基因工程

－乙肝疫苗的制備

演講者：鞠林PPT制楊秀蘭李翠華歐永銀資料提供者：鞠林劉珍王偉杰彭博周永斌李凱向運新朱曉東第一頁，共二十二頁。基因工程

定義：又稱為重組DNA技術，指將某些特定的基因或DNA片斷，通過載體或其它手段送入受體細胞，使它們在受體細胞中增殖并表達的一種遺傳學操作。是生產出符合人類需要的產品或創造出生物的新性狀并能穩定遺傳。

作用：可把來自任何生物的基因轉移到與其毫無關系的任何其他受體細胞中，可以任意改造生物的遺傳特性，創造出生物的新性狀。某一段DNA可在受體細胞內進行復制，為制備大量純化的DNA片段提供了可能.第二頁，共二十二頁。獲得目的基因表達載體重組的表達載體酶切、連接宿主細胞轉化、轉染等原核生物細胞植物細胞動物細胞卵細胞培養的動物細胞轉基因動物胚胎發育藥物、疫苗轉基因植物轉基因微生物基因工程藥物人類細胞基因治療第三頁，共二十二頁。蛋白質名稱用途促腎上腺皮質激素〔adrenocorticotrophichormone〕治療風濕〔rheumaticdisease〕B細胞生長因子〔B-cellgrowthfactor〕治療免疫系統功能失調降鈣素(calcitonin)治療軟骨病(osteomalacia)集落刺激因子(colonystimulatingfactor)治療血液病、腫瘤輔助治療絨毛膜促性腺激素(chorionicgonadotropin)治療不排卵癥內啡肽和腦啡肽(endorphineandenkephalin)鎮痛劑(analgesicagent)上皮生長因子(epidermalgrowthfactor)促進傷口愈合紅細胞生成素(erythropoietin)治療貧血(anemia)凝血因子Ⅷ(factorⅧ)治療血友病(hemophilia)凝血因子Ⅸ(factorⅨ)治療血友病生長激素(growthhormone)促進生長生長激素釋放因子(growthhormonereleasingfactor)促進生長胰島素(insulin)治療糖尿病(diabetes)干擾素(interferon)抗病毒抗腫瘤白細胞介素(interleukin)治療癌癥第四頁，共二十二頁。第五頁，共二十二頁。基因重組乙肝疫苗用基因重組技術把乙型肝炎病毒的外表抗原〔HbsAg〕基因片段插入酵母細胞或哺乳動物細胞的基因中，在體外培養增殖過程中組裝或分泌出乙型肝炎外表抗原，然后把外表抗原收集起來提純之后做成乙型肝炎疫苗。第六頁，共二十二頁。乙肝疫苗的制備第七頁，共二十二頁。目的基因的獲取編碼乙型肝炎外表抗原的基因的獲取

一般的目的基因的獲取方法有：反轉錄法化學合成法反轉錄—聚合酶鏈反響法cDNA文庫的建立？第八頁，共二十二頁。cDNA文庫的建立第九頁，共二十二頁。工程菌的構建CHO細胞的特點①具有準確的轉錄后修飾功能,表達的糖基化藥

物蛋白在分子結構、理化特性和生物學功能方面最接近于天然蛋白分子②具有產物胞外分泌功

能,便于下游產物別離純化;③具有重組基因的高效

擴增和表達能力;④具有貼壁生長特性,且有較高的

耐受剪切力和滲透壓能力,可以進行懸浮培養,表達水平較高;⑤CHO細胞屬于成纖維細胞(fibrob2last),很少分泌自身的內源蛋白,利于外源蛋白的后別離第十頁，共二十二頁。材料菌株﹑質粒及細胞大腸桿菌DH5α和質粒pMD18-Sm〔攜帶改變稀有密碼子后的S基因〕質粒pCIneoCHO／dhfr-細胞pMD18-T載體第十一頁，共二十二頁。主要試劑限制性內切酶、T4DNAligase、質粒DNA提取

和柱式膠回收試劑盒乙型肝炎外表抗原檢測試劑盒DMEM和透析胎牛血清胰蛋白酶、氨甲喋呤〔MTX〕和脂質體LipofectamineTMHBsAg血凝檢測試劑盒第十二頁，共二十二頁。

目的基因的表達第十三頁，共二十二頁。蛋白質的別離純化第十四頁，共二十二頁。濃縮與初步純化離子交換層析疏水層析親和層析固液別離離心沉淀膜過濾雙水相萃取高度純化DNA的去除熱原質的去除病毒的去除第十五頁，共二十二頁。別離純化的根本要求技術條件溫和，保持其生物活性選擇性好，到達有效別離純化的目的技術間可以直接連接，節省工藝步驟收率高，過程快選擇別離純化方法的依據根據產物表達形式來選擇根據別離單元之間的銜接來選擇根據別離純化工藝的要求來選擇第十六頁，共二十二頁。別離純化工藝流程第十七頁，共二十二頁。1、發酵液的預處理連續高速離心，除去細胞殘片，再超濾濃縮2、疏水柱層析介質：ButylSSepharoseFF參加適量硫酸銨，調節電導率與柱層析平衡液電導率相等按照平衡柱床、上樣吸附、平衡液洗柱、降低硫酸銨濃度解析、清柱再生程序層析

第十八頁，共二十二頁。3、陰離子交換柱層析介質：DEAESepharoseFFHBsAg活性蛋白經SephadexG-25柱脫鹽換液，使緩沖鹽系統的PH、離子強度和IEC平衡液一致按照平衡柱床、丄樣吸附、氯化鈉濃度梯度分段