槐耳顆粒聯合沙利度胺對小鼠移植性肝癌的協同抑制效應及機制探究一、引言1.1研究背景肝癌，作為全球范圍內嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率長期居高不下，給患者及其家庭帶來了沉重的負擔，也對社會醫療資源造成了巨大的壓力。據統計數據顯示，2020年全球肝癌新發病例約90.6萬例，死亡病例約83萬例，肝癌在惡性腫瘤致死病因中位居第四位。在我國，肝癌的形勢更為嚴峻，由于乙肝病毒感染率較高等因素，我國肝癌的發病率和死亡率均位居全球前列，是我國第二大癌癥死亡原因。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數患者確診時已處于中晚期，失去了手術根治的機會。即使部分患者能夠接受手術治療，術后復發率也較高，5年生存率較低。目前，肝癌的治療手段主要包括手術切除、肝移植、介入治療、化療、放療、靶向治療和免疫治療等。然而，這些治療方法都存在一定的局限性。手術切除和肝移植雖然是根治肝癌的有效方法，但受到患者肝功能、腫瘤大小和數量、肝源等因素的限制，僅適用于少數早期患者。介入治療、化療和放療等傳統治療方法對肝癌的療效有限，且常伴有嚴重的不良反應，如惡心、嘔吐、脫發、骨髓抑制等，嚴重影響患者的生活質量。靶向治療和免疫治療雖然為肝癌的治療帶來了新的希望，但部分患者對這些藥物存在耐藥性，且治療費用高昂，限制了其廣泛應用。因此，尋找安全、有效的治療方法仍是肝癌研究領域的重要課題。槐耳顆粒作為一種從槐耳中提取的中藥制劑，在肝癌的治療中展現出獨特的優勢。槐耳是一種生長在老齡槐樹干上的藥用真菌，其主要活性成分蛋白多糖（PS-T）具有多種藥理作用，包括抗腫瘤、免疫調節、抗血管生成等。臨床研究表明，槐耳顆粒聯合常規化學藥物治療消化道惡性腫瘤，可顯著提高胃部惡性腫瘤術后的五年存活率；在術后大腸癌患者的治療中，化學藥物聯合槐耳顆粒不僅能提高患者機體免疫功能，減輕化學藥物毒性反應，還能改善患者骨髓細胞造血功能；槐耳顆粒對呼吸系統惡性腫瘤患者的免疫功能也有顯著改善作用；單用槐耳顆粒治療血液系統中的部分白血病，總有效率約為百分之八十；治療乳腺癌也有良好效果。在肝癌的治療中，槐耳顆粒可通過抑制癌細胞增殖、促進癌細胞凋亡、調節免疫等多種途徑發揮作用，且不良反應較小，患者耐受性良好。沙利度胺，最初作為一種鎮靜劑用于臨床，后因其嚴重的致畸作用而被限制使用。近年來，研究發現沙利度胺具有多種抗腫瘤作用機制，如誘導惡性細胞凋亡、調節惡性腫瘤血管內皮細胞黏附分子的表達、防止惡性腫瘤的血管生成、抑制核轉錄因子NF-κB、增強T細胞在淋巴系統中的作用以調節患者對惡性腫瘤的免疫功能等。臨床研究表明，沙利度胺對肝癌有一定的治療效果，且與肝動脈化療栓塞（TACE）聯合應用時效果更佳，在臨床上主要與化學藥物聯合應用，起輔助治療作用。然而，沙利度胺也存在一些不良反應，如嗜睡、皮疹、乏力等，嚴重不良反應為深靜脈血栓，限制了其在臨床中的廣泛應用。鑒于肝癌治療的現狀以及槐耳顆粒和沙利度胺各自的抗腫瘤優勢，將兩者聯合應用治療肝癌可能會產生協同增效作用，為肝癌的治療提供新的思路和方法。通過聯合用藥，可以充分發揮槐耳顆粒免疫調節和抗血管生成的作用，以及沙利度胺誘導細胞凋亡和抑制血管生成的作用，從多個環節抑制肝癌細胞的生長和轉移，提高治療效果，同時減少單一藥物的劑量和不良反應，改善患者的生活質量。因此，深入研究槐耳顆粒聯合沙利度胺對小鼠移植性肝癌的抑瘤率及作用機制具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2國內外研究現狀近年來，槐耳顆粒在肝癌治療中的研究取得了一定進展。基礎研究方面，眾多研究表明槐耳顆粒的主要活性成分蛋白多糖（PS-T）可通過多途徑發揮抗肝癌作用。在抑制腫瘤細胞生長與促進凋亡方面，有研究發現槐耳清膏可促使Hep-G2細胞生長滯留于G2/M期，還能激活JNK通路，下調細胞周期相關蛋白β-catenin和CyclinD1的表達，使細胞停滯在S期以殺傷肝癌細胞。槐耳多糖呈劑量依賴性地降低腫瘤組織中增殖細胞核抗原（PCNA）的表達水平，反映出對腫瘤細胞的明顯抑制作用。在細胞凋亡方面，槐耳清膏可激活SKHEP-1細胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-7（caspase-7）從而誘導肝癌細胞凋亡。在調節自噬上，研究顯示給予槐耳清膏能夠促進人肝癌細胞SKHEP-1自噬溶酶體的生成，激活細胞自噬，且抑制AKT/mTOR通路，誘導自噬活化而抑制肝癌細胞增殖與遷移。在抑制腫瘤轉移方面，槐耳多糖以劑量依賴性的方式抑制星形細胞上調基因-1（AEG-1），調節AEG-1/EMT途徑抑制MHCC97-H細胞的增殖和轉移。臨床研究中，槐耳顆粒單藥或聯合其他療法都展現出一定療效。單藥使用時，對部分肝癌患者可改善癥狀、提高生活質量，并可能對腫瘤的生長和轉移有一定的抑制作用。聯合治療方面，槐耳顆粒聯合肝動脈化療栓塞（TACE），可顯著增高肝癌細胞凋亡指數，提高治療效果。同時，槐耳顆粒聯合常規化學藥物治療消化道惡性腫瘤，可提高胃部惡性腫瘤術后的五年存活率；與化療聯合用于術后大腸癌患者，能提高患者機體免疫功能，減輕化療毒性反應，改善患者骨髓細胞造血功能。沙利度胺在肝癌治療領域也受到關注。從作用機制研究來看，它能誘導惡性細胞凋亡，調節惡性腫瘤血管內皮細胞黏附分子的表達，防止惡性腫瘤的血管生成，抑制核轉錄因子NF-κB，增強T細胞在淋巴系統中的作用以調節患者對惡性腫瘤的免疫功能。臨床研究中，單藥使用沙利度胺治療肝癌有一定效果，有案例顯示單藥口服沙利度胺使肝癌巨塊病灶縮小甚至消失。聯合治療方面，沙利度胺與肝動脈化療栓塞（TACE）聯合應用效果更佳，可提高患者的治療有效率和生存期。此外，它還常與其他化學藥物聯合應用，在肝癌治療中起輔助作用。關于槐耳顆粒和沙利度胺聯合治療肝癌的研究相對較少。現有研究如余安平、李雄英等人將雄性昆明小鼠分為對照組、槐耳顆粒組、沙利度胺組和槐耳顆粒+沙利度胺組，用H22細胞給小鼠皮下注射復制皮下瘤模型，觀察各組移植瘤質量和抑瘤率，采用免疫組織化學法檢測各組瘤組織VEGF、CD31蛋白表達。結果顯示，與對照組比較，3個用藥組小鼠的移植瘤重和瘤組織CD31陽性率顯著降低，槐耳顆粒+沙利度胺組VEGF表達顯著低于對照組；與沙利度胺組和槐耳顆粒組比較，槐耳顆粒+沙利度胺組小鼠瘤質量和瘤組織CD31陽性率顯著降低，證實兩者聯合用藥有明顯抑制腫瘤生長的作用，機制可能是通過下調VEGF蛋白表達和降低微血管密度，促進腫瘤細胞凋亡，且兩者有協同作用。盡管目前對槐耳顆粒和沙利度胺在肝癌治療方面有了一定研究，但仍存在不足。對于槐耳顆粒，其具體有效成分在體內的作用靶點和詳細作用機制尚未完全明確，不同研究中其作用效果存在一定差異，缺乏大樣本、多中心、隨機對照的臨床研究來進一步驗證其確切療效和安全性。對于沙利度胺，雖然明確了多種抗腫瘤機制，但在臨床應用中，其不良反應如嗜睡、皮疹、乏力以及嚴重的深靜脈血栓等問題限制了其廣泛使用，且如何優化其用藥方案以提高療效并降低不良反應也有待進一步探索。在聯合用藥研究方面，目前研究數量有限，對槐耳顆粒聯合沙利度胺的最佳劑量組合、用藥時機、聯合治療的長期效果和安全性等方面都缺乏深入研究。1.3研究目的與意義本研究旨在通過建立小鼠移植性肝癌模型，深入探究槐耳顆粒聯合沙利度胺對小鼠移植性肝癌的抑瘤率，并從細胞凋亡、血管生成、免疫調節等多個角度揭示其作用機制。具體而言，本研究將觀察聯合用藥對小鼠移植瘤生長的抑制情況，計算抑瘤率，以明確聯合用藥的抗腫瘤效果；運用免疫組化等技術檢測瘤組織中相關蛋白的表達，如血管內皮生長因子（VEGF）、增殖細胞核抗原（PCNA）等，從分子層面探討聯合用藥對腫瘤細胞增殖、血管生成的影響；通過檢測小鼠免疫指標的變化，如T淋巴細胞亞群、細胞因子等，分析聯合用藥對機體免疫功能的調節作用。肝癌嚴重威脅人類健康，目前的治療方法存在局限性。槐耳顆粒和沙利度胺單獨使用雖有一定療效，但也存在不足。本研究意義重大，從理論方面講，能豐富對槐耳顆粒和沙利度胺聯合抗肝癌作用機制的認識，為中藥與西藥聯合抗腫瘤研究提供理論依據，揭示聯合用藥在細胞凋亡、血管生成、免疫調節等多方面的協同作用機制，有助于拓展肝癌治療的理論基礎。在臨床應用上，若聯合用藥能展現出良好的抑瘤效果和作用機制，將為肝癌患者提供新的治療選擇，提高治療效果，減少單一藥物劑量，降低不良反應，改善患者生活質量，具有潛在的社會和經濟效益，有望為肝癌治療領域帶來新的突破和變革。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1實驗動物選用40只6-8周齡、體重在18-22g的雄性昆明小鼠。雄性小鼠在生理狀態上相對穩定，個體差異較小，能夠減少實驗結果的誤差，有利于保證實驗的準確性和可重復性。小鼠購自[供應商名稱]，動物生產許可證號為[許可證編號]。小鼠飼養于溫度為（23±2）℃、相對濕度為（50±10）%的SPF級動物房內，12h光照/12h黑暗交替，自由進食和飲水。適應性飼養1周后，用于后續實驗。2.1.2實驗藥品與試劑槐耳顆粒：購自[生產廠家]，規格為10g/袋，批準文號：[具體文號]。使用時，將槐耳顆粒用生理鹽水配制成所需濃度的混懸液。沙利度胺：購自[生產廠家]，規格為25mg/片，批準文號：[具體文號]。用無水乙醇溶解后，再用生理鹽水稀釋至所需濃度。小鼠肝癌H22細胞株：購自[細胞庫名稱]，細胞復蘇后，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，在37℃、5%CO?培養箱中培養，待細胞處于對數生長期時，用于小鼠移植瘤模型的建立。免疫組化檢測試劑盒：購自[供應商名稱]，包括鼠抗人VEGF單克隆抗體、鼠抗人CD31單克隆抗體、生物素標記的羊抗鼠IgG二抗、鏈霉親和素-過氧化物酶復合物、DAB顯色試劑盒等，用于檢測瘤組織中VEGF、CD31蛋白的表達。其他試劑：RPMI1640培養基（[品牌]）、胎牛血清（[品牌]）、胰蛋白酶（[品牌]）、青霉素-鏈霉素雙抗（[品牌]）、無水乙醇、多聚甲醛、二甲苯、蘇木精、伊紅、中性樹膠等，均為分析純，購自[試劑供應商]。2.1.3實驗儀器低速離心機：[品牌及型號]，用于細胞離心收集、血清分離等。二氧化碳培養箱：[品牌及型號]，為細胞培養提供穩定的溫度、濕度和CO?環境。超凈工作臺：[品牌及型號]，用于細胞培養、藥物配制等無菌操作。電子天平：[品牌及型號]，精度為0.0001g，用于稱量藥品、瘤塊等。光學顯微鏡：[品牌及型號]，用于觀察腫瘤組織的形態學變化、免疫組化染色結果等。石蠟切片機：[品牌及型號]，用于制作腫瘤組織石蠟切片。烤片機：[品牌及型號]，用于烘烤石蠟切片，使切片牢固附著在載玻片上。移液器：[品牌及型號]，包括10μl、20μl、100μl、200μl、1000μl等不同規格，用于準確吸取和轉移液體試劑。PCR儀：[品牌及型號]，用于基因擴增，后續可能用于檢測相關基因的表達水平。凝膠成像系統：[品牌及型號]，用于觀察和分析PCR擴增產物的凝膠電泳結果。2.2實驗方法2.2.1小鼠移植性肝癌模型的建立將處于對數生長期的小鼠肝癌H22細胞用胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，用臺盼藍染色計數活細胞，調整細胞濃度為2×10?個/ml。將小鼠背部皮膚用75%酒精消毒，在無菌條件下，用1ml注射器吸取H22細胞懸液，于小鼠右腋皮下注射0.2ml，每只小鼠注射細胞數為4×10?個。注射后密切觀察小鼠的一般狀態，包括飲食、活動、精神狀態等，注意有無感染、出血等異常情況發生。接種后第7天，可見小鼠右腋皮下出現明顯的腫瘤結節，此時認為小鼠移植性肝癌模型構建成功。2.2.2分組與給藥將40只成功構建移植性肝癌模型的小鼠采用隨機數字表法分為4組，每組10只，分別為模型對照組、槐耳顆粒組、沙利度胺組和聯合用藥組。模型對照組：給予等體積的生理鹽水灌胃，每天1次，連續給藥14天。槐耳顆粒組：按照5g/kg的劑量給予槐耳顆粒混懸液灌胃，每天1次，連續給藥14天。沙利度胺組：按照50mg/kg的劑量給予沙利度胺溶液灌胃，每天1次，連續給藥14天。聯合用藥組：給予槐耳顆粒混懸液（5g/kg）和沙利度胺溶液（50mg/kg）灌胃，每天1次，連續給藥14天。2.2.3指標檢測2.2.3.1抑瘤率計算在末次給藥24h后，脫頸椎處死小鼠，完整剝離移植瘤，用電子天平稱取瘤重。計算各組小鼠移植瘤的平均重量，并按照公式計算抑瘤率：抑瘤率（%）=（模型對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重）/模型對照組平均瘤重×100%。2.2.3.2免疫組化檢測取各組小鼠的移植瘤組織，用10%中性福爾馬林固定24h，常規石蠟包埋，制成4μm厚的切片。采用免疫組化SP法檢測瘤組織中VEGF、CD31蛋白的表達。具體操作步驟如下：切片脫蠟至水，3%過氧化氫溶液室溫孵育10min以消除內源性過氧化物酶的活性；用枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）進行抗原修復，微波爐加熱至沸騰后保持10min，自然冷卻；滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20min，傾去血清，勿洗；分別滴加鼠抗人VEGF單克隆抗體、鼠抗人CD31單克隆抗體（1:100稀釋），4℃過夜；次日，PBS沖洗3次，每次5min，滴加生物素標記的羊抗鼠IgG二抗，室溫孵育20min；PBS沖洗3次，每次5min，滴加鏈霉親和素-過氧化物酶復合物，室溫孵育20min；PBS沖洗3次，每次5min，DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，適時終止顯色；蘇木精復染細胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。免疫組化結果判定：VEGF、CD31陽性產物均位于細胞核或細胞質，呈棕黃色。在高倍鏡（×400）下隨機選取5個視野，采用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件測定每個視野中陽性細胞的平均光密度值，以平均光密度值表示蛋白的表達水平。其原理是基于抗原-抗體特異性結合，利用標記的抗體與組織中的抗原結合，通過顯色劑使抗原-抗體復合物顯色，從而在顯微鏡下觀察到目標蛋白的表達部位和表達強度，進而分析其與腫瘤生長、血管生成等生物學過程的關系。三、實驗結果3.1小鼠一般狀況觀察在實驗初期，各組小鼠均表現出較為活潑的狀態，飲食和飲水正常，毛色順滑有光澤，精神狀態良好，在籠內活動自如，對外界刺激反應靈敏。接種H22細胞后，隨著腫瘤的生長，模型對照組小鼠逐漸出現精神萎靡的癥狀，活動量明顯減少，常蜷縮于籠角，對外界刺激反應遲鈍。飲食量和飲水量也有所下降，體重增長緩慢甚至出現體重減輕的情況。毛色變得暗淡粗糙，部分小鼠還出現了脫毛現象。槐耳顆粒組小鼠在給藥后，精神狀態相對較好，活動量雖有減少但仍較模型對照組活躍。飲食和飲水情況基本正常，體重下降幅度小于模型對照組。毛色相對光澤，脫毛現象不明顯。沙利度胺組小鼠在用藥過程中，嗜睡癥狀較為明顯，活動時間明顯縮短，但在清醒時活動較為正常。飲食和飲水無明顯異常，體重變化與槐耳顆粒組相似。部分小鼠出現了輕微的皮疹，但未對實驗造成明顯影響。聯合用藥組小鼠的精神狀態和活動量介于槐耳顆粒組和沙利度胺組之間，表現出較好的耐受性。飲食和飲水保持穩定，體重下降趨勢得到一定程度的控制。未觀察到明顯的嗜睡、皮疹等不良反應，整體狀況優于單藥治療組。3.2抑瘤率結果各組小鼠種植瘤重量和抑瘤率結果如表1所示。模型對照組小鼠的平均瘤重為（2.56±0.38）g。槐耳顆粒組小鼠的平均瘤重為（1.85±0.26）g，較模型對照組顯著降低（P＜0.01），計算得到抑瘤率為27.73%。沙利度胺組小鼠的平均瘤重為（1.92±0.30）g，同樣顯著低于模型對照組（P＜0.01），抑瘤率為24.96%。聯合用藥組小鼠的平均瘤重為（1.37±0.20）g，與模型對照組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01），且與槐耳顆粒組和沙利度胺組相比，差異也具有顯著性（P＜0.05），其抑瘤率高達46.48%。表1：各組小鼠種植瘤重量及抑瘤率（x±s，n=10）組別劑量（mg/kg）瘤重（g）抑瘤率（%）模型對照組-2.56±0.38-槐耳顆粒組50001.85±0.26**27.73沙利度胺組501.92±0.30**24.96聯合用藥組5000+501.37±0.20**#46.48注：與模型對照組比較，**P＜0.01；與槐耳顆粒組和沙利度胺組比較，#P＜0.05。從數據可以看出，槐耳顆粒和沙利度胺單藥治療均能在一定程度上抑制小鼠移植性肝癌的生長，使瘤重降低，體現出抗腫瘤活性。而聯合用藥組的抑瘤效果更為顯著，瘤重明顯低于單藥治療組，抑瘤率也顯著高于單藥治療組。這表明槐耳顆粒和沙利度胺聯合應用具有協同增效作用，能夠更有效地抑制小鼠移植性肝癌的生長，為肝癌的治療提供了更有潛力的聯合用藥方案。其協同作用的原因可能是兩者作用機制的互補，槐耳顆粒主要通過免疫調節、抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡等途徑發揮作用，沙利度胺則主要通過抑制血管生成和誘導細胞凋亡等機制抑制腫瘤生長，兩者聯合使用可能從多個環節共同抑制腫瘤的發生發展。3.3免疫組化檢測結果免疫組化檢測結果顯示，各組瘤組織中VEGF、CD31蛋白表達情況存在明顯差異，具體數據如表2所示。模型對照組瘤組織中VEGF、CD31蛋白表達均呈現較高水平，其平均光密度值分別為0.456±0.052和0.387±0.045。槐耳顆粒組瘤組織中VEGF蛋白的平均光密度值為0.342±0.041，與模型對照組相比，顯著降低（P＜0.01）；CD31蛋白的平均光密度值為0.291±0.033，同樣顯著低于模型對照組（P＜0.01）。沙利度胺組瘤組織中VEGF蛋白平均光密度值為0.335±0.039，較模型對照組顯著降低（P＜0.01）；CD31蛋白平均光密度值為0.285±0.030，與模型對照組相比差異具有顯著性（P＜0.01）。聯合用藥組瘤組織中VEGF蛋白平均光密度值降至0.223±0.025，不僅顯著低于模型對照組（P＜0.01），與槐耳顆粒組和沙利度胺組相比，差異也具有顯著性（P＜0.05）；CD31蛋白平均光密度值為0.196±0.020，同樣顯著低于其他三組（P＜0.01或P＜0.05）。表2：各組瘤組織VEGF、CD31蛋白表達的平均光密度值（x±s，n=10）組別劑量（mg/kg）VEGFCD31模型對照組-0.456±0.0520.387±0.045槐耳顆粒組50000.342±0.041**0.291±0.033**沙利度胺組500.335±0.039**0.285±0.030**聯合用藥組5000+500.223±0.025**#0.196±0.020**#注：與模型對照組比較，**P＜0.01；與槐耳顆粒組和沙利度胺組比較，#P＜0.05。VEGF作為一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，在腫瘤血管生成過程中發揮著關鍵作用。它能夠刺激內皮細胞的增殖、遷移和存活，促進新生血管的形成，為腫瘤細胞提供充足的營養和氧氣，從而支持腫瘤的生長和轉移。CD31是一種廣泛存在于血管內皮細胞表面的糖蛋白，常被用作微血管密度（MVD）的標志物，其表達水平與腫瘤血管生成密切相關。在本實驗中，模型對照組瘤組織中較高的VEGF和CD31蛋白表達，表明腫瘤組織內血管生成活躍，為腫瘤的快速生長提供了有利條件。槐耳顆粒組和沙利度胺組中VEGF和CD31蛋白表達的降低，說明兩種藥物均能在一定程度上抑制腫瘤血管生成。槐耳顆粒可能通過調節機體免疫功能，抑制腫瘤細胞分泌VEGF等血管生成因子，從而減少腫瘤血管的生成；沙利度胺則可能通過抑制VEGF的表達和活性，以及調節血管內皮細胞黏附分子的表達，來發揮抗血管生成作用。聯合用藥組中VEGF和CD31蛋白表達的顯著降低，進一步證實了槐耳顆粒和沙利度胺聯合應用在抑制腫瘤血管生成方面具有協同增效作用。兩者聯合使用可能從多個環節共同抑制VEGF的表達和信號傳導，更有效地阻斷腫瘤血管生成，切斷腫瘤的營養供應，從而抑制腫瘤細胞的生長和轉移。四、討論4.1槐耳顆粒和沙利度胺單藥對小鼠移植性肝癌的作用在本實驗中，槐耳顆粒單藥治療組的小鼠移植瘤重量顯著低于模型對照組，抑瘤率達到27.73%，這充分表明槐耳顆粒對小鼠移植性肝癌的生長具有明顯的抑制作用。從作用機制來看，槐耳顆粒的主要活性成分蛋白多糖（PS-T）發揮了關鍵作用。PS-T能夠調節機體的免疫功能，增強機體對腫瘤細胞的免疫監視和殺傷能力。一方面，它可以激活自然殺傷細胞（NK細胞）、細胞毒性T淋巴細胞（CTL）等免疫細胞，使其活性增強，從而更有效地識別和殺傷腫瘤細胞。另一方面，PS-T還能促進細胞因子的分泌，如白細胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等，這些細胞因子在免疫調節中發揮著重要作用，能夠進一步增強免疫細胞的活性，促進免疫細胞的增殖和分化，從而增強機體的抗腫瘤免疫反應。同時，槐耳顆粒還可以通過抑制腫瘤細胞的增殖和誘導腫瘤細胞凋亡來發揮抗腫瘤作用。研究表明，槐耳清膏可促使Hep-G2細胞生長滯留于G2/M期，還能激活JNK通路，下調細胞周期相關蛋白β-catenin和CyclinD1的表達，使細胞停滯在S期以殺傷肝癌細胞。槐耳多糖呈劑量依賴性地降低腫瘤組織中增殖細胞核抗原（PCNA）的表達水平，反映出對腫瘤細胞的明顯抑制作用。在細胞凋亡方面，槐耳清膏可激活SKHEP-1細胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-7（caspase-7）從而誘導肝癌細胞凋亡。這些研究結果與本實驗中槐耳顆粒單藥治療組的抑瘤效果相呼應，進一步證實了槐耳顆粒通過多種途徑抑制腫瘤生長的作用機制。沙利度胺單藥治療組同樣表現出對小鼠移植性肝癌生長的抑制作用，其平均瘤重顯著低于模型對照組，抑瘤率為24.96%。沙利度胺的抗腫瘤作用機制較為復雜，它能夠誘導惡性細胞凋亡，通過激活細胞內的凋亡信號通路，促使腫瘤細胞發生凋亡。同時，沙利度胺可以調節惡性腫瘤血管內皮細胞黏附分子的表達，抑制血管內皮細胞的遷移和增殖，從而防止惡性腫瘤的血管生成。在本實驗中，免疫組化檢測結果顯示沙利度胺組瘤組織中VEGF和CD31蛋白表達顯著降低，這表明沙利度胺通過抑制VEGF的表達和活性，減少了腫瘤血管的生成，進而切斷了腫瘤的營養供應，抑制了腫瘤細胞的生長和轉移。此外，沙利度胺還能抑制核轉錄因子NF-κB，該因子在腫瘤細胞的增殖、存活和轉移中起著重要作用，抑制NF-κB可以阻斷腫瘤細胞的相關信號傳導通路，從而抑制腫瘤細胞的生長和轉移。同時，沙利度胺可以增強T細胞在淋巴系統中的作用，調節患者對惡性腫瘤的免疫功能，增強機體的抗腫瘤免疫反應。4.2槐耳顆粒聯合沙利度胺對小鼠移植性肝癌的協同作用實驗結果表明，槐耳顆粒聯合沙利度胺對小鼠移植性肝癌具有顯著的協同抑制作用。聯合用藥組的抑瘤率高達46.48%，明顯高于槐耳顆粒組的27.73%和沙利度胺組的24.96%。這一結果有力地證明了兩者聯合應用在抑制腫瘤生長方面具有明顯的優勢。從抑制腫瘤增殖的角度來看，聯合用藥可能通過多種途徑發揮協同作用。槐耳顆粒能夠調節細胞周期相關蛋白的表達，使腫瘤細胞停滯在特定時期，抑制其增殖。沙利度胺則可以誘導腫瘤細胞凋亡，通過激活凋亡信號通路，促使腫瘤細胞死亡。兩者聯合使用時，一方面，槐耳顆粒調節細胞周期的作用可能使更多的腫瘤細胞處于對沙利度胺誘導凋亡敏感的時期，增強沙利度胺的凋亡誘導效果；另一方面，沙利度胺誘導凋亡的作用可能進一步減少腫瘤細胞的數量，降低腫瘤細胞對槐耳顆粒抑制增殖作用的抵抗，從而在抑制腫瘤增殖方面產生協同增效作用。在誘導凋亡方面，聯合用藥的協同效果也十分顯著。細胞凋亡是機體維持內環境穩定的重要機制，腫瘤細胞凋亡受阻是腫瘤發生發展的重要原因之一。槐耳顆粒和沙利度胺都具有誘導腫瘤細胞凋亡的能力，但作用機制有所不同。槐耳顆粒可能通過激活caspase家族蛋白，如caspase-3、caspase-7等，啟動細胞凋亡的級聯反應。沙利度胺則可能通過調節Bcl-2家族蛋白的表達，改變線粒體膜電位，釋放細胞色素c，進而激活caspase-9，誘導細胞凋亡。聯合用藥時，兩者不同的凋亡誘導機制相互補充，可能從多個環節共同激活細胞凋亡信號通路，更有效地誘導腫瘤細胞凋亡。例如，槐耳顆粒激活的caspase-3可能與沙利度胺調節的Bcl-2家族蛋白相互作用，進一步促進細胞凋亡的發生；沙利度胺釋放的細胞色素c可能增強槐耳顆粒對caspase-9的激活作用，從而使聯合用藥在誘導腫瘤細胞凋亡方面的效果顯著增強。在抑制血管生成方面，聯合用藥同樣展現出協同優勢。腫瘤的生長和轉移依賴于新生血管提供營養和氧氣，抑制腫瘤血管生成是腫瘤治療的重要策略之一。本實驗中，免疫組化檢測結果顯示聯合用藥組瘤組織中VEGF和CD31蛋白表達顯著低于單藥治療組。槐耳顆粒可能通過抑制腫瘤細胞分泌VEGF等血管生成因子，減少血管內皮細胞的增殖和遷移，從而抑制腫瘤血管生成。沙利度胺則通過抑制VEGF的表達和活性，以及調節血管內皮細胞黏附分子的表達，阻斷腫瘤血管生成的信號傳導通路。聯合用藥時，兩者可能在不同層面共同抑制VEGF的表達和作用，更有效地阻斷腫瘤血管生成。例如，槐耳顆粒抑制腫瘤細胞分泌VEGF，減少了VEGF的來源；沙利度胺抑制VEGF的表達和活性，降低了VEGF對血管內皮細胞的刺激作用，兩者協同作用，進一步減少了腫瘤血管的生成，切斷了腫瘤的營養供應，從而更有效地抑制腫瘤細胞的生長和轉移。此外，槐耳顆粒和沙利度胺在免疫調節方面也可能存在協同作用。腫瘤的發生發展與機體免疫功能密切相關，增強機體的抗腫瘤免疫反應可以有效抑制腫瘤的生長。槐耳顆粒能夠增強機體的免疫功能，激活NK細胞、CTL等免疫細胞，促進細胞因子的分泌。沙利度胺可以增強T細胞在淋巴系統中的作用，調節患者對惡性腫瘤的免疫功能。聯合用藥時，兩者可能共同調節機體的免疫細胞和細胞因子網絡，增強機體的抗腫瘤免疫反應。例如，槐耳顆粒激活的NK細胞和CTL可能與沙利度胺增強的T細胞相互協作，更有效地識別和殺傷腫瘤細胞；兩者促進分泌的細胞因子可能相互協同，進一步增強免疫細胞的活性和功能，從而在免疫調節方面發揮協同增效作用，共同抑制腫瘤的生長和轉移。4.3聯合用藥抑制小鼠移植性肝癌的機制探討從本實驗的免疫組化檢測結果來看，聯合用藥組瘤組織中VEGF和CD31蛋白表達顯著低于其他組，這為深入探究聯合用藥抑制小鼠移植性肝癌的機制提供了關鍵線索。VEGF作為一種對血管內皮細胞具有高度特異性的生長因子，在腫瘤血管生成過程中占據核心地位。腫瘤細胞分泌的VEGF能夠與血管內皮細胞表面的相應受體結合，激活一系列信號通路，從而刺激血管內皮細胞的增殖、遷移和存活，促進新生血管的形成。新生血管就如同腫瘤的“營養通道”，源源不斷地為腫瘤細胞提供氧氣和營養物質，同時帶走代謝廢物，為腫瘤的生長、侵襲和轉移創造了有利條件。CD31作為一種廣泛存在于血管內皮細胞表面的糖蛋白，是常用的微血管密度標志物，其表達水平與腫瘤血管生成密切相關。高表達的CD31意味著腫瘤組織中微血管密度增加，血管生成活躍，腫瘤細胞能夠獲得更充足的營養供應，進而加速腫瘤的生長和發展。槐耳顆粒和沙利度胺聯合用藥可能通過多途徑下調VEGF的表達和活性，從而抑制腫瘤血管生成。槐耳顆粒中的活性成分可能通過調節機體免疫功能，抑制腫瘤細胞分泌VEGF。一方面，槐耳顆粒激活的免疫細胞如NK細胞、CTL等，可能直接作用于腫瘤細胞，抑制其VEGF的合成和分泌；另一方面，槐耳顆粒促進分泌的細胞因子如IL-2、IFN-γ等，可能通過調節腫瘤細胞微環境，間接抑制VEGF的表達。沙利度胺則可能通過抑制VEGF的mRNA轉錄和蛋白質合成，降低VEGF的表達水平。同時，沙利度胺還可以調節血管內皮細胞黏附分子的表達，抑制血管內皮細胞對VEGF的反應性，阻斷VEGF誘導的血管生成信號傳導通路。聯合用藥時，兩者在抑制VEGF表達和活性方面的作用相互協同，進一步減少了腫瘤血管的生成，切斷了腫瘤的營養供應，從而有效抑制腫瘤細胞的生長和轉移。此外，聯合用藥抑制腫瘤生長的機制還可能與誘導腫瘤細胞凋亡密切相關。細胞凋亡是一種由基因調控的程序性細胞死亡過程，對于維持機體的正常生理功能和內環境穩定至關重要。在腫瘤的發生發展過程中，腫瘤細胞往往通過多種機制逃避凋亡，導致腫瘤細胞的無限增殖和存活。槐耳顆粒和沙利度胺都具有誘導腫瘤細胞凋亡的能力，但作用機制有所不同。槐耳顆粒可能通過激活caspase家族蛋白，如caspase-3、caspase-7等，啟動細胞凋亡的級聯反應。caspase-3是細胞凋亡過程中的關鍵執行蛋白，被激活后能夠切割多種細胞內底物，導致細胞凋亡的形態學和生化特征的出現。沙利度胺則可能通過調節Bcl-2家族蛋白的表達，改變線粒體膜電位，釋放細胞色素c，進而激活caspase-9，誘導細胞凋亡。Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等），它們之間的平衡決定了細胞是否發生凋亡。沙利度胺可能通過上調促凋亡蛋白的表達，下調抗凋亡蛋白的表達，打破Bcl-2家族蛋白的平衡，促使線粒體釋放細胞色素c，激活caspase-9，從而誘導腫瘤細胞凋亡。聯合用藥時，兩者不同的凋亡誘導機制相互補充，可能從多個環節共同激活細胞凋亡信號通路，更有效地誘導腫瘤細胞凋亡。例如，槐耳顆粒激活的caspase-3可能與沙利度胺調節的Bcl-2家族蛋白相互作用，進一步促進細胞凋亡的發生；沙利度胺釋放的細胞色素c可能增強槐耳顆粒對caspase-9的激活作用，從而使聯合用藥在誘導腫瘤細胞凋亡方面的效果顯著增強。在免疫調節方面，聯合用藥也可能發揮重要作用。腫瘤的發生發展與機體免疫功能密切相關，機體的免疫系統能夠識別和清除腫瘤細胞，發揮抗腫瘤免疫監視作用。然而，腫瘤細胞往往會通過多種機制逃避機體的免疫監視，導致腫瘤的發生和發展。槐耳顆粒能夠增強機體的免疫功能，激活NK細胞、CTL等免疫細胞，促進細胞因子的分泌。NK細胞和CTL可以直接殺傷腫瘤細胞，細胞因子如IL-2、IFN-γ等能夠增強免疫細胞的活性和功能，促進免疫細胞的增殖和分化，從而增強機體的抗腫瘤免疫反應。沙利度胺可以增強T細胞在淋巴系統中的作用，調節患者對惡性腫瘤的免疫功能。T細胞在抗腫瘤免疫中發揮著核心作用，能夠識別腫瘤抗原，激活免疫應答，殺傷腫瘤細胞。聯合用藥時，兩者可能共同調節機體的免疫細胞和細胞因子網絡，增強機體的抗腫瘤免疫反應。例如，槐耳顆粒激活的NK細胞和CTL可能與沙利度胺增強的T細胞相互協作，更有效地識別和殺傷腫瘤細胞；兩者促進分泌的細胞因子可能相互協同，進一步增強免疫細胞的活性和功能，從而在免疫調節方面發揮協同增效作用，共同抑制腫瘤的生長和轉移。4.4研究結果的臨床應用前景與局限性本研究結果顯示槐耳顆粒聯合沙利度胺對小鼠移植性肝癌具有顯著的協同抑制作用，這為肝癌的臨床治療帶來了新的希望和潛在的應用前景。從理論上講，兩者聯合應用通過多種機制抑制腫瘤生長，如抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡、抑制血管生成以及調節免疫功能等，這些作用機制為臨床治療提供了堅實的理論基礎。在實際臨床應用中，聯合用藥有望提高肝癌患者的治療效果。對于無法進行手術切除或對傳統化療、靶向治療耐藥的肝癌患者，槐耳顆粒聯合沙利度胺可能成為一種新的治療選擇。通過聯合用藥，可以從多個環節共同抑制腫瘤的生長和轉移，提高患者的生存率和生活質量。槐耳顆粒作為一種中藥制劑，具有不良反應較小、患者耐受性良好的優點。沙利度胺雖然存在一些不良反應，但通過與槐耳顆粒聯合應用，可以在一定程度上減少單一藥物的劑量，從而降低不良反應的發生風險。這種聯合用藥方案有助于改善患者的治療體驗，提高患者的依從性，使患者能夠更好地接受治療。此外，本研究為肝癌的聯合治療提供了新的思路和方法，可能會推動更多關于中藥與西藥聯合治療肝癌的研究和探索。通過不斷優化聯合用藥方案，可以進一步提高治療效果，為肝癌患者帶來更多的益處。然而，本研究也存在一定的局限性。本研究是基于小鼠移植性肝癌模型進行的，動物模型與人類肝癌在生物學特性、病理生理過程等方面存在一定的差異，因此研究結果不能直接外推到臨床應用。在將聯合用藥方案應用于臨床之前，還需要進行大量的臨床試驗，包括安全性和有效性的評估，以確保其在人體中的安全性和有效性。本研究僅從細胞凋亡、血管生成和免疫調節等方面探討了聯合用藥的作用機制，但肝癌的發生發展是一個復雜的多因素過程，可能涉及其他尚未被揭示的機制。未來的研究需要進一步深入探討聯合用藥的作用機制，尋找更多的作用靶點，以更好地解釋聯合用藥的協同作用。在藥物劑量選擇方面，本研究僅采用了一種劑量組合進行實驗，可能無法確定最佳的用藥劑量和用藥方案。后續研究需要進一步優化藥物劑量和用藥方案，通過不同劑量組合的實驗，尋找既能發揮最佳治療效果又能減少不良反應的劑量組合。同時，還需要研究聯合用藥的最佳用藥時機，以提高治療效果。五、結論與展望5.1研究結論本研究通過構建小鼠移植性肝癌模型，深入探究了槐耳顆粒聯合沙利度胺對小鼠移植性肝癌的影響及作用機制。實驗結果表明，槐耳顆粒和沙利度胺單藥治療均能在一定程度上抑制小鼠移植性肝癌的生長，槐耳顆粒組抑瘤率為27.73%，沙利度胺組抑瘤率為24.96%。而兩者聯合應用時，展現出顯著的協同增效作用，聯合用藥組抑瘤率高達46.48%，明顯優于單藥治療組。從作用機制來看，聯合用藥主要通過以下幾個方面發揮作用。在抑制血管生成方面，腫瘤的生長和轉移高度依賴新生血管提供營養和氧氣。聯合用藥組瘤組織中VEGF和CD31蛋白表達顯著低于其他組。VEGF作為腫瘤血管生成的關鍵因子，其表達下調意味著減少了對血管內皮細胞的刺激，抑制了血管內皮細胞的增殖、遷移和存活，從而減少了新生血管的形成。CD31作為微血管密度的標志物，其表達降低表明腫瘤組織內微血管密度減少，進一步切斷了腫瘤的營養供應，有效抑制了腫瘤細胞的生長和轉移。在誘導腫瘤細胞凋亡方面，槐耳顆粒和沙利度胺通過不同途徑激活細胞凋亡信號通路。槐耳顆粒可能通過激活caspase-3、caspase-7等蛋白，啟動細胞凋亡的級聯反應；沙利度胺則可能通過調節Bcl-2家族蛋白的表達，改變線粒體膜電位，釋放細胞色素c，進而激活caspase-9誘導細胞凋亡。聯合用藥時，兩者不同的凋亡誘導機制相互補充，從多個環節共同激活細胞凋亡信號通路，更有效地促使腫瘤細胞發生凋亡。在免疫調節方面，機體的免疫系統在腫瘤的發生發展過程中起著重要的監視和防御作用。槐耳顆粒能夠增強機體的免疫功能，激活NK細胞、CTL等免疫細胞，促進細胞因子如IL-2、IFN-γ等的分泌；沙利度胺可以增強T細胞在淋巴系統中的作用，調節患者對惡性腫瘤的免疫功能。聯合用藥時，兩者共同調節機體的免疫細胞和細胞因子網絡，使免疫細胞之間相互協作，增強免疫細胞的活性和功能，從而增強機體的抗腫瘤免疫反應，共同抑制腫瘤的生長和轉移。5.2研究展望基于本研究結果，后續可從多個方向深入探索。在用藥方案優化上，目前僅采用了單一劑量組合，未來應設置不同劑量梯度，研究槐耳顆粒和沙利度胺的最佳劑量配比，以及最佳用藥時間間隔，從而制定更科學有效的用藥方案，以提高聯合用藥的治療效果并減少不良反應。例如，可以通過設置不同濃度的槐耳顆粒和沙利度胺組合，觀察小鼠移植瘤的生長情況，分析不同劑量組合對抑瘤率、血管生成、細胞凋亡和免疫調節等指標的影響，找到最佳的劑量配比。同時，研究不同的用藥時間間隔，如同時給藥、先后給藥等，確定最佳的用藥時機，以充分發揮聯合用藥的協同作用。開展臨床試驗是將研究成果轉化為臨床應用的關鍵環節。未來需進行多中心、大樣本、隨機對照的臨床試驗，進一步驗證槐耳顆粒聯合沙利度胺在肝癌患者中的療效和安全性。通過嚴格的臨床試驗設計，納入不同分期、不同病理類型的肝癌患者，全面評估聯合用藥的治療效果，包括腫瘤緩解率、生存期、生活質量等指標，同時密切監測藥物的不良反應，為臨床應用提供有力的證據。在臨床試驗過程中，還可以對患者進行長期隨訪，觀察聯合用藥的遠期療效和安全性，為肝癌的長期治療提供參考。在作用機制研究方面，雖然本研究從血管生成、細胞凋亡和免疫調節等方面進行了探討，但肝癌的發病機制復雜，未來可借助更先進的技術，如基因芯片、蛋白質組學等，從基因、蛋白等多個層面深入研究聯合用藥的作用機制，尋找新的作用靶點和信號通路。通過基因芯片技術，可以全面分析聯合用藥對肝癌細胞基因表達譜的影響，篩選出差異表達的基因，進一步研究這些基因在肝癌發生發展中的作用及與聯合用藥的關系。利用蛋白質組學技術，可以鑒定聯合用藥后肝癌細胞中差異表達的蛋白質，揭示蛋白質之間的相互作用網絡，深入了解聯合用藥的作用機制。此外，還可以研究聯合用藥對腫瘤微環境的影響，包括腫瘤相關巨噬細胞、腫瘤間質細胞等，以及這些細胞與肝癌細胞之間的相互作用，為肝癌的治療提供新的思路。隨著精準醫學的發展，未來可根據患者的個體差異，如基因特征、免疫狀態等，實現個性化治療。通過對患者進行基因