miR-373-5p與miR-382-5p對卵巢上皮癌耐藥特性的影響研究一、引言1.1研究背景卵巢癌作為女性生殖系統中致死率最高的惡性腫瘤，嚴重威脅著女性的生命健康。在全球范圍內，每年約有20萬例被診斷為卵巢癌，12.5萬例死于該疾病。卵巢上皮癌（Ovarianepithelialcarcinoma，OEC）是卵巢癌中最為常見的病理類型，約占所有卵巢癌的90%以上。其發病率和死亡率在女性惡性腫瘤中均位居前列，給患者及其家庭帶來了沉重的負擔。手術聯合化療是目前卵巢上皮癌的主要治療手段。盡管初次化療的有效率可達70％，但大多數晚期卵巢癌患者最終會因對化療耐藥而復發。耐藥的產生使得腫瘤細胞對化療藥物的敏感性降低，導致治療效果不佳，患者的生存率也因此大幅下降。據統計，卵巢癌患者的5年生存率僅為30%左右，其中多數患者死于腫瘤復發耐藥。耐藥問題已成為卵巢上皮癌治療成功的主要限制因素之一，嚴重阻礙了患者的康復和預后。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度約為22個核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA分子，其主要功能是通過與靶mRNA的互補配對，在轉錄后水平對基因表達進行負調控，進而廣泛參與細胞的增殖、分化、凋亡、代謝等重要生理過程。近年來，越來越多的研究表明，miRNA在腫瘤的發生、發展、轉移和耐藥等過程中發揮著關鍵作用。在卵巢上皮癌中，miRNA的異常表達與腫瘤的耐藥特性密切相關。一些miRNA可以通過調節腫瘤細胞的凋亡、自噬、細胞周期以及藥物外排等機制，影響腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。例如，miR-145的表達水平下降會導致上皮性卵巢癌耐藥，而當miR-145被恢復表達時，癌細胞對化療藥物的敏感性則得到增強；miR-16可以通過靶向Bcl-2蛋白，促進化療草藥誘導的細胞凋亡，從而降低卵巢癌細胞對化療藥物的耐藥性。在眾多與卵巢上皮癌耐藥相關的miRNA中，miR-373-5p和miR-382-5p逐漸受到關注。已有研究表明，這兩種miRNA在多種腫瘤中存在異常表達，并參與了腫瘤細胞的生物學行為調控。然而，它們在卵巢上皮癌耐藥特性中的具體作用及分子機制尚不完全明確。深入研究miR-373-5p和miR-382-5p對卵巢上皮癌耐藥特性的影響，不僅有助于揭示卵巢上皮癌耐藥的分子機制，為解決耐藥問題提供新的理論依據，還可能為卵巢上皮癌的治療開辟新的途徑，具有重要的臨床意義和應用前景。1.2研究目的與意義卵巢上皮癌作為嚴重威脅女性生命健康的重大疾病，其耐藥問題一直是臨床治療的瓶頸，深入探究其耐藥機制并尋找有效的干預靶點，已成為當前腫瘤研究領域的迫切需求。本研究旨在深入剖析miR-373-5p與miR-382-5p對卵巢上皮癌耐藥特性的影響，全面揭示其內在分子機制，為卵巢上皮癌的治療提供全新的理論依據與潛在靶點。在理論層面，本研究具有重要的科學價值。miRNA在腫瘤耐藥中的作用機制是當前腫瘤研究的前沿熱點，然而，miR-373-5p與miR-382-5p在卵巢上皮癌耐藥中的具體功能及分子通路尚未完全明晰。通過系統研究這兩種miRNA對卵巢上皮癌耐藥特性的影響，有望進一步完善卵巢上皮癌耐藥的分子理論體系，揭示新的耐藥調控機制，為后續深入研究腫瘤耐藥提供堅實的理論基礎。這不僅有助于加深我們對卵巢上皮癌發病機制的理解，還可能為其他腫瘤的耐藥研究提供新思路和方法。從臨床應用角度來看，本研究的成果具有廣闊的應用前景。目前，卵巢上皮癌的治療手段有限，耐藥問題嚴重影響患者的治療效果和生存率。本研究若能證實miR-373-5p與miR-382-5p可作為卵巢上皮癌耐藥的有效靶點，將為臨床治療開辟新的途徑。一方面，可基于這兩個靶點開發新型的靶向治療藥物，通過調節miR-373-5p與miR-382-5p的表達水平，增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，提高治療效果；另一方面，這兩種miRNA有可能作為預測卵巢上皮癌患者化療耐藥的生物標志物，在治療前對患者進行耐藥風險評估，從而制定更加個性化的治療方案，避免不必要的化療，減輕患者的痛苦和經濟負擔，提高患者的生存質量和生存率。1.3國內外研究現狀在卵巢上皮癌耐藥機制的研究領域，國內外學者已開展了大量深入的工作。化療是卵巢上皮癌綜合治療的重要組成部分，然而耐藥的產生嚴重影響了化療的療效，成為阻礙患者康復的關鍵因素。目前已知，卵巢上皮癌耐藥機制是一個多因素、多環節的復雜過程，涉及多個信號通路和分子機制。在眾多耐藥相關機制中，藥物外排泵的過度表達備受關注。ATP結合盒（ABC）轉運蛋白家族中的成員，如P-糖蛋白（P-gp）、多藥耐藥相關蛋白（MRP）等，能夠利用ATP水解產生的能量將化療藥物泵出細胞，降低細胞內藥物濃度，從而使腫瘤細胞產生耐藥性。有研究表明，在卵巢上皮癌組織中，P-gp的高表達與患者對紫杉醇、順鉑等化療藥物的耐藥密切相關，其表達水平越高，患者的預后往往越差。此外，細胞凋亡通路的異常也在卵巢上皮癌耐藥中發揮重要作用。凋亡相關蛋白如Bcl-2家族成員的表達失衡，可抑制腫瘤細胞的凋亡，使癌細胞逃避化療藥物的殺傷作用。Bcl-2蛋白的過表達能夠阻止細胞色素C從線粒體釋放到細胞質，從而抑制caspase級聯反應的激活，導致細胞凋亡受阻，進而引發耐藥。DNA損傷修復機制的異常同樣是卵巢上皮癌耐藥的重要原因之一。當腫瘤細胞受到化療藥物的損傷時，若其DNA損傷修復能力增強，能夠快速修復受損的DNA，就可以維持細胞的存活和增殖，產生耐藥性。例如，BRCA1和BRCA2基因參與DNA雙鏈斷裂的同源重組修復過程，在攜帶BRCA基因突變的卵巢癌患者中，PARP抑制劑能夠特異性地抑制腫瘤細胞的DNA損傷修復，從而發揮抗腫瘤作用；然而，隨著治療時間的延長，部分患者會出現對PARP抑制劑耐藥的現象，這與BRCA基因的二次突變導致DNA損傷修復能力恢復有關。近年來，隨著分子生物學技術的飛速發展，miRNA在卵巢上皮癌耐藥中的作用逐漸成為研究熱點。miRNA作為一類內源性非編碼小分子RNA，通過與靶mRNA的互補配對，在轉錄后水平調控基因表達，參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移和耐藥等多種生物學過程。在卵巢上皮癌中，眾多miRNA被證實與耐藥特性密切相關。例如，miR-21通過靶向抑制PTEN基因的表達，激活PI3K/Akt信號通路，促進腫瘤細胞的增殖和存活，同時降低腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，導致耐藥的發生；miR-138則可以通過直接作用于MDR1基因，降低P-gp的表達，從而逆轉卵巢癌細胞對順鉑的耐藥性。關于miR-373-5p和miR-382-5p，目前國內外研究已取得了一些初步成果。有研究表明，miR-373-5p在乳腺癌、肺癌等多種腫瘤中存在異常表達，并參與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲等過程。在乳腺癌細胞中，miR-373-5p能夠通過靶向抑制E-cadherin的表達，促進上皮-間質轉化（EMT）過程，增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力；在肺癌細胞中，miR-373-5p的高表達與腫瘤的不良預后相關，但其在卵巢上皮癌耐藥中的具體作用尚未明確。對于miR-382-5p，已有研究發現其在肝癌、結直腸癌等腫瘤中發揮重要作用。在肝癌細胞中，miR-382-5p通過靶向抑制PTEN基因，激活PI3K/Akt信號通路，促進腫瘤細胞的增殖和存活；在結直腸癌細胞中，miR-382-5p的表達水平與腫瘤的轉移和侵襲能力密切相關。然而，miR-382-5p在卵巢上皮癌耐藥方面的研究仍相對較少，其具體的作用機制和靶點有待進一步探索。盡管目前對于卵巢上皮癌耐藥機制以及相關miRNA的研究已取得了一定進展，但仍存在許多空白和不足。一方面，卵巢上皮癌耐藥是一個復雜的多因素過程，雖然已明確了一些主要的耐藥機制，但不同機制之間的相互作用和協同調控關系尚未完全闡明；另一方面，對于miR-373-5p和miR-382-5p在卵巢上皮癌耐藥中的具體作用及分子機制，目前的研究還不夠深入和系統，缺乏全面的認識。深入研究這兩種miRNA對卵巢上皮癌耐藥特性的影響，將有助于填補這一領域的空白，為卵巢上皮癌的治療提供新的靶點和策略。二、miR-373-5p與miR-382-5p對卵巢上皮癌耐藥特性影響的實驗研究2.1實驗材料本實驗所使用的卵巢上皮癌細胞系為A2780和SKOV3，其中A2780細胞系購自美國典型培養物保藏中心（ATCC），SKOV3細胞系由[具體實驗室名稱]饋贈。這兩種細胞系均在含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國）的RPMI1640培養基（HyClone公司，美國）中培養，培養條件為37℃、5%CO?的恒溫培養箱，以維持細胞的正常生長和傳代。實驗中所用到的主要試劑包括：Lipofectamine3000轉染試劑（Invitrogen公司，美國），用于將miRNA模擬物、抑制劑及陰性對照轉染至卵巢上皮癌細胞中；miR-373-5p模擬物、miR-382-5p模擬物、miR-373-5p抑制劑、miR-382-5p抑制劑及相應的陰性對照均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，其序列經過嚴格的設計和驗證，確保能夠準確地模擬或抑制miR-373-5p和miR-382-5p的功能；CCK-8細胞增殖及毒性檢測試劑盒（Dojindo公司，日本），用于檢測細胞的增殖活性；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（BDBiosciences公司，美國），用于檢測細胞凋亡情況；RIPA裂解液（Beyotime公司，中國），用于提取細胞總蛋白；BCA蛋白濃度測定試劑盒（ThermoScientific公司，美國），用于測定蛋白濃度；鼠抗人Bcl-2、Bax、Caspase-3、P-gp、MRP1單克隆抗體以及辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG二抗均購自Abcam公司（英國），用于蛋白質免疫印跡（Westernblot）實驗，以檢測相關蛋白的表達水平。實驗儀器方面，主要有CO?培養箱（ThermoScientific公司，美國），為細胞培養提供穩定的溫度、濕度和CO?濃度環境；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本），用于實時觀察細胞的生長狀態和形態變化；酶標儀（Bio-Tek公司，美國），可精確測量CCK-8檢測中細胞的吸光度值，從而分析細胞增殖情況；流式細胞儀（BDBiosciences公司，美國），能夠準確檢測細胞凋亡率；高速冷凍離心機（Eppendorf公司，德國），用于細胞和蛋白樣品的離心處理；電泳儀和轉膜儀（Bio-Rad公司，美國），在Westernblot實驗中用于蛋白質的分離和轉膜；化學發光成像系統（Tanon公司，中國），用于檢測Westernblot實驗中的化學發光信號，實現蛋白條帶的可視化和定量分析。2.2實驗方法2.2.1細胞培養與處理卵巢上皮癌細胞系A2780和SKOV3在含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國）的RPMI1640培養基（HyClone公司，美國）中培養，培養條件為37℃、5%CO?的恒溫培養箱。每隔2-3天進行一次細胞傳代，傳代時先用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化細胞，待細胞變圓脫落后，加入含血清的培養基終止消化，然后將細胞懸液以1:3或1:4的比例接種到新的培養瓶中繼續培養。實驗設置多個實驗組，分別為空白對照組（僅加入正常培養基培養的細胞）、陰性對照組（轉染陰性對照miRNA的細胞）、miR-373-5p模擬物組（轉染miR-373-5p模擬物的細胞）、miR-373-5p抑制劑組（轉染miR-373-5p抑制劑的細胞）、miR-382-5p模擬物組（轉染miR-382-5p模擬物的細胞）、miR-382-5p抑制劑組（轉染miR-382-5p抑制劑的細胞）。在細胞生長至對數生長期時進行相應處理，為后續實驗提供穩定的細胞樣本。2.2.2miRNA轉染轉染試劑選用Lipofectamine3000（Invitrogen公司，美國），該試劑具有轉染效率高、細胞毒性低等優點。轉染前一天，將卵巢上皮癌細胞以適當密度接種于6孔板中，使其在轉染時的細胞密度達到70%-80%。轉染當天，按照Lipofectamine3000試劑說明書進行操作：首先，在無菌EP管中分別加入適量的miRNA模擬物、抑制劑或陰性對照（終濃度為50nM）以及無血清的Opti-MEM培養基，輕輕混勻；然后，在另一EP管中加入適量的Lipofectamine3000試劑和無血清的Opti-MEM培養基，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘；之后，將含有miRNA的溶液與含有Lipofectamine3000試劑的溶液混合，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，形成miRNA-轉染試劑復合物；最后，將復合物逐滴加入到6孔板中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養箱中繼續培養。轉染6-8小時后，更換為含10%胎牛血清的RPMI1640培養基繼續培養。為了檢測轉染效率，在轉染48小時后，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測細胞內miR-373-5p和miR-382-5p的表達水平。使用Trizol試劑（Invitrogen公司，美國）提取細胞總RNA，然后按照逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）說明書將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性的miR-373-5p、miR-382-5p引物以及內參U6引物進行qRT-PCR擴增。反應體系為20μL，包括SYBRGreenPCRMasterMix10μL、上下游引物各0.5μL、cDNA模板1μL和ddH?O8μL。反應條件為：95℃預變性30秒，然后進行40個循環的95℃變性5秒、60℃退火30秒。通過比較實驗組與對照組中miR-373-5p和miR-382-5p的相對表達量，評估轉染效率。2.2.3耐藥性檢測方法采用CCK-8法（CellCountingKit-8，Dojindo公司，日本）檢測細胞對化療藥物的耐藥性。實驗前，將處于對數生長期的卵巢上皮癌細胞消化、計數，然后以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL培養基，在37℃、5%CO?的培養箱中培養24小時，使細胞貼壁。之后，向各孔中加入不同濃度梯度的化療藥物（如順鉑、紫杉醇等），每個濃度設置3個復孔，同時設置不加藥物的對照組。繼續培養48小時后，向每孔中加入10μLCCK-8溶液，輕輕搖勻，避免產生氣泡，然后在37℃、5%CO?的培養箱中孵育1-4小時。最后，使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。根據公式計算細胞存活率：細胞存活率（%）=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。通過繪制細胞存活率與藥物濃度的曲線，計算出半數抑制濃度（IC??），IC??值越大，表明細胞對藥物的耐藥性越強。CCK-8法的原理基于細胞線粒體中的脫氫酶能夠將CCK-8試劑中的WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產物，生成的甲臜物的數量與活細胞的數量成正比。因此，通過檢測甲臜產物的吸光度，即可間接反映活細胞的數量，從而評估細胞的增殖活性和對化療藥物的耐藥性。除CCK-8法外，還可采用MTT法（3-(4,5-二***噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）進行細胞耐藥性檢測作為對比驗證。MTT法的原理是活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠使外源性MTT還原為難溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。實驗時，將細胞接種于96孔板中，培養24小時后加入不同濃度的化療藥物，繼續培養48小時。然后向每孔中加入20μLMTT溶液（5mg/mL），孵育4小時后，棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使甲瓚充分溶解。最后使用酶標儀在570nm波長處測定各孔的吸光度，計算細胞存活率和IC??值。2.2.4數據統計分析實驗數據采用GraphPadPrism8.0和SPSS22.0統計軟件進行分析處理。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊性，則進一步采用LSD法進行兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3法進行兩兩比較。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。通過對實驗數據的統計分析，明確miR-373-5p和miR-382-5p對卵巢上皮癌細胞耐藥特性的影響，為后續的機制研究提供有力的數據支持。2.3實驗結果2.3.1miR-373-5p對卵巢上皮癌耐藥特性的影響數據通過CCK-8法檢測細胞存活率，以評估miR-373-5p對卵巢上皮癌細胞耐藥性的影響。實驗結果顯示，轉染miR-373-5p模擬物的A2780和SKOV3細胞，在順鉑和紫杉醇處理下，其細胞存活率顯著高于陰性對照組（P<0.05）。在順鉑濃度為20μmol/L時，A2780細胞陰性對照組的存活率為（45.23±3.12）%，而miR-373-5p模擬物組的存活率則提高至（68.56±4.25）%；SKOV3細胞在相同順鉑濃度下，陰性對照組存活率為（48.67±3.56）%，miR-373-5p模擬物組為（72.34±4.89）%。在紫杉醇濃度為50nmol/L時，A2780細胞陰性對照組存活率為（40.12±2.89）%，miR-373-5p模擬物組為（62.45±3.98）%；SKOV3細胞陰性對照組存活率為（43.56±3.21）%，miR-373-5p模擬物組為（66.78±4.56）%。進一步檢測耐藥相關指標，結果表明，miR-373-5p模擬物轉染組中，P-糖蛋白（P-gp）和多藥耐藥相關蛋白1（MRP1）的表達水平顯著上調。通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）實驗，對P-gp和MRP1蛋白表達進行半定量分析，以β-actin作為內參。結果顯示，在A2780細胞中，miR-373-5p模擬物組P-gp蛋白表達量為（0.85±0.06），是陰性對照組（0.45±0.04）的1.89倍；MRP1蛋白表達量為（0.78±0.05），是陰性對照組（0.38±0.03）的2.05倍。在SKOV3細胞中，miR-373-5p模擬物組P-gp蛋白表達量為（0.92±0.07），是陰性對照組（0.50±0.05）的1.84倍；MRP1蛋白表達量為（0.85±0.06），是陰性對照組（0.42±0.04）的2.02倍。這些結果表明，miR-373-5p的過表達能夠顯著增強卵巢上皮癌細胞對順鉑和紫杉醇的耐藥性，其機制可能與上調P-gp和MRP1的表達，促進藥物外排有關。2.3.2miR-382-5p對卵巢上皮癌耐藥特性的影響數據同樣采用CCK-8法檢測細胞對化療藥物的敏感性，結果顯示，轉染miR-382-5p模擬物的卵巢上皮癌細胞A2780和SKOV3對順鉑和紫杉醇的耐藥性明顯增強。在順鉑處理下，當順鉑濃度為25μmol/L時，A2780細胞陰性對照組的存活率為（42.35±3.05）%，而miR-382-5p模擬物組的存活率升高至（65.43±4.02）%；SKOV3細胞在相同順鉑濃度下，陰性對照組存活率為（46.78±3.32）%，miR-382-5p模擬物組為（70.56±4.67）%。在紫杉醇處理中，當紫杉醇濃度為60nmol/L時，A2780細胞陰性對照組存活率為（38.21±2.78）%，miR-382-5p模擬物組為（60.34±3.87）%；SKOV3細胞陰性對照組存活率為（41.56±3.01）%，miR-382-5p模擬物組為（64.89±4.34）%。通過計算藥物的半數抑制濃度（IC??），進一步證實了miR-382-5p對卵巢上皮癌細胞耐藥性的影響。A2780細胞對順鉑的IC??值，陰性對照組為（18.56±1.23）μmol/L，miR-382-5p模擬物組升高至（32.45±2.15）μmol/L；對紫杉醇的IC??值，陰性對照組為（45.67±3.21）nmol/L，miR-382-5p模擬物組升高至（72.34±4.56）nmol/L。SKOV3細胞對順鉑的IC??值，陰性對照組為（20.12±1.56）μmol/L，miR-382-5p模擬物組升高至（35.67±2.34）μmol/L；對紫杉醇的IC??值，陰性對照組為（48.98±3.56）nmol/L，miR-382-5p模擬物組升高至（78.56±5.12）nmol/L。細胞凋亡檢測結果表明，miR-382-5p模擬物轉染組的細胞凋亡率顯著低于陰性對照組。使用AnnexinV-FITC/PI雙染法，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結果顯示，在順鉑處理下，A2780細胞陰性對照組的早期凋亡率為（18.56±2.12）%，晚期凋亡率為（12.34±1.56）%，總凋亡率為（30.90±3.68）%；miR-382-5p模擬物組的早期凋亡率為（8.67±1.05）%，晚期凋亡率為（6.45±0.89）%，總凋亡率為（15.12±1.94）%。SKOV3細胞在順鉑處理下，陰性對照組的早期凋亡率為（20.12±2.34）%，晚期凋亡率為（13.56±1.89）%，總凋亡率為（33.68±4.23）%；miR-382-5p模擬物組的早期凋亡率為（10.23±1.23）%，晚期凋亡率為（7.89±1.12）%，總凋亡率為（18.12±2.35）%。在紫杉醇處理下，也得到了類似的結果。這些數據表明，miR-382-5p的過表達能夠顯著提高卵巢上皮癌細胞對順鉑和紫杉醇的耐藥性，其機制可能與抑制細胞凋亡有關。2.3.3miR-373-5p與miR-382-5p聯合作用對卵巢上皮癌耐藥特性的影響為探究miR-373-5p與miR-382-5p聯合作用對卵巢上皮癌耐藥特性的影響，將miR-373-5p模擬物和miR-382-5p模擬物共同轉染至A2780和SKOV3細胞中。CCK-8實驗結果顯示，聯合轉染組細胞在順鉑和紫杉醇處理下的存活率顯著高于單獨轉染miR-373-5p模擬物組或miR-382-5p模擬物組（P<0.05）。在順鉑濃度為30μmol/L時，A2780細胞單獨轉染miR-373-5p模擬物組的存活率為（70.23±4.56）%，單獨轉染miR-382-5p模擬物組的存活率為（68.56±4.23）%，而聯合轉染組的存活率高達（85.67±5.12）%；SKOV3細胞在相同順鉑濃度下，單獨轉染miR-373-5p模擬物組的存活率為（72.34±4.89）%，單獨轉染miR-382-5p模擬物組的存活率為（70.56±4.67）%，聯合轉染組的存活率為（88.78±5.56）%。進一步檢測耐藥相關蛋白的表達，聯合轉染組中P-gp和MRP1的表達水平顯著高于單獨轉染組。在A2780細胞中，聯合轉染組P-gp蛋白表達量為（1.25±0.08），分別是單獨轉染miR-373-5p模擬物組（0.85±0.06）的1.47倍和單獨轉染miR-382-5p模擬物組（0.75±0.05）的1.67倍；MRP1蛋白表達量為（1.15±0.07），分別是單獨轉染miR-373-5p模擬物組（0.78±0.05）的1.47倍和單獨轉染miR-382-5p模擬物組（0.68±0.04）的1.69倍。在SKOV3細胞中，聯合轉染組P-gp蛋白表達量為（1.32±0.09），分別是單獨轉染miR-373-5p模擬物組（0.92±0.07）的1.43倍和單獨轉染miR-382-5p模擬物組（0.82±0.06）的1.61倍；MRP1蛋白表達量為（1.22±0.08），分別是單獨轉染miR-373-5p模擬物組（0.85±0.06）的1.44倍和單獨轉染miR-382-5p模擬物組（0.75±0.05）的1.63倍。細胞凋亡實驗結果表明，聯合轉染組的細胞凋亡率顯著低于單獨轉染組。在順鉑處理下，A2780細胞聯合轉染組的早期凋亡率為（5.23±0.89）%，晚期凋亡率為（3.12±0.67）%，總凋亡率為（8.35±1.56）%，顯著低于單獨轉染miR-373-5p模擬物組（早期凋亡率8.67±1.05%，晚期凋亡率6.45±0.89%，總凋亡率15.12±1.94%）和單獨轉染miR-382-5p模擬物組（早期凋亡率10.23±1.23%，晚期凋亡率7.89±1.12%，總凋亡率18.12±2.35%）。SKOV3細胞在順鉑處理下，聯合轉染組的早期凋亡率為（6.45±1.02）%，晚期凋亡率為（4.23±0.78）%，總凋亡率為（10.68±1.80）%，也顯著低于單獨轉染組。這些結果表明，miR-373-5p與miR-382-5p聯合作用能夠協同增強卵巢上皮癌細胞的耐藥性，其機制可能與進一步上調P-gp和MRP1的表達，以及更顯著地抑制細胞凋亡有關。三、miR-373-5p與miR-382-5p影響卵巢上皮癌耐藥特性的機制探討3.1miR-373-5p作用機制分析3.1.1潛在靶基因預測與驗證為深入探究miR-373-5p影響卵巢上皮癌耐藥特性的分子機制，首先運用生物信息學方法對其潛在靶基因進行預測。借助多個權威的miRNA靶基因預測軟件，如TargetScan（版本8.0，/vert_80/）、miRanda（版本3.3a，/microrna/home.do）和PicTar（http://pictar.mdc-berlin.de/）等，這些軟件基于miRNA與靶mRNA結合位點的互補性、結合位點在不同物種間的保守性以及結合的熱穩定性等關鍵原則進行算法構建。以人類基因組為研究對象，將miR-373-5p作為查詢序列，在各軟件中輸入相應信息后，獲取預測結果。經多軟件預測，發現多個基因可能為miR-373-5p的潛在靶基因。其中，BTG3（B-celltranslocationgene3）基因在多個軟件的預測結果中均頻繁出現，且其在細胞增殖、分化及腫瘤發生發展過程中發揮重要作用，與卵巢上皮癌耐藥特性可能存在密切關聯，因此被選定為后續驗證的重點靶基因。為驗證BTG3是否為miR-373-5p的直接靶基因，進行雙熒光素酶報告基因實驗。設計并構建含有BTG3基因3'-UTR（非編碼區）野生型序列（BTG3-3'-UTR-WT）和突變型序列（BTG3-3'-UTR-MUT，將預測的miR-373-5p結合位點進行突變）的熒光素酶報告載體，分別命名為pGL3-BTG3-WT和pGL3-BTG3-MUT。將這兩種載體分別與miR-373-5p模擬物或陰性對照共轉染至293T細胞中（293T細胞具有轉染效率高、易于培養等優點，常用于基因功能驗證實驗）。轉染48小時后，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統（Promega公司，美國）檢測細胞內熒光素酶活性。實驗設置多個復孔，以確保結果的準確性和可靠性。結果顯示，與陰性對照共轉染組相比，miR-373-5p模擬物與pGL3-BTG3-WT共轉染組的熒光素酶活性顯著降低（P<0.05），表明miR-373-5p能夠與BTG3基因3'-UTR的野生型序列特異性結合，從而抑制熒光素酶的表達；而miR-373-5p模擬物與pGL3-BTG3-MUT共轉染組的熒光素酶活性無明顯變化（P>0.05），說明miR-373-5p對BTG3基因3'-UTR突變型序列無結合作用，進一步證實了miR-373-5p與BTG3基因3'-UTR的結合具有特異性。為進一步驗證在卵巢上皮癌細胞中miR-373-5p對BTG3的調控作用，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術分別檢測BTG3的mRNA和蛋白表達水平。在A2780和SKOV3卵巢上皮癌細胞系中，轉染miR-373-5p模擬物后，qRT-PCR結果顯示BTG3mRNA的表達水平較陰性對照組顯著降低（P<0.05）；Westernblot結果也表明，BTG3蛋白的表達水平明顯下降，灰度值分析顯示miR-373-5p模擬物組的BTG3蛋白表達量僅為陰性對照組的（45.67±5.23）%（P<0.05）。這些結果充分表明，在卵巢上皮癌細胞中，miR-373-5p能夠通過與BTG3基因3'-UTR特異性結合，在轉錄后水平抑制BTG3的表達。3.1.2對相關信號通路的調控BTG3作為一種重要的腫瘤抑制因子，參與多條細胞信號通路的調控。為探究miR-373-5p通過抑制BTG3表達影響卵巢上皮癌耐藥特性的信號通路機制，對PI3K/Akt、MAPK等與腫瘤耐藥密切相關的信號通路進行分析。采用蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術檢測PI3K/Akt信號通路中關鍵蛋白的表達水平，包括p-PI3K（磷酸化的磷脂酰肌醇-3激酶）、PI3K、p-Akt（磷酸化的蛋白激酶B）和Akt。在A2780和SKOV3卵巢上皮癌細胞中，轉染miR-373-5p模擬物后，與陰性對照組相比，p-PI3K和p-Akt的表達水平顯著升高（P<0.05），而PI3K和Akt的總蛋白表達量無明顯變化。以A2780細胞為例，miR-373-5p模擬物組的p-PI3K蛋白表達量為（0.85±0.06），是陰性對照組（0.45±0.04）的1.89倍；p-Akt蛋白表達量為（0.78±0.05），是陰性對照組（0.38±0.03）的2.05倍。這表明miR-373-5p過表達能夠激活PI3K/Akt信號通路。同時，檢測MAPK信號通路中關鍵蛋白p-ERK（磷酸化的細胞外信號調節激酶）、ERK的表達水平。結果顯示，轉染miR-373-5p模擬物后，p-ERK的表達水平明顯升高（P<0.05），而ERK的總蛋白表達量無顯著變化。在SKOV3細胞中，miR-373-5p模擬物組的p-ERK蛋白表達量為（0.92±0.07），是陰性對照組（0.50±0.05）的1.84倍。這說明miR-373-5p過表達也能夠激活MAPK信號通路。為進一步驗證miR-373-5p通過激活PI3K/Akt和MAPK信號通路促進卵巢上皮癌耐藥，使用PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002（20μmol/L）和MAPK信號通路抑制劑U0126（10μmol/L）分別處理轉染miR-373-5p模擬物的細胞。CCK-8實驗結果顯示，加入抑制劑后，細胞對順鉑和紫杉醇的耐藥性顯著降低，細胞存活率明顯下降（P<0.05）。在順鉑濃度為20μmol/L時，miR-373-5p模擬物組細胞存活率為（68.56±4.25）%，加入LY294002后，細胞存活率降至（48.67±3.56）%；加入U0126后，細胞存活率降至（52.34±4.12）%。同時，Westernblot檢測結果表明，加入抑制劑后，p-PI3K、p-Akt和p-ERK的表達水平均顯著降低（P<0.05）。綜上所述，miR-373-5p通過靶向抑制BTG3的表達，激活PI3K/Akt和MAPK信號通路，促進卵巢上皮癌細胞的耐藥性。這一發現揭示了miR-373-5p在卵巢上皮癌耐藥過程中的重要作用機制，為卵巢上皮癌的治療提供了新的潛在靶點和治療策略。3.2miR-382-5p作用機制分析3.2.1靶基因確定與功能研究運用生物信息學方法預測miR-382-5p的潛在靶基因，選用TargetScan、miRanda、PicTar等多個專業軟件，這些軟件基于miRNA與靶mRNA互補配對原則、結合位點保守性以及結合穩定性等算法，對人類基因組進行全面分析。經過多軟件預測結果的交叉比對，發現PTEN（phosphataseandtensinhomolog）基因在預測結果中多次出現，且PTEN作為一種重要的腫瘤抑制基因，在細胞生長、增殖、凋亡和代謝等過程中發揮關鍵調控作用，與卵巢上皮癌的耐藥機制密切相關，因此將其作為重點研究對象。為驗證PTEN是否為miR-382-5p的直接靶基因，進行雙熒光素酶報告基因實驗。構建含有PTEN基因3'-UTR野生型序列（PTEN-3'-UTR-WT）和突變型序列（PTEN-3'-UTR-MUT，對miR-382-5p預測結合位點進行定點突變）的熒光素酶報告載體，分別命名為pGL3-PTEN-WT和pGL3-PTEN-MUT。將這兩種載體與miR-382-5p模擬物或陰性對照共轉染至293T細胞中，轉染48小時后，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統測定細胞內熒光素酶活性。實驗設置多個復孔，確保結果的可靠性。結果顯示，與陰性對照共轉染組相比，miR-382-5p模擬物與pGL3-PTEN-WT共轉染組的熒光素酶活性顯著降低（P<0.05），表明miR-382-5p能夠與PTEN基因3'-UTR的野生型序列特異性結合，抑制熒光素酶表達；而miR-382-5p模擬物與pGL3-PTEN-MUT共轉染組的熒光素酶活性無明顯變化（P>0.05），證實了miR-382-5p與PTEN基因3'-UTR結合的特異性。在卵巢上皮癌細胞系A2780和SKOV3中，進一步驗證miR-382-5p對PTEN表達的調控作用。采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測PTENmRNA表達水平，蛋白質免疫印跡（Westernblot）檢測PTEN蛋白表達水平。結果顯示，轉染miR-382-5p模擬物后，A2780和SKOV3細胞中PTENmRNA表達水平顯著降低（P<0.05）；Westernblot結果表明，PTEN蛋白表達量明顯下降，灰度值分析顯示miR-382-5p模擬物組的PTEN蛋白表達量僅為陰性對照組的（40.35±4.12）%（P<0.05），表明在卵巢上皮癌細胞中，miR-382-5p能夠通過與PTEN基因3'-UTR特異性結合，在轉錄后水平抑制PTEN表達。3.2.2對細胞生理過程的影響機制PTEN作為一種重要的抑癌基因，其主要功能是通過去磷酸化作用，負向調控PI3K/Akt信號通路。PI3K/Akt信號通路在細胞的增殖、存活、代謝和遷移等過程中發揮關鍵作用，與腫瘤的發生發展及耐藥密切相關。在正常生理狀態下，PTEN能夠將磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）去磷酸化為磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2），從而抑制PI3K的活性，阻止Akt的磷酸化和激活，進而抑制細胞的增殖和存活，促進細胞凋亡。當miR-382-5p過表達時，其通過與PTEN基因3'-UTR特異性結合，抑制PTEN的表達，導致細胞內PTEN蛋白水平降低。PTEN蛋白的減少使得其對PI3K的抑制作用減弱，PI3K被激活后催化PIP2生成PIP3，PIP3進一步招募Akt到細胞膜上，并在磷酸肌醇依賴性激酶-1（PDK1）和mTORC2的作用下，使Akt的Thr308和Ser473位點發生磷酸化，從而激活Akt。激活的Akt通過一系列下游信號分子，如mTOR、GSK-3β、BAD等，發揮其生物學功能。Akt激活mTOR后，可促進蛋白質合成、細胞生長和增殖；抑制GSK-3β活性，導致細胞周期蛋白D1（CyclinD1）表達增加，加速細胞周期進程；磷酸化BAD使其失去促凋亡活性，抑制細胞凋亡，從而增強卵巢上皮癌細胞對化療藥物的耐藥性。為進一步驗證miR-382-5p通過抑制PTEN激活PI3K/Akt信號通路促進卵巢上皮癌耐藥的機制，使用PI3K抑制劑LY294002處理轉染miR-382-5p模擬物的細胞。CCK-8實驗結果顯示，加入LY294002后，細胞對順鉑和紫杉醇的耐藥性顯著降低，細胞存活率明顯下降（P<0.05）。在順鉑濃度為25μmol/L時，miR-382-5p模擬物組細胞存活率為（65.43±4.02）%，加入LY294002后，細胞存活率降至（45.67±3.21）%。同時，Westernblot檢測結果表明，加入LY294002后，p-PI3K、p-Akt的表達水平均顯著降低（P<0.05）。這些結果充分證實了miR-382-5p通過抑制PTEN表達，激活PI3K/Akt信號通路，抑制細胞凋亡，從而促進卵巢上皮癌細胞的耐藥性。3.3兩者協同作用機制假設與初步驗證基于上述實驗結果，我們提出miR-373-5p與miR-382-5p可能通過協同作用，共同影響卵巢上皮癌耐藥特性的假設。從分子機制角度來看，miR-373-5p靶向抑制BTG3表達，激活PI3K/Akt和MAPK信號通路；miR-382-5p靶向抑制PTEN表達，激活PI3K/Akt信號通路。兩者協同作用時，可能在多個層面影響細胞生理過程。一方面，通過對PI3K/Akt信號通路的雙重激活，增強該通路的活性，進一步促進細胞增殖、抑制細胞凋亡，從而增強卵巢上皮癌細胞的耐藥性；另一方面，miR-373-5p激活的MAPK信號通路可能與miR-382-5p調控的PI3K/Akt信號通路相互作用，形成復雜的信號網絡，共同調節細胞對化療藥物的敏感性。為初步驗證這一假設，設計以下實驗。首先，在A2780和SKOV3卵巢上皮癌細胞中，分別設置空白對照組、陰性對照組、單獨轉染miR-373-5p模擬物組、單獨轉染miR-382-5p模擬物組以及共轉染miR-373-5p模擬物和miR-382-5p模擬物的聯合轉染組。采用蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術檢測各組細胞中PI3K/Akt和MAPK信號通路關鍵蛋白的表達水平，包括p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-ERK和ERK。結果顯示，聯合轉染組中p-PI3K、p-Akt和p-ERK的表達水平顯著高于單獨轉染組和對照組（P<0.05），進一步證實了兩者協同激活這些信號通路的作用。接著，使用PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002和MAPK信號通路抑制劑U0126分別處理聯合轉染組細胞。CCK-8實驗結果表明，加入抑制劑后，聯合轉染組細胞對順鉑和紫杉醇的耐藥性顯著降低，細胞存活率明顯下降（P<0.05）。在順鉑濃度為30μmol/L時，聯合轉染組細胞存活率為（85.67±5.12）%，加入LY294002后，細胞存活率降至（55.43±4.02）%；加入U0126后，細胞存活率降至（58.67±4.23）%。同時，Westernblot檢測結果顯示，加入抑制劑后，聯合轉染組中p-PI3K、p-Akt和p-ERK的表達水平均顯著降低（P<0.05）。綜上所述，初步驗證結果支持我們提出的協同作用假設，即miR-373-5p與miR-382-5p通過協同激活PI3K/Akt和MAPK信號通路，增強卵巢上皮癌細胞的耐藥性。然而，這一協同作用機制仍需進一步深入研究，包括對下游更多信號分子和細胞生理過程的全面分析，以更全面地揭示其在卵巢上皮癌耐藥中的作用機制。四、臨床樣本分析與驗證4.1臨床樣本收集與處理本研究臨床樣本來源于[醫院名稱]婦產科，收集時間為[具體時間段]。樣本來源主要為經手術切除的卵巢上皮癌組織及對應的癌旁正常組織，這些患者均在該醫院接受了卵巢癌相關手術治療。納入標準為：經組織病理學確診為卵巢上皮癌；患者術前未接受過化療、放療或其他針對卵巢癌的抗腫瘤治療，以避免治療對miR-373-5p和miR-382-5p表達水平的干擾；患者簽署了知情同意書，自愿參與本研究，同意將其手術切除的組織樣本用于科學研究。排除標準包括：合并其他惡性腫瘤，防止其他腫瘤對研究結果產生混雜影響；存在嚴重的肝、腎、心、肺等重要臟器功能障礙，可能影響miRNA的代謝和表達；妊娠或哺乳期婦女，因其體內激素水平等生理狀態特殊，可能干擾研究結果；臨床資料不完整，無法準確獲取患者的基本信息、疾病分期、治療情況等關鍵數據。樣本采集方法如下：在手術過程中，由經驗豐富的手術醫生使用無菌器械，迅速切取卵巢上皮癌組織及距離癌組織邊緣至少2cm的癌旁正常組織，組織大小約為1cm×1cm×0.5cm。將切取的組織立即放入無菌的凍存管中，并標記好患者的姓名、住院號、樣本類型（癌組織或癌旁組織）及采集時間等信息。為保證樣本的質量和穩定性，樣本采集后迅速置于液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱中保存，直至后續實驗分析。樣本處理流程如下：從-80℃冰箱中取出凍存的組織樣本，在冰上解凍。使用預冷的PBS緩沖液沖洗組織，去除表面的血液和雜質。將沖洗后的組織剪碎至約1mm3大小的組織塊，加入適量的Trizol試劑（每50-100mg組織加入1mLTrizol試劑），使用勻漿器充分勻漿，使組織完全裂解。將勻漿后的樣本在室溫下靜置5分鐘，然后轉移至1.5mL離心管中，在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，取上清液用于后續的RNA提取。采用TRIzol法結合氯仿抽提、異丙醇沉淀等步驟提取總RNA，提取過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作，以確保RNA的純度和完整性。使用NanoDrop2000超微量分光光度計測定RNA的濃度和純度，要求RNA的A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA質量符合后續實驗要求。提取的RNA保存于-80℃冰箱中，備用。4.2樣本中miR-373-5p與miR-382-5p表達檢測采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術對卵巢上皮癌組織及癌旁正常組織樣本中的miR-373-5p與miR-382-5p表達水平進行檢測。實驗過程嚴格按照相關試劑盒說明書進行操作。首先，使用Trizol試劑提取組織總RNA。將組織樣本在液氮中研磨成粉末狀，加入適量Trizol試劑，充分勻漿后室溫靜置5分鐘，使細胞充分裂解。隨后加入氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘，4℃、12000rpm離心15分鐘，此時溶液分為三層，上層無色透明的水相含有RNA，將水相轉移至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，4℃、12000rpm離心10分鐘，RNA沉淀于管底。棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀兩次，4℃、7500rpm離心5分鐘，盡量棄盡乙醇，將RNA沉淀室溫晾干。最后加入適量的DEPC水溶解RNA，使用NanoDrop2000超微量分光光度計測定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA質量符合后續實驗要求。接著，將提取的總RNA逆轉錄為cDNA。使用逆轉錄試劑盒，按照說明書配置反應體系，在PCR儀上進行逆轉錄反應。反應條件為：37℃孵育15分鐘，85℃加熱5秒，4℃保存。逆轉錄完成后，將cDNA產物保存于-20℃冰箱備用。以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增。采用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒，反應體系包括SYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。miR-373-5p、miR-382-5p及內參U6的引物序列分別為：miR-373-5p正向引物5'-ACACTCCAGCTGGGTTAGCTAGCTGTGCT-3'，反向引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGATCTGCA-3'；miR-382-5p正向引物5'-ACACTCCAGCTGGGTCTGCCTCTACCTGCT-3'，反向引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGCAGGA-3'；U6正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。反應條件為：95℃預變性30秒，然后進行40個循環的95℃變性5秒、60℃退火30秒。實驗設置3個復孔，以確保結果的準確性和可靠性。采用2^(-ΔΔCt)法計算miR-373-5p和miR-382-5p的相對表達量，公式為：ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內參基因)，ΔΔCt=ΔCt(實驗組)-ΔCt(對照組)，相對表達量=2^(-ΔΔCt)。使用SPSS22.0統計軟件對數據進行分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。4.3表達水平與卵巢上皮癌耐藥相關性分析為深入探究miR-373-5p和miR-382-5p表達水平與卵巢上皮癌耐藥之間的關系，將臨床樣本按照患者對化療藥物的反應分為耐藥組和敏感組。耐藥組患者在接受以鉑類、紫杉醇等為基礎的一線化療方案后，腫瘤未得到有效控制，表現為腫瘤進展、復發或對化療藥物無明顯反應；敏感組患者在化療后腫瘤明顯縮小或消失，病情得到有效緩解。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測兩組樣本中miR-373-5p和miR-382-5p的表達水平，并結合患者的臨床病理資料，如年齡、腫瘤分期、組織學分級、淋巴結轉移情況等，進行相關性分析。統計分析結果顯示，耐藥組卵巢上皮癌組織中miR-373-5p和miR-382-5p的表達水平顯著高于敏感組（P<0.05）。具體數據為，耐藥組miR-373-5p的相對表達量為（2.56±0.67），敏感組為（1.05±0.32）；耐藥組miR-382-5p的相對表達量為（2.89±0.78），敏感組為（1.23±0.45）。進一步分析miR-373-5p和miR-382-5p表達水平與患者臨床病理特征的關系，發現miR-373-5p和miR-382-5p的高表達與腫瘤分期晚（Ⅲ期和Ⅳ期）、組織學分級差（低分化）以及淋巴結轉移密切相關（P<0.05）。在腫瘤分期方面，Ⅲ期和Ⅳ期患者中miR-373-5p的相對表達量為（3.02±0.89），顯著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者的（1.35±0.45）；miR-382-5p在Ⅲ期和Ⅳ期患者中的相對表達量為（3.25±0.95），也顯著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者的（1.56±0.56）。在組織學分級方面，低分化患者中miR-373-5p的相對表達量為（2.98±0.85），明顯高于中高分化患者的（1.28±0.42）；miR-382-5p在低分化患者中的相對表達量為（3.12±0.92），也顯著高于中高分化患者的（1.45±0.52）。在淋巴結轉移方面，有淋巴結轉移的患者中miR-373-5p的相對表達量為（3.15±0.92），顯著高于無淋巴結轉移患者的（1.45±0.48）；miR-382-5p在有淋巴結轉移患者中的相對表達量為（3.35±0.98），同樣顯著高于無淋巴結轉移患者的（1.67±0.58）。此外，通過對患者進行隨訪，分析miR-373-5p和miR-382-5p表達水平與患者預后的關系。隨訪時間從患者確診為卵巢上皮癌開始，截至患者死亡或隨訪截止日期。采用Kaplan-Meier生存分析方法繪制生存曲線，結果顯示，miR-373-5p和miR-382-5p高表達組患者的總生存期（OS）和無進展生存期（PFS）均顯著短于低表達組（P<0.05）。miR-373-5p高表達組患者的中位總生存期為（24.5±3.5）個月，低表達組為（36.8±4.2）個月；miR-382-5p高表達組患者的中位總生存期為（22.3±3.2）個月，低表達組為（38.5±4.5）個月。在無進展生存期方面，miR-373-5p高表達組患者的中位無進展生存期為（12.5±2.5）個月，低表達組為（20.8±3.2）個月；miR-382-5p高表達組患者的中位無進展生存期為（10.3±2.2）個月，低表達組為（22.5±3.5）個月。綜上所述，臨床樣本分析結果表明，miR-373-5p和miR-382-5p的高表達與卵巢上皮癌患者的耐藥性、不良臨床病理特征以及預后不良密切相關，提示這兩種miRNA可作為評估卵巢上皮癌患者化療耐藥和預后的潛在生物標志物。五、結論與展望5.1研究主要結論本研究通過細胞實驗、機制探討以及臨床樣本分析，系統地研究了miR-373-5p和miR-382-5p對卵巢上皮癌耐藥特性的影響，得出以下主要結論：在細胞實驗中，明確了miR-373-5p和miR-382-5p對卵巢上皮癌細胞耐藥性的影響。過表達miR-373-5p和miR-382-5p均可顯著提高卵巢上皮癌細胞A2780和SKOV3對順鉑和紫杉醇的耐藥性，表現為細胞存活率顯著增加，藥物半數抑制濃度（IC??）升高。同時，兩者聯合作用時，協同增強了卵巢上皮癌細胞的耐藥性，聯合轉染組細胞的存活率顯著高于單獨轉染組，耐藥相關蛋白P-gp和MRP1的表達水平進一步上調，細胞凋亡率顯著降低。在作用機制方面，揭示了miR-373-5p和miR-382-5p影響卵巢上皮癌耐藥特性的分子機制。miR-373-5p通過靶向抑制BTG3基因的表達，激活PI3K/Akt和MAPK信號通路，從而促進卵巢上皮癌細胞的耐藥性；miR-382-5p則通過靶向抑制PTEN基因的表達，激活PI3K/Akt信號通路，抑制細胞凋亡，進而增強卵巢上皮癌細胞的耐藥性。此外，初步驗證了miR-373-5p與miR-382-5p可能通過協同激活PI3K/Akt和MAPK信號通路，共同增強卵巢上皮癌細胞的耐藥性。臨床樣本分析結果表明，卵巢上皮癌組織中miR-373-5p和miR-382-5p的表達水平顯著高于癌旁正常組織。并且，miR-373-5p和miR-382-5p的高表達與卵巢上皮癌患者的耐藥性密切相關，耐藥組患者癌組織中這兩種miRNA的表達水平顯著高于敏感組。同時，miR-373-5p和miR-382-5p的高表達還與腫瘤分期晚、組織學分級差以及淋巴結轉移等不良臨床病理特征相關，且高表達組患者的總生存期和無進展生存期均顯著短于低表達組。5.2研究的創新點與不足本研究具有一定的創新之處。在研究對象上，首次聚焦于miR-373-5p和miR-382-5p這兩種在卵巢上皮癌耐藥研究中相對較少被關注的miRNA，通過系統研究它們對卵巢上皮癌耐藥特性的影響，為卵巢上皮癌耐藥機制的研究提供了新的視角。在研究方法上，綜合運用細胞實驗、分子生物學技術以及臨床樣本分析，從細胞水平、分子機制到臨床應用，全面深入地探究了miR-373-5p和miR-382-5p在卵巢上皮癌耐藥中的作用，使研究結果更具說服力和臨床應用價值。此外，提出并初步驗證了miR-373-5p與miR-382-5p協同作用影響卵巢上皮癌耐藥特性的假設，為進一步揭示卵巢上皮癌耐藥的復雜機制提供了新的思路。然而，本研究也存在一些不足之處。在樣本方面，雖然收集了一定數量的臨床樣本，但樣本量仍相對有限，可能影響研究結果的普遍性和可靠性。未來需要進一步擴大樣本量，進行多中心、大樣本的研究，以更準確地評估miR-373-5p和miR-382-5p與卵巢上皮癌耐藥的相關性。在研究方法上，盡管采用了多種實驗技術，但仍存在一定的局限性。例如，在細胞實驗中，僅使用了兩種卵巢上皮癌細胞系，不能完全代表所有卵巢上皮癌的生物學特性；在機制研究中，雖然初步揭示了miR-373-5p和miR-382-5p的作用機制，但對于它們在體內的具體作用以及與其他分子之間的相互作用網絡，還需要進一步深入研究。此外，本研究僅探討了miR-373-5p和miR-382-5p對卵巢上皮癌耐藥特性的影響，而未涉及其他可能與耐藥相關的因素，如腫瘤微環境、免疫細胞等，未來研究可以考慮將這些因素納入研究范圍，以更全面地揭示卵巢上皮癌耐藥的機制。5.3未來研究方向展望未來研究可從多方面深入探索miR-373-5p和miR-382-5p在卵巢上皮癌耐藥中的作用。在機制研究方面，進一步明確兩者協同作用的具體分子機制，全面分析下游更多信號分子和細胞生理過程，構建完整的信號調控網絡。同時，深入探究它們在體內的具體作用，通過動物模型實驗，觀察miR-373-5p和miR-382-5p對腫瘤生長、轉移及化療藥物敏感性的影響，為臨床治療提供更直接的理論依據。在治療應用研究方面，基于miR-373-5p和miR-382-5p的作用機制，開發針對它們的靶向治療藥物。例如，設計合成特異性的反義寡核苷酸或小分子抑制劑，抑制miR-373-5p和miR-382-5p的表達或活性，從而逆轉卵巢上皮癌的耐藥性。此外，探索將miR-373-5p和miR-382-5p與現有化療藥物或其他靶向治療藥物聯合應用的治療方案，評估聯合治療的療效和安全性，為臨床治療提供更多選擇。在臨床應用研究方面，擴大樣本量，進行多中心、大樣本的前瞻性研究，進一步驗證miR-373-5p和miR-382-5p作為卵巢上皮癌耐藥生物標志物的可靠性和有效性。同時，結合其他臨床指標和分子標志物，建立更加準確的卵巢上皮癌耐藥預測模型，為臨床醫生制定個性化治療方案提供更精準的指導。此外，開展基于miR-373-5p和miR-382-5p的臨床試驗，評估靶向治療藥物或聯合治療方案在卵巢上皮癌患者中的療效和安全性，推動相關研究成果的臨床轉化和應用。參考文獻[1]SiegelRL,MillerKD,JemalA.Cancerstatistics,2020[J].CA:acancerjournalforclinicians,2020,70(1):7-30.[2]YangH,LuKH,ColemanRL,etal.Ovariancancer[J].Thelancet,2019,393(10167):1240-1253.[3]TianY,ZhangX,YangH,etal.MicroRNA-145overexpressionreversesepithelialovariancancerchemoresistancebytargetingFOXM1[J].Oncotarget,2017,8(47):82043-82056.[4]HuX,ZhangY,WangY,etal.MiR-16enhanceschemosensitivityofovariancancercellsbytargetingBcl-2[J].Oncologyletters,2017,13(5):3241-3246.[5]GottesmanMM.Mechanismsofcancerdrugresistance[J].Annualreviewofmedicine,2002,53(1):615-627.[6]YangX,HeX,ZhaoY,etal.HighexpressionofP-glycoproteinpredictspoorprognosisinepithelialovariancancerpatientstreatedwithtaxane/platinum-basedchemotherapy[J].Oncologyletters,2015,9(3):1079-1084.[7]ReedJC.Dysregulationofapoptosisincancer[J].Journalofclinicaloncology,1999,17(9):2941-2953.[8]ShuklaS,PandeyMK,SinghPK,etal.Bcl-2familyproteins:anoverview[J].Journalofadvancedpharmaceuticaltechnology&research,2011,2(1):33-42.[9]LordCJ,AshworthA.TheDNAdamageresponseandcancertherapy[J].Nature,2012,4