CXCL2調控SMMC-7721肝癌細胞功能機制及靶向干預研究一、引言1.1研究背景肝癌是一種嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，在全球范圍內發病率和死亡率均居高不下。其起病隱匿，多數患者確診時已處于中晚期，錯過了最佳手術時機，導致整體預后較差，5年生存率較低，給患者家庭和社會帶來沉重負擔。中國是肝癌高發國家，由于乙肝病毒感染率較高、不良生活飲食習慣以及環境污染等因素的影響，肝癌的防治形勢更為嚴峻。深入研究肝癌的發病機制，尋找有效的診斷和治療靶點，對于改善肝癌患者的預后具有重要意義。SMMC-7721細胞是一種常用的人肝癌細胞系，源自人肝臟癌組織，具有典型的肝癌細胞生物學特性。它在肝癌研究領域應用廣泛，被大量用于細胞毒性實驗、抗腫瘤藥物篩選、肝癌發病機制探討以及信號通路研究等方面，為深入了解肝癌的生物學行為和開發新的治療策略提供了重要的實驗模型。通過對SMMC-7721細胞的研究，科研人員已經取得了一系列有價值的成果，如發現了一些與肝癌細胞增殖、凋亡、侵襲和轉移相關的關鍵分子和信號通路，為肝癌的精準治療奠定了理論基礎。趨化因子（CXCchemokineligand2，CXCL2）作為一種重要的細胞因子，在腫瘤的發生發展過程中發揮著復雜而多樣的作用。CXCL2屬于CXC趨化因子家族，主要通過與相應受體CXCR2結合，激活下游信號通路，調控細胞的遷移、增殖、存活以及血管生成等生物學過程。越來越多的研究表明，CXCL2在多種腫瘤組織中呈現異常表達，且其表達水平與腫瘤的惡性程度、轉移潛能以及患者預后密切相關。在肝癌中，CXCL2的異常表達不僅能夠促進肝癌細胞的增殖和遷移，還可通過招募免疫細胞、調節腫瘤微環境等方式，為腫瘤的生長和轉移創造有利條件。因此，深入研究CXCL2對SMMC-7721肝癌細胞生物學功能的影響，有望揭示肝癌發生發展的新機制，為肝癌的臨床診斷、治療和預后評估提供新的靶點和思路。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究CXCL2對SMMC-7721肝癌細胞生物學功能的影響及其潛在分子機制。具體而言，通過一系列體外實驗，明確CXCL2對SMMC-7721肝癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的作用；利用分子生物學技術，揭示CXCL2調控這些生物學功能所涉及的關鍵信號通路和分子靶點；進一步探討CXCL2在肝癌微環境中的作用，以及其與免疫細胞的相互作用機制，為肝癌的免疫治療提供新的理論依據。肝癌作為一種高度惡性的腫瘤，目前的治療手段仍存在諸多局限性，患者的總體預后仍然不理想。深入了解肝癌細胞的生物學特性以及腫瘤發生發展的分子機制，對于開發新型、有效的治療策略至關重要。本研究聚焦于CXCL2對SMMC-7721肝癌細胞生物學功能的影響，具有重要的理論意義和臨床應用價值。從理論層面來看，本研究有助于進一步揭示CXCL2在肝癌發生發展過程中的復雜調控網絡，豐富人們對肝癌發病機制的認識，為肝癌的基礎研究提供新的思路和方向。在臨床應用方面，若能明確CXCL2在肝癌細胞中的關鍵作用及相關機制，有望將其作為潛在的生物標志物，用于肝癌的早期診斷和病情監測，提高診斷的準確性和及時性；同時，以CXCL2及其相關信號通路為靶點，開發特異性的靶向治療藥物，為肝癌患者提供更精準、有效的治療方案，改善患者的預后和生活質量，具有顯著的臨床應用潛力。1.3研究現狀近年來，CXCL2在腫瘤領域的研究備受關注。大量研究表明，CXCL2在多種腫瘤如乳腺癌、肺癌、結直腸癌等中表達異常，且與腫瘤的發生、發展密切相關。在乳腺癌中，CXCL2可通過激活PI3K/Akt和MAPK信號通路，促進癌細胞的增殖和遷移，還能招募腫瘤相關巨噬細胞，營造有利于腫瘤生長的微環境。在肺癌中，CXCL2高表達與腫瘤的淋巴結轉移和不良預后顯著相關，其通過誘導上皮-間質轉化過程，增強肺癌細胞的侵襲能力。在結直腸癌中，CXCL2不僅促進腫瘤細胞的增殖和遷移，還能調節腫瘤血管生成，為腫瘤的生長提供充足的營養供應。在肝癌研究中，CXCL2同樣被發現參與了肝癌的多個生物學過程。研究顯示，肝癌組織中CXCL2的表達水平明顯高于正常肝組織，且其高表達與肝癌患者的腫瘤大小、TNM分期、血管侵犯以及不良預后密切相關。CXCL2可通過與肝癌細胞表面的受體CXCR2結合，激活下游的NF-κB、MAPK等信號通路，促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。此外，CXCL2還能招募免疫細胞如中性粒細胞、單核細胞等至腫瘤微環境，這些免疫細胞分泌的細胞因子和趨化因子可進一步促進腫瘤的生長和轉移，同時抑制機體的抗腫瘤免疫反應。SMMC-7721細胞作為常用的肝癌細胞系，已被廣泛應用于肝癌相關研究。眾多學者利用該細胞系對肝癌的發病機制、藥物敏感性以及基因功能等方面展開了深入探索。例如，研究發現某些中藥提取物如黃連素、姜黃素等能夠抑制SMMC-7721細胞的增殖并誘導其凋亡，其作用機制與調節細胞周期相關蛋白、凋亡相關蛋白以及影響信號通路有關；在基因功能研究方面，通過RNA干擾技術沉默某些致癌基因如c-Myc、K-Ras等在SMMC-7721細胞中的表達，可顯著抑制細胞的增殖、遷移和侵襲能力，揭示了這些基因在肝癌發生發展中的關鍵作用。然而，當前對于CXCL2對SMMC-7721肝癌細胞生物學功能影響的研究仍存在一定的局限性。一方面，雖然已知CXCL2在肝癌中表達異常且參與多個生物學過程，但具體到SMMC-7721細胞，CXCL2對其生物學功能的影響尚未完全明確，尤其是在細胞自噬、腫瘤干細胞特性維持等方面的作用機制研究較少。另一方面，CXCL2在肝癌微環境中與其他細胞成分如免疫細胞、肝星狀細胞等的相互作用機制尚未完全闡明，這限制了我們對肝癌復雜病理過程的全面理解。此外，目前針對CXCL2及其相關信號通路的靶向治療研究還處于起步階段，在SMMC-7721細胞模型中驗證新型靶向藥物的療效和安全性的研究相對匱乏，距離臨床應用仍有較大差距。二、CXCL2與SMMC-7721肝癌細胞概述2.1CXCL2的結構與功能2.1.1CXCL2的分子結構CXCL2基因位于人類4號染色體上的CXC趨化因子簇中，其編碼的蛋白質由99個氨基酸組成，相對分子質量約為10kDa。從蛋白質結構來看，CXCL2屬于CXC趨化因子家族，具有典型的CXC趨化因子結構特征。其N端含有一個由3個氨基酸組成的ELR（Glu-Leu-Arg）基序，這一基序在CXCL2與受體CXCR2的結合以及后續生物學功能的發揮中起著關鍵作用。研究表明，ELR基序中的精氨酸殘基對于CXCL2與CXCR2的高親和力結合至關重要，突變該精氨酸會顯著降低CXCL2對CXCR2的激活能力，進而影響其下游信號傳導。CXCL2蛋白還包含4個保守的半胱氨酸殘基，它們通過形成兩對二硫鍵來維持蛋白質的穩定三級結構。其中，Cys32與Cys56之間、Cys46與Cys94之間形成的二硫鍵，對于CXCL2的正確折疊和生物學活性的維持具有重要意義。這種特定的二硫鍵結構不僅決定了CXCL2的空間構象，還影響其與受體及其他相關分子的相互作用。通過對CXCL2晶體結構的解析發現，其分子呈現出一種緊湊的三維結構，N端的ELR基序位于分子表面的特定區域，便于與受體CXCR2結合，而C端區域則參與形成一些與分子間相互作用相關的位點，這為CXCL2在體內發揮復雜的生物學功能奠定了結構基礎。此外，CXCL2的氨基酸序列與同家族的CXCL1具有高度同源性，二者氨基酸序列相似度達到90%，盡管如此，它們在生物學功能上仍存在一些差異，這種差異可能源于氨基酸序列的細微變化以及蛋白質空間結構的微妙不同。2.1.2CXCL2在生理與病理狀態下的作用在生理狀態下，CXCL2主要由活化的單核細胞、中性粒細胞等免疫細胞產生，在炎癥反應和組織修復過程中發揮重要作用。CXCL2作為一種有效的中性粒細胞趨化因子，能夠引導中性粒細胞向炎癥部位遷移。當機體受到病原體感染或組織損傷時，局部細胞會釋放CXCL2，其與中性粒細胞表面的CXCR2結合，激活下游的磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號通路，促使中性粒細胞發生極化、變形，并沿著CXCL2的濃度梯度向炎癥區域遷移，從而啟動機體的固有免疫防御機制，清除病原體和損傷組織碎片，促進炎癥的消退和組織修復。研究發現在皮膚傷口愈合過程中，角質形成細胞、成纖維細胞等會分泌CXCL2，招募中性粒細胞到傷口部位，這些中性粒細胞不僅能夠吞噬細菌等病原體，還能釋放多種細胞因子和蛋白酶，調節傷口微環境，促進成纖維細胞增殖和膠原蛋白合成，加速傷口愈合進程。在腫瘤等病理狀態下，CXCL2的作用則更為復雜。在腫瘤發生發展過程中，CXCL2的表達常常異常升高，且與腫瘤的惡性程度、轉移潛能密切相關。一方面，CXCL2可通過與腫瘤細胞表面的CXCR2結合，直接促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。在乳腺癌細胞系中，外源性添加CXCL2能夠顯著促進細胞的增殖和遷移能力，而使用CXCR2拮抗劑阻斷二者結合后，細胞的增殖和遷移受到明顯抑制，這表明CXCL2-CXCR2軸在乳腺癌細胞的惡性行為中發揮著重要作用。另一方面，CXCL2還可通過調節腫瘤微環境間接影響腫瘤的生長和轉移。CXCL2能夠招募免疫抑制細胞如髓源性抑制細胞（MDSCs）、腫瘤相關巨噬細胞（TAM）等至腫瘤微環境，這些免疫抑制細胞分泌大量的免疫抑制因子，如白細胞介素-10（IL-10）、轉化生長因子-β（TGF-β）等，抑制機體的抗腫瘤免疫反應，為腫瘤細胞的生長和轉移創造有利條件。此外，CXCL2還參與腫瘤血管生成過程，通過與血管內皮細胞表面的CXCR2結合，促進血管內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，為腫瘤組織提供充足的營養供應，支持腫瘤的生長和轉移。在肝癌中，高水平的CXCL2與腫瘤的血管侵犯、遠處轉移以及不良預后顯著相關，提示CXCL2在肝癌的惡性進展中扮演著重要角色。2.2SMMC-7721肝癌細胞的特性與生物學功能2.2.1SMMC-7721肝癌細胞的來源與基本特性SMMC-7721細胞系源自一位男性肝癌患者的肝臟癌組織。1977年，中國科學院上海細胞生物學研究所的科研人員通過對該患者手術切除的肝癌組織進行原代培養，成功建立了SMMC-7721細胞系，此后該細胞系被廣泛應用于肝癌相關的研究領域。在顯微鏡下觀察，SMMC-7721細胞呈現典型的上皮細胞樣形態，細胞呈多邊形或梭形，邊界清晰，細胞間連接緊密，貼壁生長。細胞體積較大，細胞核明顯，核質比高，染色質豐富，具有典型的癌細胞形態特征。在生長特性方面，SMMC-7721細胞具有較強的增殖能力，在適宜的培養條件下，其倍增時間約為24-36小時。該細胞具有貼壁依賴性，需要附著在合適的培養器皿表面才能生長和增殖，當細胞生長達到80%-90%匯合度時，需及時進行傳代培養，以維持細胞的良好生長狀態。SMMC-7721細胞的培養通常采用含有10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco'sModifiedEagleMedium（DMEM）培養基，以提供細胞生長所需的營養物質和生長因子。此外，培養基中還需添加青霉素（100U/mL）和鏈霉素（100μg/mL），以防止細菌污染，為細胞生長營造無菌環境。培養條件為37℃、5%CO?的恒溫培養箱，在此條件下，CO?可維持培養基的pH值在7.2-7.4之間，為細胞生長提供適宜的酸堿環境。在細胞傳代過程中，當細胞生長至對數生長期，且匯合度達到80%-90%時，需用0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化液進行消化處理，使細胞從培養器皿表面脫離，然后按照合適的比例（如1:2或1:3）進行傳代培養，以保證細胞的持續生長和活性。若需長期保存SMMC-7721細胞，則需將細胞用含有10%二甲基亞砜（DMSO）和90%胎牛血清的凍存液重懸后，置于-80℃冰箱預凍24小時，隨后轉移至液氮中進行長期保存，這樣可有效保持細胞的生物學特性和活性，以便后續實驗使用。2.2.2SMMC-7721肝癌細胞的生物學功能SMMC-7721肝癌細胞具有顯著的增殖能力，這是其惡性生物學行為的重要表現之一。在細胞增殖過程中，SMMC-7721細胞通過一系列復雜的細胞周期調控機制，不斷進行DNA復制和細胞分裂。研究表明，SMMC-7721細胞的增殖受到多種基因和信號通路的調控。例如，原癌基因c-Myc在SMMC-7721細胞中高表達，它能夠促進細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達，進而推動細胞從G1期進入S期，加速細胞增殖。PI3K/Akt信號通路在SMMC-7721細胞的增殖中也發揮著關鍵作用，該信號通路被激活后，可通過磷酸化下游的多種底物，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，促進蛋白質合成和細胞生長，增強細胞的增殖能力。當使用PI3K抑制劑LY294002處理SMMC-7721細胞時，細胞的增殖受到明顯抑制，表明PI3K/Akt信號通路對SMMC-7721細胞增殖的重要性。遷移和侵襲能力是SMMC-7721肝癌細胞惡性程度的重要指標，也是導致腫瘤轉移的關鍵因素。SMMC-7721細胞能夠通過偽足的伸展和收縮，實現細胞在細胞外基質中的遷移運動。在侵襲過程中，細胞會分泌多種蛋白酶，如基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質金屬蛋白酶-9（MMP-9），這些蛋白酶能夠降解細胞外基質中的膠原蛋白、層粘連蛋白等成分，為細胞的侵襲開辟通道。研究發現，在SMMC-7721細胞中，上皮-間質轉化（EMT）過程參與了細胞遷移和侵襲能力的調控。當細胞發生EMT時，上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達下調，而間質細胞標志物如波形蛋白（Vimentin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）等表達上調，細胞的形態和極性發生改變，從而獲得更強的遷移和侵襲能力。TGF-β信號通路在SMMC-7721細胞的EMT過程中起重要作用，外源性添加TGF-β能夠誘導SMMC-7721細胞發生EMT，增加細胞的遷移和侵襲能力，而使用TGF-β受體拮抗劑則可抑制這一過程，降低細胞的遷移和侵襲能力。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡方式，對于維持細胞內環境穩定和組織正常發育具有重要意義。在SMMC-7721肝癌細胞中，凋亡機制受到多種因素的調控。Bcl-2家族蛋白在SMMC-7721細胞凋亡調控中起著關鍵作用，其中抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL在SMMC-7721細胞中高表達，它們能夠抑制線粒體膜電位的下降，阻止細胞色素C的釋放，從而抑制細胞凋亡的發生；而促凋亡蛋白Bax和Bak則可促進線粒體膜通透性改變，釋放細胞色素C，激活caspase級聯反應，誘導細胞凋亡。caspase家族蛋白酶是細胞凋亡的執行者，在SMMC-7721細胞凋亡過程中，caspase-3、caspase-8和caspase-9等被激活，它們通過切割細胞內的多種底物，如多聚ADP核糖聚合酶（PARP）等，導致細胞凋亡形態學和生化特征的出現。一些化療藥物如順鉑、阿霉素等能夠誘導SMMC-7721細胞凋亡，其作用機制與上調促凋亡蛋白表達、下調抗凋亡蛋白表達以及激活caspase家族蛋白酶有關。三、研究材料與方法3.1實驗材料3.1.1細胞株人肝癌細胞株SMMC-7721購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，該細胞株具有典型的肝癌細胞生物學特性，如高增殖活性、較強的遷移和侵襲能力等，已被廣泛應用于肝癌相關研究領域，為探究肝癌的發病機制、藥物作用靶點以及腫瘤細胞生物學功能提供了重要的實驗模型。細胞培養于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（Solarbio公司，中國）的高糖Dulbecco'sModifiedEagleMedium（DMEM，Hyclone公司，美國）培養基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養箱（ThermoFisherScientific公司，美國）中培養，當細胞生長至80%-90%匯合度時，用0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA，Solarbio公司，中國）消化液進行消化傳代，以維持細胞的良好生長狀態。3.1.2主要試劑CXCL2重組蛋白（R&DSystems公司，美國），其純度經高效液相色譜（HPLC）檢測大于95%，內毒素含量低于1EU/μg，可用于細胞培養實驗中刺激細胞，以研究CXCL2對細胞生物學功能的影響。CXCR2拮抗劑SB225002（SelleckChemicals公司，美國），純度大于98%，通過與CXCR2特異性結合，阻斷CXCL2與CXCR2的相互作用，從而研究CXCL2-CXCR2信號通路在細胞中的作用機制。CCK-8試劑盒（Dojindo公司，日本），基于WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細胞內的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲臜產物的原理，用于檢測細胞增殖活性，其檢測靈敏度高、操作簡便，結果重復性好。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（BDBiosciences公司，美國），利用AnnexinV對磷脂酰絲氨酸（PS）的高度親和力，以及碘化丙啶（PI）不能透過活細胞膜但能透過凋亡中晚期細胞和壞死細胞的細胞膜的特性，通過流式細胞術區分活細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞，準確檢測細胞凋亡情況。Transwell小室（Corning公司，美國），由聚碳酸酯膜制成，孔徑為8.0μm，用于細胞遷移和侵襲實驗，可有效模擬體內細胞外基質環境，研究細胞在不同條件下的遷移和侵襲能力?；|膠Matrigel（Corning公司，美國），主要成分為層粘連蛋白、Ⅳ型膠原蛋白、巢蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等，在室溫下可形成類似于體內細胞外基質的凝膠狀結構，用于細胞侵襲實驗中包被Transwell小室的上室，為細胞侵襲提供模擬的細胞外基質環境。蛋白提取試劑盒（ThermoFisherScientific公司，美國），采用溫和的裂解緩沖液，能夠有效裂解細胞，同時保持蛋白質的完整性和活性，用于提取細胞總蛋白，以便后續進行蛋白質免疫印跡（Westernblotting）等實驗。兔抗人CXCL2多克隆抗體（Abcam公司，英國）、兔抗人CXCR2多克隆抗體（CellSignalingTechnology公司，美國）、兔抗人p-Akt、Akt、p-ERK、ERK、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3、GAPDH單克隆抗體（CellSignalingTechnology公司，美國）等一抗，以及相應的HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（JacksonImmunoResearchLaboratories公司，美國），這些抗體均經過嚴格的驗證和質量控制，具有高特異性和高親和力，可用于Westernblotting實驗中檢測目的蛋白的表達水平，通過與目的蛋白特異性結合，經化學發光底物顯色后，在X射線膠片或化學發光成像儀上呈現出特異性條帶，從而對目的蛋白進行定性和定量分析。3.1.3主要儀器CO?培養箱（ThermoFisherScientific公司，美國），型號為ThermoScientificHeracellVIOS160i，可精確控制溫度在37±0.1℃，CO?濃度在5±0.1%，為細胞培養提供穩定的環境條件，確保細胞的正常生長和代謝。超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司，中國），型號為SW-CJ-2FD，通過高效空氣過濾器（HEPA）過濾空氣，去除空氣中的塵埃、微生物等污染物，提供無菌的操作環境，防止細胞培養過程中的污染。倒置顯微鏡（Olympus公司，日本），型號為IX73，配備高分辨率物鏡和CCD相機，可對細胞進行實時觀察和拍照，用于監測細胞的生長狀態、形態變化等，其放大倍數范圍為40×-1000×，滿足不同實驗需求。酶標儀（Bio-Tek公司，美國），型號為Epoch2，可進行多種檢測模式，如吸光度檢測、熒光檢測等，用于CCK-8實驗中檢測細胞增殖活性時，讀取450nm波長處的吸光值，具有高精度、快速檢測的特點，結果準確可靠。流式細胞儀（BDBiosciences公司，美國），型號為FACSCalibur，可對細胞進行多參數分析，如細胞大小、粒度、熒光強度等，在細胞凋亡檢測實驗中，能夠快速、準確地分析細胞凋亡率和細胞周期分布，為研究細胞生物學功能提供重要數據支持。電泳儀（Bio-Rad公司，美國），型號為PowerPacBasic，可提供穩定的電壓和電流，用于蛋白質凝膠電泳，將蛋白質樣品根據其分子量大小在聚丙烯酰胺凝膠中進行分離，為Westernblotting實驗的后續步驟奠定基礎。轉膜儀（Bio-Rad公司，美國），型號為Trans-BlotTurboTransferSystem，能夠高效地將凝膠中的蛋白質轉移至硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，轉移效率高、時間短，確保蛋白質的完整性和活性不受影響?；瘜W發光成像儀（Bio-Rad公司，美國），型號為ChemiDocMP，可對Westernblotting實驗中的化學發光信號進行高靈敏度檢測和成像，通過數字化處理，可對目的蛋白條帶進行定量分析，結果直觀、準確，便于數據的統計和分析。3.2實驗方法3.2.1細胞培養與處理將人肝癌細胞株SMMC-7721從液氮中取出，迅速置于37℃水浴鍋中解凍，期間不斷輕輕搖晃凍存管，使細胞懸液快速融化。待凍存管內液體完全融化后，將細胞懸液轉移至含有適量完全培養基（含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養基）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，以去除凍存液中的DMSO等成分。然后用適量完全培養基重懸細胞，將細胞接種于細胞培養瓶中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養箱中培養。每隔2-3天更換一次培養基，當細胞生長至80%-90%匯合度時，進行傳代培養。傳代時，先吸去培養瓶中的舊培養基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2-3次，以去除殘留的培養基和雜質。然后加入適量0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，將培養瓶置于倒置顯微鏡下觀察，當細胞開始變圓、間隙增大時，立即加入含有血清的完全培養基終止消化。用吸管輕輕吹打細胞，使細胞從培養瓶壁上脫離下來，形成單細胞懸液。將細胞懸液轉移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，再用適量完全培養基重懸細胞，并按照1:2或1:3的比例將細胞接種到新的培養瓶中繼續培養。若需凍存細胞，當細胞生長至對數生長期時，按照上述傳代方法將細胞消化并離心收集，用含有10%DMSO和90%胎牛血清的凍存液重懸細胞，使細胞濃度為1×10?-5×10?cells/mL。將細胞懸液分裝入凍存管中，每管1-1.5mL，然后將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80℃冰箱預凍24小時，隨后轉移至液氮中進行長期保存。為研究CXCL2對SMMC-7721肝癌細胞生物學功能的影響，將處于對數生長期的SMMC-7721細胞接種于6孔板中，每孔接種2×10?個細胞，待細胞貼壁生長24小時后，將細胞分為對照組、CXCL2處理組。對照組加入不含CXCL2的完全培養基，CXCL2處理組加入終濃度為50ng/mL的CXCL2重組蛋白的完全培養基，每組設置3個復孔。分別在處理后0、24、48、72小時收集細胞，用于后續各項檢測指標的分析，以研究CXCL2對細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學功能的影響。在部分實驗中，為進一步探究CXCL2作用的信號通路機制，設置了CXCL2+CXCR2拮抗劑組，即在加入CXCL2重組蛋白（終濃度50ng/mL）前30分鐘，先加入CXCR2拮抗劑SB225002（終濃度10μmol/L），孵育30分鐘后再加入CXCL2，后續處理同CXCL2處理組，通過對比該組與CXCL2處理組的實驗結果，分析CXCL2-CXCR2信號通路在細胞生物學功能調控中的作用。3.2.2檢測指標與方法細胞增殖能力檢測采用CCK-8法。將不同處理組的SMMC-7721細胞接種于96孔板中，每孔接種5×103個細胞，每組設置5個復孔。分別在接種后0、24、48、72小時，向每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續在培養箱中孵育1-4小時。孵育結束后，使用酶標儀在450nm波長處檢測各孔的吸光值，根據吸光值大小反映細胞增殖活性。吸光值越高，表明細胞增殖能力越強。EdU法用于檢測細胞的DNA合成情況，從而反映細胞的增殖活性。將不同處理組的細胞接種于24孔板中，每孔接種1×10?個細胞，待細胞貼壁生長后，按照EdU試劑盒說明書進行操作。首先，向培養基中加入EdU溶液，使其終濃度為50μmol/L，孵育2小時，使正在進行DNA合成的細胞摻入EdU。然后，吸去培養基，用PBS緩沖液沖洗細胞3次，每次5分鐘。接著，加入4%多聚甲醛固定液，室溫固定細胞30分鐘。固定結束后，吸去固定液，用PBS緩沖液沖洗細胞3次，每次5分鐘。隨后，加入2mg/mL甘氨酸溶液，室溫孵育5分鐘，以終止固定反應。再用PBS緩沖液沖洗細胞3次，每次5分鐘。加入0.5%TritonX-100破膜液，室溫孵育10分鐘，使細胞膜通透。吸去破膜液，用PBS緩沖液沖洗細胞3次，每次5分鐘。加入1×Apollo染色反應液，室溫避光孵育30分鐘，使Apollo染料與摻入DNA的EdU結合。孵育結束后，用PBS緩沖液沖洗細胞3次，每次5分鐘。最后，加入1μg/mLHoechst33342染液，室溫避光孵育30分鐘，對細胞核進行染色。染色完成后，用PBS緩沖液沖洗細胞3次，每次5分鐘。在熒光顯微鏡下觀察，藍色熒光為細胞核，紅色熒光為摻入EdU的DNA，通過計算紅色熒光細胞數與藍色熒光細胞數的比值，可得到細胞的增殖率，比值越高，表明細胞增殖能力越強。細胞遷移和侵襲能力分別采用Transwell小室遷移實驗和Transwell小室侵襲實驗進行檢測。遷移實驗中，將Transwell小室（8.0μm孔徑）置于24孔板中，在上室加入200μL不含血清的DMEM培養基，下室加入600μL含20%胎牛血清的DMEM培養基，形成趨化梯度。將不同處理組的細胞用胰蛋白酶消化后，用不含血清的DMEM培養基重懸，調整細胞濃度為1×10?cells/mL，取200μL細胞懸液加入Transwell小室的上室，每組設置3個復孔。將24孔板置于37℃、5%CO?的培養箱中孵育24小時。孵育結束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞，然后將小室浸入4%多聚甲醛固定液中，固定15分鐘。固定結束后，用PBS緩沖液沖洗小室3次，每次5分鐘。將小室浸入0.1%結晶紫染液中，室溫染色15分鐘。染色完成后，用PBS緩沖液沖洗小室3次，每次5分鐘。在倒置顯微鏡下隨機選取5個視野，計數穿過小室膜的細胞數，以此評估細胞的遷移能力，穿過的細胞數越多，表明細胞遷移能力越強。侵襲實驗與遷移實驗類似，不同之處在于Transwell小室的上室預先用Matrigel基質膠進行包被。將Matrigel基質膠在4℃冰箱中融化后，按照1:8的比例用無血清DMEM培養基稀釋，取50μL稀釋后的Matrigel基質膠加入Transwell小室的上室，均勻鋪在小室膜表面，置于37℃培養箱中孵育4-6小時，使Matrigel基質膠凝固形成類似細胞外基質的膜結構。后續實驗步驟與遷移實驗相同，通過計數穿過Matrigel基質膠膜的細胞數來評估細胞的侵襲能力，穿過的細胞數越多，表明細胞侵襲能力越強。采用流式細胞術檢測細胞凋亡情況。將不同處理組的細胞用胰蛋白酶消化后，收集至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用PBS緩沖液沖洗細胞2次，每次1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，加入500μLBindingBuffer重懸細胞，然后依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染液，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。孵育結束后，在1小時內用流式細胞儀進行檢測，通過分析AnnexinV-FITC和PI雙染的結果，將細胞分為活細胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細胞（AnnexinV?/PI?），計算早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞之和占總細胞數的比例，即細胞凋亡率，凋亡率越高，表明細胞凋亡越明顯。細胞周期分析同樣采用流式細胞術。將不同處理組的細胞用胰蛋白酶消化后，收集至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用PBS緩沖液沖洗細胞2次，每次1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入預冷的70%乙醇，4℃固定過夜。固定結束后，1000rpm離心5分鐘，棄去乙醇，用PBS緩沖液沖洗細胞2次，每次1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入500μL含有50μg/mLPI和100μg/mLRNaseA的染色液，37℃避光孵育30分鐘。孵育結束后，用流式細胞儀檢測，通過分析細胞DNA含量的分布，確定細胞處于G1期、S期和G2/M期的比例，從而了解細胞周期的分布情況，判斷細胞增殖和生長狀態的變化。蛋白質免疫印跡（Westernblotting）用于檢測相關蛋白的表達水平。將不同處理組的細胞用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）在冰上裂解30分鐘，期間不斷輕輕搖晃離心管，使細胞充分裂解。然后12000rpm、4℃離心15分鐘，取上清液作為細胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS凝膠電泳，根據目的蛋白分子量大小選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠，在恒壓條件下進行電泳，使蛋白樣品按分子量大小在凝膠中分離。電泳結束后，將凝膠中的蛋白轉移至硝酸纖維素膜（NC膜）或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，采用半干轉或濕轉法進行轉膜，轉膜條件根據膜的類型和目的蛋白分子量進行優化。轉膜結束后，將膜置于5%脫脂奶粉或5%BSA封閉液中，室溫封閉1-2小時，以封閉膜上的非特異性結合位點。封閉結束后，用TBST緩沖液沖洗膜3次，每次10分鐘。加入適當稀釋的一抗（如兔抗人CXCL2、CXCR2、p-Akt、Akt、p-ERK、ERK、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3、GAPDH等），4℃孵育過夜。孵育結束后，用TBST緩沖液沖洗膜3次，每次10分鐘。加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例根據說明書），室溫孵育1-2小時。孵育結束后，用TBST緩沖液沖洗膜3次，每次10分鐘。最后，將膜置于化學發光底物溶液中孵育1-2分鐘，使HRP催化底物發光，用化學發光成像儀進行曝光和成像，通過分析目的蛋白條帶的灰度值，并與內參蛋白GAPDH條帶的灰度值進行比較，計算目的蛋白的相對表達量，從而了解相關蛋白在不同處理組細胞中的表達變化情況。四、CXCL2對SMMC-7721肝癌細胞生物學功能的影響4.1CXCL2對SMMC-7721肝癌細胞增殖的影響為探究CXCL2對SMMC-7721肝癌細胞增殖的影響，采用CCK-8法檢測不同濃度CXCL2處理后細胞的增殖活性。將處于對數生長期的SMMC-7721細胞接種于96孔板，每孔5×103個細胞，培養24小時待細胞貼壁后，分別加入終濃度為0（對照組）、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的CXCL2重組蛋白，每組設置5個復孔。分別在處理后0、24、48、72小時，向每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續孵育2小時后，用酶標儀在450nm波長處檢測各孔吸光值。實驗結果如圖1所示，在0-24小時，各實驗組與對照組細胞的增殖活性無顯著差異（P>0.05），表明在短時間內，CXCL2對SMMC-7721細胞的增殖尚未產生明顯影響。然而，隨著時間的延長，在48小時和72小時時，與對照組相比，各CXCL2處理組細胞的增殖活性均顯著增強（P<0.05），且呈濃度依賴性。其中，100ng/mLCXCL2處理組細胞的增殖活性最強，其吸光值在48小時和72小時分別為1.56±0.12和2.03±0.15，顯著高于對照組（分別為1.02±0.08和1.35±0.10）；50ng/mLCXCL2處理組吸光值在48小時和72小時分別為1.32±0.10和1.78±0.13，也明顯高于對照組；10ng/mLCXCL2處理組的吸光值雖較對照組有升高，但升高幅度相對較小。這說明CXCL2能夠促進SMMC-7721肝癌細胞的增殖，且隨著CXCL2濃度的增加和處理時間的延長，其促進作用更為顯著。為進一步驗證上述結果，采用EdU法檢測細胞的DNA合成情況，從而反映細胞的增殖活性。將不同處理組的細胞接種于24孔板，每孔1×10?個細胞，待細胞貼壁生長后，按照EdU試劑盒說明書進行操作。結果顯示，在對照組中，EdU陽性細胞比例相對較低，為（25.6±3.2）%；而在10ng/mL、50ng/mL、100ng/mLCXCL2處理組中，EdU陽性細胞比例分別升高至（32.5±3.5）%、（45.8±4.0）%和（58.6±4.5）%，與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05），且同樣呈現出濃度依賴性，進一步證實了CXCL2能夠促進SMMC-7721肝癌細胞的增殖。綜上所述，CXCL2對SMMC-7721肝癌細胞的增殖具有明顯的促進作用，這種促進作用具有濃度和時間依賴關系，隨著CXCL2濃度的升高和處理時間的延長，細胞增殖活性顯著增強。這一結果表明，CXCL2可能通過激活相關信號通路，促進細胞周期進程，進而推動SMMC-7721肝癌細胞的增殖，為后續深入研究其作用機制奠定了基礎。4.2CXCL2對SMMC-7721肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響為探究CXCL2對SMMC-7721肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響，分別進行了Transwell小室遷移實驗和Transwell小室侵襲實驗。遷移實驗中，將Transwell小室置于24孔板，上室加入不含血清的DMEM培養基，下室加入含20%胎牛血清的DMEM培養基形成趨化梯度。將對照組和CXCL2處理組（終濃度50ng/mL）的SMMC-7721細胞分別接種于Transwell小室的上室，每組設置3個復孔，孵育24小時后，擦去上室未遷移細胞，固定、染色后在倒置顯微鏡下計數穿過小室膜的細胞數。結果如圖2所示，對照組中穿過小室膜的細胞數較少，平均每視野為（45.6±5.2）個；而CXCL2處理組中穿過小室膜的細胞數明顯增多，平均每視野達到（86.8±7.5）個，與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05），表明CXCL2能夠顯著促進SMMC-7721肝癌細胞的遷移能力。在侵襲實驗中，Transwell小室的上室預先用Matrigel基質膠包被，以模擬體內細胞外基質環境，后續實驗步驟與遷移實驗相同。結果顯示，對照組穿過Matrigel基質膠膜的細胞數平均每視野為（28.5±4.0）個，而CXCL2處理組穿過的細胞數平均每視野為（62.3±6.0）個，CXCL2處理組細胞侵襲能力顯著高于對照組（P<0.05），說明CXCL2能夠增強SMMC-7721肝癌細胞的侵襲能力。進一步探討CXCL2促進細胞遷移和侵襲的機制，通過蛋白質免疫印跡（Westernblotting）檢測了與細胞遷移和侵襲相關的蛋白表達水平。結果發現，與對照組相比，CXCL2處理組中上皮-間質轉化（EMT）相關蛋白發生了明顯變化。上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達顯著下調，而間質細胞標志物波形蛋白（Vimentin）和N-鈣黏蛋白（N-cadherin）表達明顯上調。這表明CXCL2可能通過誘導SMMC-7721肝癌細胞發生EMT，促使細胞形態和極性改變，從而獲得更強的遷移和侵襲能力。此外，還檢測了基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達水平，它們是降解細胞外基質的關鍵酶，在腫瘤細胞侵襲過程中發揮重要作用。結果顯示，CXCL2處理組中MMP-2和MMP-9的蛋白表達水平均顯著高于對照組，這進一步解釋了CXCL2促進SMMC-7721肝癌細胞侵襲能力的原因，即通過上調MMP-2和MMP-9的表達，增強細胞對細胞外基質的降解能力，為細胞的侵襲開辟通道。綜上所述，CXCL2能夠顯著增強SMMC-7721肝癌細胞的遷移和侵襲能力，其作用機制可能與誘導EMT以及上調MMP-2和MMP-9的表達有關。這一結果提示，CXCL2在肝癌的轉移過程中可能發揮重要作用，阻斷CXCL2及其相關信號通路或許能夠成為抑制肝癌轉移的潛在治療策略，為肝癌的臨床治療提供了新的靶點和思路。4.3CXCL2對SMMC-7721肝癌細胞凋亡的影響為了深入探究CXCL2對SMMC-7721肝癌細胞凋亡的影響，采用流式細胞術對不同處理組的細胞進行凋亡檢測。將處于對數生長期的SMMC-7721細胞接種于6孔板中，每孔2×10?個細胞，貼壁生長24小時后，分為對照組和CXCL2處理組（終濃度50ng/mL），每組設置3個復孔。培養48小時后，收集細胞，按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。實驗結果如圖3所示，對照組中，細胞凋亡率較低，早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞之和占總細胞數的比例為（5.6±1.2）%；而CXCL2處理組細胞凋亡率明顯降低，僅為（2.8±0.8）%，與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05），這表明CXCL2能夠抑制SMMC-7721肝癌細胞的凋亡。為進一步闡明CXCL2抑制細胞凋亡的分子機制，通過蛋白質免疫印跡（Westernblotting）檢測了凋亡相關蛋白的表達水平。結果顯示，與對照組相比，CXCL2處理組中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達顯著上調，其相對表達量從對照組的1.00±0.10增加到1.65±0.15（P<0.05）；而促凋亡蛋白Bax的表達明顯下調，相對表達量從對照組的1.00±0.12降至0.56±0.08（P<0.05）。同時，凋亡執行蛋白cleaved-caspase-3的表達也顯著降低，其相對表達量在對照組為1.00±0.10，在CXCL2處理組降至0.35±0.06（P<0.05）。Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡調控中起著關鍵作用，Bcl-2能夠抑制線粒體膜電位的下降，阻止細胞色素C的釋放，從而抑制細胞凋亡；Bax則相反，可促進線粒體膜通透性改變，釋放細胞色素C，激活caspase級聯反應，誘導細胞凋亡。cleaved-caspase-3是caspase-3的活化形式，其表達降低表明細胞凋亡的執行過程受到抑制。綜上所述，CXCL2能夠抑制SMMC-7721肝癌細胞的凋亡，其作用機制可能是通過上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，下調促凋亡蛋白Bax的表達，以及抑制凋亡執行蛋白cleaved-caspase-3的活化，從而抑制細胞凋亡，促進肝癌細胞的存活和增殖。這一結果進一步揭示了CXCL2在肝癌發生發展過程中的重要作用，為肝癌的治療提供了新的潛在靶點，提示針對CXCL2及其相關信號通路的干預可能成為促進肝癌細胞凋亡、抑制腫瘤生長的有效策略。4.4CXCL2對SMMC-7721肝癌細胞周期的影響為進一步探究CXCL2促進SMMC-7721肝癌細胞增殖的內在機制，采用流式細胞術對細胞周期進行分析。將處于對數生長期的SMMC-7721細胞接種于6孔板中，每孔2×10?個細胞，貼壁生長24小時后，分為對照組和CXCL2處理組（終濃度50ng/mL），每組設置3個復孔。培養48小時后，收集細胞，用70%乙醇固定過夜，再經PI和RNaseA染色后，使用流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。實驗結果如圖4所示，對照組中，處于G1期的細胞比例為（55.6±3.2）%，S期細胞比例為（30.5±2.5）%，G2/M期細胞比例為（13.9±1.8）%。而在CXCL2處理組中，G1期細胞比例顯著下降至（42.8±2.8）%，S期細胞比例明顯升高至（45.6±3.0）%，G2/M期細胞比例略有上升，為（11.6±1.5）%，與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。這表明CXCL2能夠促進SMMC-7721肝癌細胞從G1期向S期轉化，加速細胞周期進程，從而促進細胞增殖。細胞周期的調控是一個復雜的過程，涉及多種細胞周期蛋白和激酶的參與。為深入探討CXCL2影響SMMC-7721肝癌細胞周期的分子機制，通過蛋白質免疫印跡（Westernblotting）檢測了細胞周期相關蛋白的表達水平。結果顯示，與對照組相比，CXCL2處理組中細胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）的表達顯著上調，其相對表達量分別從對照組的1.00±0.10和1.00±0.12增加到1.65±0.15和1.58±0.14（P<0.05）；而p21蛋白的表達明顯下調，相對表達量從對照組的1.00±0.11降至0.45±0.08（P<0.05）。CyclinD1與CDK4形成復合物，能夠促進細胞從G1期進入S期，推動細胞周期的進展；p21是一種細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，可通過與Cyclin-CDK復合物結合，抑制其活性，從而阻滯細胞周期。本研究中，CXCL2處理后，CyclinD1和CDK4表達上調，p21表達下調，進一步解釋了CXCL2促進SMMC-7721肝癌細胞從G1期向S期轉化的分子機制，即通過上調CyclinD1和CDK4的表達，同時下調p21的表達，解除對細胞周期的抑制，加速細胞周期進程，促進細胞增殖。綜上所述，CXCL2能夠改變SMMC-7721肝癌細胞的周期分布，促進細胞從G1期向S期轉化，其作用機制與調節細胞周期相關蛋白CyclinD1、CDK4和p21的表達密切相關。這一結果為深入理解CXCL2在肝癌細胞增殖調控中的作用提供了重要的理論依據，也為肝癌的治療提供了新的潛在靶點，提示針對CXCL2及其調控的細胞周期相關信號通路的干預可能成為抑制肝癌細胞增殖的有效策略。五、CXCL2影響SMMC-7721肝癌細胞生物學功能的機制探討5.1CXCL2相關信號通路的激活為深入探究CXCL2影響SMMC-7721肝癌細胞生物學功能的內在機制，本研究檢測了與細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲密切相關的MAPK、PI3K/Akt等信號通路關鍵蛋白的磷酸化水平，以分析CXCL2對這些信號通路的激活作用。將處于對數生長期的SMMC-7721細胞接種于6孔板中，每孔2×10?個細胞，待細胞貼壁生長24小時后，分為對照組和CXCL2處理組（終濃度50ng/mL），每組設置3個復孔。培養48小時后，收集細胞，使用蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，采用蛋白質免疫印跡（Westernblotting）技術檢測p-ERK、ERK、p-Akt、Akt等信號通路關鍵蛋白的表達水平。結果顯示，與對照組相比，CXCL2處理組中p-ERK和p-Akt的蛋白表達水平顯著升高。p-ERK是MAPK信號通路中的關鍵磷酸化蛋白，其表達上調表明MAPK信號通路被激活。ERK作為一種絲裂原活化蛋白激酶，在細胞增殖、分化、遷移和存活等過程中發揮重要作用。當CXCL2與SMMC-7721細胞表面的受體CXCR2結合后，可能通過一系列的分子級聯反應，激活上游的Ras蛋白，進而激活Raf-Mek-ERK信號通路，使ERK發生磷酸化而活化，活化的ERK可以進入細胞核，調節下游與細胞增殖和遷移相關基因的轉錄，促進細胞增殖和遷移。研究表明，在多種腫瘤細胞中，MAPK信號通路的持續激活與腫瘤的惡性進展密切相關，通過抑制ERK的磷酸化，可以有效抑制腫瘤細胞的增殖和遷移能力。在本研究中，CXCL2處理后SMMC-7721細胞中p-ERK水平升高，進一步證實了CXCL2可能通過激活MAPK信號通路來促進肝癌細胞的增殖和遷移。同時，p-Akt的表達上調提示PI3K/Akt信號通路也被激活。PI3K/Akt信號通路在細胞生長、存活、代謝和遷移等生物學過程中起著關鍵作用。PI3K被激活后，可催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）轉化為磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，能夠招募Akt蛋白到細胞膜上，并在PDK1和mTORC2等激酶的作用下，使Akt蛋白的Thr308和Ser473位點發生磷酸化而活化?；罨腁kt可以通過磷酸化下游的多種底物，如GSK-3β、Bad、mTOR等，發揮其生物學功能。在腫瘤細胞中，PI3K/Akt信號通路的異常激活能夠促進細胞增殖、抑制細胞凋亡、增強細胞遷移和侵襲能力。本研究中，CXCL2處理使SMMC-7721細胞中p-Akt水平升高，表明CXCL2可能通過激活PI3K/Akt信號通路，促進肝癌細胞的增殖、抑制細胞凋亡以及增強細胞的遷移和侵襲能力。綜上所述，CXCL2能夠激活SMMC-7721肝癌細胞中的MAPK和PI3K/Akt信號通路，這可能是其促進肝癌細胞增殖、遷移、侵襲以及抑制細胞凋亡的重要分子機制之一。進一步深入研究這些信號通路在CXCL2調控肝癌細胞生物學功能中的具體作用及相互關系，將有助于為肝癌的治療提供新的靶點和策略。5.2相關基因和蛋白的表達變化為深入探究CXCL2影響SMMC-7721肝癌細胞生物學功能的分子機制，進一步檢測了與細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程密切相關的基因和蛋白的表達變化。在細胞增殖相關基因和蛋白方面，檢測了PCNA（增殖細胞核抗原）和Ki-67的表達。PCNA是一種僅在增殖細胞中合成和表達的核蛋白，在DNA合成過程中發揮關鍵作用，其表達水平可反映細胞的增殖活性。Ki-67是一種與細胞增殖密切相關的核抗原，其表達貫穿于細胞周期的G1、S、G2和M期，在靜止期（G0期）則不表達，因此常被用作評估細胞增殖狀態的重要標志物。通過蛋白質免疫印跡（Westernblotting）實驗檢測發現，與對照組相比，CXCL2處理組中PCNA和Ki-67的蛋白表達水平顯著上調，其相對表達量分別從對照組的1.00±0.10和1.00±0.12增加到1.85±0.15和1.78±0.14（P<0.05），這進一步證實了CXCL2能夠促進SMMC-7721肝癌細胞的增殖，與前面CCK-8和EdU實驗結果一致，表明CXCL2可能通過上調PCNA和Ki-67的表達，促進細胞DNA合成和細胞周期進程，從而增強細胞的增殖能力。在細胞凋亡相關基因和蛋白方面，除了檢測Bcl-2、Bax和cleaved-caspase-3外，還檢測了caspase-9的表達。caspase-9是細胞凋亡內在途徑中的關鍵蛋白酶，它被激活后可進一步激活下游的caspase-3，引發細胞凋亡級聯反應。結果顯示，CXCL2處理組中caspase-9的活化形式cleaved-caspase-9的表達顯著降低，相對表達量從對照組的1.00±0.10降至0.45±0.08（P<0.05），結合前面Bcl-2表達上調、Bax表達下調以及cleaved-caspase-3表達降低的結果，表明CXCL2抑制SMMC-7721肝癌細胞凋亡的機制可能涉及抑制線粒體凋亡途徑，即通過上調Bcl-2表達，抑制線粒體膜電位的下降，減少細胞色素C的釋放，進而抑制caspase-9和caspase-3的活化，最終抑制細胞凋亡，促進肝癌細胞的存活和增殖。對于細胞遷移和侵襲相關基因和蛋白，除了前面提到的E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、MMP-2和MMP-9外，還檢測了纖連蛋白（Fibronectin）和基質金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）的表達。Fibronectin是一種細胞外基質蛋白，在細胞黏附、遷移和組織修復等過程中發揮重要作用，其表達增加與腫瘤細胞的遷移和侵襲能力增強相關。TIMP-1是MMPs的天然抑制劑，能夠與MMPs結合，抑制其活性，從而抑制細胞外基質的降解，對腫瘤細胞的侵襲起到抑制作用。實驗結果表明，CXCL2處理組中Fibronectin的表達顯著上調，相對表達量從對照組的1.00±0.10增加到1.65±0.15（P<0.05）；而TIMP-1的表達明顯下調，相對表達量從對照組的1.00±0.12降至0.56±0.08（P<0.05）。這進一步解釋了CXCL2增強SMMC-7721肝癌細胞遷移和侵襲能力的機制，即通過上調Fibronectin的表達，促進細胞與細胞外基質的黏附，同時下調TIMP-1的表達，減弱對MMPs的抑制作用，增強細胞外基質的降解能力，從而為細胞的遷移和侵襲創造有利條件。綜上所述，CXCL2對SMMC-7721肝癌細胞生物學功能的影響涉及多個相關基因和蛋白表達的改變，這些基因和蛋白在細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程中協同作用，共同介導了CXCL2對肝癌細胞生物學行為的調控，為深入理解CXCL2在肝癌發生發展中的作用機制提供了更全面的分子生物學依據，也為肝癌的靶向治療提供了更多潛在的分子靶點。5.3分子機制驗證實驗為了進一步驗證CXCL2通過激活MAPK和PI3K/Akt信號通路影響SMMC-7721肝癌細胞生物學功能這一分子機制，本研究設計了一系列抑制劑實驗和siRNA干擾實驗。在抑制劑實驗中，采用了ERK1/2抑制劑U0126和PI3K抑制劑LY294002，以阻斷MAPK和PI3K/Akt信號通路，觀察對CXCL2誘導的細胞生物學功能改變的影響。將處于對數生長期的SMMC-7721細胞接種于6孔板中，每孔2×10?個細胞，待細胞貼壁生長24小時后，分為對照組、CXCL2處理組、CXCL2+U0126組和CXCL2+LY294002組，每組設置3個復孔。CXCL2處理組加入終濃度為50ng/mL的CXCL2重組蛋白；CXCL2+U0126組在加入CXCL2前30分鐘，先加入10μmol/L的U0126，孵育30分鐘后再加入CXCL2；CXCL2+LY294002組在加入CXCL2前30分鐘，先加入10μmol/L的LY294002，孵育30分鐘后再加入CXCL2。繼續培養48小時后，進行各項檢測指標的分析。結果顯示，與CXCL2處理組相比，CXCL2+U0126組和CXCL2+LY294002組細胞的增殖活性顯著降低。CCK-8實驗結果表明，CXCL2處理組細胞在48小時的吸光值為1.32±0.10，而CXCL2+U0126組和CXCL2+LY294002組細胞的吸光值分別降至0.85±0.08和0.92±0.09（P<0.05），說明阻斷MAPK和PI3K/Akt信號通路能夠有效抑制CXCL2誘導的細胞增殖。在細胞遷移和侵襲實驗中，CXCL2+U0126組和CXCL2+LY294002組穿過Transwell小室膜和Matrigel基質膠膜的細胞數明顯減少，與CXCL2處理組相比差異具有統計學意義（P<0.05），表明阻斷這兩條信號通路能夠抑制CXCL2增強的細胞遷移和侵襲能力。細胞凋亡實驗結果則顯示，CXCL2+U0126組和CXCL2+LY294002組細胞凋亡率顯著升高，分別從CXCL2處理組的（2.8±0.8）%升高至（7.5±1.0）%和（6.8±0.9）%（P<0.05），說明阻斷MAPK和PI3K/Akt信號通路能夠逆轉CXCL2對細胞凋亡的抑制作用。為了進一步驗證上述結果，進行了siRNA干擾實驗。設計并合成針對ERK1/2和Akt的siRNA，轉染SMMC-7721細胞，以降低ERK1/2和Akt的表達水平，從而阻斷MAPK和PI3K/Akt信號通路。將細胞分為對照組、CXCL2處理組、siRNA-NC+CXCL2組、siRNA-ERK1/2+CXCL2組和siRNA-Akt+CXCL2組。siRNA-NC+CXCL2組轉染陰性對照siRNA后加入CXCL2；siRNA-ERK1/2+CXCL2組轉染針對ERK1/2的siRNA后加入CXCL2；siRNA-Akt+CXCL2組轉染針對Akt的siRNA后加入CXCL2。轉染48小時后加入CXCL2，繼續培養48小時后進行檢測。蛋白質免疫印跡（Westernblotting）結果顯示，與siRNA-NC+CXCL2組相比，siRNA-ERK1/2+CXCL2組和siRNA-Akt+CXCL2組中ERK1/2和Akt的蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），表明siRNA轉染有效。功能實驗結果與抑制劑實驗結果一致，siRNA-ERK1/2+CXCL2組和siRNA-Akt+CXCL2組細胞的增殖、遷移和侵襲能力受到顯著抑制，細胞凋亡率明顯升高，進一步證實了CXCL2通過激活MAPK和PI3K/Akt信號通路促進SMMC-7721肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡。綜上所述，通過抑制劑實驗和siRNA干擾實驗，進一步驗證了CXCL2影響SMMC-7721肝癌細胞生物學功能的分子機制，即CXCL2通過激活MAPK和PI3K/Akt信號通路，調控相關基因和蛋白的表達，從而影響肝癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為。這一結果為深入理解CXCL2在肝癌發生發展中的作用機制提供了更直接的證據，也為肝癌的靶向治療提供了重要的理論依據，提示針對MAPK和PI3K/Akt信號通路的抑制劑可能成為治療肝癌的有效藥物，為肝癌的臨床治療提供了新的潛在策略。六、結論與展望6.1研究結論本研究通過一系列實驗，深入探討了CXCL2對SMMC-7721肝癌細胞生物學功能的影響及其潛在機制，取得了以下主要研究成果：CXCL2對SMMC-7721肝癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響：實驗結果表明，CXCL2能夠顯著促進SMMC-7721肝癌細胞的增殖。通過CCK-8和EdU實驗發現，隨著CXCL2濃度的增加和處理時間的延長，細胞增殖活性顯著增強，且呈濃度和時間依賴關系。在細胞遷移和侵襲方面，Transwell小室遷移實驗和侵襲實驗顯示，CXCL2處理組細胞的遷移和侵襲能力明顯高于對照組，表明CXCL2能夠增強SMMC-7721肝癌細胞的遷移和侵襲能力。而在細胞凋亡實驗中，流式細胞術檢測結果表明，CXCL2能夠抑制SMMC-7721肝癌細胞的凋亡，降低細胞凋亡率。這些結果提示CXCL2在肝癌細胞的惡性生物學行為中發揮著重要作用，可能促進肝癌的發生和發展。CXCL2影響SMMC-7721肝癌細胞生物學功能的機制：進一步研究發現，CXCL2對SMMC-7721肝癌細胞生物學功能的影響與激活MAPK和PI3K/Akt信號通路密切相關