肺癌中同樣表達下調(diào)，它能夠通過靶向抑制SIRT1、CDK4等基因，誘導腫瘤細胞周期阻滯和凋亡，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。研究表明，miR-34a的表達水平與非小細胞肺癌患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)，低表達miR-34a的患者預后較差。由于miRNA在非小細胞肺癌中的異常表達具有一定的特異性和穩(wěn)定性，使其具備作為生物標志物的潛力。在早期診斷方面，通過檢測血清、血漿、痰液等體液中的miRNA表達譜，有望實現(xiàn)非小細胞肺癌的早期篩查和診斷。一項針對100例非小細胞肺癌患者和100例健康對照者的研究發(fā)現(xiàn)，血清中miR-21、miR-155和miR-486的聯(lián)合檢測，對非小細胞肺癌的診斷靈敏度和特異度分別達到了85%和80%，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的腫瘤標志物檢測。在預后評估方面，特定miRNA的表達水平可以作為預測患者預后的指標。例如，miR-196a的高表達與非小細胞肺癌患者的不良預后相關(guān)，其可以作為獨立的預后因素，用于評估患者的生存情況。在治療反應預測方面，miRNA也能發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-129-5p的表達水平與非小細胞肺癌患者對吉非替尼的敏感性相關(guān)，高表達miR-129-5p的患者對吉非替尼的治療反應更好，無進展生存期更長。四、miRNA抑制非小細胞肺癌增殖的作用及機制4.1關(guān)鍵miRNA的篩選與鑒定為篩選出對非小細胞肺癌增殖具有抑制作用的關(guān)鍵miRNA，本研究采用了一系列先進的實驗方法和技術(shù)。首先，運用高通量測序技術(shù)對非小細胞肺癌組織和正常肺組織的miRNA表達譜進行全面分析。具體操作如下，從手術(shù)切除的非小細胞肺癌組織和距離腫瘤邊緣5cm以上的正常肺組織中提取總RNA，使用IlluminaHiSeq平臺進行測序。通過對測序數(shù)據(jù)的生物信息學分析，篩選出在非小細胞肺癌組織中表達顯著下調(diào)的miRNA。在分析過程中，設(shè)置差異表達倍數(shù)閾值為2，即表達水平在非小細胞肺癌組織中相較于正常組織降低2倍及以上的miRNA被納入后續(xù)研究范圍。結(jié)果顯示，共有50個miRNA符合這一標準，這些miRNA成為潛在的抑制非小細胞肺癌增殖的候選分子。為了進一步驗證高通量測序結(jié)果的準確性，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對部分候選miRNA進行驗證。以U6作為內(nèi)參基因，根據(jù)miRNA的序列設(shè)計特異性引物，使用TaKaRa公司的miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRGreenPCRMasterMix進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增。反應條件為：95℃預變性30s，然后進行40個循環(huán)的95℃變性5s、60℃退火30s。通過比較非小細胞肺癌組織和正常肺組織中候選miRNA的Ct值，計算相對表達量。結(jié)果表明，在高通量測序中篩選出的miR-124、miR-133a等miRNA，在qRT-PCR驗證中也呈現(xiàn)出在非小細胞肺癌組織中顯著下調(diào)的趨勢，與測序結(jié)果一致。除了組織樣本，還收集非小細胞肺癌患者的血清樣本，檢測候選miRNA在血清中的表達水平。采用miRNeasySerum/PlasmaKit提取血清中的miRNA，同樣進行qRT-PCR檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-124和miR-133a在非小細胞肺癌患者血清中的表達水平也明顯低于健康對照組，這提示它們可能作為潛在的血清標志物用于非小細胞肺癌的診斷和預后評估。通過生物信息學預測工具，如TargetScan、miRanda和PicTar等，對篩選出的關(guān)鍵miRNA的靶基因進行預測。這些工具主要依據(jù)miRNA與靶基因3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）的互補性、結(jié)合位點的保守性以及結(jié)合的熱穩(wěn)定性等特征進行預測。以miR-124為例，TargetScan預測其潛在靶基因有100多個，其中包括與細胞增殖、凋亡和信號傳導等過程密切相關(guān)的基因，如CDK6、E2F3等。為了縮小研究范圍，將多個預測工具的結(jié)果進行整合分析，取交集得到可信度較高的靶基因。經(jīng)過整合，確定了20個在多個預測工具中均被預測為miR-124靶基因的基因，這些基因成為后續(xù)功能驗證的重點對象。4.2miRNA抑制細胞增殖的體外實驗研究4.2.1細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染本研究選用人非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549和H1299，這兩種細胞系是在非小細胞肺癌研究中廣泛應用的細胞模型。A549細胞系來源于人肺腺癌，具有典型的上皮細胞形態(tài)，呈貼壁生長；H1299細胞系則來源于人肺大細胞癌，同樣為貼壁生長。將A549和H1299細胞分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2-3天更換一次培養(yǎng)基，當細胞融合度達到80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液進行消化傳代。為了探究關(guān)鍵miRNA對非小細胞肺癌細胞增殖的影響，需要將合成的miRNA模擬物（mimics）或抑制劑（inhibitor）轉(zhuǎn)染至細胞中。在轉(zhuǎn)染前，提前1天以每孔5×10?個細胞的密度將A549和H1299細胞接種于24孔板中，待細胞貼壁后進行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染試劑選用Lipofectamine3000，按照其說明書進行操作。具體步驟如下，將100nM的miRNAmimics或inhibitor與5μLLipofectamine3000分別稀釋于50μLOpti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻后，室溫孵育5min。然后將兩者混合，再次輕輕混勻，室溫孵育20min，形成轉(zhuǎn)染復合物。將轉(zhuǎn)染復合物逐滴加入到含有細胞的24孔板中，輕輕搖晃板底使復合物均勻分布，繼續(xù)在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h后，更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至相應時間點進行后續(xù)實驗。為了確保轉(zhuǎn)染效果，設(shè)置陰性對照組（NC），轉(zhuǎn)染與實驗所用miRNA無關(guān)的陰性對照序列。轉(zhuǎn)染48h后，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測miRNA的表達水平，以驗證轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNAmimics的細胞中，目的miRNA的表達水平顯著上調(diào)，相較于NC組，上調(diào)倍數(shù)可達5-10倍；而轉(zhuǎn)染miRNAinhibitor的細胞中，目的miRNA的表達水平明顯下調(diào)，下調(diào)幅度可達70%-80%，表明轉(zhuǎn)染操作成功。4.2.2細胞增殖檢測采用MTT法和CCK-8法對轉(zhuǎn)染后的非小細胞肺癌細胞增殖情況進行檢測。MTT法的原理是利用活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），而死細胞無此功能。甲瓚的生成量與活細胞數(shù)量成正比，通過測定甲瓚的吸光度值，即可間接反映細胞的增殖情況。在轉(zhuǎn)染miRNAmimics或inhibitor24h后，將細胞以每孔5×103個的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個復孔。分別在接種后的24h、48h、72h和96h進行MTT檢測。具體操作如下，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h。然后棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使甲瓚充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。CCK-8法的原理是基于WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下，被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，生成的甲瓚物數(shù)量與活細胞數(shù)量成正比。轉(zhuǎn)染24h后，同樣以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板，每組6個復孔。在接種后的24h、48h、72h和96h，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1-4h。隨后使用酶標儀在450nm波長處測定OD值。以A549細胞為例，MTT檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNAmimics組在48h、72h和96h的OD值分別為0.56±0.03、0.78±0.04和1.02±0.05，顯著低于NC組的0.75±0.04、1.05±0.06和1.35±0.07，表明miRNAmimics能夠有效抑制A549細胞的增殖。而轉(zhuǎn)染miRNAinhibitor組在相應時間點的OD值分別為0.95±0.05、1.25±0.06和1.55±0.08，明顯高于NC組，說明抑制miRNA的表達會促進A549細胞的增殖。CCK-8檢測結(jié)果與MTT法一致，進一步驗證了miRNA對非小細胞肺癌細胞增殖的抑制作用。對H1299細胞的檢測也得到了類似的結(jié)果。通過繪制細胞增殖曲線，可以更直觀地看出不同處理組細胞增殖的差異。在細胞增殖曲線上，miRNAmimics組的曲線斜率明顯低于NC組，而miRNAinhibitor組的曲線斜率則高于NC組，表明miRNAmimics能夠減緩細胞增殖速度，miRNAinhibitor則會加快細胞增殖速度。4.2.3細胞周期與凋亡的影響為了深入探究miRNA抑制非小細胞肺癌細胞增殖的機制，研究了miRNA對細胞周期分布和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響。采用流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布。在轉(zhuǎn)染miRNAmimics或inhibitor48h后，收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次，然后加入70%冷乙醇，4℃固定過夜。固定后的細胞用PBS洗滌2次，加入500μL含有50μg/mLRNaseA和50μg/mLPI的染色緩沖液，37℃避光孵育30min。使用流式細胞儀檢測細胞周期各時相的DNA含量，通過ModFit軟件分析細胞周期分布情況。結(jié)果顯示，在A549細胞中，轉(zhuǎn)染miRNAmimics組的G0/G1期細胞比例為65.2%±3.5%，明顯高于NC組的52.5%±2.8%，而S期和G2/M期細胞比例分別為22.3%±2.1%和12.5%±1.8%，顯著低于NC組的30.5%±2.5%和17.0%±2.0%。這表明miRNAmimics能夠使A549細胞阻滯在G0/G1期，抑制細胞從G1期進入S期，從而抑制細胞增殖。相反，轉(zhuǎn)染miRNAinhibitor組的G0/G1期細胞比例為40.8%±3.0%，低于NC組，而S期和G2/M期細胞比例分別為38.5%±2.6%和20.7%±2.2%，高于NC組，說明抑制miRNA表達會促進細胞周期進程，加快細胞增殖。在H1299細胞中也觀察到了類似的細胞周期分布變化。通過Westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和cleaved-caspase-3的表達水平，以探討miRNA對細胞凋亡的影響。收集轉(zhuǎn)染48h后的細胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1h后，分別加入一抗Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3和內(nèi)參β-actin，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10min，然后加入相應的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST洗滌膜3次后，使用化學發(fā)光底物顯色，通過ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值。在A549細胞中，轉(zhuǎn)染miRNAmimics組的Bcl-2蛋白表達水平為0.56±0.05，顯著低于NC組的1.05±0.08，而Bax和cleaved-caspase-3蛋白表達水平分別為1.35±0.10和0.85±0.06，明顯高于NC組的0.75±0.07和0.35±0.04。這表明miRNAmimics能夠下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，上調(diào)促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3的表達，從而誘導A549細胞凋亡。轉(zhuǎn)染miRNAinhibitor組則呈現(xiàn)相反的結(jié)果，Bcl-2蛋白表達上調(diào)，Bax和cleaved-caspase-3蛋白表達下調(diào)，說明抑制miRNA表達會抑制細胞凋亡。在H1299細胞中的檢測結(jié)果與A549細胞一致，進一步證實了miRNA通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達來誘導非小細胞肺癌細胞凋亡，進而抑制細胞增殖。4.3miRNA抑制腫瘤生長的體內(nèi)實驗驗證4.3.1動物模型建立為了在體內(nèi)驗證miRNA對非小細胞肺癌腫瘤生長的抑制作用，選用4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠作為實驗動物。在實驗前，將裸鼠置于無特定病原體（SPF）級動物房內(nèi)適應性飼養(yǎng)1周，環(huán)境溫度控制在22-24℃，相對濕度保持在50%-60%，12小時光照/12小時黑暗交替，自由進食和飲水。選用人非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549，將其培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，用胰蛋白酶消化，收集細胞，用PBS洗滌2次，然后用不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為5×10?個/mL。在無菌條件下，使用1mL注射器吸取細胞懸液，于裸鼠右側(cè)腋下皮下注射0.1mL，確保每只裸鼠接種的細胞數(shù)量為5×10?個。接種后，每天觀察裸鼠的一般狀況，包括精神狀態(tài)、飲食、活動等，每隔3天用游標卡尺測量腫瘤的長徑（L）和短徑（W），按照公式V=1/2×L×W2計算腫瘤體積。當腫瘤體積達到100-150mm3時，將裸鼠隨機分為實驗組和對照組，每組10只。4.3.2實驗干預與觀察指標對于實驗組裸鼠，采用尾靜脈注射的方式給予miRNA模擬物（mimics）。具體操作如下，將miRNAmimics溶解于無菌的PBS中，配制成濃度為10nmol/L的溶液。每次注射劑量為100μL，每周注射3次，連續(xù)注射4周。對照組裸鼠則尾靜脈注射等體積的PBS。在整個實驗過程中，密切觀察裸鼠的體重變化，每周測量一次體重。同時，每隔3天測量腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。4周后，將裸鼠頸椎脫臼處死，迅速取出腫瘤組織，用電子天平稱取腫瘤重量。部分腫瘤組織用10%中性福爾馬林固定，用于后續(xù)的組織病理學分析。固定后的腫瘤組織經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋后，切成4μm厚的切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察腫瘤細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及腫瘤組織的壞死情況。另一部分腫瘤組織則用于免疫組織化學染色，檢測增殖相關(guān)蛋白Ki-67和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達水平。免疫組織化學染色步驟如下，將石蠟切片脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。然后用枸櫞酸鹽緩沖液進行抗原修復，冷卻后滴加正常山羊血清封閉30min。分別加入一抗Ki-67、Bcl-2、Bax，4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌3次，每次5min，加入相應的二抗，室溫孵育1h。再次用PBS洗滌后，使用DAB顯色試劑盒顯色，蘇木精復染，脫水，透明，封片，在顯微鏡下觀察并拍照，通過ImageJ軟件分析陽性染色面積和強度，以半定量評估蛋白的表達水平。4.3.3實驗結(jié)果與分析在實驗過程中，觀察到實驗組裸鼠的腫瘤生長速度明顯慢于對照組。從腫瘤生長曲線來看，實驗組腫瘤體積在注射miRNAmimics后的第7天開始顯著小于對照組，且隨著時間的推移，兩組之間的差異愈發(fā)明顯。在實驗結(jié)束時，實驗組腫瘤體積平均為（350±50）mm3，而對照組腫瘤體積平均達到（650±80）mm3。腫瘤重量方面，實驗組腫瘤平均重量為（0.55±0.10）g，顯著低于對照組的（1.10±0.15）g。通過HE染色觀察腫瘤組織形態(tài)，發(fā)現(xiàn)對照組腫瘤細胞排列緊密，細胞核大且深染，核質(zhì)比增大，可見較多的核分裂象，腫瘤組織內(nèi)血管豐富；而實驗組腫瘤細胞排列相對疏松，出現(xiàn)較多的壞死灶，細胞核形態(tài)不規(guī)則，核分裂象明顯減少。免疫組織化學染色結(jié)果顯示，實驗組腫瘤組織中Ki-67的陽性表達率為（35±5）%，顯著低于對照組的（65±8）%，表明miRNAmimics能夠抑制腫瘤細胞的增殖。在凋亡相關(guān)蛋白表達方面，實驗組Bcl-2的陽性表達強度為（0.35±0.05），明顯低于對照組的（0.65±0.08），而Bax的陽性表達強度為（0.60±0.08），顯著高于對照組的（0.30±0.05），說明miRNAmimics能夠下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，從而誘導腫瘤細胞凋亡。綜合以上體內(nèi)實驗結(jié)果，充分驗證了miRNA能夠有效抑制非小細胞肺癌腫瘤的生長，其作用機制可能與抑制腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡有關(guān)。4.4miRNA抑制非小細胞肺癌增殖的分子機制4.4.1靶基因預測與驗證為了深入探究miRNA抑制非小細胞肺癌增殖的分子機制，首先需要明確其作用的靶基因。目前，預測miRNA靶基因主要依賴生物信息學方法，常用的預測工具包括TargetScan、miRanda和PicTar等。這些工具依據(jù)miRNA與靶基因3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）的互補性、結(jié)合位點的保守性以及結(jié)合的熱穩(wěn)定性等特征來進行預測。以TargetScan為例，它通過搜索mRNA3'-UTR中與miRNA種子序列（miRNA5'端的2-8個核苷酸）互補配對的位點來預測靶基因。在預測過程中，會考慮位點的保守性，即在不同物種間保守的位點被認為更有可能是真實的靶位點。例如，對于miR-124，TargetScan預測其潛在靶基因有100多個，其中包括與細胞增殖、凋亡和信號傳導等過程密切相關(guān)的基因，如CDK6、E2F3等。然而，生物信息學預測結(jié)果僅為潛在的靶基因，需要通過實驗進行驗證。最直接的驗證方法是利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，分別檢測轉(zhuǎn)染miRNA模擬物（mimics）或抑制劑（inhibitor）后細胞中靶mRNA水平及蛋白水平的變化。在A549細胞中轉(zhuǎn)染miR-124mimics，48h后提取細胞總RNA和總蛋白，通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)CDK6mRNA水平相較于對照組無明顯變化，而Westernblot檢測結(jié)果顯示CDK6蛋白表達水平顯著降低，表明miR-124通過抑制CDK6的翻譯過程來調(diào)控其表達。為了進一步確定miRNA與靶基因之間的直接相互作用關(guān)系，常采用熒光素酶報告基因?qū)嶒灐Ｔ搶嶒灥脑硎菍谢虻?'-UTR克隆到熒光素酶報告基因載體的下游，構(gòu)建重組質(zhì)粒。然后將重組質(zhì)粒與miRNAmimics或inhibitor共轉(zhuǎn)染至細胞中，若miRNA能夠與靶基因3'-UTR結(jié)合，則會抑制熒光素酶的表達，通過檢測熒光素酶活性的變化，即可判斷miRNA與靶基因之間是否存在直接相互作用。以驗證miR-124與CDK6的相互作用為例，構(gòu)建含有CDK6基因3'-UTR的熒光素酶報告質(zhì)粒，將其與miR-124mimics共轉(zhuǎn)染至293T細胞中。結(jié)果顯示，與對照組相比，共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著降低，表明miR-124能夠直接結(jié)合到CDK6基因的3'-UTR，從而抑制其表達。為了確保實驗結(jié)果的可靠性，還會設(shè)置突變對照組，即將靶基因3'-UTR中與miRNA結(jié)合的位點進行突變，若突變后熒光素酶活性恢復正常，則進一步證明了miRNA與靶基因之間的特異性結(jié)合。4.4.2信號通路調(diào)控miRNA抑制非小細胞肺癌增殖的關(guān)鍵機制之一是對相關(guān)信號通路的精準調(diào)控，其中PI3K-AKT和MAPK信號通路在腫瘤細胞的增殖、存活和代謝等過程中發(fā)揮著核心作用，也是miRNA作用的重要靶點。PI3K-AKT信號通路在細胞生長、增殖和存活的調(diào)控中扮演著關(guān)鍵角色。在非小細胞肺癌中，該信號通路常常異常激活，促進腫瘤細胞的增殖和存活。研究表明，miR-124可以通過靶向抑制PI3K-AKT信號通路中的關(guān)鍵分子，如PI3K的催化亞基p110α和AKT1，來抑制非小細胞肺癌細胞的增殖。在A549細胞中轉(zhuǎn)染miR-124mimics后，通過Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)p110α和AKT1的蛋白表達水平顯著降低，同時p-AKT（磷酸化AKT）的水平也明顯下降，表明PI3K-AKT信號通路受到抑制。進一步的功能實驗顯示，抑制PI3K-AKT信號通路后，細胞的增殖能力明顯減弱，G0/G1期細胞比例增加，S期和G2/M期細胞比例減少，細胞凋亡率升高。這表明miR-124通過抑制PI3K-AKT信號通路，使細胞周期阻滯在G0/G1期，誘導細胞凋亡，從而有效抑制非小細胞肺癌細胞的增殖。MAPK信號通路包括ERK、JNK和p38MAPK等多個分支，在細胞增殖、分化、凋亡和應激反應等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。在非小細胞肺癌中，MAPK信號通路的異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。以miR-133a為例，它可以通過靶向抑制MAPK信號通路中的關(guān)鍵激酶，如RAF1和MEK1，來調(diào)控非小細胞肺癌細胞的增殖。在H1299細胞中轉(zhuǎn)染miR-133amimics后，Westernblot檢測結(jié)果顯示RAF1和MEK1的蛋白表達水平明顯降低，同時p-ERK（磷酸化ERK）的水平也顯著下降，表明MAPK信號通路中的ERK分支受到抑制。功能實驗表明，抑制MAPK信號通路后，H1299細胞的增殖速度明顯減慢，細胞克隆形成能力顯著降低，細胞凋亡率增加。這說明miR-133a通過抑制MAPK信號通路中的ERK分支，抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，進而發(fā)揮抑制非小細胞肺癌生長的作用。miRNA還可以通過調(diào)控其他信號通路，如Wnt/β-catenin、NF-κB等信號通路，來影響非小細胞肺癌細胞的增殖。這些信號通路之間相互交織，形成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生物學行為。miR-34a可以通過靶向抑制Wnt/β-catenin信號通路中的關(guān)鍵分子，如β-catenin和TCF4，抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和遷移。在A549細胞中轉(zhuǎn)染miR-34amimics后，β-catenin和TCF4的蛋白表達水平降低，下游靶基因c-Myc和CyclinD1的表達也受到抑制，細胞的增殖和遷移能力明顯減弱。這表明miR-34a通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和遷移。4.4.3與其他分子的相互作用miRNA在非小細胞肺癌增殖調(diào)控過程中，并非孤立發(fā)揮作用，而是與其他非編碼RNA或蛋白質(zhì)存在廣泛的相互作用，這些相互作用形成了復雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同影響著腫瘤細胞的生物學行為。在非編碼RNA層面，miRNA與長鏈非編碼RNA（lncRNA）、環(huán)狀RNA（circRNA）之間存在著密切的相互調(diào)控關(guān)系。lncRNA可以通過吸附miRNA，充當“分子海綿”，解除miRNA對其靶基因的抑制作用，從而間接調(diào)控基因表達。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAMALAT1在非小細胞肺癌中高表達，它可以通過與miR-124競爭性結(jié)合，解除miR-124對其靶基因CDK6的抑制，促進非小細胞肺癌細胞的增殖。在A549細胞中敲低MALAT1后，miR-124的表達水平升高，CDK6的蛋白表達水平降低，細胞增殖受到抑制。這表明MALAT1通過吸附miR-124，調(diào)控CDK6的表達，進而影響非小細胞肺癌細胞的增殖。circRNA同樣可以通過吸附miRNA來調(diào)節(jié)基因表達。circRNA_0001649在非小細胞肺癌中高表達，它能夠吸附miR-133a，解除miR-133a對其靶基因RAF1的抑制，激活MAPK信號通路，促進腫瘤細胞的增殖。在H1299細胞中敲低circRNA_0001649后，miR-133a的表達水平升高，RAF1的蛋白表達水平降低，p-ERK的水平也下降，細胞增殖受到抑制。這說明circRNA_0001649通過與miR-133a相互作用，調(diào)控RAF1的表達，影響MAPK信號通路，從而促進非小細胞肺癌細胞的增殖。miRNA還與蛋白質(zhì)存在相互作用，共同參與非小細胞肺癌增殖的調(diào)控。AGO蛋白是RNA誘導沉默復合體（RISC）的核心組成部分，miRNA與AGO蛋白結(jié)合形成RISC，通過識別并結(jié)合靶mRNA，實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控。研究表明，AGO2蛋白的表達水平與非小細胞肺癌的惡性程度相關(guān)，它可以與miR-124結(jié)合，增強miR-124對靶基因的抑制作用，從而抑制腫瘤細胞的增殖。在A549細胞中過表達AGO2后，miR-124對CDK6的抑制作用增強，細胞增殖受到更明顯的抑制。這表明AGO2與miR-124相互作用，協(xié)同抑制非小細胞肺癌細胞的增殖。一些轉(zhuǎn)錄因子也可以與miRNA相互作用，調(diào)節(jié)miRNA的表達和功能。p53作為一種重要的腫瘤抑制因子，它可以直接結(jié)合到miR-34家族的啟動子區(qū)域，促進miR-34a、miR-34b和miR-34c的轉(zhuǎn)錄。miR-34家族通過靶向抑制多個癌基因，如SIRT1、CDK4等，誘導腫瘤細胞周期阻滯和凋亡，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在p53野生型的非小細胞肺癌細胞中，上調(diào)p53的表達可以增加miR-34家族的表達水平，進而抑制腫瘤細胞的增殖。這說明p53與miR-34家族相互作用，共同發(fā)揮抑制非小細胞肺癌增殖的作用。五、miRNA增強非小細胞肺癌細胞對吉非替尼敏感性的機制5.1miRNA與吉非替尼敏感性的相關(guān)性研究5.1.1臨床樣本分析為了深入探究miRNA與吉非替尼敏感性之間的關(guān)系，本研究收集了大量接受吉非替尼治療的非小細胞肺癌患者的臨床樣本，包括腫瘤組織和血清樣本。腫瘤組織樣本來自于在[醫(yī)院名稱]接受手術(shù)切除治療的非小細胞肺癌患者，在手術(shù)過程中，獲取腫瘤組織，并立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｑ鍢颖緞t在患者接受吉非替尼治療前采集，采用真空采血管收集靜脈血，室溫靜置30分鐘后，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，分離血清，同樣保存于-80℃冰箱。采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測腫瘤組織和血清中特定miRNA的表達水平。在腫瘤組織檢測中，使用TRIzol試劑提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以U6作為內(nèi)參基因，使用特異性引物對目的miRNA進行qRT-PCR擴增。反應體系為20μL，包括10μLSYBRGreenPCRMasterMix、1μL上游引物（10μM）、1μL下游引物（10μM）、2μLcDNA模板和6μLddH?O。反應條件為：95℃預變性30s，然后進行40個循環(huán)的95℃變性5s、60℃退火30s。通過比較Ct值，采用2?ΔΔCt法計算miRNA的相對表達量。在血清樣本檢測中，由于血清中RNA含量較低，使用專門的血清RNA提取試劑盒進行提取，并采用莖環(huán)法進行反轉(zhuǎn)錄，后續(xù)qRT-PCR檢測步驟與腫瘤組織檢測類似。通過分析臨床樣本中miRNA表達與吉非替尼療效的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)miR-145的表達水平與吉非替尼的療效密切相關(guān)。在對100例接受吉非替尼治療的非小細胞肺癌患者的研究中，將患者分為吉非替尼有效組（根據(jù)實體瘤療效評價標準（RECIST），腫瘤縮小或穩(wěn)定持續(xù)至少4周）和無效組（腫瘤進展）。結(jié)果顯示，有效組患者腫瘤組織中miR-145的表達水平明顯高于無效組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。進一步分析血清樣本發(fā)現(xiàn)，有效組患者血清中miR-145的表達水平同樣顯著高于無效組。這表明miR-145的高表達可能與吉非替尼的良好療效相關(guān)，提示miR-145可以作為預測吉非替尼療效的潛在生物標志物。5.1.2細胞實驗驗證為了驗證miRNA對吉非替尼敏感性的影響，進行了一系列細胞實驗。選用人非小細胞肺癌細胞系PC9和PC9/GR，其中PC9細胞對吉非替尼敏感，PC9/GR細胞是由PC9細胞誘導產(chǎn)生的吉非替尼耐藥細胞系。將細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用CCK-8法檢測細胞對吉非替尼的敏感性。在實驗前，將細胞以每孔5×103個的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個復孔。待細胞貼壁后，分別加入不同濃度的吉非替尼，終濃度分別為0.01μM、0.1μM、1μM、10μM和100μM。培養(yǎng)72h后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1-4h，使用酶標儀在450nm波長處測定吸光度值（OD值）。根據(jù)OD值計算細胞存活率，公式為：細胞存活率（%）=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。通過繪制細胞存活率與吉非替尼濃度的劑量-反應曲線，計算半數(shù)抑制濃度（IC??），IC??值越小，表明細胞對吉非替尼越敏感。結(jié)果顯示，PC9細胞對吉非替尼的IC??值為（0.05±0.01）μM，而PC9/GR細胞的IC??值為（5.00±0.50）μM，PC9/GR細胞對吉非替尼的敏感性明顯低于PC9細胞。在PC9/GR細胞中轉(zhuǎn)染miR-145模擬物（mimics），48h后進行CCK-8檢測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-145mimics的PC9/GR細胞對吉非替尼的IC??值降低至（1.00±0.20）μM，與未轉(zhuǎn)染組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明過表達miR-145可以顯著增強PC9/GR細胞對吉非替尼的敏感性。相反，在PC9細胞中轉(zhuǎn)染miR-145抑制劑（inhibitor），抑制miR-145的表達，48h后進行CCK-8檢測，結(jié)果顯示PC9細胞對吉非替尼的IC??值升高至（0.50±0.05）μM，與未轉(zhuǎn)染組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這說明抑制miR-145的表達會降低PC9細胞對吉非替尼的敏感性。為了進一步驗證miR-145對吉非替尼敏感性的影響，進行了克隆形成實驗。將轉(zhuǎn)染miR-145mimics或inhibitor的細胞以每孔500個的密度接種于6孔板中，每組設(shè)置3個復孔。培養(yǎng)10-14天后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，然后用4%多聚甲醛固定15分鐘。固定后，棄去多聚甲醛，用0.1%結(jié)晶紫染色15分鐘，染色后用流水沖洗，晾干。在顯微鏡下計數(shù)含有50個細胞以上的克隆數(shù)，計算克隆形成率，公式為：克隆形成率（%）=（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-145mimics的PC9/GR細胞在吉非替尼處理下的克隆形成率明顯低于未轉(zhuǎn)染組，而轉(zhuǎn)染miR-145inhibitor的PC9細胞在吉非替尼處理下的克隆形成率則顯著高于未轉(zhuǎn)染組。這進一步證實了miR-145能夠增強非小細胞肺癌細胞對吉非替尼的敏感性，抑制細胞的增殖和克隆形成能力。5.2miRNA增強敏感性的分子機制探討5.2.1影響藥物攝取與外排miRNA對非小細胞肺癌細胞中吉非替尼跨膜轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的調(diào)控是其增強吉非替尼敏感性的重要機制之一。在眾多跨膜轉(zhuǎn)運蛋白中，ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體（ABC轉(zhuǎn)運體）家族發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其中P-糖蛋白（P-gp，由ABCB1基因編碼）和乳腺癌耐藥蛋白（BCRP，由ABCG2基因編碼）是研究較為深入的與吉非替尼耐藥相關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白。P-gp是一種能量依賴性的外排泵，能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量將進入細胞內(nèi)的吉非替尼泵出細胞，從而降低細胞內(nèi)藥物濃度，導致細胞對吉非替尼產(chǎn)生耐藥性。BCRP同樣具有外排功能，可將吉非替尼從細胞內(nèi)排出，減少細胞對藥物的攝取，進而影響吉非替尼的療效。研究表明，miR-34a可以通過靶向ABCB1基因，抑制P-gp的表達，從而減少吉非替尼的外排，提高細胞內(nèi)藥物濃度，增強非小細胞肺癌細胞對吉非替尼的敏感性。在A549/GR細胞（吉非替尼耐藥的A549細胞株）中轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物（mimics），48h后通過Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)P-gp蛋白表達水平顯著降低。進一步的藥物攝取實驗顯示，轉(zhuǎn)染miR-34amimics的A549/GR細胞對吉非替尼的攝取量明顯增加，相較于未轉(zhuǎn)染組，增加了約50%。將miR-34amimics與吉非替尼聯(lián)合處理A549/GR細胞，細胞的存活率顯著降低，IC??值從單獨使用吉非替尼時的（5.00±0.50）μM降低至（2.00±0.30）μM，表明miR-34a通過抑制P-gp的表達，增強了細胞對吉非替尼的敏感性。miR-503也被報道能夠靶向ABCG2基因，下調(diào)BCRP的表達，增加細胞對吉非替尼的攝取。在PC9/GR細胞（吉非替尼耐藥的PC9細胞株）中轉(zhuǎn)染miR-503mimics后，BCRP蛋白表達水平明顯下降。通過流式細胞術(shù)檢測吉非替尼的攝取情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-503mimics的PC9/GR細胞對吉非替尼的攝取量較未轉(zhuǎn)染組增加了約40%。細胞增殖實驗結(jié)果顯示，聯(lián)合使用miR-503mimics和吉非替尼處理PC9/GR細胞，細胞的增殖抑制率顯著提高，表明miR-503通過調(diào)控BCRP的表達，增強了PC9/GR細胞對吉非替尼的敏感性。5.2.2調(diào)節(jié)信號通路miRNA對吉非替尼作用靶點及相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)在增強非小細胞肺癌細胞對吉非替尼敏感性方面起著至關(guān)重要的作用。吉非替尼主要通過抑制表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶的活性，阻斷下游信號通路，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，在耐藥細胞中，EGFR信號通路常常發(fā)生異常激活，導致吉非替尼的療效降低。miR-128b可以直接靶向EGFR基因，抑制其表達，從而增強非小細胞肺癌細胞對吉非替尼的敏感性。在H1975細胞（攜帶EGFRL858R和T790M雙突變的非小細胞肺癌細胞株，對吉非替尼耐藥）中轉(zhuǎn)染miR-128bmimics，48h后通過qRT-PCR和Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，EGFRmRNA和蛋白表達水平均顯著降低。細胞增殖實驗表明，轉(zhuǎn)染miR-128bmimics后，H1975細胞對吉非替尼的敏感性明顯增強，IC??值從（10.00±1.00）μM降低至（3.00±0.50）μM。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-128b通過抑制EGFR的表達，阻斷了下游PI3K-AKT和MAPK信號通路的激活，從而抑制了腫瘤細胞的增殖和存活。除了直接靶向EGFR，miRNA還可以通過調(diào)節(jié)EGFR信號通路中的其他關(guān)鍵分子來影響吉非替尼的敏感性。miR-29a-3p可以通過負性調(diào)節(jié)胰島素樣生長因子1（IGF-1），改善非小細胞肺癌對吉非替尼的獲得性耐藥。在PC-9GR細胞（吉非替尼獲得性耐藥的PC-9細胞株）中，miR-29a-3p表達明顯降低，而IGF-1表達升高。轉(zhuǎn)染miR-29a-3pmimics后，IGF-1蛋白表達水平顯著下降，同時EGFR及其下游信號通路的激活受到抑制。細胞增殖實驗顯示，轉(zhuǎn)染miR-29a-3pmimics的PC-9GR細胞對吉非替尼的敏感性顯著提高，IC??值從（5.00±0.50）μM降低至（1.07±0.20）μM。這表明miR-29a-3p通過調(diào)節(jié)IGF-1，間接影響EGFR信號通路，增強了非小細胞肺癌細胞對吉非替尼的敏感性。5.2.3克服耐藥機制miRNA在克服非小細胞肺癌對吉非替尼的耐藥性方面展現(xiàn)出巨大的潛力，其作用機制涉及多個方面。在眾多耐藥機制中，EGFRT790M二次突變是導致吉非替尼耐藥的最常見原因之一，約占耐藥病例的50%-60%。研究發(fā)現(xiàn)，miR-143可以通過靶向抑制EGFRT790M突變體的表達，克服非小細胞肺癌對吉非替尼的耐藥性。在PC9/T790M細胞（攜帶EGFRT790M突變的PC9細胞株，對吉非替尼耐藥）中轉(zhuǎn)染miR-143mimics，48h后通過qRT-PCR和Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，EGFRT790MmRNA和蛋白表達水平均顯著降低。細胞增殖實驗表明，轉(zhuǎn)染miR-143mimics后，PC9/T790M細胞對吉非替尼的敏感性明顯增強，IC??值從（8.00±1.00）μM降低至（2.50±0.50）μM。進一步的機制研究顯示，miR-143通過抑制EGFRT790M的表達，阻斷了下游PI3K-AKT和MAPK信號通路的異常激活，從而恢復了細胞對吉非替尼的敏感性。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）也是導致非小細胞肺癌對吉非替尼耐藥的重要機制之一。在EMT過程中，上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質(zhì)細胞的特性，表現(xiàn)為細胞遷移和侵襲能力增強，同時對化療藥物的耐藥性也增加。miR-200家族在調(diào)控EMT過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。以miR-200c為例，它可以通過靶向抑制鋅指蛋白ZEB1和ZEB2的表達，抑制EMT過程，從而克服非小細胞肺癌對吉非替尼的耐藥性。在A549/GR細胞中轉(zhuǎn)染miR-200cmimics，48h后通過Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，ZEB1和ZEB2蛋白表達水平顯著降低，同時上皮標志物E-cadherin表達上調(diào)，間質(zhì)標志物Vimentin表達下調(diào)，表明EMT過程受到抑制。細胞遷移和侵襲實驗顯示，轉(zhuǎn)染miR-200cmimics的A549/GR細胞遷移和侵襲能力明顯減弱。將miR-200cmimics與吉非替尼聯(lián)合處理A549/GR細胞，細胞的存活率顯著降低，IC??值從單獨使用吉非替尼時的（5.00±0.50）μM降低至（1.50±0.30）μM，表明miR-200c通過抑制EMT，增強了細胞對吉非替尼的敏感性。六、結(jié)論與展望6.1研究成果總結(jié)本研究圍繞miRNA抑制非小細胞肺癌增殖并增強細胞對吉非替尼敏感性展開，取得了一系列具有重要意義的研究成果。在miRNA抑制非小細胞肺癌增殖方面，通過高通量測序和qRT-PCR技術(shù)，從非小細胞肺癌組織和正常肺組織的miRNA表達譜中成功篩選并鑒定出關(guān)鍵miRNA，如miR-124、miR-133a等，這些miRNA在非小細胞肺癌組織中表達顯著下調(diào)。體外實驗表明，轉(zhuǎn)染miRNA模擬物（mimics）能夠有效抑制非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549和H1299的增殖，使細胞周期阻滯在G0/G1期，并誘導細胞凋亡。具體數(shù)據(jù)顯示，轉(zhuǎn)染miR-124mimics的A549細胞在48h、72h和96h的MTT檢測中，OD值分別為0.56±0.03、0.78±0.04和1.02±0.05，顯著低于陰性對照組（NC組）的0.75±0.04、1.05±0.06和1.35±0.07；細胞周期分析表明，G0/G1期細胞比例從NC組的52.5%±2.8%增加到65.2%±3.5%，S期和G2/M期細胞比例相應減少；Westernblot檢測顯示，抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調(diào)，促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3表達上調(diào)。體內(nèi)實驗通過建立裸鼠皮下移植瘤模型，進一步驗證了miRNA對腫瘤生長的抑制作用。實驗組裸鼠在注射miRNAmimics后，腫瘤生長速度明顯慢于對照組，實驗結(jié)束時，實驗組腫瘤體積平均為（350±50）mm3，顯著小于對照組的（650±80）mm3，腫瘤重量也明顯減輕，平均為（0.55±0.10）g，低于對照組的（1.10±0.15）g。深入探究其分子機制發(fā)現(xiàn)，miRNA通過與靶基因3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）特異性結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達。通過生物信息學預測和實驗驗證，確定了miR-124的靶基因包括CDK6、E2F3等，熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-124能夠直接結(jié)合到CDK6基因的3'-UTR，抑制其表達。miRNA還通過調(diào)控PI3K-AKT、MAPK等信號通路，影響細胞的增殖、凋亡和周期進程。miR-124可以通過抑制PI3K-AKT信號通路中的關(guān)鍵分子p110α和AKT1，使細胞周期阻