第三章高效液相色譜分析高效液相色譜法(HPLC)是一種強(qiáng)大的分析技術(shù)，用于分離、鑒定和量化樣品中的不同成分。它在醫(yī)藥、環(huán)境、食品和化工等多個(gè)領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。JS作者：高效液相色譜分析概述高效液相色譜高效液相色譜是一種分離和分析物質(zhì)的技術(shù)，它利用不同物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中分配系數(shù)的差異來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。應(yīng)用廣泛它被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、環(huán)境、化工等領(lǐng)域，用于分析樣品的成分、含量、純度等信息。分析技術(shù)該技術(shù)具有高靈敏度、高分離度、高效率等優(yōu)點(diǎn)，能夠快速、準(zhǔn)確地分析各種樣品。高效液相色譜儀的組成高效液相色譜儀是進(jìn)行高效液相色譜分析的重要儀器。它通常由六個(gè)主要部分組成，包括流動(dòng)相輸送系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜柱、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和溫度控制系統(tǒng)。流動(dòng)相輸送系統(tǒng)主要負(fù)責(zé)提供流動(dòng)相，進(jìn)樣系統(tǒng)負(fù)責(zé)將樣品引入色譜柱，色譜柱是分離樣品中不同組分的核心部件，檢測(cè)器負(fù)責(zé)檢測(cè)流出液中各組分的濃度變化，數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)負(fù)責(zé)采集和分析檢測(cè)信號(hào)，溫度控制系統(tǒng)則用于控制色譜柱和流動(dòng)相的溫度。流動(dòng)相定義流動(dòng)相是液相色譜中將樣品帶入色譜柱的液體。流動(dòng)相的選擇對(duì)分離效果至關(guān)重要。性質(zhì)流動(dòng)相的性質(zhì)影響樣品的溶解度、保留時(shí)間和分離度。流動(dòng)相必須與樣品和色譜柱兼容。類(lèi)型流動(dòng)相的類(lèi)型包括水、甲醇、乙腈、二氯甲烷等。不同的流動(dòng)相適合分離不同的樣品。混合為了優(yōu)化分離效果，可以將兩種或多種流動(dòng)相混合使用，形成混合流動(dòng)相。流動(dòng)相的選擇11.溶劑強(qiáng)度溶劑強(qiáng)度決定著分析物的保留時(shí)間和分離效果。選擇合適的溶劑強(qiáng)度可以有效地提高分離效果，縮短分析時(shí)間。22.溶劑極性溶劑極性是影響分離的關(guān)鍵因素，根據(jù)分析物的極性選擇合適的溶劑極性，才能獲得理想的分離效果。33.溶解度選擇能夠充分溶解分析物的溶劑，確保分析物能夠完全溶解并進(jìn)入色譜柱。44.粘度低粘度的流動(dòng)相可以提高分離效率，減少峰展寬，縮短分析時(shí)間。柱溫控制1溫度梯度控制提高分離效率2恒溫控制保持穩(wěn)定性3溫度傳感器精準(zhǔn)測(cè)溫柱溫控制是高效液相色譜分析的重要環(huán)節(jié)，它直接影響著分離效果和分析結(jié)果。通過(guò)控制柱溫，可以調(diào)節(jié)樣品在色譜柱中的擴(kuò)散速率和分配系數(shù)，從而優(yōu)化分離效果。此外，柱溫控制還能有效避免流動(dòng)相和樣品在色譜柱中發(fā)生降解或揮發(fā)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。進(jìn)樣系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣器用于將樣品精確地注入色譜系統(tǒng)，提高分析效率和準(zhǔn)確性。手動(dòng)進(jìn)樣閥手動(dòng)進(jìn)樣閥適用于樣品體積較小或需要特殊操作的進(jìn)樣方式。定量環(huán)定量環(huán)用于精確控制進(jìn)樣體積，確保樣品注入量的一致性。檢測(cè)器檢測(cè)器是高效液相色譜儀的關(guān)鍵部件，負(fù)責(zé)檢測(cè)流動(dòng)相中組分的濃度變化。不同的檢測(cè)器對(duì)不同的物質(zhì)有不同的靈敏度，例如紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器對(duì)紫外可見(jiàn)光吸收的物質(zhì)比較靈敏，而熒光檢測(cè)器對(duì)熒光物質(zhì)比較靈敏。檢測(cè)器可以分為多種類(lèi)型，常見(jiàn)的檢測(cè)器有紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器等。色譜柱色譜柱是高效液相色譜儀的核心部件，是樣品分離的關(guān)鍵。它通常由一根填充有固定相的管柱組成。固定相可以是固體或液體，固定在惰性載體上。根據(jù)固定相的性質(zhì)，色譜柱可以分為正相色譜柱、反相色譜柱、離子交換色譜柱、親和色譜柱等。色譜柱的選擇固定相固定相類(lèi)型和性質(zhì)是決定分離效果的關(guān)鍵因素。根據(jù)分析物的性質(zhì)和分離需求，選擇合適的固定相是至關(guān)重要的。柱尺寸柱長(zhǎng)、內(nèi)徑和填充床高度等參數(shù)會(huì)影響分離效率和分析時(shí)間。選擇合適的柱尺寸可優(yōu)化分離效果，提高分析效率。粒徑固定相顆粒的粒徑會(huì)影響流動(dòng)相阻力、分離效率和分析時(shí)間。選擇合適的粒徑可平衡分離效率和分析時(shí)間。溫度柱溫會(huì)影響流動(dòng)相黏度、分離效率和峰形。選擇合適的柱溫可優(yōu)化分離效果，提高分析精度。色譜柱的保護(hù)11.預(yù)處理使用前，用流動(dòng)相沖洗色譜柱，確保色譜柱處于最佳狀態(tài)。使用適當(dāng)?shù)娜軇┻M(jìn)行預(yù)處理，以去除殘留物質(zhì)。22.過(guò)濾流動(dòng)相使用0.45μm濾膜過(guò)濾流動(dòng)相，以防止顆粒物進(jìn)入色譜柱，防止堵塞。過(guò)濾能夠確保流動(dòng)相的清潔度。33.正確進(jìn)樣避免注入強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或有機(jī)溶劑，這些物質(zhì)會(huì)損壞色譜柱。使用合適的樣品前處理方法，確保樣品中沒(méi)有沉淀或雜質(zhì)。44.定期維護(hù)定期沖洗色譜柱，清除柱內(nèi)積聚的物質(zhì)。根據(jù)使用頻率和樣品性質(zhì)，選擇合適的清洗方法和頻率。分離模式等度洗脫等度洗脫是指在整個(gè)分離過(guò)程中使用固定濃度的流動(dòng)相。這種方法簡(jiǎn)單易行，適用于分離性質(zhì)相似的化合物。梯度洗脫梯度洗脫是指在分離過(guò)程中，改變流動(dòng)相的組成，例如改變?nèi)軇?qiáng)度或pH值。梯度洗脫可以提高分離效率，適用于分離性質(zhì)差異較大的化合物。等度洗脫1流動(dòng)相組成不變整個(gè)洗脫過(guò)程中2固定濃度和比例3簡(jiǎn)單易操作適用于分離4相似性質(zhì)物質(zhì)等度洗脫是指在整個(gè)洗脫過(guò)程中，流動(dòng)相的組成和比例保持不變，即流動(dòng)相的濃度和組成固定。這種方法簡(jiǎn)單易操作，適合分離性質(zhì)相似的物質(zhì)，但對(duì)于復(fù)雜樣品的分離效果可能有限。梯度洗脫概念梯度洗脫是指在色譜分析過(guò)程中，改變流動(dòng)相的組成，逐漸增加強(qiáng)洗脫劑的比例，以提高分離效率，適用于分離復(fù)雜樣品。原理隨著強(qiáng)洗脫劑比例增加，流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，從而使不同組分在色譜柱上的保留時(shí)間縮短，達(dá)到分離目的。優(yōu)勢(shì)梯度洗脫能夠有效地分離極性差異較大的組分，提高分析效率和分離度，適用于復(fù)雜樣品的分離和分析。類(lèi)型常見(jiàn)梯度洗脫方式包括線(xiàn)性梯度、步進(jìn)梯度和凹形梯度，選擇合適的梯度方式取決于樣品性質(zhì)和分離需求。色譜分離機(jī)理吸附作用固定相表面具有活性中心，可以與被分離物質(zhì)的分子發(fā)生吸附作用。不同的物質(zhì)由于極性不同，對(duì)固定相的吸附力不同，因此分離。分配作用被分離物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行分配，分配系數(shù)不同的物質(zhì)在兩相中的濃度不同，從而實(shí)現(xiàn)分離。尺寸排阻作用固定相中存在一定大小的孔徑，不同大小的分子在通過(guò)固定相時(shí)受到阻滯的程度不同，從而實(shí)現(xiàn)分離。離子交換作用固定相表面帶有可交換的離子，與流動(dòng)相中帶相反電荷的離子發(fā)生交換，從而實(shí)現(xiàn)分離。保留時(shí)間和保留因子保留時(shí)間(tR)樣品從進(jìn)樣到檢測(cè)器的時(shí)間保留因子(k)組分在固定相中的滯留時(shí)間與在流動(dòng)相中的滯留時(shí)間的比值保留時(shí)間和保留因子是衡量色譜分離性能的重要指標(biāo)。它們反映了組分在色譜柱中的遷移速度和分離程度。分離度和理論塔板數(shù)分離度（Rs）是衡量色譜分離效果的重要指標(biāo)，它反映了兩個(gè)相鄰峰之間的分離程度。理論塔板數(shù)（N）是衡量色譜柱效率的指標(biāo)，它反映了色譜柱的分離能力。分離度越大，兩個(gè)相鄰峰之間的分離程度越好，理論塔板數(shù)越大，色譜柱的分離能力越強(qiáng)。色譜峰形色譜峰形是色譜圖中峰的形狀。理想的峰形是對(duì)稱(chēng)的、尖銳的，類(lèi)似于正態(tài)分布曲線(xiàn)。峰形可以反映樣品在色譜柱中的分離效率，以及樣品組分在色譜柱中的行為。峰形異常通常表明色譜分離過(guò)程存在問(wèn)題。峰寬和峰高峰寬和峰高是色譜峰的重要參數(shù)，反映了色譜分離的效率和質(zhì)量。峰寬表示色譜峰的寬度，峰高表示色譜峰的高度。峰寬越窄，峰高越高，說(shuō)明分離效率越高。峰面積和峰高測(cè)定峰面積和峰高是定量分析中常用的參數(shù)，用來(lái)反映樣品組分的含量。峰面積是指色譜峰的面積，峰高是指色譜峰的最高點(diǎn)與基線(xiàn)的距離。定性分析保留時(shí)間保留時(shí)間是樣品組分從進(jìn)樣到檢測(cè)器的時(shí)間。在特定條件下，純物質(zhì)具有特定的保留時(shí)間。譜圖匹配將未知樣品的色譜圖與已知標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的譜圖進(jìn)行比較，通過(guò)對(duì)比峰位、峰型和峰面積，判斷樣品成分。質(zhì)譜聯(lián)用高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用，通過(guò)質(zhì)譜儀對(duì)色譜流出物進(jìn)行分子量和結(jié)構(gòu)信息的分析，確定樣品成分。定量分析濃度測(cè)定定量分析的主要目標(biāo)是測(cè)定樣品中目標(biāo)化合物的濃度，確定目標(biāo)化合物在樣品中的含量。峰面積通過(guò)分析色譜峰面積可以確定目標(biāo)化合物的濃度，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法可以進(jìn)行定量分析。數(shù)據(jù)分析根據(jù)峰面積或峰高以及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行計(jì)算，可以得出樣品中目標(biāo)化合物的濃度。高效液相色譜法高效液相色譜法（HPLC）廣泛應(yīng)用于定量分析，可以精確測(cè)定樣品中不同組分的濃度。內(nèi)標(biāo)法原理內(nèi)標(biāo)法是一種定量分析方法，使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（內(nèi)標(biāo)物）作為參照物，與待測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)樣，通過(guò)比較內(nèi)標(biāo)物和待測(cè)物質(zhì)的峰面積或峰高，計(jì)算待測(cè)物質(zhì)的含量。優(yōu)點(diǎn)提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，不受進(jìn)樣量、流動(dòng)相流速、檢測(cè)器靈敏度等因素的影響。適用于復(fù)雜基質(zhì)的樣品分析，可以有效地消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。外標(biāo)法11.標(biāo)準(zhǔn)品外標(biāo)法使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為參考物質(zhì)。22.測(cè)量測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的峰面積或峰高，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。33.計(jì)算根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，通過(guò)樣品的峰面積或峰高計(jì)算樣品中目標(biāo)物的濃度。44.校正外標(biāo)法需要進(jìn)行校正，以消除系統(tǒng)誤差的影響。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制通過(guò)測(cè)定一系列已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)信號(hào)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，建立濃度與信號(hào)之間的關(guān)系。未知樣品測(cè)定測(cè)定未知樣品的響應(yīng)信號(hào)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行濃度換算，確定未知樣品的濃度。方法驗(yàn)證1準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度是指測(cè)定結(jié)果與真實(shí)值的接近程度。它反映了方法的系統(tǒng)誤差。2精密度精密度是指測(cè)定結(jié)果之間的一致性。它反映了方法的隨機(jī)誤差。3線(xiàn)性范圍線(xiàn)性范圍是指測(cè)定結(jié)果與待測(cè)物濃度呈線(xiàn)性關(guān)系的濃度范圍。4檢出限和定量限檢出限是指能可靠地檢測(cè)出待測(cè)物的最低濃度。定量限是指能準(zhǔn)確地定量測(cè)定待測(cè)物的最低濃度。5穩(wěn)定性穩(wěn)定性是指方法在一定時(shí)間內(nèi)保持其準(zhǔn)確度和精密度的能力。精密度精密度是指在相同條件下多次測(cè)定結(jié)果的接近程度，反映測(cè)定方法的重復(fù)性。重復(fù)性同一人，同一儀器，同一樣品，在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行多次測(cè)定所得結(jié)果的接近程度中間精密度不同人，同一儀器，同一樣品，在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行多次測(cè)定所得結(jié)果的接近程度再現(xiàn)性不同人，不同儀器，同一樣品，在不同時(shí)間進(jìn)行多次測(cè)定所得結(jié)果的接近程度準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度是指測(cè)定結(jié)果與真實(shí)值之間的接近程度。準(zhǔn)確度反映了測(cè)定結(jié)果的系統(tǒng)誤差的大小。系統(tǒng)誤差是指在同一條件下進(jìn)行多次測(cè)定，測(cè)定結(jié)果偏離真實(shí)值的程度。準(zhǔn)確度越高，測(cè)定結(jié)果越接近真實(shí)值，系統(tǒng)誤差越小。準(zhǔn)確度通常用偏差來(lái)表示。偏差是指測(cè)定結(jié)果與真實(shí)值之差。偏差可以是正的，也可以是負(fù)的。偏差越小，準(zhǔn)確度越高。影響準(zhǔn)確度的因素很多，包括試劑的純度、儀器的校準(zhǔn)、操作人員的技術(shù)水平等等。為了提高準(zhǔn)確度，需要采取一些措施，例如使用高純度的試劑、定期校準(zhǔn)儀器、操作人員要嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行操作等等。線(xiàn)性范圍線(xiàn)性范圍是指在一定的濃度范圍內(nèi)，樣品濃度與色譜峰面積或峰高之間呈線(xiàn)性關(guān)系的范圍。線(xiàn)性范圍是定量分析方法的重要指標(biāo)之一，它反映了方法的準(zhǔn)確性和可靠性。線(xiàn)性范圍越寬，定量分析的范圍就越大，可以用于分析更高濃度或更低濃度的樣品。線(xiàn)性范圍的確定需要進(jìn)行方法驗(yàn)證，通常通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)確定。檢出限和定量限檢出限(LOD)是指在給定置信度下，可以從樣品中檢測(cè)出分析物的最低濃度。定量限(LOQ)是指在給定置信度下，可以定量測(cè)定分析物的最低濃度。LOD和LOQ是評(píng)價(jià)分析方法靈敏度的重要指標(biāo)。LOD和LOQ與分析方法的靈敏度密切相關(guān)。靈敏度高的分析方法，LOD和LOQ較低。靈敏度低的分析方法，LOD和LOQ較高。LOD和LOQ的測(cè)定方法主要有兩種：信號(hào)比噪聲法和標(biāo)準(zhǔn)偏差法。信號(hào)比噪聲法是指通過(guò)測(cè)量空