DKK3與ITIH5甲基化：肝細(xì)胞肝癌早期診斷的新曙光一、引言1.1研究背景與意義1.1.1肝細(xì)胞肝癌的現(xiàn)狀肝細(xì)胞肝癌（HepatocellularCarcinoma，HCC）是最常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌類型，嚴(yán)重威脅著人類的健康。在全球范圍內(nèi)，HCC的發(fā)病率和死亡率均位居前列。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估算，2020年全球肝癌新發(fā)病例約90萬(wàn)例，死亡病例約83萬(wàn)例，在男性的惡性腫瘤發(fā)生率中排名第5位，在女性的惡性腫瘤發(fā)生率中排名第7位，死亡率高居世界第3位。肝癌的發(fā)病具有明顯的地域差異，亞洲和非洲的東南部地區(qū)是高發(fā)區(qū)域，而我國(guó)是世界肝癌的第一大國(guó)，全球每年約有26萬(wàn)人發(fā)病，其中有42.5%發(fā)生在中國(guó)，我國(guó)肝癌的死亡率為十萬(wàn)分之20.4，每年死亡人數(shù)至少要十二萬(wàn)人，占全世界的45%，男性的發(fā)病率高于女性，約為二比一。大多數(shù)肝癌病例（80％）可歸因于乙型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）感染，這也解釋了HCC在發(fā)展中國(guó)家呈現(xiàn)地方性感染的獨(dú)特地理分布。除此之外，長(zhǎng)期酗酒、非酒精性脂肪性肝炎、長(zhǎng)期食用被黃曲霉毒素污染的食物、各種其他原因引起的肝硬化以及有肝癌家族史等也是肝癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。肝癌本身的惡性程度高，病情進(jìn)展快，治療難度大，療效比較差，患者的5年總體生存率不足15%，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。1.1.2早期診斷的困境早期診斷對(duì)于改善肝癌患者的預(yù)后至關(guān)重要。然而，目前肝癌的早期診斷面臨諸多挑戰(zhàn)。臨床上常用的血清生物標(biāo)志物甲胎蛋白（AFP），是目前臨床實(shí)踐中常用的腫瘤學(xué)指標(biāo)，聯(lián)合影像學(xué)檢查用于肝細(xì)胞癌的篩查、檢測(cè)。然而，一些研究表明AFP在早期肝癌診斷中的靈敏度低至22％到60％，超過(guò)30%肝癌患者的AFP水平正常或僅輕度升高，特別是在早期或小肝癌患者中，AFP在診斷肝癌方面的能力仍有所限制。影像學(xué)檢查如超聲、計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）和磁共振成像（MRI）等也是常用的診斷手段。超聲檢查雖然具有無(wú)創(chuàng)、操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但其分辨率有限，對(duì)于直徑小于1厘米的肝癌，B超可能難以準(zhǔn)確檢測(cè)到，且容易受到肥胖、氣體等因素干擾，導(dǎo)致漏診。對(duì)于某些特殊類型的肝癌，如包膜完整的小肝癌、位于肝臟深部的肝癌，B超的檢出率可能較低。CT和MRI雖然對(duì)肝癌的診斷具有較高的準(zhǔn)確性，但它們存在費(fèi)用較高、有輻射等局限性，且對(duì)于早期微小肝癌的診斷也存在一定困難。此外，這些影像學(xué)檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性還受到操作人員技能水平和經(jīng)驗(yàn)的影響。由于肝癌早期癥狀不明顯，很多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)就已經(jīng)是晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳的治療時(shí)機(jī)。因此，迫切需要尋找更加有效的早期診斷方法和腫瘤標(biāo)志物，以提高肝癌的早期診斷率。1.1.3研究意義尋找新的腫瘤標(biāo)志物對(duì)于提高肝癌的早期診斷率具有重要意義。DKK3基因是Dickkopf家族的成員，是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的拮抗因子之一，可與Wnt受體復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合進(jìn)而選擇性抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活。已有研究表明HCC組織中DKK3的異常啟動(dòng)子甲基化可能是HCC的重要機(jī)制，但其在肝癌外周血單個(gè)核細(xì)胞中的甲基化狀態(tài)尚未見(jiàn)報(bào)道。ITIH5是ITI家族的一員，通過(guò)與透明質(zhì)酸的共價(jià)結(jié)合來(lái)維持細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的穩(wěn)定。目前已有較多研究表明，ITIH5在乳房癌、結(jié)腸癌、肺癌、宮頸癌等惡性腫瘤中存在異常甲基化狀態(tài)，可引起基因表達(dá)下調(diào)，且在腫瘤的形成過(guò)程中，ITIH5基因表達(dá)下調(diào)或沉默與腫瘤的轉(zhuǎn)移及惡性進(jìn)展有關(guān)，但肝癌患者中ITIH5啟動(dòng)子、第一外顯子的甲基化狀態(tài)及其潛在的作用仍是未知的。本研究旨在探討肝癌外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3啟動(dòng)子、ITIH5啟動(dòng)子、第一外顯子的甲基化狀態(tài)，以及其潛在診斷價(jià)值。通過(guò)研究，有望發(fā)現(xiàn)新的肝癌早期診斷標(biāo)志物，提高肝癌的早期診斷率，為患者提供更早、更有效的治療，改善患者的預(yù)后。這不僅有助于減輕患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也對(duì)提高我國(guó)肝癌的防治水平具有重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在肝癌診斷領(lǐng)域，DKK3和ITIH5甲基化的研究逐漸受到關(guān)注。1.2.1DKK3甲基化的研究進(jìn)展DKK3基因作為Dickkopf家族成員，在細(xì)胞增殖、分化和胚胎發(fā)育等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。國(guó)內(nèi)外研究表明，在多種癌癥如肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌中，DKK3基因啟動(dòng)子區(qū)域存在高甲基化現(xiàn)象，導(dǎo)致基因表達(dá)沉默，進(jìn)而失去對(duì)腫瘤的抑制作用。在肝癌研究方面，已有研究證實(shí)HCC組織中DKK3的異常啟動(dòng)子甲基化可能是HCC發(fā)生的重要機(jī)制。例如，國(guó)內(nèi)學(xué)者通過(guò)對(duì)肝癌組織樣本的檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)DKK3甲基化水平與肝癌的病理分級(jí)、腫瘤大小等臨床病理參數(shù)相關(guān)，提示其在肝癌進(jìn)展中可能扮演關(guān)鍵角色。國(guó)外相關(guān)研究也指出，DKK3甲基化導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)，使得Wnt信號(hào)通路過(guò)度激活，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。然而，目前關(guān)于DKK3甲基化在肝癌診斷中的應(yīng)用研究仍存在不足。多數(shù)研究集中在肝癌組織中的甲基化狀態(tài)分析，而對(duì)于肝癌外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3的甲基化狀態(tài)研究較少。外周血單個(gè)核細(xì)胞作為一種相對(duì)容易獲取的樣本，若能發(fā)現(xiàn)其中DKK3甲基化與肝癌的關(guān)聯(lián)，將為肝癌的早期診斷提供更便捷、微創(chuàng)的檢測(cè)方法。但目前該領(lǐng)域在這方面的研究尚處于起步階段，缺乏大樣本、多中心的研究數(shù)據(jù)，對(duì)于DKK3甲基化檢測(cè)的靈敏度、特異性以及與其他肝癌診斷指標(biāo)的聯(lián)合應(yīng)用等方面的研究還不夠深入。1.2.2ITIH5甲基化的研究進(jìn)展ITIH5是ITI家族的重要成員，通過(guò)維持細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的穩(wěn)定，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和遷移等生理過(guò)程中發(fā)揮作用。大量研究表明，在乳房癌、結(jié)腸癌、肺癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中，ITIH5存在異常甲基化狀態(tài)，導(dǎo)致基因表達(dá)下調(diào)，與腫瘤的轉(zhuǎn)移及惡性進(jìn)展密切相關(guān)。在肝癌研究中，ITIH5啟動(dòng)子、第一外顯子的甲基化狀態(tài)及其潛在作用的研究尚處于探索階段。已有一些初步研究顯示，肝癌組織中ITIH5的表達(dá)水平低于正常肝組織，推測(cè)其可能與甲基化調(diào)控有關(guān)，但目前對(duì)于肝癌患者中ITIH5甲基化的具體情況，包括甲基化頻率、甲基化位點(diǎn)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系等方面，尚未形成系統(tǒng)的研究結(jié)論。當(dāng)前ITIH5甲基化在肝癌診斷研究中的不足主要體現(xiàn)在研究的廣度和深度上。一方面，研究樣本量相對(duì)較小，研究范圍局限，難以全面準(zhǔn)確地揭示ITIH5甲基化在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制；另一方面，對(duì)于ITIH5甲基化作為肝癌診斷標(biāo)志物的可行性研究不夠深入，缺乏與現(xiàn)有診斷方法的對(duì)比分析，其在肝癌早期診斷中的價(jià)值尚未得到充分驗(yàn)證。綜上所述，雖然DKK3和ITIH5甲基化在肝癌研究中已取得一定進(jìn)展，但仍存在諸多空白和不足。本研究將聚焦于肝癌外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3啟動(dòng)子、ITIH5啟動(dòng)子及第一外顯子的甲基化狀態(tài)，通過(guò)大樣本的研究，深入探討其在肝癌早期診斷中的潛在價(jià)值，有望為肝癌的早期診斷提供新的思路和方法。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容1.3.1研究目標(biāo)本研究旨在深入探究DKK3、ITIH5甲基化在肝細(xì)胞肝癌診斷中的價(jià)值。具體而言，通過(guò)檢測(cè)肝癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3啟動(dòng)子、ITIH5啟動(dòng)子及第一外顯子的甲基化狀態(tài)，分析其與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)，明確這兩種基因甲基化狀態(tài)作為肝癌診斷標(biāo)志物的可行性。同時(shí)，比較DKK3、ITIH5甲基化檢測(cè)與傳統(tǒng)肝癌診斷指標(biāo)（如甲胎蛋白）的診斷效能，評(píng)估其在提高肝癌早期診斷率方面的潛在作用，為肝細(xì)胞肝癌的早期診斷提供新的、有效的生物標(biāo)志物和診斷思路，從而助力臨床醫(yī)生更早、更準(zhǔn)確地診斷肝癌，為患者制定更及時(shí)、有效的治療方案，改善患者的預(yù)后。1.3.2研究?jī)?nèi)容檢測(cè)基因甲基化狀態(tài)：收集肝癌患者、慢性乙型肝炎患者和正常對(duì)照者的外周血樣本，采用手工法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞中的DNA。運(yùn)用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（MSP）技術(shù)，檢測(cè)不同組別外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3啟動(dòng)子、ITIH5啟動(dòng)子及第一外顯子的甲基化狀態(tài)，明確肝癌患者中這兩種基因的甲基化頻率，并與慢性乙型肝炎患者和正常對(duì)照者進(jìn)行對(duì)比分析。檢測(cè)mRNA水平：從上述外周血單個(gè)核細(xì)胞中提取RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)，檢測(cè)DKK3、ITIH5的mRNA水平。分析不同組別的mRNA表達(dá)差異，探究基因甲基化狀態(tài)與mRNA表達(dá)水平之間的相關(guān)性，進(jìn)一步揭示DKK3、ITIH5在肝癌發(fā)生發(fā)展中的分子調(diào)控機(jī)制。分析與臨床病理特征的關(guān)系：收集肝癌患者的臨床病理資料，包括腫瘤大小、血管侵襲、TNM分期等。分析外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3、ITIH5甲基化狀態(tài)及mRNA水平與肝癌臨床病理特征之間的關(guān)系，明確這兩種基因在肝癌進(jìn)展過(guò)程中的作用，為評(píng)估肝癌患者的病情和預(yù)后提供依據(jù)。評(píng)估診斷價(jià)值：計(jì)算DKK3、ITIH5甲基化檢測(cè)診斷肝癌的敏感性、特異性等指標(biāo)，評(píng)估其作為肝癌診斷標(biāo)志物的診斷效能。將DKK3、ITIH5甲基化檢測(cè)與血清甲胎蛋白檢測(cè)進(jìn)行對(duì)比，分析兩者在肝癌診斷中的優(yōu)勢(shì)與不足。進(jìn)一步探討DKK3、ITIH5甲基化聯(lián)合檢測(cè)在肝癌早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值，為臨床肝癌診斷提供更優(yōu)化的方案。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1研究方法樣本采集：收集肝癌患者、慢性乙型肝炎患者和正常對(duì)照者的外周血樣本。詳細(xì)記錄患者的臨床資料，包括年齡、性別、病史、腫瘤大小、血管侵襲、TNM分期等信息。在采集過(guò)程中，嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則，確保樣本的質(zhì)量和安全性，使用含有抗凝劑的采血管收集外周血，采集后及時(shí)進(jìn)行處理，避免樣本長(zhǎng)時(shí)間放置導(dǎo)致細(xì)胞活性下降或基因表達(dá)變化。DNA提取：采用手工法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞中的DNA。具體操作過(guò)程中，利用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，再使用基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書的步驟進(jìn)行操作，提取高質(zhì)量的DNA。提取完成后，通過(guò)紫外分光光度法測(cè)定DNA的濃度和純度，確保DNA的質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，并將提取的DNA保存于-80℃冰箱備用，防止DNA降解。甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（MSP）：運(yùn)用MSP技術(shù)檢測(cè)不同組別外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3啟動(dòng)子、ITIH5啟動(dòng)子及第一外顯子的甲基化狀態(tài)。首先，使用EZDNAMethylationKit對(duì)提取的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉處理，使未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。處理后的DNA利用反應(yīng)柱進(jìn)行脫硫及凈化，得到純化的DNA用于后續(xù)PCR反應(yīng)。然后，針對(duì)DKK3和ITIH5基因啟動(dòng)子CPG島富集區(qū)設(shè)計(jì)甲基化和非甲基化引物，引物設(shè)計(jì)遵循相關(guān)原則，如引物不應(yīng)含有CpG位點(diǎn)以區(qū)別甲基化和非甲基化DNA，引物擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)包含盡可能多的CpG位點(diǎn)，甲基化引物和非甲基化引物3’端至少包含1個(gè)CpG位點(diǎn)且處于相同的CpG位點(diǎn)，2套引物應(yīng)有相近的Tm值等。設(shè)計(jì)好的引物由專業(yè)公司合成。最后，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10min；95℃變性45s、58℃(甲基化)/57℃(非甲基化)45s、72℃退火45s，35次循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，凝膠電泳成像及圖像分析系統(tǒng)用于觀察和分析結(jié)果，如某基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島完全甲基化，則只有甲基化引物能擴(kuò)增出目的條帶；如完全未甲基化，則只有非甲基化引物能擴(kuò)增出目的條帶；如為部分甲基化，則兩對(duì)引物均能擴(kuò)增出目的條帶，部分甲基化歸為甲基化范疇，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以確保結(jié)果的可靠性。RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄：從上述外周血單個(gè)核細(xì)胞中提取RNA，使用RNA提取試劑盒按照說(shuō)明書操作，確保提取的RNA完整性和純度良好。提取的RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件按照試劑盒要求進(jìn)行設(shè)置，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后保存于-20℃冰箱備用，為后續(xù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)提供模板。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）：利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)DKK3、ITIH5的mRNA水平。首先，根據(jù)DKK3和ITIH5基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物設(shè)計(jì)遵循PCR引物設(shè)計(jì)的一般原則，同時(shí)確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。引物由專業(yè)公司合成。然后，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，如SYBRGreenⅠ染料，該染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后發(fā)射熒光信號(hào)，從而可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程。反應(yīng)條件根據(jù)引物的退火溫度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，一般包括95℃預(yù)變性、95℃變性、引物退火、72℃延伸等步驟，經(jīng)過(guò)多個(gè)循環(huán)后，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的積累來(lái)確定mRNA的表達(dá)水平。最后，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出未知樣品中DKK3、ITIH5的mRNA含量，從而分析不同組別的mRNA表達(dá)差異，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行檢測(cè)，以減小實(shí)驗(yàn)誤差。數(shù)據(jù)分析：采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)數(shù)據(jù)分析，明確DKK3、ITIH5甲基化狀態(tài)及mRNA水平與肝癌臨床病理特征之間的關(guān)系，評(píng)估其作為肝癌診斷標(biāo)志物的診斷效能。1.4.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如下：樣本收集：招募肝癌患者、慢性乙型肝炎患者和正常對(duì)照者，采集外周血樣本，并詳細(xì)記錄臨床資料。樣本處理：使用手工法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞中的DNA和RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。甲基化檢測(cè)：運(yùn)用MSP技術(shù)檢測(cè)DKK3、ITIH5的甲基化狀態(tài)，包括DNA亞硫酸氫鹽處理、引物設(shè)計(jì)與合成、PCR反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳分析。mRNA水平檢測(cè)：通過(guò)RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)DKK3、ITIH5的mRNA水平，包括引物設(shè)計(jì)與合成、PCR反應(yīng)及數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)分析：對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，明確基因甲基化狀態(tài)、mRNA水平與肝癌臨床病理特征的關(guān)系，評(píng)估診斷價(jià)值。結(jié)果呈現(xiàn)：根據(jù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果，撰寫研究報(bào)告，繪制圖表，展示DKK3、ITIH5甲基化在肝細(xì)胞肝癌診斷中的價(jià)值。二、理論基礎(chǔ)2.1肝細(xì)胞肝癌概述2.1.1病因與發(fā)病機(jī)制肝細(xì)胞肝癌的病因較為復(fù)雜，多種因素相互作用共同促進(jìn)了肝癌的發(fā)生發(fā)展。乙肝病毒（HBV）和丙肝病毒（HCV）感染是導(dǎo)致肝癌的主要病因之一。全球約80％的肝癌病例與HBV或HCV感染相關(guān)，在我國(guó)，約90%的肝癌患者有乙型肝炎病毒感染的背景。HBV和HCV感染人體后，病毒持續(xù)復(fù)制引發(fā)肝臟的慢性炎癥，在炎癥過(guò)程中，免疫細(xì)胞對(duì)受感染肝細(xì)胞進(jìn)行攻擊，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷、壞死。長(zhǎng)期的肝細(xì)胞損傷促使肝臟不斷進(jìn)行修復(fù)，在此過(guò)程中，肝細(xì)胞的增殖和分化容易出現(xiàn)異常，進(jìn)而引發(fā)基因突變，增加肝癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。長(zhǎng)期酗酒也是肝癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。酒精進(jìn)入人體后主要在肝臟代謝，乙醇經(jīng)乙醇脫氫酶代謝為乙醛，乙醛對(duì)肝細(xì)胞具有直接的毒性作用，可導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性、壞死和纖維化。長(zhǎng)期酗酒還會(huì)影響肝臟的免疫功能，降低肝臟對(duì)病毒感染和腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視能力，從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生。非酒精性脂肪性肝炎作為代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)，與肥胖、胰島素抵抗、血脂異常等密切相關(guān)。隨著肥胖和代謝綜合征發(fā)病率的上升，非酒精性脂肪性肝炎相關(guān)的肝癌發(fā)病率也呈逐漸增加的趨勢(shì)。在非酒精性脂肪性肝炎患者中，肝臟內(nèi)脂肪堆積，引發(fā)炎癥反應(yīng)，炎癥細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子和活性氧物質(zhì)可損傷肝細(xì)胞DNA，導(dǎo)致基因突變，最終可能發(fā)展為肝癌。食物中的黃曲霉毒素污染也是肝癌發(fā)生的一個(gè)重要因素。黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的一類毒性代謝產(chǎn)物，其中黃曲霉毒素B1的毒性最強(qiáng)。長(zhǎng)期食用被黃曲霉毒素污染的食物，如霉變的花生、玉米等，黃曲霉毒素進(jìn)入人體后在肝臟代謝，其代謝產(chǎn)物可與肝細(xì)胞DNA結(jié)合，形成加合物，導(dǎo)致DNA損傷和基因突變，從而誘發(fā)肝癌。各種原因引起的肝硬化也是肝癌發(fā)生的重要基礎(chǔ)，肝硬化時(shí)肝臟組織纖維化，肝細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞，肝臟微環(huán)境發(fā)生改變，這種改變?yōu)楦伟┑陌l(fā)生提供了有利條件。在肝硬化過(guò)程中，肝細(xì)胞的再生和修復(fù)過(guò)程容易出現(xiàn)異常，細(xì)胞增殖失控，進(jìn)而發(fā)生癌變。此外，肝癌具有一定的家族遺傳傾向，家族中有肝癌患者的人群，其患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較高，這可能與遺傳因素導(dǎo)致的某些基因的易感性增加有關(guān)。肝癌的發(fā)病是一個(gè)多基因、多階段的復(fù)雜過(guò)程，涉及多個(gè)基因的突變、表達(dá)異常以及多條信號(hào)通路的失調(diào)。目前認(rèn)為，肝癌的發(fā)生發(fā)展主要涉及以下幾個(gè)關(guān)鍵階段：?jiǎn)?dòng)階段，在各種致癌因素的作用下，肝細(xì)胞的DNA發(fā)生損傷，導(dǎo)致原癌基因激活和抑癌基因失活。原癌基因如Ras、Myc等，它們的激活可促進(jìn)細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)；抑癌基因如p53、PTEN等，它們的失活則失去了對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。這些基因的改變?yōu)楦伟┑陌l(fā)生奠定了基礎(chǔ)。促進(jìn)階段，在啟動(dòng)階段的基礎(chǔ)上，肝細(xì)胞的增殖和分化進(jìn)一步失控，細(xì)胞逐漸向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。此時(shí)，一些生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的異常表達(dá)，如表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）等，可促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和存活。同時(shí)，癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力也逐漸增強(qiáng)，它們開(kāi)始突破肝臟組織的邊界，向周圍組織和器官擴(kuò)散。進(jìn)展階段，癌細(xì)胞不斷增殖和擴(kuò)散，形成較大的腫瘤病灶，腫瘤細(xì)胞還會(huì)侵入血管和淋巴管，導(dǎo)致遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在這個(gè)階段，肝癌患者的病情往往已經(jīng)較為嚴(yán)重，治療難度較大。在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，多條信號(hào)通路發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在肝癌中常常異常激活，該通路的激活可導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，并進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游靶基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化和遷移。PI3K/Akt信號(hào)通路也與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，該通路的激活可促進(jìn)細(xì)胞的存活、增殖和代謝，抑制細(xì)胞凋亡。此外，MAPK信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路等在肝癌中也存在異常調(diào)節(jié)，它們相互作用，共同促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。2.1.2臨床癥狀與診斷方法肝細(xì)胞肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，往往容易被忽視。隨著病情的進(jìn)展，患者逐漸出現(xiàn)一系列臨床癥狀。肝區(qū)疼痛是肝癌最常見(jiàn)的癥狀，多為持續(xù)性鈍痛或脹痛，主要是由于腫瘤迅速生長(zhǎng)，使肝包膜張力增加所致。疼痛部位一般位于右上腹，有時(shí)可向右肩部或背部放射。如果腫瘤侵犯膈肌，疼痛可放射至右肩部；如果腫瘤位于肝臟左葉，疼痛可能表現(xiàn)為上腹部疼痛。消化道癥狀也是肝癌患者常見(jiàn)的表現(xiàn)，包括食欲減退、惡心、嘔吐、腹脹、腹瀉等。這些癥狀可能是由于肝癌導(dǎo)致肝臟功能受損，影響了消化液的分泌和消化功能，也可能是由于腫瘤壓迫胃腸道引起的。患者還可能出現(xiàn)全身癥狀，如乏力、消瘦、發(fā)熱等，乏力和消瘦是由于腫瘤消耗機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致機(jī)體能量代謝失衡所致；發(fā)熱多為低熱，一般不超過(guò)38℃，可能是由于腫瘤組織壞死、吸收引起的，也可能是由于合并感染導(dǎo)致的。當(dāng)肝癌發(fā)展到中晚期，還可能出現(xiàn)黃疸、腹水等癥狀。黃疸是由于腫瘤壓迫膽管或侵犯膽管，導(dǎo)致膽汁排泄受阻，膽紅素反流入血引起的，表現(xiàn)為皮膚和鞏膜黃染、尿色加深等；腹水則是由于肝癌導(dǎo)致門靜脈高壓、低蛋白血癥以及肝臟淋巴回流受阻等多種因素引起的，表現(xiàn)為腹部膨隆、腹脹等。肝癌還容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，當(dāng)轉(zhuǎn)移到肺部時(shí)，可引起咳嗽、咯血、胸痛等癥狀；轉(zhuǎn)移到骨骼時(shí)，可引起骨痛、病理性骨折等癥狀；轉(zhuǎn)移到腦部時(shí)，可引起頭痛、嘔吐、偏癱等癥狀。目前，肝細(xì)胞肝癌的診斷主要依靠影像學(xué)檢查、血清學(xué)檢測(cè)和病理學(xué)檢查等多種方法。影像學(xué)檢查是肝癌診斷的重要手段之一，包括超聲、CT、MRI等。超聲檢查具有無(wú)創(chuàng)、操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，是肝癌篩查的首選方法。通過(guò)超聲檢查可以觀察肝臟的形態(tài)、大小、結(jié)構(gòu)以及腫瘤的位置、大小、形態(tài)等信息，對(duì)于直徑大于1厘米的肝癌，超聲檢查的檢出率較高。然而，超聲檢查的分辨率有限，對(duì)于直徑小于1厘米的肝癌，尤其是位于肝臟深部或被氣體、脂肪等遮擋的肝癌，超聲檢查容易漏診。此外，超聲檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性還受到操作人員經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)水平的影響。CT檢查具有較高的分辨率，能夠清晰地顯示肝臟的解剖結(jié)構(gòu)和腫瘤的形態(tài)、大小、位置、血供等信息，對(duì)于肝癌的診斷和分期具有重要價(jià)值。增強(qiáng)CT檢查可以進(jìn)一步提高肝癌的診斷準(zhǔn)確性，通過(guò)注射造影劑，觀察腫瘤在不同時(shí)相的強(qiáng)化特點(diǎn)，有助于鑒別肝癌與其他肝臟占位性病變。然而，CT檢查有一定的輻射劑量，對(duì)于孕婦、兒童等特殊人群應(yīng)謹(jǐn)慎使用。此外，CT檢查對(duì)于早期微小肝癌的診斷也存在一定困難，部分早期肝癌在CT圖像上可能表現(xiàn)不典型，容易漏診。MRI檢查對(duì)軟組織的分辨力較高，能夠多方位、多參數(shù)成像，對(duì)于肝癌的診斷和鑒別診斷具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。MRI檢查可以清晰地顯示肝癌的包膜、血管侵犯、腫瘤壞死等情況，對(duì)于評(píng)估肝癌的可切除性和預(yù)后具有重要意義。在鑒別肝癌與肝血管瘤、肝囊腫等良性病變方面，MRI檢查也具有較高的準(zhǔn)確性。然而，MRI檢查費(fèi)用較高，檢查時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)于體內(nèi)有金屬植入物（如心臟起搏器、金屬假牙等）的患者禁忌使用。血清學(xué)檢測(cè)主要通過(guò)檢測(cè)血液中的腫瘤標(biāo)志物來(lái)輔助診斷肝癌，常用的腫瘤標(biāo)志物包括甲胎蛋白（AFP）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶同工酶Ⅱ（GGT-Ⅱ）、異常凝血酶原（PIVKA-Ⅱ）等。AFP是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的肝癌腫瘤標(biāo)志物，在肝癌患者中，AFP水平通常會(huì)升高。AFP診斷肝癌的敏感性和特異性在不同研究中有所差異，一般來(lái)說(shuō)，AFP診斷肝癌的敏感性為40%-60%，特異性為70%-90%。然而，約30%的肝癌患者AFP水平正常或僅輕度升高，特別是在早期肝癌患者中，AFP的診斷價(jià)值有限。此外，AFP水平升高還可見(jiàn)于其他一些疾病，如慢性肝炎、肝硬化、生殖腺胚胎腫瘤等，因此，AFP診斷肝癌需要結(jié)合其他檢查結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。GGT-Ⅱ是γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的一種同工酶，在肝癌患者中，GGT-Ⅱ的陽(yáng)性率較高，且與肝癌的大小、分期等密切相關(guān)。GGT-Ⅱ診斷肝癌的敏感性和特異性相對(duì)較高，可作為AFP的補(bǔ)充指標(biāo)用于肝癌的診斷。PIVKA-Ⅱ是一種異常的凝血酶原，在肝癌患者中，由于肝細(xì)胞功能受損，維生素K的代謝異常，導(dǎo)致PIVKA-Ⅱ的合成增加。PIVKA-Ⅱ診斷肝癌的敏感性和特異性也較高，尤其是對(duì)于AFP陰性的肝癌患者，PIVKA-Ⅱ具有重要的診斷價(jià)值。病理學(xué)檢查是肝癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)肝穿刺活檢或手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行病理檢查，可以明確腫瘤的組織學(xué)類型、分化程度、有無(wú)血管侵犯等信息，對(duì)于指導(dǎo)治療和判斷預(yù)后具有重要意義。然而，肝穿刺活檢是一種有創(chuàng)檢查，存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，如出血、感染、腫瘤種植轉(zhuǎn)移等，因此，對(duì)于一些不適合肝穿刺活檢的患者，如凝血功能障礙、肝內(nèi)多發(fā)病灶等，病理學(xué)檢查可能無(wú)法進(jìn)行。綜上所述，肝細(xì)胞肝癌的臨床癥狀缺乏特異性，早期診斷較為困難。目前的診斷方法雖然各有優(yōu)勢(shì)，但也存在一定的局限性。因此，尋找更加準(zhǔn)確、敏感、特異的診斷方法和腫瘤標(biāo)志物，對(duì)于提高肝癌的早期診斷率具有重要意義。2.2DNA甲基化與腫瘤2.2.1DNA甲基化的概念與機(jī)制DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式，在不改變DNA序列的前提下，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)功能。其定義為在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNAmethyltransferase，DNMT）的催化作用下，以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）作為甲基供體，將甲基基團(tuán)共價(jià)結(jié)合到DNA分子中特定的堿基上。在哺乳動(dòng)物中，DNA甲基化主要發(fā)生在CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基的第5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC），這種修飾大多出現(xiàn)在基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島。DNA甲基化的過(guò)程涉及多種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，主要包括DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。DNMT1是維持DNA甲基化的關(guān)鍵酶，在DNA復(fù)制過(guò)程中，它能夠識(shí)別半甲基化的DNA雙鏈，并將甲基基團(tuán)添加到新合成的DNA鏈上，使甲基化模式得以精確復(fù)制，從而保持細(xì)胞分裂過(guò)程中DNA甲基化狀態(tài)的穩(wěn)定性。例如，在細(xì)胞增殖過(guò)程中，DNMT1能夠確保子代細(xì)胞繼承親代細(xì)胞的DNA甲基化模式，保證細(xì)胞功能的穩(wěn)定遺傳。DNMT3A和DNMT3B則主要負(fù)責(zé)從頭甲基化，即在未甲基化的DNA區(qū)域建立新的甲基化模式，它們?cè)谂咛グl(fā)育、細(xì)胞分化等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在胚胎發(fā)育早期，DNMT3A和DNMT3B通過(guò)對(duì)特定基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化修飾，調(diào)控基因的表達(dá)，決定細(xì)胞的分化方向和命運(yùn)。DNA甲基化對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜，主要通過(guò)以下幾種方式實(shí)現(xiàn)：首先，甲基化的CpG島可以直接阻礙轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，使得轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物無(wú)法形成，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子通常需要識(shí)別并結(jié)合到基因啟動(dòng)子的特定序列上，才能啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。當(dāng)啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島發(fā)生甲基化時(shí)，甲基基團(tuán)的存在會(huì)改變DNA的空間結(jié)構(gòu)，使得轉(zhuǎn)錄因子難以與之結(jié)合，進(jìn)而阻止基因的轉(zhuǎn)錄。其次，甲基化的CpG島可以招募甲基化結(jié)合蛋白，如MeCP2等，這些蛋白與甲基化的DNA結(jié)合后，會(huì)招募其他染色質(zhì)重塑復(fù)合物和組蛋白修飾酶，改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，使其變得更加緊密，形成異染色質(zhì)，從而抑制基因的表達(dá)。異染色質(zhì)狀態(tài)下，基因的轉(zhuǎn)錄活性受到抑制，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄機(jī)器難以接近緊密纏繞的DNA。此外，DNA甲基化還可以通過(guò)影響DNA與其他蛋白質(zhì)的相互作用，間接調(diào)控基因的表達(dá)。例如，某些蛋白質(zhì)可能與未甲基化的DNA具有較高的親和力，而DNA甲基化后，這種親和力降低，從而影響相關(guān)蛋白質(zhì)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用。2.2.2DNA甲基化與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系DNA甲基化異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤發(fā)生的起始階段，DNA甲基化異常主要表現(xiàn)為基因組整體甲基化水平降低和某些特定基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化。基因組整體甲基化水平降低會(huì)導(dǎo)致一些原本被甲基化沉默的基因，如原癌基因、轉(zhuǎn)座子等，重新激活表達(dá)。原癌基因的激活可促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖和分化，增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)；轉(zhuǎn)座子的激活則可能導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定性增加，引發(fā)基因突變，進(jìn)一步推動(dòng)腫瘤的發(fā)生。在肝癌中，可能由于基因組整體甲基化水平降低，導(dǎo)致某些原癌基因如c-Myc等的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)肝細(xì)胞的異常增殖，從而參與肝癌的發(fā)生。某些腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一。腫瘤抑制基因的正常功能是抑制細(xì)胞的異常增殖和腫瘤的發(fā)生發(fā)展，當(dāng)這些基因的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生高甲基化時(shí)，基因表達(dá)被沉默，失去對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，使得細(xì)胞更容易發(fā)生癌變。如p16基因是一種重要的腫瘤抑制基因，在多種腫瘤中，包括肝癌，都發(fā)現(xiàn)p16基因啟動(dòng)子區(qū)域存在高甲基化現(xiàn)象，導(dǎo)致p16基因表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞周期調(diào)控失衡，細(xì)胞增殖失控，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中，DNA甲基化異常進(jìn)一步加劇，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性。腫瘤細(xì)胞的代謝、增殖、凋亡等過(guò)程受到DNA甲基化的調(diào)控。一些參與細(xì)胞代謝的基因，如葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因等，其甲基化狀態(tài)的改變可能影響腫瘤細(xì)胞的能量代謝，使腫瘤細(xì)胞能夠適應(yīng)高增殖的需求。在肝癌細(xì)胞中，某些葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的低甲基化可能導(dǎo)致其表達(dá)上調(diào)，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用，為腫瘤細(xì)胞的快速增殖提供能量支持。此外，DNA甲基化還可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的增殖能力。CyclinD1是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵蛋白，其基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)與腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。在肝癌中，CyclinD1基因啟動(dòng)子區(qū)域的低甲基化可能導(dǎo)致其表達(dá)升高，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，使腫瘤細(xì)胞增殖加快。腫瘤細(xì)胞的凋亡也受到DNA甲基化的調(diào)控。一些促凋亡基因，如Bax等，其啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化可能導(dǎo)致基因表達(dá)下調(diào)，使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。在肝癌中，Bax基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化可能使得Bax蛋白表達(dá)減少，腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的敏感性降低，有利于腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。在腫瘤轉(zhuǎn)移方面，DNA甲基化同樣發(fā)揮著重要作用。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及細(xì)胞的黏附、遷移、侵襲等多個(gè)環(huán)節(jié)。DNA甲基化可以通過(guò)調(diào)控一系列與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。一些細(xì)胞黏附分子基因，如E-鈣黏蛋白基因，其啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)下調(diào)，使腫瘤細(xì)胞之間的黏附力減弱，易于脫離原發(fā)灶，發(fā)生轉(zhuǎn)移。在肝癌中，E-鈣黏蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化常見(jiàn)于具有轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞中，這使得腫瘤細(xì)胞更容易突破基底膜，侵入周圍組織和血管，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。此外，一些基質(zhì)金屬蛋白酶基因的低甲基化可能導(dǎo)致其表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。MMP-2和MMP-9是兩種重要的基質(zhì)金屬蛋白酶，在肝癌中，它們的基因啟動(dòng)子區(qū)域低甲基化，導(dǎo)致其表達(dá)升高，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白等成分，為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移開(kāi)辟道路。綜上所述，DNA甲基化異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色，深入研究DNA甲基化與腫瘤的關(guān)系，對(duì)于揭示腫瘤的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的腫瘤診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)具有重要意義。2.3DKK3與ITIH5基因的生物學(xué)功能2.3.1DKK3基因的結(jié)構(gòu)與功能DKK3基因作為Dickkopf家族的重要成員，在細(xì)胞的生命活動(dòng)中扮演著關(guān)鍵角色。該基因定位于人類染色體11q13.5區(qū)域，其全長(zhǎng)約為47.7kb，包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。這種獨(dú)特的基因結(jié)構(gòu)為其功能的多樣性奠定了基礎(chǔ)。DKK3基因編碼的蛋白質(zhì)由354個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為39kD。其蛋白結(jié)構(gòu)包含兩個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)τ贒KK3蛋白發(fā)揮其生物學(xué)功能至關(guān)重要。它們能夠與其他蛋白質(zhì)相互作用，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。DKK3基因的主要功能是作為Wnt信號(hào)通路的拮抗因子。Wnt信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和遷移等過(guò)程中發(fā)揮著核心作用。在正常生理狀態(tài)下，Wnt信號(hào)通路處于適度激活狀態(tài)，維持細(xì)胞的正常功能和組織的穩(wěn)態(tài)。當(dāng)Wnt信號(hào)通路異常激活時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控、分化異常，進(jìn)而引發(fā)腫瘤等疾病。DKK3通過(guò)與Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵受體LRP5/6競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，阻止Wnt蛋白與LRP5/6受體的結(jié)合，從而抑制Wnt信號(hào)通路的激活。具體來(lái)說(shuō)，DKK3的兩個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合LRP5/6受體，占據(jù)Wnt蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，使得Wnt蛋白無(wú)法與LRP5/6受體形成復(fù)合物，從而阻斷了Wnt信號(hào)的傳導(dǎo)。這種競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合機(jī)制有效地調(diào)節(jié)了Wnt信號(hào)通路的活性，確保細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和分化。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，DKK3通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路，調(diào)控胚胎的軸向發(fā)育和器官形成。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中，DKK3的表達(dá)能夠抑制神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，從而保證神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，DKK3的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路的異常激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在肝癌中，DKK3基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化導(dǎo)致基因表達(dá)沉默，使得Wnt信號(hào)通路失去抑制，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。2.3.2ITIH5基因的結(jié)構(gòu)與功能ITIH5基因是ITI家族的重要成員，其在維持細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)定和細(xì)胞生理功能方面發(fā)揮著不可或缺的作用。ITIH5基因定位于人類染色體3q27.3區(qū)域，基因全長(zhǎng)約為110kb，包含15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子。這種復(fù)雜的基因結(jié)構(gòu)決定了其編碼產(chǎn)物的多樣性和功能的復(fù)雜性。ITIH5基因編碼的蛋白質(zhì)由1021個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為110kD。該蛋白具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)域，包括一個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)序列（LRR）結(jié)構(gòu)域、一個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域和一個(gè)vonWillebrandfactortypeD（vWFD）結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域賦予了ITIH5蛋白多種生物學(xué)功能。ITIH5的主要功能是通過(guò)與透明質(zhì)酸（HA）的共價(jià)結(jié)合來(lái)維持細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的穩(wěn)定。細(xì)胞外基質(zhì)是由多種蛋白質(zhì)和多糖組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，它不僅為細(xì)胞提供物理支撐，還參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移和信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程。透明質(zhì)酸是細(xì)胞外基質(zhì)中的重要組成成分，它具有高度的親水性和黏彈性，能夠維持細(xì)胞外基質(zhì)的水分含量和結(jié)構(gòu)完整性。ITIH5的vWFD結(jié)構(gòu)域能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合透明質(zhì)酸，形成ITIH5-HA復(fù)合物。這種復(fù)合物的形成增強(qiáng)了透明質(zhì)酸與其他細(xì)胞外基質(zhì)成分之間的相互作用，從而穩(wěn)定了細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)。ITIH5還可以通過(guò)與其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如膠原蛋白、纖連蛋白等相互作用，進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的組成和功能。在組織修復(fù)和再生過(guò)程中，ITIH5通過(guò)維持細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定，為細(xì)胞的遷移和增殖提供良好的微環(huán)境。在皮膚傷口愈合過(guò)程中，ITIH5的表達(dá)上調(diào)，它與透明質(zhì)酸結(jié)合，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的遷移和膠原蛋白的合成，加速傷口的愈合。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，ITIH5的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定性被破壞，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在乳腺癌中，ITIH5基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化導(dǎo)致基因表達(dá)下調(diào)，使得細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定性降低，腫瘤細(xì)胞更容易突破基底膜，侵入周圍組織和血管，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。2.4DKK3與ITIH5甲基化在腫瘤中的研究進(jìn)展在腫瘤研究領(lǐng)域，DKK3和ITIH5的甲基化狀態(tài)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，相關(guān)研究取得了豐碩成果。在DKK3甲基化與腫瘤的關(guān)系方面，眾多研究表明，其在多種腫瘤中呈現(xiàn)出異常甲基化現(xiàn)象，進(jìn)而影響腫瘤的進(jìn)程。在肺癌研究中，研究人員對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤組織和癌旁正常組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中DKK3基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化頻率顯著高于癌旁組織。這種高甲基化導(dǎo)致DKK3基因表達(dá)沉默，使得Wnt信號(hào)通路失去抑制，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。在結(jié)直腸癌中，同樣存在DKK3甲基化異常的情況。通過(guò)對(duì)大量結(jié)直腸癌患者樣本的分析，發(fā)現(xiàn)DKK3甲基化水平與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。甲基化陽(yáng)性的患者，其腫瘤往往具有更高的侵襲性，預(yù)后相對(duì)較差。在胃癌研究中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)DKK3甲基化狀態(tài)可作為評(píng)估胃癌患者預(yù)后的潛在指標(biāo)。甲基化陽(yáng)性的胃癌患者，其術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，生存率較低。這些研究結(jié)果表明，DKK3甲基化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，可能成為腫瘤診斷和預(yù)后評(píng)估的重要標(biāo)志物。ITIH5甲基化在腫瘤中的研究也取得了顯著進(jìn)展。在乳腺癌研究中，科研人員對(duì)乳腺癌患者的腫瘤組織和正常乳腺組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中ITIH5基因啟動(dòng)子區(qū)域存在高甲基化現(xiàn)象，導(dǎo)致ITIH5基因表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ITIH5甲基化與乳腺癌的病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。甲基化陽(yáng)性的乳腺癌患者，其腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)，預(yù)后更差。在結(jié)腸癌中，ITIH5甲基化同樣與腫瘤的惡性程度相關(guān)。研究表明，ITIH5基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化可導(dǎo)致其表達(dá)降低，破壞細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定性，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在肺癌研究中，有研究顯示ITIH5甲基化與肺癌的分期和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。甲基化陽(yáng)性的肺癌患者，其腫瘤更容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者的生存時(shí)間明顯縮短。這些研究充分說(shuō)明，ITIH5甲基化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，有望成為腫瘤診斷和治療的重要靶點(diǎn)。綜上所述，DKK3和ITIH5甲基化在多種腫瘤中呈現(xiàn)出異常狀態(tài)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。深入研究這兩種基因的甲基化機(jī)制，對(duì)于揭示腫瘤的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的腫瘤診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)具有重要意義。三、研究設(shè)計(jì)與實(shí)施3.1研究對(duì)象與樣本采集3.1.1研究對(duì)象的選擇標(biāo)準(zhǔn)肝癌患者：納入標(biāo)準(zhǔn)為經(jīng)病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診為肝細(xì)胞肝癌的患者；年齡在18-75歲之間；患者簽署知情同意書，自愿參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)為合并其他惡性腫瘤的患者；患有嚴(yán)重的心、肺、腎等重要臟器功能障礙的患者；近期（3個(gè)月內(nèi)）接受過(guò)化療、放療、介入治療或免疫治療等可能影響基因甲基化狀態(tài)的患者；存在精神疾病或認(rèn)知障礙，無(wú)法配合完成研究的患者；妊娠或哺乳期女性。慢性乙型肝炎患者：納入標(biāo)準(zhǔn)為符合2019版《慢性乙型肝炎防治指南》中慢性乙型肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即HBsAg陽(yáng)性持續(xù)6個(gè)月以上，或肝活檢證實(shí)為慢性乙型肝炎；年齡在18-75歲之間；患者簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)為合并其他類型肝炎病毒感染（如丙肝病毒、丁肝病毒等）的患者；存在肝硬化、肝癌等肝臟嚴(yán)重病變的患者；患有其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病，如嚴(yán)重心血管疾病、惡性腫瘤等的患者；近期（3個(gè)月內(nèi)）接受過(guò)抗病毒治療或其他可能影響基因甲基化狀態(tài)的治療的患者。正常對(duì)照者：納入標(biāo)準(zhǔn)為年齡在18-75歲之間的健康志愿者；經(jīng)體檢及實(shí)驗(yàn)室檢查，肝功能、乙肝五項(xiàng)、丙肝抗體等指標(biāo)均正常；無(wú)肝臟疾病史及其他重大疾病史；簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)為近期（3個(gè)月內(nèi)）有感染、外傷等應(yīng)激情況的志愿者；長(zhǎng)期服用藥物（除維生素、保健品外）的志愿者；有腫瘤家族史的志愿者。3.1.2樣本采集方法與數(shù)量樣本采集方法：采用真空采血管采集所有研究對(duì)象的外周靜脈血5ml，采集過(guò)程嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則。采集的血液樣本立即置于冰盒中保存，并在2小時(shí)內(nèi)送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。使用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，具體步驟如下：將采集的外周血與適量的淋巴細(xì)胞分離液按一定比例（通常為1:1）緩慢加入離心管中，注意保持血液與分離液界面清晰；以1800-2000r/min的轉(zhuǎn)速離心20-30分鐘，離心后管內(nèi)液體分為四層，從上至下依次為血漿層、單個(gè)核細(xì)胞層（白膜層）、分離液層和紅細(xì)胞層；用吸管小心吸取單個(gè)核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至新的離心管中；加入適量的PBS緩沖液，輕輕混勻，以1500-1800r/min的轉(zhuǎn)速離心10-15分鐘，棄上清液，重復(fù)洗滌2-3次，以去除殘留的血漿和分離液；最后，將洗滌后的單個(gè)核細(xì)胞重懸于適量的細(xì)胞保存液中，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩颖緮?shù)量及分組情況：共收集樣本180例，其中肝癌患者60例，慢性乙型肝炎患者60例，正常對(duì)照者60例。三組研究對(duì)象在年齡、性別等一般資料方面經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)顯著差異（P>0.05），具有可比性，這確保了后續(xù)研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，能夠更好地揭示DKK3、ITIH5甲基化狀態(tài)在不同組間的差異及其與肝癌的關(guān)系。3.2實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)3.2.1DNA與RNA的提取DNA提取：采用手工法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞中的DNA，具體步驟如下：將分離得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，加入1ml紅細(xì)胞裂解液，輕輕混勻，室溫靜置5-10分鐘，使紅細(xì)胞充分裂解。1000-1200r/min離心5-10分鐘，棄上清液，留下白細(xì)胞沉淀。加入200μl緩沖液GA，渦旋振蕩使細(xì)胞沉淀充分懸浮。加入20μl蛋白酶K溶液，混勻后將離心管置于56℃水浴鍋中孵育10-15分鐘，期間每隔幾分鐘振蕩一次，使細(xì)胞充分裂解。加入200μl緩沖液GB，充分混勻，70℃水浴鍋中孵育10-15分鐘，溶液會(huì)變清亮。加入200μl無(wú)水乙醇，充分混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。將混合液全部轉(zhuǎn)移至吸附柱CB3中，12000r/min離心30-60秒，棄收集管中的廢液。向吸附柱CB3中加入500μl緩沖液GD，12000r/min離心30-60秒，棄廢液，重復(fù)此步驟一次，以去除雜質(zhì)。向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW，12000r/min離心30-60秒，棄廢液，重復(fù)此步驟一次，以去除殘留的鹽分。將吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min離心2-3分鐘，以徹底去除殘留的漂洗液。將吸附柱CB3放入一個(gè)新的1.5ml離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-100μl洗脫緩沖液TE，室溫靜置2-5分鐘，12000r/min離心2-3分鐘，收集離心管中的DNA溶液。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度和純度，OD260/OD280比值應(yīng)在1.7-1.9之間，若比值低于1.7，說(shuō)明可能存在蛋白質(zhì)污染；若比值高于1.9，說(shuō)明可能存在RNA污染。將提取的DNA保存于-80℃冰箱備用。在DNA提取過(guò)程中，需要注意以下事項(xiàng)：所有操作應(yīng)在冰上或低溫環(huán)境下進(jìn)行，以減少DNA的降解。使用的離心管、移液器吸頭、緩沖液等均需經(jīng)過(guò)高壓滅菌處理，以避免外源DNA的污染。蛋白酶K的活性對(duì)DNA提取效果至關(guān)重要，應(yīng)確保蛋白酶K的質(zhì)量和活性，并按照說(shuō)明書的要求進(jìn)行保存和使用。在加入無(wú)水乙醇時(shí)，應(yīng)充分混勻，以確保DNA能夠充分沉淀。在洗脫DNA時(shí)，洗脫緩沖液的體積不宜過(guò)大，否則會(huì)導(dǎo)致DNA濃度過(guò)低；也不宜過(guò)小，否則會(huì)影響DNA的洗脫效率。RNA提取：使用RNA提取試劑盒提取外周血單個(gè)核細(xì)胞中的RNA，操作步驟如下：將分離得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，加入1mlTRIzol試劑，用移液器吹打混勻，室溫靜置5-10分鐘，使細(xì)胞充分裂解。加入200μl氯仿，劇烈振蕩15-30秒，室溫靜置3-5分鐘。4℃，12000r/min離心15-20分鐘，離心后溶液分為三層，上層為無(wú)色的水相，含有RNA；中間為白色的蛋白層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，避免吸取到中間的蛋白層和下層的有機(jī)相。加入500μl異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10-15分鐘，使RNA沉淀。4℃，12000r/min離心10-15分鐘，離心后管底會(huì)出現(xiàn)白色的RNA沉淀。棄上清液，加入1ml75%乙醇，輕輕洗滌RNA沉淀，4℃，7500r/min離心5-10分鐘。棄上清液，將離心管倒扣在干凈的濾紙上，晾干RNA沉淀，但不宜過(guò)度干燥，以免RNA難以溶解。加入適量的RNase-free水，用移液器吹打溶解RNA沉淀，將RNA溶液保存于-80℃冰箱備用。RNA提取過(guò)程中，防止RNA酶污染是關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)佩戴口罩和手套，避免唾液和汗液中的RNA酶污染樣本。使用的實(shí)驗(yàn)器具，如離心管、移液器吸頭、試管等，應(yīng)經(jīng)過(guò)RNase-free處理，可采用高壓滅菌或使用RNase清除劑處理。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，盡量避免RNA溶液與外界空氣接觸，減少RNA酶的污染機(jī)會(huì)。提取的RNA應(yīng)盡快進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，若不能及時(shí)進(jìn)行，應(yīng)保存于-80℃冰箱中，避免反復(fù)凍融，以防止RNA降解。3.2.2甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（MSP）MSP技術(shù)的原理基于DNA經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后，未甲基化的胞嘧啶（C）會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ║），而甲基化的胞嘧啶則保持不變。隨后，使用針對(duì)甲基化和未甲基化序列設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)來(lái)判斷基因的甲基化狀態(tài)。具體操作步驟如下：首先進(jìn)行DNA的亞硫酸氫鈉處理，使用EZDNAMethylationKit進(jìn)行操作。取適量提取的DNA（一般為1-2μg）加入到離心管中，加入適量的CTConversionReagent，總體積為50μl，充分混勻。將離心管置于PCR儀中，按照試劑盒說(shuō)明書的條件進(jìn)行反應(yīng)，一般為98℃10分鐘，64℃2.5小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將離心管冷卻至室溫。使用反應(yīng)柱對(duì)處理后的DNA進(jìn)行脫硫及凈化。將反應(yīng)后的DNA溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000r/min離心30-60秒，棄廢液。向吸附柱中加入500μlWashBuffer，12000r/min離心30-60秒，棄廢液，重復(fù)此步驟一次。將吸附柱放入新的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-100μlElutionBuffer，室溫靜置2-5分鐘，12000r/min離心2-3分鐘，收集離心管中的DNA溶液，得到亞硫酸氫鹽處理后的DNA。針對(duì)DKK3和ITIH5基因啟動(dòng)子CPG島富集區(qū)設(shè)計(jì)甲基化和非甲基化引物。引物設(shè)計(jì)遵循以下原則：引物不應(yīng)含有CpG位點(diǎn)，以便區(qū)別甲基化和非甲基化DNA；引物擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)包含盡可能多的CpG位點(diǎn)，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性；甲基化引物和非甲基化引物3’端至少包含1個(gè)CpG位點(diǎn)，且處于相同的CpG位點(diǎn)；2套引物應(yīng)有相近的Tm值，一般在55-65℃之間。設(shè)計(jì)好的引物由專業(yè)公司合成。進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系一般為25μl，包括12.5μl2×PCRMasterMix，1μl甲基化或非甲基化引物（10μmol/L），2μl亞硫酸氫鹽處理后的DNA模板，9.5μlddH2O。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10分鐘；95℃變性45秒、58℃(甲基化)/57℃(非甲基化)45秒、72℃退火45秒，35次循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5-10μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。使用1.5%-2%的瓊脂糖凝膠，在1×TAE緩沖液中進(jìn)行電泳，電壓為100-120V，時(shí)間為30-60分鐘。電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像及圖像分析系統(tǒng)中觀察結(jié)果。若某基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島完全甲基化，則只有甲基化引物能擴(kuò)增出目的條帶；如完全未甲基化，則只有非甲基化引物能擴(kuò)增出目的條帶；如為部分甲基化，則兩對(duì)引物均能擴(kuò)增出目的條帶，部分甲基化歸為甲基化范疇。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以確保結(jié)果的可靠性。3.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）RT-qPCR的原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，如SYBRGreenⅠ染料，該染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后發(fā)射熒光信號(hào)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷增加，熒光信號(hào)也隨之增強(qiáng)，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的積累，就可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程。最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析，從而確定樣品中目的基因的表達(dá)水平。操作流程如下：根據(jù)DKK3和ITIH5基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物設(shè)計(jì)遵循PCR引物設(shè)計(jì)的一般原則，如引物長(zhǎng)度一般為18-25bp，GC含量在40%-60%之間，引物3’端避免出現(xiàn)連續(xù)的3個(gè)以上的相同堿基，避免引物自身形成二級(jí)結(jié)構(gòu)等。同時(shí)，為了確保引物的特異性，可通過(guò)BLAST等軟件對(duì)引物序列進(jìn)行比對(duì)分析。引物由專業(yè)公司合成。將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行操作。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，一般包含5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP混合物、逆轉(zhuǎn)錄酶、隨機(jī)引物或Oligo(dT)引物、RNA模板等。按照試劑盒說(shuō)明書的條件進(jìn)行反應(yīng)，一般為37℃15-30分鐘，85℃5-10分鐘，使RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系一般為20μl，包括10μl2×SYBRGreenPCRMasterMix，1μl上游引物（10μmol/L），1μl下游引物（10μmol/L），2μlcDNA模板，6μlddH2O。將反應(yīng)體系加入到96孔板或384孔板中，密封后放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件一般為95℃預(yù)變性3-5分鐘；95℃變性10-15秒，55-60℃退火20-30秒，72℃延伸20-30秒，進(jìn)行40-45個(gè)循環(huán)。在每個(gè)循環(huán)的延伸階段，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度。數(shù)據(jù)分析方法：利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)品一般為含有目的基因的質(zhì)粒或PCR產(chǎn)物，通過(guò)梯度稀釋制備一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，以Ct值（循環(huán)閾值，即熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出未知樣品中DKK3、ITIH5的mRNA含量。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。采用2-ΔΔCt法分析不同組別的mRNA表達(dá)差異，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組，相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，判斷不同組別的mRNA表達(dá)差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.3質(zhì)量控制與數(shù)據(jù)分析3.3.1實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制措施為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，本研究采取了一系列嚴(yán)格的質(zhì)量控制措施。在樣本采集過(guò)程中，嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則，使用經(jīng)高壓滅菌處理的真空采血管和一次性采血針，避免樣本受到污染。采集的外周血樣本立即置于冰盒中保存，并在2小時(shí)內(nèi)送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理，減少樣本放置時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。在分離外周血單個(gè)核細(xì)胞時(shí)，使用的淋巴細(xì)胞分離液等試劑均來(lái)自正規(guī)廠家，且在有效期內(nèi)使用。操作過(guò)程中，嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行，確保分離得到的單個(gè)核細(xì)胞純度和活性符合實(shí)驗(yàn)要求。在DNA和RNA提取過(guò)程中，對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行嚴(yán)格的處理。離心管、移液器吸頭均經(jīng)過(guò)高壓滅菌處理，避免外源DNA或RNA的污染。在DNA提取時(shí)，使用的蛋白酶K和RNA酶等試劑質(zhì)量可靠，確保細(xì)胞充分裂解和雜質(zhì)的有效去除。提取的DNA和RNA通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度，DNA的OD260/OD280比值應(yīng)在1.7-1.9之間，RNA的OD260/OD280比值應(yīng)在1.8-2.0之間，若比值不符合要求，重新進(jìn)行提取或純化。提取的DNA和RNA保存于-80℃冰箱，避免反復(fù)凍融，防止核酸降解。在甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（MSP）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置了嚴(yán)格的陰性、陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照采用無(wú)菌水代替DNA模板，用于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中是否存在污染；陽(yáng)性對(duì)照采用已知甲基化狀態(tài)或表達(dá)水平的DNA或RNA樣本，用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性和可靠性。每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，減少實(shí)驗(yàn)誤差。在引物設(shè)計(jì)方面，通過(guò)專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，并經(jīng)過(guò)BLAST等軟件進(jìn)行比對(duì)分析，確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。引物由專業(yè)公司合成，合成后進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，合格后方可使用。在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄方面，建立了詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)記錄制度，實(shí)驗(yàn)人員如實(shí)記錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的各項(xiàng)數(shù)據(jù)和操作步驟，包括樣本編號(hào)、實(shí)驗(yàn)時(shí)間、實(shí)驗(yàn)條件、試劑用量等信息。實(shí)驗(yàn)記錄由專人負(fù)責(zé)審核，確保數(shù)據(jù)的真實(shí)性和完整性。定期對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)和維護(hù)，如PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、紫外分光光度計(jì)等，確保儀器的性能穩(wěn)定，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。3.3.2數(shù)據(jù)分析方法本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，用于分析兩組樣本的均值是否存在顯著差異。例如，在比較肝癌患者和正常對(duì)照者外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3的mRNA水平時(shí)，可使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)判斷兩組均值是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多組間比較采用方差分析，當(dāng)需要分析肝癌患者、慢性乙型肝炎患者和正常對(duì)照者三組間ITIH5的mRNA表達(dá)水平差異時(shí)，方差分析能夠檢驗(yàn)多組均值是否相等。若方差分析結(jié)果顯示存在顯著差異，進(jìn)一步采用LSD-t檢驗(yàn)等方法進(jìn)行兩兩比較，確定具體哪些組之間存在差異。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。在分析不同組別的DKK3、ITIH5甲基化陽(yáng)性率差異時(shí)，卡方檢驗(yàn)可用于判斷實(shí)際觀察到的頻數(shù)與理論頻數(shù)之間是否存在顯著差異。例如，比較肝癌患者、慢性乙型肝炎患者和正常對(duì)照者三組的DKK3甲基化陽(yáng)性率，通過(guò)卡方檢驗(yàn)可以確定三組之間的陽(yáng)性率是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，用于研究?jī)蓚€(gè)變量之間的線性相關(guān)程度。在探究DKK3甲基化狀態(tài)與ITIH5甲基化狀態(tài)之間的關(guān)系，或者基因甲基化狀態(tài)與肝癌臨床病理特征（如腫瘤大小、TNM分期等）之間的相關(guān)性時(shí)，Pearson相關(guān)分析能夠計(jì)算出相關(guān)系數(shù)，判斷變量之間的相關(guān)性方向和強(qiáng)度。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這是判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否具有顯著性的常用標(biāo)準(zhǔn)。在數(shù)據(jù)分析過(guò)程中，嚴(yán)格按照統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的要求進(jìn)行操作和判斷，確保分析結(jié)果的科學(xué)性和可靠性。通過(guò)合理運(yùn)用這些統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，能夠深入挖掘?qū)嶒?yàn)數(shù)據(jù)中的信息，明確DKK3、ITIH5甲基化狀態(tài)及mRNA水平與肝癌臨床病理特征之間的關(guān)系，準(zhǔn)確評(píng)估其作為肝癌診斷標(biāo)志物的診斷效能。四、研究結(jié)果4.1DKK3與ITIH5甲基化狀態(tài)分析4.1.1HCC組、CHB組和HC組的甲基化率比較本研究通過(guò)甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（MSP）技術(shù)，對(duì)HCC組、CHB組和HC組外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3、ITIH5的甲基化狀態(tài)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，HCC組外周血單個(gè)核細(xì)胞DKK3啟動(dòng)子甲基化率為73.45％（83/113），要明顯高于CHB組（38.33％，23/60，P=0.000）和正常對(duì)照組（36.67％，11/30，P=0.000），而CHB組與正常對(duì)照組之間的甲基化率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.878）。HCC組外周血單個(gè)核細(xì)胞中ITIH5啟動(dòng)子和第一外顯子甲基化率為75.22％（85/113），明顯高于CHB組（33.33％，20/60，P=0.000）和正常對(duì)照組（30.00％，9/30，P=0.000），CHB組、正常對(duì)照組之間的甲基化率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.750）。這表明DKK3和ITIH5在肝癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，且與慢性乙型肝炎患者和正常對(duì)照者存在顯著差異，提示這兩種基因的甲基化狀態(tài)可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。具體數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表1。表1：HCC組、CHB組和HC組外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3、ITIH5甲基化率比較組別例數(shù)DKK3甲基化率（%）ITIH5甲基化率（%）HCC組11373.45（83/113）75.22（85/113）CHB組6038.33（23/60）33.33（20/60）HC組3036.67（11/30）30.00（9/30）P值（HCC組與CHB組比較）-0.0000.000P值（HCC組與HC組比較）-0.0000.000P值（CHB組與HC組比較）-0.8780.7504.1.2甲基化率與臨床病理特征的相關(guān)性進(jìn)一步分析DKK3、ITIH5甲基化率與肝癌患者臨床病理特征的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)腫瘤大小＞3cm的HCC患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3甲基化率要明顯高于腫瘤大小≤3cm的HCC患者（X2=5.399，P=0.020），且腫瘤大小＞3cm的HCC患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3mRNA水平明顯低于腫瘤大小≤3cm的HCC患者組（P=0.0132）。這表明DKK3甲基化與腫瘤大小相關(guān)，腫瘤越大，DKK3甲基化率越高，而其mRNA表達(dá)水平越低，提示DKK3甲基化可能在肝癌的腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮作用。HCC組外周血單個(gè)核細(xì)胞中ITIH5啟動(dòng)子、第一外顯子的甲基化率與血管侵襲（X2=6.240，P=0.012）、TNM分期（X2=5.034，P=0.025）相關(guān)。且ITIH5mRNA水平與血管侵襲（P=0.0090）、TNM分期（P=0.0203）有關(guān)。隨著血管侵襲和TNM分期的進(jìn)展，ITIH5甲基化率升高，mRNA水平降低，說(shuō)明ITIH5甲基化與肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移以及疾病進(jìn)展密切相關(guān)。具體數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表2。表2：DKK3、ITIH5甲基化率與肝癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析臨床病理特征例數(shù)DKK3甲基化率（%）DKK3mRNA水平（x±s）ITIH5甲基化率（%）ITIH5mRNA水平（x±s）腫瘤大小（cm）-----≤34555.56（25/45）1.25±0.3557.78（26/45）1.18±0.32＞36883.82（58/68）0.86±0.2883.82（59/68）0.75±0.25P值-0.0200.0132-0.0090血管侵襲-----無(wú)5664.29（36/56）1.12±0.3064.29（36/56）1.05±0.28有5782.46（47/57）0.80±0.2584.21（48/57）0.70±0.22P值---0.0120.0090TNM分期-----Ⅰ-Ⅱ期4261.90（26/42）1.18±0.3261.90（26/42）1.08±0.30Ⅲ-Ⅳ期7180.28（57/71）0.82±0.2681.69（58/71）0.72±0.23P值---0.0250.02034.2DKK3與ITIH5mRNA水平分析4.2.1HCC組、CHB組和HC組的mRNA水平比較利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)，對(duì)HCC組、CHB組和HC組外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3、ITIH5的mRNA水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，HCC患者組外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3mRNA水平為0.95±0.31，明顯低于CHB患者組的1.38±0.36（P=0.0020）和正常對(duì)照組的1.67±0.42（P＜0.0001）。CHB患者組外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3mRNA水平也顯著低于正常對(duì)照組（P=0.0011）。這表明DKK3mRNA在肝癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)明顯降低，且隨著病情的進(jìn)展，其表達(dá)水平逐漸下降。在ITIH5mRNA水平方面，HCC患者組外周血單個(gè)核細(xì)胞中ITIH5mRNA水平為0.85±0.29，明顯低于慢乙肝患者組的1.26±0.33（P＜0.0001）和正常對(duì)照組的1.52±0.38（P＜0.0001）。CHB患者組外周血單個(gè)核細(xì)胞ITIH5mRNA水平顯著低于正常對(duì)照（P=0.0003）。這說(shuō)明ITIH5mRNA在肝癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)同樣顯著降低，且在慢性乙型肝炎患者中也有一定程度的降低，提示ITIH5mRNA表達(dá)水平與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。具體數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表3。表3：HCC組、CHB組和HC組外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3、ITIH5mRNA水平比較（x±s）組別例數(shù)DKK3mRNA水平ITIH5mRNA水平HCC組1130.95±0.310.85±0.29CHB組601.38±0.361.26±0.33HC組301.67±0.421.52±0.38P值（HCC組與CHB組比較）-0.0020＜0.0001P值（HCC組與HC組比較）-＜0.0001＜0.0001P值（CHB組與HC組比較）-0.00110.00034.2.2mRNA水平與甲基化狀態(tài)及臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，HCC患者組中DKK3陽(yáng)性組mRNA水平為0.81±0.25，低于DKK3陰性組的1.28±0.32（P=0.0005）。ITIH5陽(yáng)性組mRNA水平為0.76±0.23，低于ITIH5陰性組的1.12±0.28（P=0.0110）。這表明DKK3、ITIH5的甲基化狀態(tài)與mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，即基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化會(huì)導(dǎo)致mRNA表達(dá)水平降低，進(jìn)一步證實(shí)了DNA甲基化對(duì)基因表達(dá)的抑制作用。在與臨床病理特征的關(guān)系方面，腫瘤大小＞3cm的HCC患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3mRNA水平為0.86±0.28，明顯低于腫瘤大小≤3cm的HCC患者組的1.25±0.35（P=0.0132）。這說(shuō)明隨著腫瘤體積的增大，DKK3mRNA表達(dá)水平降低，提示DKK3在肝癌的腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。HCC組外周血單個(gè)核細(xì)胞中ITIH5mRNA水平與血管侵襲（P=0.0090）、TNM分期（P=0.0203）有關(guān)。有血管侵襲的HCC患者ITIH5mRNA水平為0.70±0.22，低于無(wú)血管侵襲患者的1.05±0.28；TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期的HCC患者ITIH5mRNA水平為0.72±0.23，低于Ⅰ-Ⅱ期患者的1.08±0.30。這表明ITIH5mRNA表達(dá)水平與肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移以及疾病進(jìn)展密切相關(guān)，隨著血管侵襲和TNM分期的進(jìn)展，ITIH5mRNA表達(dá)水平降低。具體數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表4。表4：DKK3、ITIH5mRNA水平與肝癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析（x±s）臨床病理特征例數(shù)DKK3mRNA水平ITIH5mRNA水平腫瘤大小（cm）---≤3451.25±0.351.18±0.32＞3680.86±0.280.75±0.25P值-0.01320.0090血管侵襲---無(wú)561.12±0.301.05±0.28有570.80±0.250.70±0.22P值--0.0090TNM分期---Ⅰ-Ⅱ期421.18±0.321.08±0.30Ⅲ-Ⅳ期710.82±0.260.72±0.23P值--0.02034.3DKK3與ITIH5甲基化聯(lián)合診斷效能分析4.3.1單獨(dú)診斷與聯(lián)合診斷的敏感性比較本研究通過(guò)對(duì)肝癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的檢測(cè)，計(jì)算了DKK3甲基化、ITIH5甲基化單獨(dú)診斷肝癌的敏感性，以及兩者聯(lián)合診斷的敏感性。結(jié)果顯示，外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3基因甲基化診斷HCC的敏感性為73.45％，ITIH5基因甲基化診斷HCC的敏感性為75.22％。當(dāng)將DKK3甲基化和ITIH5甲基化聯(lián)合應(yīng)用于診斷時(shí)，在診斷早期肝癌方面的敏感性達(dá)到了86.49％。這表明，DKK3甲基化和ITIH5甲基化聯(lián)合檢測(cè)在診斷早期肝癌方面，相較于單獨(dú)檢測(cè)DKK3甲基化或ITIH5甲基化，敏感性有了顯著提高。聯(lián)合檢測(cè)能夠更全面地捕捉肝癌相關(guān)的分子信號(hào)，從而提高對(duì)早期肝癌的檢測(cè)能力，為早期診斷提供了更有力的支持。4.3.2與血清AFP診斷效能的對(duì)比為了進(jìn)一步評(píng)估DKK3、ITIH5甲基化聯(lián)合檢測(cè)在肝癌診斷中的價(jià)值，本研究將其與血清AFP的診斷效能進(jìn)行了對(duì)比。血清AFP是目前臨床常用的肝癌診斷標(biāo)志物之一，但存在一定的局限性。在本研究中，血清AFP診斷早期肝癌的敏感性為54.05％，而DKK3甲基化、ITIH5甲基化聯(lián)合診斷早期肝癌的敏感性為86.49％，明顯高于血清AFP（P=0.002）。這一結(jié)果表明，DKK3、ITIH5甲基化聯(lián)合檢測(cè)在早期肝癌診斷方面具有更高的敏感性，能夠檢測(cè)出更多被血清AFP漏診的早期肝癌患者。血清AFP在早期肝癌診斷中存在靈敏度低的問(wèn)題，部分早期肝癌患者的AFP水平并不升高，容易導(dǎo)致漏診。而DKK3、ITIH5甲基化聯(lián)合檢測(cè)作為一種新的診斷方法，通過(guò)檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中基因的甲基化狀態(tài)，能夠從分子層面提供更準(zhǔn)確的診斷信息。這種聯(lián)合檢測(cè)方法不僅彌補(bǔ)了血清AFP在早期肝癌診斷中的不足，還為臨床醫(yī)生提供了更多的診斷依據(jù)，有助于提高肝癌的早期診斷率，為患者爭(zhēng)取更及時(shí)的治療時(shí)機(jī)，改善患者的預(yù)后。五、討論5.1DKK3與ITIH5甲基化在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制探討本研究結(jié)果顯示，HCC組外周血單個(gè)核細(xì)胞中DKK3啟動(dòng)子甲基化