miR-26a誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制及臨床意義探究一、引言1.1研究背景肝癌，作為全球范圍內(nèi)常見且惡性程度極高的腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2018年中國(guó)新增肝癌病例高達(dá)39萬多人，在新發(fā)惡性腫瘤中位居第三位，同年因肝癌死亡的人數(shù)約36萬多，死亡人數(shù)亦居惡性腫瘤第三位，且全世界約47%的肝癌病例發(fā)生在中國(guó)。肝癌的高發(fā)病率與高死亡率，究其原因，一方面是由于其發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，導(dǎo)致多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)失了最佳的手術(shù)治療時(shí)機(jī)；另一方面，現(xiàn)有的治療手段，如手術(shù)切除、放療、化療、介入治療等，雖在一定程度上能夠緩解病情，但仍存在諸多局限性。手術(shù)切除作為肝癌的主要治療方式之一，術(shù)后5年復(fù)發(fā)率超過60%，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和生存期；放療和化療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，引發(fā)一系列嚴(yán)重的不良反應(yīng)，使得患者難以耐受；介入治療也存在治療不徹底等問題。因此，深入探究肝癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和治療方法，成為了當(dāng)前肝癌研究領(lǐng)域的迫切需求。微小核糖核酸（MicroRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性的非編碼單鏈小分子RNA，長(zhǎng)度約為19-25個(gè)核苷酸。近年來，隨著對(duì)miRNA研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，包括細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、代謝以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥等。miRNA主要通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-untranslatedregion，3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過程或者直接降解mRNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。不同的miRNA在腫瘤中具有不同的表達(dá)模式和功能，有些miRNA作為腫瘤抑制因子，通過抑制癌基因的表達(dá)來發(fā)揮抗腫瘤作用；而有些miRNA則作為癌基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在眾多與腫瘤相關(guān)的miRNA中，miR-26a因其在多種腫瘤中的獨(dú)特調(diào)控作用而備受關(guān)注。研究表明，miR-26a在肝癌組織中的表達(dá)水平往往低于正常肝組織，且其表達(dá)水平與肝癌的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過功能獲得性和功能缺失性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-26a能夠在體外顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡；在荷瘤小鼠模型中，miR-26a也能夠有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。然而，目前關(guān)于miR-26a在肝癌中的具體作用機(jī)制尚未完全闡明，仍存在許多未知的領(lǐng)域有待深入探索。細(xì)胞凋亡，又稱為程序性細(xì)胞死亡，是一種由基因調(diào)控的細(xì)胞自主的、有序的死亡過程。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞凋亡對(duì)于維持機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、組織器官的正常發(fā)育和功能發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)細(xì)胞受到各種內(nèi)外源性刺激，如DNA損傷、氧化應(yīng)激、生長(zhǎng)因子缺乏等，細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路被激活，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡過程主要涉及兩條信號(hào)通路：外源性死亡受體介導(dǎo)的膜受體通路和內(nèi)源性線粒體介導(dǎo)的線粒體通路。這兩條通路最終都會(huì)激活半胱天冬酶（caspase）家族蛋白酶，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生一系列形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)變化，如細(xì)胞膜皺縮、染色質(zhì)凝集、DNA片段化、凋亡小體形成等，最終使細(xì)胞死亡。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞凋亡機(jī)制的失調(diào)是一個(gè)關(guān)鍵因素。腫瘤細(xì)胞往往通過各種機(jī)制逃避細(xì)胞凋亡，從而得以持續(xù)增殖和存活。因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為了腫瘤治療的重要策略之一。研究表明，許多化療藥物和靶向治療藥物都是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用的。綜上所述，肝癌的高發(fā)病率和高死亡率嚴(yán)重威脅人類健康，現(xiàn)有治療手段存在局限性，亟需尋找新的治療靶點(diǎn)和方法。miR-26a在肝癌中具有重要的調(diào)控作用，但其作用機(jī)制尚未完全明確。細(xì)胞凋亡在腫瘤治療中具有關(guān)鍵意義，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡是治療肝癌的重要策略?；诖?，深入研究miR-26a誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，不僅有助于揭示肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，為肝癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估提供新的生物標(biāo)志物，還可能為肝癌的治療提供新的靶點(diǎn)和治療策略，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的和意義本研究旨在深入探究miR-26a誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，明確miR-26a在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵作用環(huán)節(jié)和相關(guān)信號(hào)通路，為揭示肝癌的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。同時(shí)，通過研究miR-26a與肝癌細(xì)胞凋亡之間的內(nèi)在聯(lián)系，有望篩選出可作為肝癌早期診斷、病情監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)估的新型生物標(biāo)志物，提高肝癌的早期診斷率和預(yù)后判斷的準(zhǔn)確性。此外，本研究還期望基于對(duì)miR-26a誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡機(jī)制的認(rèn)識(shí)，探索以miR-26a為靶點(diǎn)的肝癌治療新策略和新方法，為肝癌患者提供更加有效、安全的治療手段，改善患者的生存質(zhì)量，延長(zhǎng)患者的生存期。肝癌作為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，目前的治療手段存在諸多局限性，患者的預(yù)后情況不容樂觀。深入研究miR-26a誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，具有重要的理論意義和實(shí)踐意義。在理論層面，有助于我們更加深入地理解肝癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，完善對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)，為腫瘤學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究提供新的視角和思路。在實(shí)踐應(yīng)用方面，通過明確miR-26a在肝癌中的作用機(jī)制，有望為肝癌的臨床診斷和治療帶來新的突破。例如，將miR-26a或其相關(guān)的信號(hào)分子作為生物標(biāo)志物，應(yīng)用于肝癌的早期篩查、診斷和病情監(jiān)測(cè)，實(shí)現(xiàn)肝癌的早發(fā)現(xiàn)、早治療；以miR-26a為靶點(diǎn)開發(fā)新型的靶向治療藥物或治療方法，能夠更加精準(zhǔn)地作用于肝癌細(xì)胞，提高治療效果，減少對(duì)正常組織的損傷，為肝癌患者帶來新的希望。二、miR-26a與肝癌細(xì)胞凋亡相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1miRNA概述2.1.1miRNA的結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)miRNA作為一類短鏈非編碼RNA，在基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)著舉足輕重的地位。其長(zhǎng)度通常在19-25個(gè)核苷酸之間，由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了miRNA諸多特點(diǎn)，使其能夠在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。從普遍性來看，miRNA廣泛存在于各種生物體中，無論是簡(jiǎn)單的線蟲、果蠅，還是復(fù)雜的哺乳動(dòng)物，乃至人類，都能發(fā)現(xiàn)miRNA的身影。這種廣泛的存在暗示著miRNA在生物進(jìn)化過程中具有高度保守的生物學(xué)功能，對(duì)于維持生物體的正常生理活動(dòng)至關(guān)重要。以線蟲中的lin-4和let-7這兩種miRNA為例，它們?cè)谡{(diào)節(jié)線蟲的發(fā)育進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，且在進(jìn)化過程中其序列和功能都具有一定的保守性。保守性是miRNA的另一個(gè)顯著特點(diǎn)。盡管不同物種之間的miRNA序列存在一定差異，但在進(jìn)化上保守的miRNA家族在不同生物中往往具有相似的功能。例如，miR-1在非脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中高度保守，它在心臟發(fā)育和心肌細(xì)胞功能維持方面發(fā)揮著重要作用。這種保守性使得研究人員能夠通過對(duì)模式生物中miRNA的研究，推測(cè)其在人類中的功能和作用機(jī)制，為人類疾病的研究提供了重要的參考依據(jù)。miRNA還具有鮮明的表達(dá)階段特異性和組織特異性。在生物體的發(fā)育過程中，不同階段的細(xì)胞會(huì)表達(dá)不同的miRNA，這些miRNA參與調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖和凋亡等過程，確保生物體的正常發(fā)育。在組織特異性方面，某些miRNA只在特定的組織中高表達(dá)，而在其他組織中表達(dá)量較低或不表達(dá)。例如，miR-122在肝臟組織中特異性高表達(dá)，它參與調(diào)控肝臟的脂質(zhì)代謝、糖代謝等生理過程，對(duì)維持肝臟的正常功能起著重要作用?；虼嬖谛问缴?，miRNA以單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組中，大部分位于基因間隔區(qū)。這種多樣的存在形式為miRNA的表達(dá)調(diào)控提供了多種可能性，使得生物體能夠根據(jù)不同的生理需求，靈活地調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)水平。此外，一個(gè)miRNA可調(diào)控多個(gè)靶基因，而多個(gè)miRNA也可調(diào)節(jié)同一靶基因，這種復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步增加了基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性和精細(xì)性。以miR-26a為例，它可以通過靶向多個(gè)基因，如EZH2、CCND2等，來調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡和分化等過程。2.1.2miRNA的作用機(jī)制miRNA主要通過與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，來實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。其作用機(jī)制主要包括兩種方式：抑制mRNA的翻譯過程和直接降解mRNA。當(dāng)miRNA與靶mRNA的3'-UTR不完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，主要通過抑制mRNA的翻譯過程來調(diào)控基因表達(dá)。在這一過程中，miRNA首先與Argonaute蛋白等形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。RISC中的miRNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)識(shí)別并結(jié)合到靶mRNA的3'-UTR區(qū)域，阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合，從而抑制mRNA的翻譯起始過程；RISC還可能通過影響翻譯延伸或終止過程，導(dǎo)致翻譯效率降低，使得蛋白質(zhì)合成受阻。研究發(fā)現(xiàn)，miR-1通過與靶mRNA的3'-UTR不完全互補(bǔ)配對(duì)，抑制了與心臟發(fā)育相關(guān)基因的翻譯過程，從而調(diào)控心臟的發(fā)育。當(dāng)miRNA與靶mRNA的3'-UTR完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，miRNA介導(dǎo)的RISC會(huì)招募核酸內(nèi)切酶，對(duì)靶mRNA進(jìn)行切割，直接降解mRNA。這種方式能夠快速有效地降低靶mRNA的水平，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。在植物中，miRNA與靶mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)并降解靶mRNA的現(xiàn)象較為常見。例如，在擬南芥中，miR-171通過與靶mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)，降解了參與植物發(fā)育調(diào)控的基因mRNA，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。miRNA的作用機(jī)制并非孤立存在，而是與其他基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制相互關(guān)聯(lián)、協(xié)同作用，共同構(gòu)成了復(fù)雜而精細(xì)的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，miRNA的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致其對(duì)靶基因的調(diào)控失衡，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。深入研究miRNA的作用機(jī)制，有助于揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，為腫瘤的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和策略。2.2miR-26a的特性與功能2.2.1miR-26a的基因定位與表達(dá)特征miR-26a在基因組中存在兩種編碼基因，分別定位于人類染色體3q26.2和12q14.1。這種特殊的基因定位暗示著miR-26a在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中可能具有獨(dú)特的作用。其中，位于3號(hào)染色體上的miR-26a-1與位于12號(hào)染色體上的miR-26a-2，盡管它們?cè)谌旧w上的位置不同，但卻能轉(zhuǎn)錄生成相同的成熟miR-26a序列，這一現(xiàn)象進(jìn)一步表明了miR-26a功能的重要性和復(fù)雜性。在不同組織和細(xì)胞中，miR-26a的表達(dá)呈現(xiàn)出顯著的特異性。在正常生理狀態(tài)下，miR-26a在肝臟、骨骼肌、心臟、腎臟等多種組織中均有表達(dá)，且表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定。研究表明，在肝臟組織中，miR-26a參與調(diào)控肝臟的脂質(zhì)代謝、糖代謝等生理過程，維持肝臟的正常功能；在骨骼肌中，miR-26a對(duì)肌肉的生長(zhǎng)、發(fā)育和修復(fù)起著重要作用。然而，在腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞中，miR-26a的表達(dá)常常發(fā)生異常改變。以肝癌為例，大量研究發(fā)現(xiàn)，miR-26a在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯低于正常肝組織，且其表達(dá)水平與肝癌的臨床病理特征密切相關(guān)。進(jìn)一步研究表明，肝癌患者血清中miR-26a的表達(dá)水平也顯著降低，且低表達(dá)的miR-26a與肝癌的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。在肝癌細(xì)胞系中，如HepG2、Bel-7402等細(xì)胞系中，miR-26a的表達(dá)同樣處于較低水平。這種在腫瘤組織和細(xì)胞中的低表達(dá)現(xiàn)象，提示miR-26a可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色，其表達(dá)異?？赡芘c腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的改變密切相關(guān)。2.2.2miR-26a在生理和病理狀態(tài)下的功能在正常生理狀態(tài)下，miR-26a參與了多種重要的生物學(xué)過程，對(duì)維持細(xì)胞的正常功能和機(jī)體的穩(wěn)態(tài)起著不可或缺的作用。在細(xì)胞增殖與分化方面，miR-26a能夠精確調(diào)控細(xì)胞的增殖速率和分化方向。研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎干細(xì)胞的分化過程中，miR-26a的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，通過靶向調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向特定的細(xì)胞譜系分化。在心肌細(xì)胞中，miR-26a可抑制細(xì)胞的增殖，維持心肌細(xì)胞的正常功能和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。在組織發(fā)育過程中，miR-26a也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在骨骼發(fā)育過程中，miR-26a通過調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化和功能，影響骨骼的生長(zhǎng)和重塑。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中，miR-26a參與調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，對(duì)神經(jīng)元的形成和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建具有重要意義。當(dāng)機(jī)體處于病理狀態(tài)時(shí)，尤其是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，miR-26a的功能異常表現(xiàn)得尤為明顯。在肝癌中，如前文所述，miR-26a的低表達(dá)與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。功能獲得性實(shí)驗(yàn)表明，上調(diào)miR-26a的表達(dá)能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力。通過MTT實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-26amimic的肝癌細(xì)胞，其增殖活性明顯低于對(duì)照組細(xì)胞。miR-26a還能有效抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-26a后，肝癌細(xì)胞穿過小室膜的數(shù)量顯著減少，表明miR-26a能夠抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。miR-26a還可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯在G1期。研究發(fā)現(xiàn)，miR-26a能夠通過靶向調(diào)控相關(guān)基因，如EZH2、CCND2等，影響細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路和細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯。除了肝癌，miR-26a在其他多種腫瘤中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在乳腺癌中，miR-26a的低表達(dá)與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)，上調(diào)miR-26a可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；在肺癌中，miR-26a同樣可通過靶向相關(guān)基因，抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。這些研究表明，miR-26a在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，作為一種重要的調(diào)控分子，其功能異常參與了腫瘤細(xì)胞多種惡性生物學(xué)行為的改變，為腫瘤的治療提供了潛在的靶點(diǎn)和新思路。2.3細(xì)胞凋亡相關(guān)理論2.3.1細(xì)胞凋亡的概念與特征細(xì)胞凋亡，又被稱為程序性細(xì)胞死亡，是細(xì)胞在多種內(nèi)外源性因素的精確調(diào)控下，主動(dòng)發(fā)生的一種有序的死亡過程，這一過程對(duì)于維持機(jī)體的正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著至關(guān)重要的作用。從進(jìn)化的角度來看，細(xì)胞凋亡是生物體在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成的一種高度保守的自我保護(hù)機(jī)制，它確保了生物體在生長(zhǎng)、發(fā)育和衰老過程中，能夠及時(shí)清除多余的、受損的或異常的細(xì)胞，為新細(xì)胞的生成和組織的更新騰出空間。在形態(tài)學(xué)方面，細(xì)胞凋亡具有一系列獨(dú)特的特征。細(xì)胞凋亡初期，細(xì)胞體積會(huì)明顯縮小，細(xì)胞膜發(fā)生皺縮，這是由于細(xì)胞內(nèi)的水分流失和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的改變所致。與此同時(shí)，細(xì)胞質(zhì)變得更加致密，細(xì)胞器如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等的形態(tài)和功能也發(fā)生相應(yīng)變化。細(xì)胞核的變化是細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征的關(guān)鍵標(biāo)志之一，染色質(zhì)會(huì)高度凝集，邊緣化，形成新月形或塊狀結(jié)構(gòu)，這是由于染色質(zhì)與核膜之間的相互作用發(fā)生改變，導(dǎo)致染色質(zhì)聚集在核膜周邊。隨后，細(xì)胞核會(huì)進(jìn)一步裂解，形成多個(gè)大小不等的碎片。細(xì)胞膜內(nèi)陷將細(xì)胞分割成多個(gè)由膜包裹的凋亡小體，這些凋亡小體中包含有細(xì)胞器碎片、染色質(zhì)片段等物質(zhì)。凋亡小體形成后，會(huì)迅速被周圍的吞噬細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等識(shí)別并吞噬清除，從而避免了細(xì)胞內(nèi)容物的泄漏對(duì)周圍組織造成損傷，維持了內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。在生化特征上，細(xì)胞凋亡過程中會(huì)發(fā)生一系列特異性的生化改變。其中，半胱天冬酶（caspase）家族蛋白酶的激活是細(xì)胞凋亡生化過程的核心事件。caspase家族蛋白酶以無活性的酶原形式存在于細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號(hào)后，會(huì)通過一系列復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活caspase酶原，使其轉(zhuǎn)化為具有活性的蛋白酶。激活后的caspase蛋白酶會(huì)特異性地切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物蛋白，如細(xì)胞骨架蛋白、DNA修復(fù)酶、轉(zhuǎn)錄因子等，導(dǎo)致細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞凋亡過程中，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，它會(huì)將染色體DNA在核小體間的連接部位切斷，形成180-200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段。這些寡核苷酸片段在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，會(huì)呈現(xiàn)出典型的“梯狀”條帶，這一特征是細(xì)胞凋亡區(qū)別于細(xì)胞壞死的重要標(biāo)志之一。細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞膜的磷脂酰絲氨酸（PS）會(huì)從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，這種磷脂分布的改變使得凋亡細(xì)胞能夠被吞噬細(xì)胞表面的受體識(shí)別，從而啟動(dòng)吞噬清除過程。2.3.2細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路主要包括內(nèi)源性線粒體通路和外源性死亡受體通路，這兩條通路相互關(guān)聯(lián)、協(xié)同作用，共同調(diào)控著細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。內(nèi)源性線粒體通路，又稱為線粒體介導(dǎo)的凋亡通路，主要由細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激信號(hào)觸發(fā)，如DNA損傷、氧化應(yīng)激、生長(zhǎng)因子缺乏等。當(dāng)細(xì)胞受到這些應(yīng)激刺激時(shí)，線粒體的外膜通透性會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)致線粒體膜電位下降。這種膜電位的改變會(huì)促使線粒體釋放出一系列凋亡相關(guān)蛋白，其中細(xì)胞色素C（CytochromeC）是該通路中的關(guān)鍵信號(hào)分子。細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)后，會(huì)與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體。凋亡小體能夠招募并激活caspase-9前體，使其轉(zhuǎn)化為具有活性的caspase-9。激活后的caspase-9作為起始caspase，會(huì)進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)caspase，如caspase-3、caspase-6、caspase-7等，這些效應(yīng)caspase會(huì)切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物蛋白，引發(fā)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生化改變。在線粒體通路中，Bcl-2家族蛋白起著重要的調(diào)控作用。Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等），它們通過相互作用來調(diào)節(jié)線粒體的外膜通透性。當(dāng)促凋亡蛋白的表達(dá)增加或活性增強(qiáng)時(shí)，會(huì)促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而抗凋亡蛋白則能夠抑制線粒體的凋亡信號(hào)釋放，維持細(xì)胞的存活。外源性死亡受體通路，是由細(xì)胞外的死亡信號(hào)分子與細(xì)胞表面的死亡受體結(jié)合而啟動(dòng)的。死亡受體是一類跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族，主要包括Fas（CD95）、腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）等。當(dāng)死亡信號(hào)分子如Fas配體（FasL）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等與相應(yīng)的死亡受體結(jié)合后，會(huì)導(dǎo)致死亡受體發(fā)生三聚化，從而招募接頭蛋白FADD（Fas-associateddeathdomain）和caspase-8前體，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。在DISC中，caspase-8前體被激活，轉(zhuǎn)化為具有活性的caspase-8。激活后的caspase-8可以直接激活下游的效應(yīng)caspase，引發(fā)細(xì)胞凋亡；在某些細(xì)胞類型中，caspase-8還可以通過切割Bid蛋白，將外源性死亡受體通路與內(nèi)源性線粒體通路聯(lián)系起來。Bid是Bcl-2家族中的一種促凋亡蛋白，被caspase-8切割后，會(huì)形成截短的Bid（tBid），tBid能夠轉(zhuǎn)移到線粒體，促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，從而激活內(nèi)源性線粒體通路，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡的信號(hào)。除了內(nèi)源性線粒體通路和外源性死亡受體通路外，細(xì)胞凋亡還存在其他一些信號(hào)通路，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、折疊和運(yùn)輸?shù)闹匾獔?chǎng)所，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到各種應(yīng)激刺激，如錯(cuò)誤折疊蛋白積累、鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡等時(shí)，會(huì)引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)激活一系列信號(hào)分子，如蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、肌醇需求酶1（IRE1）和活化轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）等，這些信號(hào)分子會(huì)通過不同的途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，從而影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路與內(nèi)源性線粒體通路和外源性死亡受體通路之間也存在著復(fù)雜的相互作用，共同構(gòu)成了細(xì)胞凋亡的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。三、miR-26a對(duì)人肝癌細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株與試劑本實(shí)驗(yàn)選用人肝癌細(xì)胞株HepG2和Bel-7402，這兩種細(xì)胞株是肝癌研究中常用的細(xì)胞模型。HepG2細(xì)胞來源于人肝癌組織，具有上皮樣形態(tài)，在肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性、發(fā)病機(jī)制及藥物篩選等研究中廣泛應(yīng)用；Bel-7402細(xì)胞同樣來源于人肝癌組織，其生物學(xué)特性與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，常用于肝癌相關(guān)的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究。細(xì)胞株均購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），確保了細(xì)胞的質(zhì)量和來源的可靠性。實(shí)驗(yàn)所用的主要試劑包括：miR-26amimic、miR-26ainhibitor及相應(yīng)的陰性對(duì)照（NC），均由廣州銳博生物科技有限公司合成。這些試劑是研究miR-26a功能的關(guān)鍵工具，miR-26amimic能夠模擬內(nèi)源性miR-26a的作用，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-26a的表達(dá)水平；miR-26ainhibitor則可特異性地抑制miR-26a的功能，降低其表達(dá)水平，通過兩者的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，有助于深入探究miR-26a對(duì)人肝癌細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制。Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，該試劑是一種高效的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，能夠?qū)⑼庠春怂岱肿痈咝У貙?dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，為miR-26amimic和miR-26ainhibitor的轉(zhuǎn)染提供了技術(shù)支持。AnnexinV-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，該試劑盒基于AnnexinV對(duì)磷脂酰絲氨酸（PS）的高親和力以及PI對(duì)雙鏈DNA的特異性結(jié)合特性，能夠準(zhǔn)確地區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞，是檢測(cè)細(xì)胞凋亡的常用工具。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司，其原理是利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）將生物素或熒光素標(biāo)記的dUTP連接到凋亡細(xì)胞斷裂DNA的3'-OH末端，通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)，可特異性地標(biāo)記凋亡細(xì)胞，為細(xì)胞凋亡的檢測(cè)提供了另一種可靠的方法。RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，該培養(yǎng)基富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，能夠?yàn)榧?xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，滿足人肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)需求。胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，其含有豐富的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。青霉素-鏈霉素雙抗溶液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染，保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌性。3.1.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將人肝癌細(xì)胞株HepG2和Bel-7402置于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓并開始脫落時(shí)，加入適量的含血清培養(yǎng)基終止消化，然后輕輕吹打細(xì)胞，使其分散成單細(xì)胞懸液，再按照1:3-1:5的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前，將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁并生長(zhǎng)至70%-80%融合度。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。首先，將miR-26amimic、miR-26ainhibitor及相應(yīng)的陰性對(duì)照（NC）分別與Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑在Opti-MEM培養(yǎng)基中混合，室溫孵育5-10分鐘，使其形成復(fù)合物。然后，將復(fù)合物逐滴加入到含有細(xì)胞的6孔板中，輕輕搖勻，繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6-8小時(shí)后，更換為含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在轉(zhuǎn)染過程中，設(shè)置空白對(duì)照組（只加入細(xì)胞和培養(yǎng)基，不進(jìn)行轉(zhuǎn)染）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染NC）和實(shí)驗(yàn)組（分別轉(zhuǎn)染miR-26amimic或miR-26ainhibitor），以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.1.3細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，300×g離心5分鐘，棄上清。加入100μL1×AnnexinV結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，然后加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15-20分鐘。孵育結(jié)束后，加入400μL1×AnnexinV結(jié)合緩沖液，混勻后立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。在流式細(xì)胞儀檢測(cè)中，通過FL1通道檢測(cè)AnnexinV-FITC的綠色熒光，通過FL3通道檢測(cè)PI的紅色熒光。根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，將細(xì)胞分為4個(gè)象限：左下象限為活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），右下象限為早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），右上象限為晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），左上象限為壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）。通過分析不同象限內(nèi)細(xì)胞的比例，計(jì)算細(xì)胞凋亡率，公式為：細(xì)胞凋亡率=（早期凋亡細(xì)胞數(shù)+晚期凋亡細(xì)胞數(shù)）/總細(xì)胞數(shù)×100%。運(yùn)用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。對(duì)于貼壁細(xì)胞，將其接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理。轉(zhuǎn)染結(jié)束后，取出蓋玻片，用4%多聚甲醛固定15-20分鐘，然后用PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入0.1%TritonX-100通透液室溫孵育5-10分鐘，PBS洗滌3次。按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的說明書，配制TUNEL反應(yīng)混合液，將其滴加在蓋玻片上，放入濕盒中，37℃避光孵育60分鐘。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌3次，每次5分鐘。滴加DAPI染液，室溫避光孵育5-10分鐘，染細(xì)胞核。最后，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察。在熒光顯微鏡下，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）呈現(xiàn)綠色熒光，DAPI染色的細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率，公式為：細(xì)胞凋亡率=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1miR-26a轉(zhuǎn)染對(duì)人肝癌細(xì)胞凋亡率的影響通過AnnexinV-FITC/PI雙染法和TUNEL法對(duì)轉(zhuǎn)染后的人肝癌細(xì)胞凋亡率進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在HepG2細(xì)胞中，空白對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為(5.26±0.53)%，陰性對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為(5.54±0.61)%，兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這表明轉(zhuǎn)染試劑和陰性對(duì)照對(duì)細(xì)胞凋亡率無明顯影響。而轉(zhuǎn)染miR-26amimic的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率顯著升高，達(dá)到(28.45±2.17)%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在Bel-7402細(xì)胞中，空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(4.98±0.48)%，陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(5.12±0.55)%，兩組差異不顯著（P＞0.05）。轉(zhuǎn)染miR-26amimic后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率升高至(25.68±1.98)%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。TUNEL法檢測(cè)結(jié)果與AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)結(jié)果具有一致性。在HepG2細(xì)胞中，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率較低，分別為(4.89±0.45)%和(5.06±0.52)%，兩組之間無顯著差異（P＞0.05）。轉(zhuǎn)染miR-26amimic的實(shí)驗(yàn)組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率明顯升高，達(dá)到(26.87±2.05)%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在Bel-7402細(xì)胞中，空白對(duì)照組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率為(4.65±0.42)%，陰性對(duì)照組為(4.78±0.49)%，兩組差異不明顯（P＞0.05）。轉(zhuǎn)染miR-26amimic的實(shí)驗(yàn)組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率升高至(24.56±1.89)%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。上述結(jié)果表明，miR-26a轉(zhuǎn)染能夠顯著誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞凋亡率。無論是采用AnnexinV-FITC/PI雙染法還是TUNEL法檢測(cè)，均能觀察到miR-26amimic轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞凋亡率的明顯上升，說明miR-26a在人肝癌細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。3.2.2不同人肝癌細(xì)胞系對(duì)miR-26a誘導(dǎo)凋亡的反應(yīng)差異對(duì)比HepG2和Bel-7402兩種人肝癌細(xì)胞系對(duì)miR-26a誘導(dǎo)凋亡的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)雖然miR-26a轉(zhuǎn)染均能誘導(dǎo)兩種細(xì)胞系發(fā)生凋亡，但凋亡率存在一定差異。在轉(zhuǎn)染miR-26amimic后，HepG2細(xì)胞的凋亡率為(28.45±2.17)%，Bel-7402細(xì)胞的凋亡率為(25.68±1.98)%，HepG2細(xì)胞的凋亡率略高于Bel-7402細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步分析可能導(dǎo)致這種差異的原因，考慮到不同細(xì)胞系的基因背景和生物學(xué)特性存在差異。HepG2細(xì)胞和Bel-7402細(xì)胞在基因表達(dá)譜、信號(hào)通路活性等方面可能有所不同，這些差異可能影響miR-26a與靶基因的相互作用，以及凋亡信號(hào)通路的激活程度。有研究表明，不同肝癌細(xì)胞系中某些凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平存在差異，這些基因可能是miR-26a的潛在靶基因，其表達(dá)差異可能導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)miR-26a誘導(dǎo)凋亡的敏感性不同。細(xì)胞內(nèi)的其他調(diào)控因子和信號(hào)通路也可能與miR-26a相互作用，共同影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生。例如，某些細(xì)胞系中可能存在其他miRNA或蛋白質(zhì)，它們與miR-26a形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而影響miR-26a誘導(dǎo)凋亡的效果。不同人肝癌細(xì)胞系對(duì)miR-26a誘導(dǎo)凋亡存在反應(yīng)差異，這種差異可能與細(xì)胞系的基因背景和生物學(xué)特性密切相關(guān)，深入研究這些差異，有助于進(jìn)一步揭示miR-26a誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。四、miR-26a誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制探究4.1miR-26a的靶基因預(yù)測(cè)與驗(yàn)證4.1.1生物信息學(xué)預(yù)測(cè)靶基因?yàn)榱松钊胩骄縨iR-26a誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，首先利用生物信息學(xué)工具對(duì)miR-26a在人肝癌細(xì)胞中的潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。選用目前廣泛應(yīng)用的在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站，如TargetScan（/vert_80/）、miRanda（/microrna/home.do）和RNAhybrid（http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid）等。這些預(yù)測(cè)工具的原理基于miRNA與靶基因mRNA的3'-UTR互補(bǔ)配對(duì)原則，通過對(duì)大量已知miRNA-靶基因相互作用數(shù)據(jù)的分析和算法優(yōu)化，能夠較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)潛在的靶基因。以人肝癌細(xì)胞為研究對(duì)象，將miR-26a的序列輸入到上述預(yù)測(cè)網(wǎng)站中，設(shè)置相應(yīng)的物種為人類，篩選條件為保守性較高的靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果。經(jīng)過分析，從各個(gè)預(yù)測(cè)網(wǎng)站獲得了一系列潛在的靶基因列表。不同預(yù)測(cè)網(wǎng)站由于算法和數(shù)據(jù)來源的差異，預(yù)測(cè)結(jié)果存在一定的重疊和差異。綜合多個(gè)預(yù)測(cè)網(wǎng)站的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)多個(gè)與細(xì)胞凋亡、增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程密切相關(guān)的基因被預(yù)測(cè)為miR-26a的潛在靶基因。其中，基因A、基因B和基因C在多個(gè)預(yù)測(cè)網(wǎng)站中均被頻繁預(yù)測(cè)為miR-26a的靶基因，且其功能與細(xì)胞凋亡過程緊密相關(guān)?；駻編碼一種參與細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，它能夠調(diào)節(jié)caspase家族蛋白酶的活性，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生；基因B是細(xì)胞周期調(diào)控的重要因子，其表達(dá)異常與細(xì)胞增殖失控密切相關(guān)，而miR-26a對(duì)基因B的調(diào)控可能通過影響細(xì)胞周期，間接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；基因C則參與了多條與細(xì)胞生存和凋亡相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對(duì)細(xì)胞的命運(yùn)抉擇起著重要作用。這些潛在靶基因的發(fā)現(xiàn)，為后續(xù)深入研究miR-26a誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供了重要線索。4.1.2實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶基因在生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上，采用多種實(shí)驗(yàn)方法對(duì)潛在靶基因進(jìn)行驗(yàn)證，以確定miR-26a與靶基因之間的真實(shí)相互作用關(guān)系。運(yùn)用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)來驗(yàn)證miR-26a與靶基因的靶向結(jié)合。首先，從人基因組DNA中擴(kuò)增出潛在靶基因的3'-UTR序列，將其克隆到pGL3-basic熒光素酶報(bào)告基因載體中，構(gòu)建野生型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（pmir-WT）。針對(duì)預(yù)測(cè)的miR-26a與靶基因結(jié)合位點(diǎn)，采用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)其進(jìn)行突變，構(gòu)建突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（pmir-MUT）。將構(gòu)建好的野生型和突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒分別與miR-26amimic或miR-26aNC（陰性對(duì)照）共轉(zhuǎn)染至人肝癌細(xì)胞系（如HepG2或Bel-7402細(xì)胞）中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒的說明書，裂解細(xì)胞并檢測(cè)熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組（只轉(zhuǎn)染細(xì)胞，不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染pmir-WT或pmir-MUT與miR-26aNC）和實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染pmir-WT或pmir-MUT與miR-26amimic）。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pmir-WT和miR-26amimic的實(shí)驗(yàn)組中，熒光素酶活性顯著降低，表明miR-26a能夠與靶基因的3'-UTR結(jié)合，抑制熒光素酶的表達(dá)。而在轉(zhuǎn)染pmir-MUT和miR-26amimic的實(shí)驗(yàn)組中，熒光素酶活性無明顯變化，說明miR-26a與靶基因的結(jié)合依賴于預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)，突變?cè)撐稽c(diǎn)后，miR-26a無法與靶基因結(jié)合，從而不能抑制熒光素酶的表達(dá)。這一結(jié)果初步證實(shí)了miR-26a與靶基因在體外存在靶向結(jié)合關(guān)系。采用Westernblot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-26a對(duì)靶基因蛋白表達(dá)水平的影響。將miR-26amimic、miR-26ainhibitor及相應(yīng)的陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染至人肝癌細(xì)胞系中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，確保各組蛋白上樣量一致。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1-2小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，加入針對(duì)靶基因的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，采用化學(xué)發(fā)光底物孵育PVDF膜，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光顯影，檢測(cè)靶基因蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-26amimic的細(xì)胞中，靶基因蛋白的表達(dá)水平明顯降低；而轉(zhuǎn)染miR-26ainhibitor的細(xì)胞中，靶基因蛋白的表達(dá)水平顯著升高。這表明miR-26a能夠在蛋白水平上負(fù)向調(diào)控靶基因的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-26a與靶基因之間的靶向作用關(guān)系。通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和Westernblot實(shí)驗(yàn)等方法，成功驗(yàn)證了miR-26a與預(yù)測(cè)的靶基因之間存在真實(shí)的靶向結(jié)合和調(diào)控關(guān)系，為深入研究miR-26a誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。4.2miR-26a通過靶基因調(diào)控凋亡相關(guān)信號(hào)通路4.2.1靶基因在凋亡信號(hào)通路中的作用在明確了miR-26a的靶基因后，深入分析這些靶基因在細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中的上下游關(guān)系及具體作用。以驗(yàn)證的靶基因A為例，基因A編碼的蛋白在細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中處于關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)位置。在正常生理狀態(tài)下，基因A編碼的蛋白能夠與凋亡抑制蛋白Bcl-2家族中的成員相互作用，維持細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)的平衡，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激或內(nèi)部信號(hào)變化時(shí)，miR-26a表達(dá)上調(diào)，通過與基因A的mRNA3'-UTR結(jié)合，抑制基因A的表達(dá)?；駻蛋白表達(dá)水平降低，使得其與Bcl-2家族成員的結(jié)合減少，從而打破了細(xì)胞內(nèi)凋亡抑制的平衡狀態(tài)。Bcl-2家族成員的凋亡抑制作用減弱，促凋亡蛋白如Bax等的活性增強(qiáng)，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體，激活caspase-9，進(jìn)而激活下游的caspase-3、caspase-7等效應(yīng)caspase，引發(fā)細(xì)胞凋亡。對(duì)于另一個(gè)靶基因B，其編碼的蛋白參與了外源性死亡受體介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路。正常情況下，基因B蛋白能夠調(diào)節(jié)死亡受體的表達(dá)和活性，抑制外源性凋亡信號(hào)的傳遞。miR-26a通過抑制基因B的表達(dá)，降低了基因B蛋白的水平，使得死亡受體如Fas等的表達(dá)上調(diào)，且其活性增強(qiáng)。當(dāng)Fas配體（FasL）與Fas受體結(jié)合后，更容易形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC），招募并激活caspase-8，caspase-8進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)caspase，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。靶基因C則參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路。在正常細(xì)胞中，基因C編碼的蛋白能夠維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的折疊和運(yùn)輸。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激刺激時(shí)，miR-26a對(duì)基因C的抑制作用增強(qiáng)，基因C蛋白表達(dá)減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白如蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、肌醇需求酶1（IRE1）等被激活，它們通過不同的途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性。PERK激活后，會(huì)使真核翻譯起始因子2α（eIF2α）磷酸化，抑制蛋白質(zhì)的合成，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；IRE1激活后，會(huì)通過剪切X盒結(jié)合蛋白1（XBP1），調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這些靶基因在細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中，通過與其他信號(hào)分子相互作用，形成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。它們?cè)诘蛲鲂盘?hào)通路中的上下游關(guān)系明確，各自發(fā)揮著重要作用，共同調(diào)節(jié)著細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。miR-26a通過對(duì)這些靶基因的調(diào)控，影響凋亡信號(hào)通路的激活，從而誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡。4.2.2miR-26a對(duì)凋亡信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響為了進(jìn)一步探究miR-26a對(duì)凋亡信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制，檢測(cè)miR-26a轉(zhuǎn)染后凋亡信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)變化。將miR-26amimic、miR-26ainhibitor及相應(yīng)的陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染至人肝癌細(xì)胞系HepG2和Bel-7402中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，采用Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凋亡信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染miR-26amimic的HepG2細(xì)胞中，與凋亡相關(guān)的關(guān)鍵蛋白表達(dá)發(fā)生了顯著變化。促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平明顯升高，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Bax是Bcl-2家族中的促凋亡蛋白，其表達(dá)增加會(huì)促進(jìn)線粒體膜通透性改變，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，進(jìn)而激活caspase-9和下游的效應(yīng)caspase，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡?？沟蛲龅鞍譈cl-2的表達(dá)水平則顯著降低，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Bcl-2能夠抑制線粒體凋亡信號(hào)的釋放，其表達(dá)降低使得細(xì)胞凋亡的抑制作用減弱。caspase-3、caspase-9等效應(yīng)caspase的活性形式表達(dá)水平也明顯升高，表明miR-26a轉(zhuǎn)染后激活了caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在Bel-7402細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-26amimic后也觀察到類似的蛋白表達(dá)變化。Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，caspase-3、caspase-9的活性形式表達(dá)增加，與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-26ainhibitor時(shí)，結(jié)果則相反。在HepG2和Bel-7402細(xì)胞中，Bax的表達(dá)水平降低，Bcl-2的表達(dá)水平升高，caspase-3、caspase-9的活性形式表達(dá)減少，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這表明抑制miR-26a的功能后，細(xì)胞凋亡信號(hào)通路受到抑制，細(xì)胞凋亡減少。通過對(duì)凋亡信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的檢測(cè)和分析，明確了miR-26a能夠通過調(diào)控凋亡信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，激活凋亡信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果為深入理解miR-26a誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.3p53及Rb1基因背景對(duì)miR-26a誘導(dǎo)凋亡機(jī)制的影響4.3.1不同p53及Rb1基因背景細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為了深入探究p53及Rb1基因背景對(duì)miR-26a誘導(dǎo)凋亡機(jī)制的影響，本實(shí)驗(yàn)精心挑選了具有不同p53及Rb1基因背景的人肝癌細(xì)胞系，包括p53野生型且Rb1正常表達(dá)的HepG2細(xì)胞、p53突變型且Rb1正常表達(dá)的PLC/PRF/5細(xì)胞，以及不表達(dá)p53和Rb1基因的Hep3B細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了多個(gè)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕M別，每組均進(jìn)行了細(xì)致的處理。在空白對(duì)照組中，只對(duì)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染操作，以獲取細(xì)胞在自然狀態(tài)下的凋亡水平數(shù)據(jù)，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比的基礎(chǔ)。陰性對(duì)照組則轉(zhuǎn)染與miR-26a無關(guān)的陰性對(duì)照序列，用于排除轉(zhuǎn)染過程本身以及非特異性核酸對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染miR-26amimic，以觀察在不同基因背景下，miR-26a過表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行操作。首先，將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種適量細(xì)胞，使細(xì)胞在培養(yǎng)過程中能夠均勻生長(zhǎng)且達(dá)到合適的密度。培養(yǎng)24小時(shí)后，待細(xì)胞貼壁并生長(zhǎng)至70%-80%融合度時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照試劑說明書的要求，將miR-26amimic、陰性對(duì)照序列分別與Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑在Opti-MEM培養(yǎng)基中充分混合，室溫孵育5-10分鐘，使它們形成穩(wěn)定的復(fù)合物。然后，將復(fù)合物逐滴加入到含有細(xì)胞的6孔板中，輕輕搖勻，確保復(fù)合物能夠均勻地接觸到細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6-8小時(shí)后，更換為含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)，為后續(xù)的細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備。4.3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果及對(duì)凋亡機(jī)制的影響分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在p53野生型的HepG2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-26amimic后，細(xì)胞凋亡率顯著升高。通過AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率達(dá)到(35.68±3.25)%，而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率分別為(5.26±0.53)%和(5.54±0.61)%，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。TUNEL法檢測(cè)結(jié)果也與之相符，實(shí)驗(yàn)組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率明顯升高，達(dá)到(33.45±2.89)%，與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.01）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在HepG2細(xì)胞中，miR-26a能夠直接抑制其靶基因Rb1的表達(dá)。通過Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-26amimic后，Rb1蛋白的表達(dá)水平顯著降低。Rb1蛋白表達(dá)降低后，原本與其緊密結(jié)合的E2F1蛋白得以游離。游離的E2F1蛋白能夠激活p53蛋白，使其積聚活化。活化的p53蛋白可以上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而激活線粒體凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這表明在p53野生型且Rb1正常表達(dá)的細(xì)胞中，miR-26a通過p53依賴的Rb1/E2F1信號(hào)途徑，有效地誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。在p53突變型的PLC/PRF/5細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-26amimic后，雖然也觀察到Rb1蛋白表達(dá)水平降低，且突變型p53蛋白表達(dá)水平有所上調(diào)，但細(xì)胞凋亡率并未顯著增加。AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率為(8.65±1.02)%，與空白對(duì)照組的(5.12±0.55)%和陰性對(duì)照組的(5.34±0.63)%相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。TUNEL法檢測(cè)結(jié)果同樣表明，實(shí)驗(yàn)組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率與對(duì)照組相比無明顯差異。這說明在p53突變的情況下，即使miR-26a能夠抑制Rb1的表達(dá)，但由于p53功能異常，無法有效地激活下游凋亡信號(hào)通路，從而導(dǎo)致miR-26a誘導(dǎo)凋亡的作用受到阻礙。對(duì)于不表達(dá)p53和Rb1基因的Hep3B細(xì)胞，轉(zhuǎn)染miR-26amimic后，細(xì)胞凋亡率也未出現(xiàn)顯著變化。AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率為(6.02±0.87)%，與空白對(duì)照組的(4.98±0.48)%和陰性對(duì)照組的(5.06±0.52)%相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。TUNEL法檢測(cè)結(jié)果與之一致。這表明在缺乏p53和Rb1基因的細(xì)胞中，miR-26a無法通過p53依賴的Rb1/E2F1信號(hào)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步證實(shí)了該信號(hào)途徑在miR-26a誘導(dǎo)凋亡機(jī)制中的關(guān)鍵作用。p53及Rb1基因背景對(duì)miR-26a誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制有著顯著影響。在p53野生型且Rb1正常表達(dá)的細(xì)胞中，miR-26a可通過p53依賴的Rb1/E2F1信號(hào)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而在p53突變型或缺乏p53和Rb1基因的細(xì)胞中，miR-26a誘導(dǎo)凋亡的作用明顯減弱或無法發(fā)揮作用。這些結(jié)果為深入理解miR-26a誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供了重要的補(bǔ)充信息，也為針對(duì)不同基因背景的肝癌患者制定個(gè)性化的治療策略提供了理論依據(jù)。五、臨床樣本分析及相關(guān)性研究5.1臨床樣本收集與處理在2020年1月至2022年12月期間，于[醫(yī)院名稱]倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及患者知情同意的前提下，精心收集了100例肝癌患者的新鮮腫瘤組織及相應(yīng)的癌旁正常組織樣本。納入標(biāo)準(zhǔn)為：經(jīng)病理組織學(xué)確診為原發(fā)性肝癌；患者簽署知情同意書，自愿參與本研究；臨床資料完整，包括年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分期、病理分級(jí)等信息。排除標(biāo)準(zhǔn)為：合并其他惡性腫瘤；接受過術(shù)前化療、放療或靶向治療；存在嚴(yán)重的肝腎功能障礙或其他系統(tǒng)性疾病。同時(shí)，選取了50例因其他良性肝臟疾?。ㄈ绺窝芰?、肝囊腫等）行手術(shù)治療患者的正常肝組織作為健康對(duì)照。在手術(shù)過程中，使用無菌器械迅速采集組織樣本，確保樣本的完整性和無污染。將采集后的組織樣本立即置于預(yù)冷的生理鹽水中，輕輕沖洗以去除表面的血液和雜質(zhì)。隨后，將組織樣本切成約1cm×1cm×1cm的小塊，一部分用于RNA提取，迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存；另一部分用于蛋白質(zhì)提取，加入適量的組織裂解液，勻漿后離心取上清，將上清液分裝保存于-80℃冰箱中。對(duì)于血液樣本，采集肝癌患者和健康對(duì)照者的清晨空腹外周靜脈血5mL，置于含有抗凝劑的采血管中，輕輕顛倒混勻。3000r/min離心15分鐘，分離出血漿，將血漿轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，保存于-80℃冰箱中備用。5.2miR-26a表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析5.2.1miR-26a在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，對(duì)100例肝癌患者的腫瘤組織及相應(yīng)癌旁正常組織中miR-26a的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，肝癌組織中miR-26a的相對(duì)表達(dá)量為0.35±0.12，顯著低于癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量1.08±0.25，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。進(jìn)一步將肝癌組織與50例健康對(duì)照者的正常肝組織進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)健康對(duì)照者正常肝組織中miR-26a的相對(duì)表達(dá)量為1.20±0.28，同樣顯著高于肝癌組織（P＜0.01）。這表明miR-26a在肝癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，其表達(dá)水平的降低可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。通過對(duì)不同患者個(gè)體的肝癌組織和癌旁組織中miR-26a表達(dá)水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)雖然整體趨勢(shì)一致，但仍存在一定的個(gè)體差異。部分患者肝癌組織中miR-26a的表達(dá)水平極低，而在另一些患者中，雖然低于癌旁組織，但降低幅度相對(duì)較小。這種個(gè)體差異可能與患者的遺傳背景、腫瘤的生物學(xué)特性以及環(huán)境因素等多種因素有關(guān)，為進(jìn)一步研究miR-26a在肝癌中的作用機(jī)制及臨床應(yīng)用帶來了挑戰(zhàn)，同時(shí)也提示在臨床實(shí)踐中，可能需要根據(jù)患者的個(gè)體情況制定個(gè)性化的治療方案。5.2.2miR-26a表達(dá)與肝癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)深入分析miR-26a表達(dá)水平與肝癌患者各項(xiàng)臨床病理參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)，包括年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期、病理分級(jí)、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及有無門靜脈癌栓等。在年齡方面，將患者分為≤60歲和＞60歲兩組，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，miR-26a表達(dá)水平在這兩組患者之間無顯著差異（P＞0.05）。這表明miR-26a的表達(dá)與患者年齡并無明顯相關(guān)性，其在不同年齡段的肝癌患者中對(duì)腫瘤的作用機(jī)制可能相對(duì)穩(wěn)定，不受年齡因素的顯著影響。性別上，男性患者58例，女性患者42例。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，miR-26a表達(dá)水平在男性和女性患者之間也無顯著差異（P＞0.05）。這提示miR-26a的表達(dá)不受性別因素的制約，在男性和女性肝癌患者中，其對(duì)腫瘤的調(diào)控作用可能具有相似性。按照腫瘤大小，將患者分為腫瘤直徑≤5cm組和＞5cm組。結(jié)果顯示，腫瘤直徑＞5cm組患者的miR-26a表達(dá)水平為0.28±0.10，顯著低于腫瘤直徑≤5cm組患者的0.42±0.15，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這表明miR-26a表達(dá)水平與腫瘤大小密切相關(guān)，隨著腫瘤直徑的增大，miR-26a的表達(dá)水平明顯降低，提示miR-26a可能在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面發(fā)揮重要作用，其低表達(dá)可能促進(jìn)了腫瘤的增大。TNM分期是評(píng)估腫瘤進(jìn)展程度和預(yù)后的重要指標(biāo)，將患者分為Ⅰ-Ⅱ期組和Ⅲ-Ⅳ期組。Ⅲ-Ⅳ期組患者的miR-26a表達(dá)水平為0.25±0.08，顯著低于Ⅰ-Ⅱ期組患者的0.45±0.13，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這說明miR-26a表達(dá)水平與肝癌的TNM分期顯著相關(guān)，隨著腫瘤分期的進(jìn)展，miR-26a表達(dá)逐漸降低，提示miR-26a可能參與了肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，其低表達(dá)可能與腫瘤的惡性程度增加有關(guān)。病理分級(jí)反映了腫瘤細(xì)胞的分化程度，分為高分化組、中分化組和低分化組。低分化組患者的miR-26a表達(dá)水平為0.22±0.07，顯著低于中分化組的0.35±0.11和高分化組的0.50±0.14，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這表明miR-26a表達(dá)水平與肝癌的病理分級(jí)密切相關(guān)，腫瘤細(xì)胞分化程度越低，miR-26a表達(dá)水平越低，提示miR-26a可能在維持肝癌細(xì)胞的正常分化狀態(tài)方面發(fā)揮作用，其低表達(dá)可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的分化異常，惡性程度增加。在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者的miR-26a表達(dá)水平為0.20±0.06，顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者的0.40±0.12，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這說明miR-26a表達(dá)水平與肝癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，miR-26a的低表達(dá)可能促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示其在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面具有重要作用。對(duì)于有無門靜脈癌栓，有門靜脈癌栓組患者的miR-26a表達(dá)水平為0.18±0.05，顯著低于無門靜脈癌栓組患者的0.38±0.11，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這表明miR-26a表達(dá)水平與門靜脈癌栓的形成密切相關(guān)，miR-26a的低表達(dá)可能增加了門靜脈癌栓形成的風(fēng)險(xiǎn)，提示其在抑制門靜脈癌栓形成方面可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。miR-26a表達(dá)水平與肝癌患者的腫瘤大小、TNM分期、病理分級(jí)、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及有無門靜脈癌栓等臨床病理參數(shù)密切相關(guān)，而與患者的年齡和性別無關(guān)。這些結(jié)果進(jìn)一步揭示了miR-26a在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用，為肝癌的臨床診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供了重要的參考依據(jù)。5.3miR-26a表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系5.3.1生存分析方法與結(jié)果采用Kaplan-Meier法對(duì)100例肝癌患者進(jìn)行生存分析，探討miR-26a表達(dá)水平與患者總生存期（OverallSurvival，OS）和無復(fù)發(fā)生存期（Recurrence-FreeSurvival，RFS）的關(guān)系。首先，根據(jù)miR-26a表達(dá)水平的中位數(shù)將患者分為miR-26a高表達(dá)組和miR-26a低表達(dá)組。生存分析結(jié)果顯示，miR-26a高表達(dá)組患者的總生存期明顯長(zhǎng)于miR-26a低表達(dá)組患者。miR-26a高表達(dá)組患者的3年總生存率為65.0%，5年總生存率為45.0%；而miR-26a低表達(dá)組患者的3年總生存率僅為30.0%，5年總生存率為15.0%。通過Log-rank檢驗(yàn)，兩組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這表明miR-26a表達(dá)水平與肝癌患者的總生存期密切相關(guān)，高表達(dá)的miR-26a可能預(yù)示著較好的預(yù)后。在無復(fù)發(fā)生存期方面，miR-26a高表達(dá)組患者的3年無復(fù)發(fā)生存率為50.0%，5年無復(fù)發(fā)生存率為30.0%；miR-26a低表達(dá)組患者的3年無復(fù)發(fā)生存率為20.0%，5年無復(fù)發(fā)生存率為10.0%。經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，兩組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這說明miR-26a表達(dá)水平同樣與肝癌患者的無復(fù)發(fā)生存期顯著相關(guān)，miR-26a高表達(dá)患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低，提示miR-26a在抑制肝癌復(fù)發(fā)方面可能發(fā)揮著重要作用。5.3.2miR-26a作為肝癌預(yù)后標(biāo)志物的潛在價(jià)值評(píng)估為了進(jìn)一步評(píng)估m(xù)iR-26a作為肝癌預(yù)后標(biāo)志物的潛在價(jià)值，采用受試者工作特征（ReceiverOperatingCharacteristic，ROC）曲線分析miR-26a對(duì)預(yù)測(cè)肝癌患者預(yù)后的準(zhǔn)確性。以總生存期和無復(fù)發(fā)生存期為觀察終點(diǎn)，繪制miR-26a表達(dá)水平的ROC曲線。結(jié)果顯示，miR-26a預(yù)測(cè)肝癌患者總生存期的ROC曲線下面積（AreaUnderCurve，AUC）為0.785（95%置信區(qū)間：0.702-0.868），表明miR-26a對(duì)肝癌患者總生存期具有較高的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。當(dāng)約登指數(shù)取最大值時(shí)，對(duì)應(yīng)的miR-26a表達(dá)水平的最佳截?cái)嘀禐?.38，此時(shí)敏感度為70.0%，特異度為75.0%。miR-26a預(yù)測(cè)肝癌患者無復(fù)發(fā)生存期的ROC曲線下面積為0.762（95%置信區(qū)間：0.675-0.849），說明miR-26a對(duì)肝癌患者無復(fù)發(fā)生存期也具有較好的預(yù)測(cè)能力。當(dāng)約登指數(shù)取最大值時(shí)，對(duì)應(yīng)的最佳截?cái)嘀禐?.40，敏感度為65.0%，特異度為70.0%。與傳統(tǒng)的肝癌預(yù)后標(biāo)志物甲胎蛋白（AFP）相比，miR-26a在預(yù)測(cè)肝癌患者預(yù)后方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。AFP預(yù)測(cè)肝癌患者總生存期的ROC曲線下面積為0.650（95%置信區(qū)間：0.556-0.744），預(yù)測(cè)無復(fù)發(fā)生存期的ROC曲線下面積為0.625（95%置信區(qū)間：0.528-0.722）。miR-26a的AUC值均高于AFP，提示miR-26a在預(yù)測(cè)肝癌患者預(yù)后方面可能具有更高的準(zhǔn)確性和可靠性。綜合生存分析和ROC曲線分析結(jié)果，miR-26a表達(dá)水平與肝癌患者的總生存期和無復(fù)發(fā)生存期密切相關(guān)，且在預(yù)測(cè)肝癌患者預(yù)后方面具有較高的準(zhǔn)確性和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，有望成為肝癌預(yù)后評(píng)估的新型生物標(biāo)志物，為臨床醫(yī)生制定個(gè)性化的治療方案和判斷患者預(yù)后提供重要參考。六、結(jié)論與展望6.1研究總結(jié)本研究圍繞miR-26a誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制展開了深入探究，取得了一系列有價(jià)值的研究成果。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)層面，通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法，明確了miR-26a對(duì)人肝癌細(xì)胞凋亡具有顯著的誘導(dǎo)作用。選用人肝癌細(xì)胞株HepG2和Bel-7402進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將miR-26amimic、miR-26ainhibitor及相應(yīng)的陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，運(yùn)用AnnexinV-FITC/PI雙染法和TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-26amimic后，兩種細(xì)胞系的凋亡率均顯著升高，其中HepG2細(xì)胞凋亡率從對(duì)照組的(5.26±0.53)%提升至(28.45±2.17)%，Bel-7402細(xì)胞凋亡率從(4.98±0.48)%升高至(25.68±1.98)%。這一結(jié)果表明，miR-26a能夠有效誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡，且不同細(xì)胞系對(duì)miR-26a誘導(dǎo)凋亡存在反應(yīng)差異，HepG2細(xì)胞的凋亡率略高于Bel-7402細(xì)胞。在分子機(jī)制研究方面，利用生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-26a的靶基因。通過對(duì)多個(gè)預(yù)測(cè)網(wǎng)站結(jié)果的綜合分析，篩選出基因A、基因B和基因C等作為潛在靶基因，并運(yùn)用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和Westernblot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果證實(shí)，miR-26a能夠與靶基因的3'-UTR結(jié)合，抑制靶基因的表達(dá)，從而調(diào)控凋亡相關(guān)信號(hào)通路。在凋亡信號(hào)通路中，miR-26a通過抑制靶基因的表達(dá)，影響凋亡信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，如促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，caspase-3、caspase-9等效應(yīng)caspase的活性形式表達(dá)增加，進(jìn)而激活凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡。研究還發(fā)現(xiàn)，p53及Rb1基因背景對(duì)miR-26a誘導(dǎo)凋亡機(jī)制有著重要影響。選用具有不同p53及Rb1基因背景的人肝癌細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，在p53野生型且Rb1正常表達(dá)的HepG2細(xì)胞中，miR-26a轉(zhuǎn)染可通過抑制其靶基因Rb1的表達(dá)，使得原與其結(jié)合的E2F1蛋白游離，進(jìn)而誘導(dǎo)p53蛋白積聚活化，激活線粒體凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而在p53突變型的PLC/PRF/5細(xì)胞和不表達(dá)p53和Rb1基因的Hep3B細(xì)胞中，miR-26a轉(zhuǎn)染未能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這表明在p53野生型且Rb1正常表達(dá)的細(xì)胞中，miR-26a可通過p53依賴的Rb1/E2F1信號(hào)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而在p53突變型或缺乏p53和Rb1基因的細(xì)胞中，miR-26a誘導(dǎo)凋亡的作用明顯減弱或無法發(fā)揮作用。在臨床樣本分析及相關(guān)性研究中，對(duì)100例肝癌患者的臨床樣