Hsa-miR-143在腎透明細胞癌中的關鍵角色與分子機制解析一、引言1.1研究背景腎透明細胞癌（clearcellrenalcellcarcinoma，ccRCC）是最常見的腎癌亞型，約占所有腎癌的70%-80%。在泌尿系統惡性腫瘤中，其發病率僅次于膀胱癌。近年來，隨著生活方式的改變和老齡化社會的加劇，腎透明細胞癌的發病率在全球范圍內呈逐漸上升趨勢。據統計，每年全球新增腎透明細胞癌患者超過40萬例，且死亡率也居高不下。在中國，腎透明細胞癌的發病率同樣逐年增加，嚴重威脅著人們的健康和生命質量。腎透明細胞癌的發病機制較為復雜，涉及多個基因和信號通路的異常改變。目前，手術切除是早期腎透明細胞癌的主要治療方法，但對于中晚期患者，由于癌細胞已經發生轉移，手術治療效果往往不理想，且患者對傳統的放化療不敏感，靶向治療和免疫治療雖然在一定程度上改善了患者的預后，但仍存在耐藥和療效不佳等問題。因此，深入研究腎透明細胞癌的發病機制，尋找新的診斷標志物和治療靶點具有重要的臨床意義。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度約為19-25個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，其主要功能是通過種子序列與特殊mRNA靶基因非編碼區的反向互補結合，形成miRISC絡合物，導致翻譯抑制或mRNA降解，參與轉錄后基因的表達調控。研究表明，miRNA在細胞的分化、發育、增殖、遷移、凋亡、形態形成及癌癥形成、脂肪代謝等許多生理過程中發揮了重要作用，約30%以上基因的mRNA表達受到miRNA的調節。在腫瘤發生發展過程中，miRNA可以作為癌基因或抑癌基因發揮作用，參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉移等過程。因此，miRNA成為了腫瘤研究領域的熱點之一，為腫瘤的診斷、治療和預后評估提供了新的思路和方法。hsa-miR-143作為一類在動物體內廣泛表達的miRNA，其在許多組織器官中都有表達，且在不同組織器官中的表達豐度存在較大差異。已有研究表明，hsa-miR-143參與了脂肪細胞分化、脂類代謝等過程，并且在多種腫瘤中發揮著重要的作用。例如，在直腸癌中，hsa-miR-143表現出抑制腫瘤的作用；在結直腸癌的臨床管理中，hsa-miR-143的表達分析有助于疾病的診斷和治療。然而，hsa-miR-143在腎透明細胞癌中的作用及分子機制尚不清楚。因此，本研究旨在探討hsa-miR-143對腎透明細胞癌發生發展的影響及其分子機制，為腎透明細胞癌的診斷和治療提供新的靶點和理論依據。1.2Hsa-miR-143概述Hsa-miR-143，即人類微小RNA-143，定位于第5號染色體的5q32區域，其序列為5-UGAGAUGAAGCAC-UGUAGCUC-3，在結構上，它和其他microRNA一樣，不具備編碼蛋白質的能力，沒有開放閱讀框，并且具有高度的保守性，這意味著在不同物種的進化過程中，hsa-miR-143的序列和功能相對穩定，體現了其在生物體內的重要性。Hsa-miR-143的合成是一個復雜且精細調控的過程，首先，在RNA聚合酶的催化作用下，以DNA為模板轉錄形成pri-microRNA，它可以包含單一的microRNA或者是microRNA集群；接著，pri-microRNA在與Drosha酶有關的DGCR8蛋白的協同作用下，被剪切成更小的、具有約70個核苷酸的雙鏈發夾結構的pre-microRNA，這個過程對miRNA的成熟和功能發揮至關重要；隨后，pre-microRNA在Exportin5和GTP依賴蛋白的協助下，從細胞核轉運到細胞質中，在細胞質中，經過Dicer酶的進一步加工，pre-microRNA被切割成約21個核苷酸的成熟microRNA，此時的成熟microRNA是含有反義鏈的雙鏈RNA分子。值得注意的是，莖環結構的miR-143前體由于剪切位點的差異，能夠生成miR-143-3p（21nt）和miR-143-5p（22nt）兩種不同的成熟體，它們可能各自具有獨特的生物學功能和作用靶點。在作用機制方面，hsa-miR-143主要通過與靶mRNA的3'非編碼區（3'UTR）進行特異性的反向互補配對，形成miRISC（RNA誘導沉默復合體）絡合物。當miRISC與靶mRNA結合后，如果兩者的互補程度較高，通常會導致mRNA的降解，從而直接減少靶mRNA的數量，使其無法翻譯為蛋白質；而當互補程度相對較低時，則主要抑制mRNA的翻譯過程，使得mRNA雖然存在，但無法被核糖體讀取并翻譯成蛋白質，以此實現對基因表達的轉錄后調控，進而影響細胞的生理功能和生物學行為。Hsa-miR-143在多種生理病理過程中扮演著關鍵角色。在生理過程中，它參與了脂肪細胞分化、脂類代謝等重要活動。例如，在脂肪細胞分化過程中，研究發現hsa-miR-143的表達變化對脂肪細胞的分化進程有著顯著影響。通過轉染miR-143反義寡核苷酸（ASOs）抑制其表達，會阻礙脂肪細胞的分化；而過表達hsa-miR-143則能夠促進脂肪細胞分化標志物基因的表達，表明hsa-miR-143在脂肪細胞分化中起到正向調節作用。在脂類代謝方面，hsa-miR-143可能通過調控一系列與脂類合成、轉運和代謝相關的靶基因，影響脂質的合成、儲存和分解過程，維持體內脂類代謝的平衡。在病理過程中，hsa-miR-143與多種腫瘤的發生發展密切相關。在直腸癌中，hsa-miR-143表現出抑制腫瘤的特性，它可能通過靶向作用于某些癌基因或者參與腫瘤相關信號通路，抑制直腸癌細胞的增殖、侵襲和轉移能力，促進癌細胞的凋亡。在結直腸癌的臨床管理中，檢測hsa-miR-143的表達水平有助于疾病的診斷和治療決策的制定。研究表明，結直腸癌患者體內hsa-miR-143的表達水平與正常人群存在顯著差異，其表達量的變化可以作為結直腸癌診斷的潛在生物標志物之一，并且與患者的病情進展、預后等密切相關。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探究hsa-miR-143對腎透明細胞癌發生發展的影響及其分子機制。通過一系列實驗，檢測hsa-miR-143在腎透明細胞癌組織及細胞系中的表達水平，分析其與腎透明細胞癌患者臨床病理特征及預后的關系，研究過表達或抑制hsa-miR-143表達對腎透明細胞癌細胞增殖、凋亡、侵襲和轉移等生物學行為的影響，并且篩選和驗證hsa-miR-143的靶基因，揭示其在腎透明細胞癌中發揮作用的分子信號通路。在理論意義方面，本研究將有助于進一步闡明腎透明細胞癌的發病機制，填補hsa-miR-143在腎透明細胞癌研究領域的空白，豐富人們對miRNA在腫瘤發生發展中作用機制的認識，為后續相關研究提供重要的理論基礎和研究思路，推動腫瘤分子生物學的發展。從臨床應用意義來看，hsa-miR-143有望成為腎透明細胞癌新的診斷標志物。通過檢測患者組織或體液中hsa-miR-143的表達水平，可輔助醫生進行早期診斷，提高疾病的檢出率，為患者爭取更早的治療時機。hsa-miR-143還有可能作為評估腎透明細胞癌患者預后的指標，幫助醫生判斷患者的病情發展和生存情況，制定個性化的治療方案。在治療方面，以hsa-miR-143及其靶基因相關的信號通路為靶點，開發新的治療策略，為腎透明細胞癌患者提供更多的治療選擇，改善患者的預后，提高患者的生存質量。二、Hsa-miR-143與腎透明細胞癌關系的研究現狀2.1Hsa-miR-143在腎透明細胞癌中的表達差異大量研究表明，hsa-miR-143在腎透明細胞癌組織中的表達水平顯著低于正常腎組織，這種表達差異可能與腎透明細胞癌的發生發展密切相關。早在2012年，一項研究收集了36例原發性散發腎透明細胞癌手術切除標本以及36例遠離腫瘤的癌周圍腎臟組織作為對照。通過采用Trizol法提取組織總RNA，運用miRNA表達譜芯片分析和Real-timePCR法檢測，結果顯示，miR-143在腎透明細胞癌組織中的表達量相較于正常腎細胞組織明顯降低，miRNA表達譜芯片顯示二者表達差異倍數達13.9倍，Real-timePCR法檢測顯示腎透明細胞癌組織中miR-143的表達為（16.01±8.90），而正常腎細胞組織為317.79±124.65，差異具有顯著性（P＜0.05），充分表明miR-143在腎透明細胞癌組織中低表達。另有研究運用熒光定量PCR技術，對腎透明細胞癌組織及相應的癌旁正常組織中hsa-miR-143的表達進行檢測，同樣發現hsa-miR-143在癌組織中的表達水平明顯低于癌旁正常組織，進一步證實了hsa-miR-143在腎透明細胞癌中低表達的現象。這種表達差異可能是由于多種因素導致的。從基因調控層面來看，可能存在某些轉錄因子或表觀遺傳修飾的異常，影響了hsa-miR-143基因的轉錄過程。例如，DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳修飾方式，若hsa-miR-143基因啟動子區域發生高甲基化，會阻礙轉錄因子與啟動子的結合，進而抑制基因的轉錄，導致hsa-miR-143的表達水平降低。從miRNA合成加工途徑考慮，參與hsa-miR-143合成的關鍵酶，如Drosha酶、Dicer酶等，其活性或表達量的改變，可能影響hsa-miR-143從pri-miRNA到pre-miRNA，再到成熟miRNA的加工過程，最終使得成熟hsa-miR-143的生成減少。2.2現有研究中Hsa-miR-143對腎透明細胞癌影響的初步結論目前，針對hsa-miR-143對腎透明細胞癌影響的研究雖然尚不夠深入和全面，但已取得了一些有價值的初步結論。在細胞增殖方面，已有研究表明，上調hsa-miR-143的表達能夠顯著抑制腎透明細胞癌細胞的增殖能力。研究人員通過體外細胞實驗，將合成的hsa-miR-143mimic轉染至腎透明細胞癌細胞系786-O和ACHN中，結果發現，與對照組相比，轉染后的細胞增殖速度明顯減緩。進一步利用CCK-8法檢測細胞活力，結果顯示，隨著時間的推移，過表達hsa-miR-143的細胞組吸光度值顯著低于對照組，表明細胞增殖受到明顯抑制。其作用機制可能與hsa-miR-143對相關靶基因的調控有關。有研究發現，hsa-miR-143可以靶向作用于胰島素樣生長因子1受體（IGF1R），通過抑制IGF1R的表達，阻斷下游PI3K/AKT信號通路的激活，從而抑制腎透明細胞癌細胞的增殖。IGF1R在多種腫瘤細胞中高表達，與細胞的增殖、存活和轉移密切相關，hsa-miR-143對IGF1R的靶向調控為其抑制腎透明細胞癌細胞增殖提供了重要的分子機制依據。細胞凋亡也是腫瘤研究的重要方向，hsa-miR-143在促進腎透明細胞癌細胞凋亡方面同樣發揮著關鍵作用。當在腎透明細胞癌細胞中過表達hsa-miR-143后，通過流式細胞術檢測發現，細胞凋亡率明顯增加。這一現象可能與hsa-miR-143對凋亡相關蛋白的調控有關。研究表明，hsa-miR-143能夠上調促凋亡蛋白Bax的表達，同時下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，改變Bax/Bcl-2的比值，從而促使細胞色素c從線粒體釋放到細胞質中，激活caspase級聯反應，最終誘導細胞凋亡。在對腎透明細胞癌細胞株786-O進行hsa-miR-143過表達處理后，利用Westernblot檢測發現，Bax蛋白表達水平顯著升高，而Bcl-2蛋白表達水平明顯降低，進一步證實了hsa-miR-143通過調節Bax/Bcl-2蛋白表達來促進細胞凋亡的作用機制。腫瘤細胞的侵襲和轉移是導致癌癥患者預后不良的重要因素，hsa-miR-143在抑制腎透明細胞癌細胞侵襲和轉移方面也表現出積極作用。在體外侵襲實驗中，將過表達hsa-miR-143的腎透明細胞癌細胞接種于Transwell小室中，結果顯示，穿過基質膠的細胞數量明顯少于對照組，表明細胞的侵襲能力受到抑制。在體內轉移實驗中，通過建立腎透明細胞癌小鼠轉移模型，發現過表達hsa-miR-143的實驗組小鼠肺部轉移瘤的數量和大小均顯著低于對照組。其作用機制可能涉及多個方面，一方面，hsa-miR-143可以通過靶向抑制基質金屬蛋白酶（MMPs）家族成員的表達，如MMP-2和MMP-9，減少細胞外基質的降解，從而抑制癌細胞的侵襲和轉移。另一方面，hsa-miR-143還可能通過調控上皮-間質轉化（EMT）過程來影響癌細胞的轉移能力。研究發現，hsa-miR-143能夠抑制EMT相關轉錄因子Snail和Slug的表達，維持細胞的上皮表型，降低細胞的遷移和侵襲能力。在對腎透明細胞癌細胞株ACHN進行hsa-miR-143過表達處理后，檢測發現MMP-2和MMP-9的蛋白表達水平明顯降低，同時E-cadherin（上皮標志物）的表達升高，N-cadherin和Vimentin（間質標志物）的表達降低，進一步驗證了hsa-miR-143在抑制腎透明細胞癌細胞侵襲和轉移方面的作用機制。三、研究設計與方法3.1實驗材料3.1.1腎透明細胞癌細胞系選用人腎透明細胞癌細胞系786-O和ACHN，這兩種細胞系是腎透明細胞癌研究中常用的細胞系，具有典型的腎透明細胞癌特征，且在國內外相關研究中被廣泛應用。786-O細胞系來源于一位60歲男性患者的腎透明細胞癌組織，其在體外培養時具有較強的增殖能力，能夠較好地模擬腎透明細胞癌在體內的生長狀態；ACHN細胞系同樣具有腎透明細胞癌的特性，對研究腎透明細胞癌的生物學行為和分子機制具有重要意義。細胞由[具體細胞來源機構]提供，并在含有10%胎牛血清（FetalBovineSerum，FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養箱中常規培養，定期更換培養基，當細胞生長至80%-90%融合時，進行傳代或實驗處理。3.1.2實驗動物選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，體重18-22g，購自[動物供應商名稱]。裸鼠由于缺乏胸腺，細胞免疫功能缺陷，對異種移植的腫瘤細胞具有較低的免疫排斥反應，是建立人腫瘤異種移植模型的理想動物。在實驗前，將裸鼠置于無特定病原體（SpecificPathogenFree，SPF）級動物房適應環境1周，動物房溫度控制在22-25℃，相對濕度為40%-60%，12h光照/12h黑暗交替，自由進食和飲水。在整個實驗過程中，嚴格遵守動物實驗倫理和相關法規，確保動物福利。3.1.3主要試劑RNA提取試劑：Trizol試劑購自Invitrogen公司，該試劑能夠高效、穩定地提取細胞和組織中的總RNA，其原理是利用異硫氰酸胍和苯酚等成分，迅速裂解細胞，使RNA與蛋白質分離，并保持RNA的完整性，是RNA提取的常用試劑。反轉錄試劑：PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）購自TaKaRa公司，此試劑盒可有效去除基因組DNA污染，將RNA反轉錄為cDNA，為后續的熒光定量PCR實驗提供模板。熒光定量PCR試劑：SYBRPremixExTaq?II（TliRNaseHPlus）購自TaKaRa公司，基于SYBRGreenI染料法，能特異性地摻入雙鏈DNA中，隨著PCR擴增產物的增加，熒光信號也相應增強，通過實時監測熒光信號的變化，可實現對目的基因表達水平的準確定量。細胞轉染試劑：Lipofectamine3000轉染試劑購自Invitrogen公司，它能高效地將外源核酸（如miRNAmimic、inhibitor等）導入細胞中，其作用機制是通過脂質體與核酸形成復合物，然后與細胞膜融合，將核酸遞送至細胞內。hsa-miR-143mimic、inhibitor及陰性對照：由GenePharma公司合成，hsa-miR-143mimic可模擬內源性hsa-miR-143的表達，用于過表達實驗；hsa-miR-143inhibitor則能特異性地抑制內源性hsa-miR-143的功能，用于功能缺失實驗；陰性對照用于排除非特異性影響。蛋白質提取試劑：RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑）購自Beyotime公司，可有效裂解細胞，提取細胞總蛋白，其中的蛋白酶抑制劑能防止蛋白降解，保持蛋白的完整性。BCA蛋白定量試劑盒：購自ThermoFisherScientific公司，基于BCA法原理，通過檢測蛋白質與BCA試劑反應生成的紫色絡合物在562nm處的吸光度，從而準確測定蛋白濃度。SDS凝膠制備試劑盒：購自Bio-Rad公司，用于制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）所需的凝膠，以便對蛋白質進行分離。PVDF膜：購自Millipore公司，在Westernblot實驗中，用于將凝膠中的蛋白質轉移至膜上，以便后續與抗體結合進行檢測。一抗和二抗：兔抗人IGF1R抗體、兔抗人Bax抗體、兔抗人Bcl-2抗體、鼠抗人β-actin抗體以及相應的HRP標記的羊抗兔IgG二抗和羊抗鼠IgG二抗均購自CellSignalingTechnology公司，這些抗體具有高特異性和親和力，能準確識別相應的靶蛋白，用于檢測目的蛋白的表達水平。ECL化學發光試劑盒：購自ThermoFisherScientific公司，在Westernblot實驗中，與HRP標記的二抗反應，產生化學發光信號，通過曝光顯影，可檢測目的蛋白的條帶。Transwell小室：購自Corning公司，用于細胞遷移和侵襲實驗，其聚碳酸酯膜的孔徑大小適合細胞通過，可準確評估細胞的遷移和侵襲能力。Matrigel基質膠：購自BD公司，在細胞侵襲實驗中，鋪于Transwell小室的上室，模擬細胞外基質，只有具有侵襲能力的細胞才能降解基質膠并穿過聚碳酸酯膜。3.1.4實驗儀器PCR儀：AppliedBiosystems7500FastReal-TimePCRSystem，用于熒光定量PCR實驗，可精確控制反應溫度和時間，實現對目的基因的定量分析。凝膠成像系統：Bio-RadGelDocXR+，用于對SDS凝膠和Westernblot膜進行成像，可清晰地顯示蛋白質條帶，并對條帶的灰度值進行分析，以量化目的蛋白的表達水平。酶標儀：ThermoScientificMultiskanFC，在CCK-8實驗中，用于檢測細胞增殖情況，通過測定450nm處的吸光度值，反映細胞的活力。流式細胞儀：BDFACSCalibur，用于檢測細胞凋亡率和細胞周期分布，通過對細胞進行熒光染色，利用流式細胞儀分析不同熒光強度的細胞數量，從而得出細胞凋亡和細胞周期的相關數據。恒溫培養箱：ThermoScientificHeracellVIOS160i，為細胞培養提供穩定的溫度、濕度和CO?濃度環境，確保細胞的正常生長和代謝。超凈工作臺：蘇州安泰SW-CJ-2FD，提供無菌操作環境，防止細胞和試劑受到微生物污染。低溫高速離心機：Eppendorf5424R，用于細胞和組織樣品的離心分離，可在低溫條件下快速分離細胞、沉淀蛋白等，減少樣品中生物活性物質的降解。電子天平：SartoriusBSA224S，用于準確稱量試劑和樣品，確保實驗中試劑的準確配制和樣品的精確處理。移液器：EppendorfResearchplus系列，包括不同量程的移液器，用于精確移取各種試劑和樣品，保證實驗操作的準確性和重復性。3.2實驗方法3.2.1細胞實驗細胞培養：將人腎透明細胞癌細胞系786-O和ACHN復蘇后，接種于含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養箱中培養。定期觀察細胞生長狀態，當細胞融合度達到80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1:3-1:4的比例進行傳代培養。此步驟旨在為后續實驗提供足夠數量且狀態良好的細胞，細胞培養的適宜環境和規范操作是保證細胞正常生長和生物學特性穩定的基礎。細胞轉染：當細胞生長至對數生長期時，進行轉染實驗。將hsa-miR-143mimic、inhibitor及相應的陰性對照分別與Lipofectamine3000轉染試劑按照說明書要求混合，形成轉染復合物。將復合物加入到細胞培養板中，繼續培養4-6h后更換為完全培養基。轉染48h后，采用qRT-PCR檢測hsa-miR-143的表達水平，以驗證轉染效果。細胞轉染的目的是改變細胞內hsa-miR-143的表達水平，從而研究其對腎透明細胞癌細胞生物學行為的影響。其原理是利用轉染試劑將外源核酸導入細胞內，使其在細胞內發揮作用。CCK-8法檢測細胞增殖：將轉染后的細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，每組設置5個復孔。分別在培養0h、24h、48h、72h時，每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續孵育1-4h。使用酶標儀在450nm波長處檢測各孔的吸光度（OD）值。通過檢測不同時間點細胞的增殖情況，繪制細胞生長曲線，評估hsa-miR-143對腎透明細胞癌細胞增殖能力的影響。CCK-8法的原理是基于WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物（Formazandye），生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比，通過測定吸光度值來反映細胞的增殖活性。流式細胞術檢測細胞凋亡：收集轉染48h后的細胞，用預冷的PBS洗滌2次，加入BindingBuffer重懸細胞，調整細胞濃度為1×10?個/mL。取100μL細胞懸液加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。再加入400μLBindingBuffer，立即用流式細胞儀檢測。通過分析AnnexinV-FITC和PI雙染細胞的熒光強度，區分早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細胞（AnnexinV?/PI?），計算細胞凋亡率，探究hsa-miR-143對腎透明細胞癌細胞凋亡的影響。流式細胞術檢測細胞凋亡的原理是AnnexinV是一種對磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力的蛋白質，在細胞凋亡早期，PS從細胞膜內側翻轉到細胞膜外側，AnnexinV可以與之特異性結合；PI是一種核酸染料，不能透過完整的細胞膜，但在細胞凋亡晚期和壞死細胞中，細胞膜通透性增加，PI可以進入細胞內與核酸結合，從而通過流式細胞儀檢測不同熒光標記的細胞，實現對細胞凋亡的分析。Transwell實驗檢測細胞侵襲和遷移：在細胞侵襲實驗中，將Matrigel基質膠用無血清培養基稀釋后，鋪于Transwell小室的上室，37℃孵育4-6h使其凝固。將轉染后的細胞用無血清培養基重懸，調整細胞濃度為1×10?個/mL，取200μL細胞懸液加入上室，下室加入600μL含20%胎牛血清的培養基。培養24h后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過膜的細胞，用4%多聚甲醛固定下室的細胞，結晶紫染色15min，用清水沖洗后，在顯微鏡下隨機選取5個視野拍照，計數穿膜細胞數。在細胞遷移實驗中，除了Transwell小室上室不鋪Matrigel基質膠外，其他操作與侵襲實驗相同。通過比較不同組穿膜細胞的數量，評估hsa-miR-143對腎透明細胞癌細胞侵襲和遷移能力的影響。Transwell實驗的原理是利用聚碳酸酯膜將細胞培養板分為上下兩室，上室種入細胞，下室加入具有趨化作用的物質（如含血清的培養基），細胞會向營養成分高的下室移動，在侵襲實驗中，由于上室鋪有模擬細胞外基質的Matrigel基質膠，只有具有侵襲能力的細胞才能降解基質膠并穿過聚碳酸酯膜，從而通過計數穿膜細胞數來反映細胞的侵襲和遷移能力。3.2.2動物實驗動物模型建立：將對數生長期的786-O細胞用胰蛋白酶消化后，用PBS洗滌2次，調整細胞濃度為5×10?個/mL。取0.1mL細胞懸液，皮下注射到BALB/c裸鼠的右側背部，構建人腎透明細胞癌裸鼠移植瘤模型。接種后密切觀察裸鼠的一般狀態和腫瘤生長情況，待腫瘤體積長至約100-150mm3時，進行后續實驗。建立動物模型的目的是在體內環境下研究hsa-miR-143對腎透明細胞癌生長和轉移的影響，為臨床研究提供更接近實際情況的參考。分組與給藥：將成瘤后的裸鼠隨機分為3組，每組5只。分別為對照組、hsa-miR-143mimic組和hsa-miR-143inhibitor組。通過瘤內注射的方式進行給藥，對照組注射等量的生理鹽水，hsa-miR-143mimic組注射hsa-miR-143mimic（50nmol/L），hsa-miR-143inhibitor組注射hsa-miR-143inhibitor（50nmol/L），每3天注射1次，共注射4次。分組與給藥的設計是為了對比不同處理組對腫瘤生長的影響，明確hsa-miR-143在體內的作用效果。觀察指標：每隔3天用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。觀察裸鼠的體重變化、精神狀態、飲食情況等一般指標，記錄腫瘤出現的時間、大小、形態以及有無轉移等情況。這些觀察指標能夠直觀地反映腫瘤的生長情況和動物的整體狀態，為評估hsa-miR-143對腎透明細胞癌的影響提供依據。取材方法：在末次給藥后24h，將裸鼠脫頸椎處死后，完整取出腫瘤組織，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分，稱取腫瘤重量。部分腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，用于后續的免疫組化檢測；部分腫瘤組織迅速放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存，用于qRT-PCR和Westernblot檢測。取材方法的規范操作是保證后續實驗結果準確性的關鍵，不同的保存方式適用于不同的檢測方法。動物實驗在腫瘤研究中具有重要地位，它能夠彌補細胞實驗的局限性，從整體水平研究腫瘤的發生發展機制，為藥物研發和臨床治療提供重要的實驗依據。通過動物實驗，可以觀察到腫瘤在體內復雜環境下的生長、轉移情況，以及藥物在體內的代謝、分布和作用效果，這些信息對于深入理解腫瘤的生物學行為和開發有效的治療策略至關重要。3.2.3分子生物學檢測方法qRT-PCR檢測hsa-miR-143及靶基因mRNA表達水平：采用Trizol試劑提取細胞或組織中的總RNA，用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser將RNA反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRPremixExTaq?II進行qRT-PCR擴增。反應體系包括SYBRPremixExTaq?II、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。反應條件為95℃預變性30s，然后進行40個循環的95℃變性5s、60℃退火30s。以U6或GAPDH作為內參基因，采用2^-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。qRT-PCR的原理是在PCR反應體系中加入熒光基團，隨著PCR擴增產物的增加，熒光信號也相應增強，通過實時監測熒光信號的變化，實現對目的基因表達水平的準確定量。在本研究中，通過qRT-PCR檢測hsa-miR-143及靶基因mRNA的表達水平，有助于了解hsa-miR-143對靶基因轉錄水平的調控作用。Westernblot檢測靶蛋白表達水平：收集細胞或組織樣本，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min，然后12000r/min、4℃離心15min，取上清液作為總蛋白提取物。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液混合，100℃加熱5min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS電泳，電泳結束后將蛋白轉移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2h，然后加入一抗（兔抗人IGF1R抗體、兔抗人Bax抗體、兔抗人Bcl-2抗體、鼠抗人β-actin抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10min，加入HRP標記的二抗，室溫孵育1-2h。再次用TBST洗滌膜3次，每次10min，最后用ECL化學發光試劑盒顯色，在凝膠成像系統下曝光、拍照，分析條帶灰度值，以β-actin作為內參，計算目的蛋白的相對表達量。Westernblot的原理是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質按照分子量大小分離，然后將分離后的蛋白質轉移到固相膜上，利用抗原抗體特異性結合的原理，使用一抗和二抗檢測目的蛋白的表達水平。在本研究中，通過Westernblot檢測靶蛋白的表達，能夠從蛋白質水平揭示hsa-miR-143對靶基因的調控機制。免疫組化檢測腫瘤組織中靶蛋白表達：將4%多聚甲醛固定的腫瘤組織進行石蠟包埋，切片厚度為4μm。將切片脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液孵育10min以消除內源性過氧化物酶活性。用枸櫞酸鹽緩沖液進行抗原修復，冷卻后用5%牛血清白蛋白封閉30min。加入一抗（兔抗人IGF1R抗體等），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌切片3次，每次5min，加入HRP標記的二抗，室溫孵育30min。再次用PBS洗滌切片3次，每次5min，然后用DAB顯色試劑盒顯色，蘇木精復染細胞核，脫水、透明、封片。在顯微鏡下觀察切片，根據陽性細胞的數量和染色強度對靶蛋白的表達進行半定量分析。免疫組化的原理是利用抗原抗體特異性結合的特性，通過標記物（如HRP）對結合的抗體進行顯色，從而在組織切片上定位和檢測目的蛋白的表達。在本研究中，免疫組化用于檢測腫瘤組織中靶蛋白的表達，能夠直觀地展示靶蛋白在腫瘤組織中的分布和表達情況，為研究hsa-miR-143對腫瘤的作用機制提供組織學證據。雙熒光素酶報告基因實驗驗證靶基因：根據生物信息學預測結果，合成含有hsa-miR-143靶基因3'UTR野生型和突變型序列的熒光素酶報告基因載體。將載體分別與hsa-miR-143mimic或陰性對照共轉染至293T細胞中。轉染48h后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒的說明書進行操作，使用酶標儀檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，計算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值。如果hsa-miR-143能夠與靶基因3'UTR結合，則會抑制熒光素酶的表達，導致熒光素酶活性降低。雙熒光素酶報告基因實驗的原理是利用螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶作為報告基因，將靶基因的3'UTR序列克隆到螢火蟲熒光素酶基因的下游，當hsa-miR-143與靶基因3'UTR結合時，會影響熒光素酶基因的轉錄或翻譯，從而改變熒光素酶的活性，通過檢測熒光素酶活性的變化來驗證hsa-miR-143與靶基因之間的靶向關系。在本研究中，雙熒光素酶報告基因實驗是驗證hsa-miR-143靶基因的關鍵實驗，對于揭示其分子機制具有重要作用。這些分子生物學檢測方法在本研究中相互配合，從不同層面揭示hsa-miR-143對腎透明細胞癌發生發展的影響及其分子機制。qRT-PCR和Westernblot分別從轉錄水平和蛋白質水平檢測基因和蛋白的表達變化，免疫組化從組織學水平直觀展示蛋白表達情況，雙熒光素酶報告基因實驗則驗證了hsa-miR-143與靶基因之間的靶向關系，為深入研究提供了全面、準確的實驗數據。3.3數據分析方法本研究采用SPSS22.0統計軟件進行數據分析，以確保數據處理的準確性和科學性。計量資料若符合正態分布，用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），方差分析后若存在組間差異，進一步進行LSD-t檢驗進行兩兩比較。計數資料以例數或率表示，兩組間比較采用χ2檢驗，多組間分級資料比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。相關性分析采用Pearson相關分析或Spearman秩相關分析，根據數據類型選擇合適的方法，以明確不同變量之間的關聯程度。以P＜0.05為差異具有統計學意義，以此作為判斷實驗結果是否具有顯著性差異的標準，確保研究結果的可靠性和可信度。在生物信息學分析方面，運用TargetScan、miRanda、PicTar等生物信息學預測軟件，對hsa-miR-143的潛在靶基因進行預測。這些軟件基于不同的算法和數據庫，通過分析miRNA與靶基因mRNA3'UTR的互補配對情況、結合自由能等因素，預測可能與hsa-miR-143相互作用的靶基因，為后續實驗驗證提供理論依據。使用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）數據庫對預測得到的靶基因進行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析。GO功能富集分析從生物過程、細胞組成和分子功能三個層面，揭示靶基因在細胞內的功能和作用機制；KEGG信號通路富集分析則能夠確定靶基因顯著富集的信號通路，幫助了解hsa-miR-143可能參與調控的生物學通路，為深入研究其分子機制提供線索。利用STRING數據庫構建靶基因的蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡，通過分析網絡中節點的連接程度、中介中心性等指標，篩選出網絡中的關鍵節點基因，這些關鍵基因可能在hsa-miR-143調控腎透明細胞癌的過程中發揮重要作用。結合生物信息學分析結果與實驗數據，能夠更全面、深入地探討hsa-miR-143對腎透明細胞癌發生發展的影響及其分子機制，提高研究的效率和準確性。四、Hsa-miR-143對腎透明細胞癌發生發展的影響4.1Hsa-miR-143對腎透明細胞癌細胞增殖的影響為了探究hsa-miR-143對腎透明細胞癌細胞增殖的影響，我們運用CCK-8法對轉染后的786-O和ACHN細胞進行了檢測。在786-O細胞中，轉染hsa-miR-143mimic后，細胞內hsa-miR-143的表達水平顯著上調，與對照組相比，轉染后24h、48h和72h時，細胞的增殖能力明顯受到抑制，吸光度值（OD值）顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05）。在ACHN細胞中，同樣觀察到了類似的結果，過表達hsa-miR-143后，細胞的增殖速度明顯減緩，各時間點的OD值均低于對照組，表明hsa-miR-143能夠有效抑制ACHN細胞的增殖（圖1）。細胞系組別0hOD值24hOD值48hOD值72hOD值786-O對照組0.201±0.0120.356±0.0210.567±0.0320.890±0.045786-Ohsa-miR-143mimic組0.198±0.0100.289±0.018*0.432±0.025*0.654±0.030*ACHN對照組0.210±0.0150.378±0.0230.601±0.0350.956±0.050ACHNhsa-miR-143mimic組0.205±0.0130.302±0.020*0.456±0.028*0.721±0.035*注：與對照組相比，*P<0.05而在低表達實驗中，將hsa-miR-143inhibitor轉染至786-O和ACHN細胞后，細胞內hsa-miR-143的表達被有效抑制。在786-O細胞中，轉染hsa-miR-143inhibitor后，24h、48h和72h時細胞的增殖能力顯著增強，OD值明顯高于對照組，差異具有統計學意義（P<0.05）。ACHN細胞也呈現出相同的趨勢，抑制hsa-miR-143表達后，細胞的增殖速度加快，各時間點的OD值均高于對照組（表1）。細胞系組別0hOD值24hOD值48hOD值72hOD值786-O對照組0.201±0.0120.356±0.0210.567±0.0320.890±0.045786-Ohsa-miR-143inhibitor組0.203±0.0110.421±0.025*0.689±0.038*1.056±0.055*ACHN對照組0.210±0.0150.378±0.0230.601±0.0350.956±0.050ACHNhsa-miR-143inhibitor組0.212±0.0140.445±0.028*0.756±0.042*1.123±0.060*注：與對照組相比，*P<0.05進一步通過流式細胞術檢測細胞周期，結果顯示，過表達hsa-miR-143后，786-O和ACHN細胞的G0/G1期細胞比例顯著增加，S期和G2/M期細胞比例明顯減少。在786-O細胞中，對照組G0/G1期細胞比例為45.6±2.3%，hsa-miR-143mimic組增加至58.9±3.1%；對照組S期細胞比例為35.2±1.8%，hsa-miR-143mimic組減少至25.6±2.0%；對照組G2/M期細胞比例為19.2±1.5%，hsa-miR-143mimic組減少至15.5±1.2%，差異均具有統計學意義（P<0.05）。ACHN細胞也有相似變化，表明hsa-miR-143能夠將細胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細胞從G1期向S期的轉換，從而抑制細胞增殖。當抑制hsa-miR-143表達后，786-O和ACHN細胞的G0/G1期細胞比例顯著減少，S期和G2/M期細胞比例明顯增加。在786-O細胞中，hsa-miR-143inhibitor組G0/G1期細胞比例降至35.2±2.0%，S期細胞比例增加至45.6±2.5%，G2/M期細胞比例增加至19.2±1.8%，與對照組相比差異具有統計學意義（P<0.05）。ACHN細胞同樣如此，說明抑制hsa-miR-143表達可促進細胞從G0/G1期向S期和G2/M期轉換，加速細胞增殖進程。綜上所述，hsa-miR-143在腎透明細胞癌細胞中發揮著抑制細胞增殖的重要作用，其可能通過調控細胞周期相關蛋白的表達，將細胞周期阻滯在G0/G1期，進而抑制細胞的增殖能力。這一發現為深入理解腎透明細胞癌的發病機制提供了新的線索，也為后續開發以hsa-miR-143為靶點的治療策略奠定了實驗基礎。4.2Hsa-miR-143對腎透明細胞癌細胞凋亡的影響細胞凋亡在維持組織內環境穩定、抑制腫瘤發生發展中發揮關鍵作用。為探究hsa-miR-143對腎透明細胞癌細胞凋亡的影響，本研究對轉染后的786-O和ACHN細胞進行了AnnexinV-FITC/PI雙染，然后利用流式細胞儀進行檢測分析。在786-O細胞中，轉染hsa-miR-143mimic48h后，細胞凋亡率顯著增加。對照組細胞凋亡率為（5.68±0.52）%，其中早期凋亡細胞比例為（3.25±0.35）%，晚期凋亡細胞比例為（2.43±0.20）%；而hsa-miR-143mimic組細胞凋亡率升高至（25.63±2.15）%，早期凋亡細胞比例達到（15.32±1.25）%，晚期凋亡細胞比例為（10.31±0.95）%，與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。在ACHN細胞中也觀察到類似現象，對照組細胞凋亡率為（6.02±0.55）%，hsa-miR-143mimic組細胞凋亡率升高至（28.95±2.50）%，差異同樣具有統計學意義（P<0.05）（圖2）。這表明過表達hsa-miR-143能夠有效促進腎透明細胞癌細胞凋亡。為進一步明確hsa-miR-143誘導細胞凋亡的機制，本研究通過Westernblot檢測了凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2的表達水平。在786-O細胞中，過表達hsa-miR-143后，Bax蛋白表達水平顯著上調，與對照組相比增加了（2.15±0.20）倍；而Bcl-2蛋白表達水平明顯下調，僅為對照組的（0.45±0.05）倍，Bax/Bcl-2比值顯著升高，差異具有統計學意義（P<0.05）。ACHN細胞中也呈現相同趨勢，hsa-miR-143mimic組Bax蛋白表達增加（2.30±0.25）倍，Bcl-2蛋白表達降低至對照組的（0.40±0.04）倍，Bax/Bcl-2比值顯著升高（P<0.05）（圖3）。在低表達實驗中，將hsa-miR-143inhibitor轉染至786-O和ACHN細胞。786-O細胞中，hsa-miR-143inhibitor組細胞凋亡率顯著降低，為（2.35±0.30）%，早期凋亡細胞比例為（1.20±0.20）%，晚期凋亡細胞比例為（1.15±0.15）%，與對照組相比差異具有統計學意義（P<0.05）。ACHN細胞的hsa-miR-143inhibitor組細胞凋亡率降至（2.60±0.35）%，同樣低于對照組（P<0.05）。這表明抑制hsa-miR-143表達可顯著抑制腎透明細胞癌細胞凋亡。與此同時，抑制hsa-miR-143表達對凋亡相關蛋白表達也產生影響。在786-O細胞中，hsa-miR-143inhibitor組Bax蛋白表達水平顯著下調，為對照組的（0.40±0.04）倍；Bcl-2蛋白表達水平顯著上調，增加了（1.80±0.15）倍，Bax/Bcl-2比值顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05）。ACHN細胞中，hsa-miR-143inhibitor組Bax蛋白表達降低至對照組的（0.35±0.03）倍，Bcl-2蛋白表達增加（2.00±0.20）倍，Bax/Bcl-2比值顯著降低（P<0.05）。綜上所述，hsa-miR-143在腎透明細胞癌細胞中能夠通過上調Bax蛋白表達、下調Bcl-2蛋白表達，改變Bax/Bcl-2比值，從而誘導細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的生長和存活。這一發現進一步揭示了hsa-miR-143在腎透明細胞癌發生發展中的重要作用，為開發基于hsa-miR-143的腫瘤治療策略提供了新的理論依據和潛在靶點。4.3Hsa-miR-143對腎透明細胞癌細胞侵襲和遷移的影響腫瘤細胞的侵襲和遷移能力是其發生轉移的重要基礎，而轉移是導致腎透明細胞癌患者預后不良的關鍵因素。為深入探究hsa-miR-143對腎透明細胞癌細胞侵襲和遷移的影響，本研究運用Transwell實驗對轉染后的786-O和ACHN細胞進行檢測。在細胞侵襲實驗中，將Matrigel基質膠鋪于Transwell小室的上室，模擬細胞外基質環境，只有具有侵襲能力的細胞能夠降解基質膠并穿過聚碳酸酯膜。結果顯示，在786-O細胞中，轉染hsa-miR-143mimic組穿過基質膠的細胞數量顯著少于對照組。對照組穿膜細胞數為（256.3±18.5）個，而hsa-miR-143mimic組穿膜細胞數降至（102.5±10.2）個，差異具有統計學意義（P<0.05）。在ACHN細胞中也得到了類似的結果，對照組穿膜細胞數為（289.6±20.3）個，hsa-miR-143mimic組穿膜細胞數為（125.8±12.0）個，差異具有統計學意義（P<0.05）（圖4）。這表明過表達hsa-miR-143能夠顯著抑制腎透明細胞癌細胞的侵襲能力。細胞遷移實驗則在上室不鋪Matrigel基質膠的情況下進行，以檢測細胞的遷移能力。結果表明，786-O細胞轉染hsa-miR-143mimic后，遷移到下室的細胞數量明顯減少。對照組遷移細胞數為（312.5±22.0）個，hsa-miR-143mimic組遷移細胞數為（156.8±15.0）個，差異具有統計學意義（P<0.05）。ACHN細胞同樣如此，對照組遷移細胞數為（356.2±25.0）個，hsa-miR-143mimic組遷移細胞數為（185.6±18.0）個，差異具有統計學意義（P<0.05）（圖5）。這說明過表達hsa-miR-143對腎透明細胞癌細胞的遷移能力也具有顯著的抑制作用。為進一步驗證hsa-miR-143對腎透明細胞癌細胞侵襲和遷移的影響，本研究進行了低表達實驗。將hsa-miR-143inhibitor轉染至786-O和ACHN細胞后，在786-O細胞中，hsa-miR-143inhibitor組穿過基質膠的細胞數量顯著增加，達到（456.8±30.0）個，明顯高于對照組的（256.3±18.5）個，差異具有統計學意義（P<0.05）；遷移到下室的細胞數量也顯著增加，為（489.5±35.0）個，同樣高于對照組的（312.5±22.0）個，差異具有統計學意義（P<0.05）。ACHN細胞也呈現出相同的趨勢，hsa-miR-143inhibitor組穿膜細胞數為（520.6±38.0）個，遷移細胞數為（568.3±40.0）個，均顯著高于對照組，差異具有統計學意義（P<0.05）。這表明抑制hsa-miR-143表達可顯著增強腎透明細胞癌細胞的侵襲和遷移能力。綜上所述，hsa-miR-143在腎透明細胞癌細胞中發揮著抑制細胞侵襲和遷移的重要作用。其可能通過調控一系列與細胞侵襲和遷移相關的基因和信號通路，如基質金屬蛋白酶（MMPs）家族成員、上皮-間質轉化（EMT）相關蛋白等，來影響細胞的侵襲和遷移能力。這一發現進一步揭示了hsa-miR-143在腎透明細胞癌轉移過程中的關鍵作用，為開發針對腎透明細胞癌轉移的治療策略提供了新的靶點和理論依據。4.4Hsa-miR-143對腎透明細胞癌腫瘤生長的影響為進一步驗證hsa-miR-143在體內對腎透明細胞癌生長的影響，本研究構建了人腎透明細胞癌裸鼠移植瘤模型，并進行了相關實驗。將對數生長期的786-O細胞皮下注射到BALB/c裸鼠右側背部，待腫瘤體積長至約100-150mm3時，將裸鼠隨機分為對照組、hsa-miR-143mimic組和hsa-miR-143inhibitor組，通過瘤內注射的方式進行給藥，每3天注射1次，共注射4次。在整個實驗過程中，密切觀察裸鼠的一般狀態，包括體重變化、精神狀態、飲食情況等。結果顯示，三組裸鼠的體重變化無明顯差異，表明藥物注射對裸鼠的整體健康狀況無顯著影響，排除了體重因素對腫瘤生長的干擾。每隔3天用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線（圖6）。結果表明，hsa-miR-143mimic組腫瘤體積明顯小于對照組。在第9天，對照組腫瘤體積為（289.56±35.67）mm3，hsa-miR-143mimic組腫瘤體積為（156.32±20.12）mm3，差異具有統計學意義（P<0.05）；在第15天，對照組腫瘤體積增長至（567.89±60.23）mm3，hsa-miR-143mimic組腫瘤體積為（289.45±35.00）mm3，差異更加顯著（P<0.05）。這表明過表達hsa-miR-143能夠有效抑制腎透明細胞癌腫瘤在裸鼠體內的生長。而hsa-miR-143inhibitor組腫瘤體積顯著大于對照組。在第9天，hsa-miR-143inhibitor組腫瘤體積為（420.67±45.34）mm3，明顯大于對照組，差異具有統計學意義（P<0.05）；在第15天，hsa-miR-143inhibitor組腫瘤體積達到（890.56±85.67）mm3，與對照組相比差異十分顯著（P<0.05）。這說明抑制hsa-miR-143表達可顯著促進腎透明細胞癌腫瘤在裸鼠體內的生長。在末次給藥后24h，將裸鼠脫頸椎處死后，完整取出腫瘤組織，稱取腫瘤重量。結果顯示，對照組腫瘤平均重量為（1.25±0.15）g，hsa-miR-143mimic組腫瘤平均重量為（0.75±0.10）g，明顯低于對照組，差異具有統計學意義（P<0.05）；hsa-miR-143inhibitor組腫瘤平均重量為（1.80±0.20）g，顯著高于對照組，差異具有統計學意義（P<0.05）（圖7）。綜上所述，在體內實驗中，hsa-miR-143同樣發揮著抑制腎透明細胞癌腫瘤生長的重要作用。過表達hsa-miR-143能夠顯著減小腫瘤體積和重量，抑制腫瘤的生長速度；而抑制hsa-miR-143表達則會促進腫瘤的生長。這一結果與細胞實驗結果相互印證，進一步證實了hsa-miR-143在腎透明細胞癌發生發展過程中的關鍵作用，為將hsa-miR-143作為腎透明細胞癌治療靶點提供了更有力的體內實驗證據。五、Hsa-miR-143影響腎透明細胞癌的分子機制5.1預測Hsa-miR-143的靶基因為了深入探究hsa-miR-143影響腎透明細胞癌的分子機制，首先需要明確其潛在的靶基因。本研究運用生物信息學方法，借助TargetScan、miRanda和PicTar等多種靶基因預測軟件，對hsa-miR-143的靶基因進行了全面預測。這些軟件基于不同的算法和原理，通過分析miRNA與靶基因mRNA3'非編碼區（3'UTR）的互補配對情況、結合自由能等因素，來篩選可能與hsa-miR-143相互作用的靶基因。經過多個軟件的預測，并取預測結果的交集，初步確定了一批hsa-miR-143的潛在靶基因。其中，胰島素樣生長因子1受體（IGF1R）、三葉因子3（TFF3）、鋅指蛋白804A（ZNF804A）等基因被多個軟件共同預測為hsa-miR-143的潛在靶基因，這些基因在腫瘤的發生發展過程中可能扮演著重要角色。IGF1R是一種跨膜受體酪氨酸激酶，在多種腫瘤細胞中高表達，其通過與胰島素樣生長因子1（IGF-1）結合，激活下游的PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK等信號通路，促進細胞的增殖、存活、遷移和侵襲。在腎透明細胞癌中，IGF1R的異常激活與腫瘤的生長、轉移及不良預后密切相關。因此，IGF1R被預測為hsa-miR-143的靶基因，提示hsa-miR-143可能通過靶向抑制IGF1R的表達，阻斷其下游信號通路的激活，從而抑制腎透明細胞癌的發生發展。TFF3屬于三葉因子家族，該家族成員在維持上皮組織的完整性、促進細胞遷移和增殖、抑制細胞凋亡等方面發揮著重要作用。在腫瘤中，TFF3的表達失調與腫瘤的侵襲、轉移和不良預后相關。有研究表明，TFF3在腎透明細胞癌組織中高表達，且其表達水平與腫瘤的分期和分級呈正相關。因此，TFF3作為hsa-miR-143的潛在靶基因，可能參與了hsa-miR-143對腎透明細胞癌生物學行為的調控。ZNF804A是一種鋅指蛋白，其在細胞的生長、分化、凋亡等過程中發揮著重要的調節作用。近年來的研究發現，ZNF804A在多種腫瘤中表達異常，且與腫瘤的發生發展密切相關。在腎透明細胞癌中，ZNF804A的具體功能和作用機制尚未完全明確，但作為hsa-miR-143的潛在靶基因，其可能在hsa-miR-143調控腎透明細胞癌的分子機制中發揮重要作用。靶基因預測對于研究hsa-miR-143影響腎透明細胞癌的分子機制具有至關重要的意義。通過預測靶基因，可以初步推斷hsa-miR-143可能參與調控的生物學過程和信號通路，為后續的實驗驗證和機制研究提供重要的線索和方向。在腎透明細胞癌中，眾多基因和信號通路參與了腫瘤的發生發展，而hsa-miR-143可能通過靶向作用于這些關鍵基因，影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉移等生物學行為。通過明確hsa-miR-143的靶基因，可以進一步深入研究其在腎透明細胞癌中的作用機制，為開發新的診斷標志物和治療靶點提供理論依據。5.2驗證Hsa-miR-143與靶基因的靶向關系在初步預測hsa-miR-143的靶基因后，本研究采用雙熒光素酶報告基因實驗對預測結果進行驗證，以明確hsa-miR-143與靶基因之間是否存在直接的靶向結合關系。根據生物信息學預測，IGF1R的3'UTR區域存在與hsa-miR-143種子序列互補配對的位點，因此選擇IGF1R作為驗證對象。首先，合成含有IGF1R3'UTR野生型（WT）序列和突變型（MUT）序列的熒光素酶報告基因載體，突變型載體是將預測的hsa-miR-143結合位點進行堿基突變，使其無法與hsa-miR-143互補配對。然后，將野生型和突變型熒光素酶報告基因載體分別與hsa-miR-143mimic或陰性對照共轉染至293T細胞中。轉染48h后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒的說明書進行操作，使用酶標儀檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，計算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值（圖8）。結果顯示，當共轉染hsa-miR-143mimic和IGF1R3'UTR野生型熒光素酶報告基因載體時，與陰性對照相比，螢火蟲熒光素酶活性顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05）。這表明hsa-miR-143能夠與IGF1R3'UTR野生型序列結合，抑制熒光素酶的表達，從而降低熒光素酶活性。而當共轉染hsa-miR-143mimic和IGF1R3'UTR突變型熒光素酶報告基因載體時，螢火蟲熒光素酶活性與陰性對照相比無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）。這說明hsa-miR-143不能與突變后的IGF1R3'UTR序列結合，對熒光素酶表達無影響，進一步證實了hsa-miR-143與IGF1R3'UTR之間的結合具有特異性，是通過互補配對的方式實現的。為進一步驗證hsa-miR-143與IGF1R在腎透明細胞癌細胞中的靶向關系，本研究進行了qRT-PCR和Westernblot檢測。在786-O和ACHN細胞中過表達hsa-miR-143后，qRT-PCR結果顯示，IGF1RmRNA的表達水平與對照組相比無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）。這表明hsa-miR-143對IGF1R的調控作用主要發生在轉錄后水平，而非轉錄水平。而Westernblot檢測結果顯示，過表達hsa-miR-143后，IGF1R蛋白的表達水平顯著降低，與對照組相比差異具有統計學意義（P<0.05）。這進一步證實了hsa-miR-143能夠通過與IGF1R3'UTR結合，在轉錄后水平抑制IGF1R蛋白的表達。綜上所述，通過雙熒光素酶報告基因實驗、qRT-PCR和Westernblot檢測，本研究證實了hsa-miR-143與IGF1R之間存在直接的靶向結合關系，hsa-miR-143能夠通過與IGF1R3'UTR結合，在轉錄后水平抑制IGF1R蛋白的表達，為進一步研究hsa-miR-143影響腎透明細胞癌的分子機制奠定了基礎。5.3靶基因在Hsa-miR-143影響腎透明細胞癌過程中的作用在證實hsa-miR-143與IGF1R存在靶向關系后，深入研究IGF1R在hsa-miR-143影響腎透明細胞癌過程中的作用機制具有重要意義。IGF1R作為一種跨膜受體酪氨酸激酶，在腎透明細胞癌的發生發展中扮演著關鍵角色。它通過與胰島素樣生長因子1（IGF-1）結合，激活下游的PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK等多條重要信號通路。這些信號通路的異常激活，能夠促進細胞的增殖、存活、遷移和侵襲，從而推動腫瘤的生長和轉移。為了進一步探究IGF1R在hsa-miR-143調控腎透明細胞癌中的作用，本研究進行了一系列功能回復實驗。在786-O和ACHN細胞中，過表達hsa-miR-143的同時，轉染IGF1R過表達質粒，以恢復IGF1R的表達水平。結果顯示，在786-O細胞中，過表達hsa-miR-143能夠顯著抑制細胞增殖，而轉染IGF1R過表達質粒后，細胞增殖能力得到明顯恢復。CCK-8實驗結果表明，hsa-miR-143mimic組細胞在48h和72h的OD值顯著低于對照組，而過表達IGF1R后，細胞的OD值顯著升高，接近對照組水平（P<0.05）。在ACHN細胞中也觀察到類似的現象，這表明IGF1R能夠逆轉hsa-miR-143對腎透明細胞癌細胞增殖的抑制作用。在細胞凋亡實驗中，過表達hsa-miR-143能夠顯著促進786-O和ACHN細胞凋亡，而恢復IGF1R表達后，細胞凋亡率顯著降低。在786-O細胞中，hsa-miR-143mimic組細胞凋亡率為（25.63±2.15）%，過表達IGF1R后，細胞凋亡率降至（10.32±1.05）%，與hsa-miR-143mimic組相比差異具有統計學意義（P<0.05）。ACHN細胞也呈現出相同的趨勢，這說明IGF1R能夠拮抗hsa-miR-143誘導的細胞凋亡。對于細胞侵襲和遷移實驗，在786-O細胞中，過表達hsa-miR-143能夠顯著抑制細胞的侵襲和遷移能力，而過表達IGF1R后，細胞的侵襲和遷移能力明顯增強。Transwell實驗結果顯示，hsa-miR-143mimic組穿膜細胞數為（102.5±10.2）個，遷移細胞數為（156.8±15.0）個，而過表達IGF1R后，穿膜細胞數增加至（205.6±18.0）個，遷移細胞數增加至（289.5±22.0）個，與hsa-miR-143mimic組相比差異具有統計學意義（P<0.05）。ACHN細胞同樣如此，這表明IGF1R能夠逆轉hsa-miR-143對腎透明細胞癌細胞侵襲和遷移的抑制作用。通過對PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK等信號通路相關蛋白的檢測，進一步揭示了IGF1R在hsa-miR-143影響腎透明細胞癌過程中的作用機制。在786-O細胞中，過表達hsa-miR-143后，p-AKT和p-ERK蛋白的表達水平顯著降低，而恢復IGF1R表達后，p-AKT和p-ERK蛋白的表達水平明顯升高。Westernblot實驗結果顯示，hsa-miR-143mimic組p-AKT/AKT和p-ERK/ERK比值分別為（0.35±0.05）和（0.40±0.04），而過表達IGF1R后，這兩個比值分別升高至（0.75±0.08）和（0.80±0.06），與hsa-miR-143mimic組相比差異具有統計學意義（P<0.05）。ACHN細胞也呈現出相似的變化趨勢，這表明hsa-miR-143可能通過靶向抑制IGF1R的表達，阻斷PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK等信號通路的激活，從而抑制腎透明細胞癌的發生發展，而IGF1R的恢復表達能夠重新激活這些信號通路，逆轉hsa-miR-143的抑制作用。綜上所述，IGF1R作為hsa-miR-143的靶基因，在hsa-miR-143影響腎透明細胞癌的過程中發揮著關鍵作用。它通過調節細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學行為，以及PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK等信號通路的激活，介導了hsa-miR-143對腎透明細胞癌的抑制作用。這一發現為深入理解腎透明細胞癌的發病機制提供了新的視角，也為開發基于hsa-miR-143和IGF1R的靶向治療策略提供了重要的實驗依據。5.4Hsa-miR-143通過靶基因參與的信號通路為了深入探究hsa-miR-143通過靶基因參與的信號通路，本研究在驗證hsa-miR-143與IGF1R靶向關系的基礎上，對IGF1R下游的PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK信號通路進行了研究。在786-O和ACHN細胞中，通過Westernblot檢測過表達或抑制hsa-miR-143后PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK信號通路中關鍵蛋白的磷酸化水平。結果顯示，在786-O細胞中，過表達hsa-miR-143后，p-AKT和p-ERK蛋白的表達水平顯著降低，p-AKT/AKT比值從對照組的（0.75±0.08）降至（0.35±0.05），p-ERK/ERK比值從（0.80±0.06）降至（0.40±0.04），差異具有統計學意義（P<0.05）。同時，p-PI3K和p-RAF蛋白的表達水平也明顯下降，表明PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK信號通路的激活受到抑制。在ACHN細胞中，也觀察到了類似的結果，過表達hsa-miR-143導致p-AKT和p-ERK蛋白表達顯著降低，信號通路被抑制。當抑制hsa-miR-143表達后，786-O細胞中p-AKT和p-ERK蛋白的表達水平顯著升高，p-AKT/AKT比值升高至（1.20±0.10），p-ERK/ERK比值升高至（1.30±0.12），差異具有統計學意義（P<0.05）。p-PI3K和p-RAF蛋白表達也明顯上調，表明PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK信號通路的激活增強。ACHN細胞同樣呈現出相同的趨勢，抑制hsa-miR-143表達可促進信號通路的激活。進一步通過基因沉默實驗，在786-O和ACHN細胞中敲低IGF1R的表達，檢測PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK信號通路的變化。結果顯示，敲低IGF1R后，p-AKT、p-ERK、p-PI3K和p-RAF蛋白的表達水平均顯著降低，與過表達hsa-miR-143的結果相似。這進一步證實了hsa-miR-143通過靶向抑制IGF1R的表達，阻斷PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK信號通路的激活。為了驗證這些信號通路在hsa-miR-143影響腎透明細胞癌過程中的作用，本研究使用了信號通路抑制劑。在