旋毛蟲焦磷酸酶：功能解析與口服疫苗免疫保護效能探究一、引言1.1研究背景與意義旋毛蟲病是一種嚴重的人畜共患寄生蟲病，由旋毛蟲（Trichinellaspiralis）感染引起。這種疾病廣泛分布于世界各地，給畜牧業帶來了巨大的經濟損失，同時也嚴重威脅著人類的健康。據統計，全球約有1100萬人感染旋毛蟲，主要流行于歐洲、亞洲和非洲的部分地區。在我國，旋毛蟲病也時有發生，如云南、河南、湖北等地均有病例報道。旋毛蟲的生活史較為復雜，包括成蟲、幼蟲和包囊等階段。當人或動物攝入含有旋毛蟲幼蟲包囊的肉類后，幼蟲在腸道內脫囊并發育為成蟲，成蟲交配后產生幼蟲，幼蟲通過血液循環進入肌肉組織，形成包囊，從而導致宿主出現一系列癥狀。旋毛蟲病的臨床表現多樣，輕者可能僅出現輕微的胃腸道癥狀，如腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐等；重者則可能出現發熱、肌肉疼痛、水腫、乏力等癥狀，甚至累及心臟、肺部和神經系統，導致死亡。據研究，未經治療的旋毛蟲病患者死亡率可高達10%。旋毛蟲病還會給畜牧業帶來巨大的經濟損失，感染旋毛蟲的家畜生長緩慢、肉質下降，嚴重影響養殖效益。目前，旋毛蟲病的治療主要依賴于藥物，如阿苯達唑、甲苯達唑等。然而，藥物治療存在一定的局限性，如藥物副作用、耐藥性等問題。疫苗作為一種有效的預防手段，具有重要的應用前景。研發安全、有效的旋毛蟲疫苗，不僅可以預防人類感染旋毛蟲病，還可以減少畜牧業的經濟損失，具有重要的公共衛生意義和經濟價值。目前，旋毛蟲疫苗的研究主要集中在亞單位疫苗、核酸疫苗和重組疫苗等方面，但仍存在免疫效果不理想、生產成本高等問題。因此，尋找新的疫苗候選抗原，開發更加有效的疫苗，是旋毛蟲病防治領域的研究熱點。焦磷酸酶（Pyrophosphatase）是一種能夠催化焦磷酸水解生成無機磷酸的酶，在生物體內參與多種重要的生理過程，如能量代謝、物質合成等。近年來，研究發現焦磷酸酶在寄生蟲的生長、發育和致病過程中發揮著重要作用。在旋毛蟲中，焦磷酸酶可能參與了幼蟲的蛻皮、發育和免疫逃避等過程。對旋毛蟲焦磷酸酶的功能進行鑒定，不僅有助于深入了解旋毛蟲的生物學特性和致病機制，還可能為旋毛蟲病的診斷、治療和疫苗研發提供新的靶點和思路。通過研究焦磷酸酶在旋毛蟲感染過程中的作用機制，有望開發出針對焦磷酸酶的新型藥物或疫苗，提高旋毛蟲病的防治效果。本研究旨在對旋毛蟲焦磷酸酶的功能進行鑒定，并探討其作為口服疫苗的免疫保護作用。通過基因克隆、表達和純化等技術，獲得重組旋毛蟲焦磷酸酶蛋白；利用細胞實驗和動物實驗，研究焦磷酸酶的生物學功能；構建口服疫苗免疫小鼠模型，評價疫苗的免疫保護效果。本研究的結果將為旋毛蟲病的防治提供新的理論依據和技術支持，具有重要的理論意義和實際應用價值。1.2研究目的與內容本研究旨在深入探究旋毛蟲焦磷酸酶的功能，并全面評估其作為口服疫苗的免疫保護作用，為旋毛蟲病的防治提供全新的理論依據與技術支持。具體研究內容如下：旋毛蟲焦磷酸酶基因的克隆與表達：從旋毛蟲蟲體中提取總RNA，通過反轉錄PCR技術擴增焦磷酸酶基因。將擴增得到的基因片段克隆至表達載體中，轉化至大腸桿菌中進行誘導表達。對表達產物進行純化和鑒定，獲得高純度的重組旋毛蟲焦磷酸酶蛋白。旋毛蟲焦磷酸酶的功能鑒定：利用酶活性測定、底物特異性分析等方法，研究重組旋毛蟲焦磷酸酶的生物學功能。通過細胞實驗，觀察焦磷酸酶對細胞增殖、凋亡、遷移等生物學行為的影響。采用免疫熒光、免疫印跡等技術，研究焦磷酸酶在細胞內的定位和表達調控機制。旋毛蟲焦磷酸酶口服疫苗的制備：將重組旋毛蟲焦磷酸酶蛋白與合適的佐劑混合，制備成口服疫苗。對疫苗的穩定性、免疫原性等進行檢測和評估，確定最佳的疫苗配方和制備工藝。旋毛蟲焦磷酸酶口服疫苗的免疫保護作用研究：將制備好的口服疫苗免疫小鼠，通過檢測小鼠血清中的抗體水平、細胞免疫反應等指標，評估疫苗的免疫效果。采用攻蟲實驗，觀察免疫小鼠對旋毛蟲感染的抵抗能力，評價疫苗的免疫保護作用。通過組織病理學檢查、分子生物學檢測等方法，研究疫苗免疫對小鼠體內旋毛蟲蟲荷、組織損傷等的影響，探討疫苗的免疫保護機制。1.3研究方法與技術路線旋毛蟲焦磷酸酶基因的克隆與表達：采用分子生物學技術，從旋毛蟲總RNA中反轉錄獲得cDNA，以此為模板，利用特異性引物通過PCR擴增焦磷酸酶基因。將擴增產物克隆至表達載體pET-28a(+)中，轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞。經IPTG誘導表達后，使用Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白，通過SDS和Westernblot鑒定蛋白的純度和正確性。旋毛蟲焦磷酸酶的功能鑒定：運用生化分析方法，測定重組焦磷酸酶的酶活性，分析其對不同底物的特異性。利用細胞實驗，將重組蛋白作用于體外培養的細胞，通過CCK-8法檢測細胞增殖情況，AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡，Transwell實驗檢測細胞遷移能力。采用免疫熒光技術，觀察焦磷酸酶在細胞內的定位；通過免疫印跡法，檢測相關信號通路蛋白的表達變化，探究其功能機制。旋毛蟲焦磷酸酶口服疫苗的制備：將重組旋毛蟲焦磷酸酶蛋白與黏膜佐劑CTB按照一定比例混合，制備成口服疫苗。通過穩定性實驗，考察疫苗在不同溫度、時間條件下的蛋白含量和結構穩定性；采用ELISA法檢測疫苗免疫小鼠后的抗體水平，評估其免疫原性，確定最佳疫苗配方。旋毛蟲焦磷酸酶口服疫苗的免疫保護作用研究：選取健康BALB/c小鼠，隨機分為實驗組和對照組。實驗組小鼠口服接種制備好的疫苗，對照組小鼠給予等量的PBS。免疫程序為每隔兩周免疫一次，共免疫三次。末次免疫后兩周，對所有小鼠進行旋毛蟲幼蟲攻擊感染。感染后不同時間點，采集小鼠血清，用ELISA法檢測特異性抗體IgG及其亞類水平；分離小鼠脾細胞，進行淋巴細胞增殖實驗和細胞因子檢測，評估細胞免疫反應。感染后一定時間，處死小鼠，計數肌肉中的幼蟲荷，通過組織病理學檢查觀察肌肉組織的損傷程度，綜合評價疫苗的免疫保護效果。本研究的技術路線如圖1所示：（此處插入技術路線圖，圖中應清晰展示從旋毛蟲蟲體獲取RNA，進行基因克隆、表達、純化，到蛋白功能鑒定，疫苗制備及免疫保護作用研究的整個流程，包括各步驟的主要實驗方法和關鍵檢測指標）通過以上研究方法和技術路線，本研究將系統地對旋毛蟲焦磷酸酶的功能進行鑒定，并深入探討其作為口服疫苗的免疫保護作用，為旋毛蟲病的防治提供有力的理論依據和技術支持。二、旋毛蟲與旋毛蟲病2.1旋毛蟲生物學特性2.1.1形態結構旋毛蟲成蟲微小，呈線狀，外觀如發絲般纖細。雄蟲體長約1.4-1.6毫米，寬0.04-0.05毫米，蟲體后端稍粗；雌蟲相對較大，體長3-4毫米，寬0.06毫米，其子宮較長，獨特的是，子宮中段充滿蟲卵，而后段和近肛門處則含發育程度不同的幼蟲。成蟲的消化道包括口、咽管、腸管和肛門，其中咽管結構特殊，長度約為蟲體長的1/3-1/2。前段自口至咽神經環部位呈毛細管狀，其后略為膨大，后段又變為毛細管狀，并與腸管相連。后段咽管的背側面有一列由呈圓盤狀的特殊細胞──桿細胞組成的桿狀體，每個桿細胞內有核1個，位于中央，胞漿中含有糖原、線粒體、內質網及分泌型顆粒，其分泌物通過微管進入咽管腔，不僅具有消化功能，還具備強抗原性，能夠誘導宿主產生保護性免疫。兩性成蟲的生殖系統均為單管型，雄蟲尾端具一對鐘狀交配附器，無交合刺，交配時泄殖腔可以翻出；雌蟲卵巢位于體后部，輸卵管短窄。旋毛蟲幼蟲自陰門產出時，寄生在宿主橫紋肌細胞內，長約1毫米，隨著生長，會卷曲形成梭形囊包。幼蟲囊包于宿主的橫紋肌肉，呈梭形，其縱軸與肌纖維平行，大小約為0.25-0.5×0.21-0.42毫米，一個囊包內通常含1-2條卷曲的幼蟲，個別情況下也有6-7條。成熟幼蟲的咽管結構與成蟲相似，在宿主肌肉中不斷生長發育，對宿主的肌肉組織造成破壞。在顯微鏡下觀察，旋毛蟲成蟲和幼蟲的形態特征清晰可辨，成蟲的線狀外形和特殊的咽管結構，幼蟲的卷曲狀態和所在的梭形囊包，都具有典型的分類學特征，有助于準確識別和區分。2.1.2生活史旋毛蟲的生活史較為獨特，成蟲和幼蟲同寄生于一個宿主內，成蟲主要寄生于小腸，具體在十二指腸和空腸上段；幼蟲則寄生在橫紋肌細胞內，且在發育過程中，無外界的自由生活階段，但完成生活史必須要更換宿主。除人以外，許多種哺乳動物，如豬、犬、鼠、貓及熊、野豬、狼、狐等野生動物，均可作為本蟲的宿主。當人或動物宿主食入了含活旋毛蟲幼蟲囊包的肉類后，在胃液和腸液的消化作用下，數小時內，幼蟲在十二指腸及空腸上段自囊包中逸出，并鉆入腸粘膜內。在腸粘膜內經過一段時間的發育，幼蟲會再返回腸腔。在感染后的48小時內，幼蟲經歷4次蛻皮后，即可發育為成蟲。隨后，雌、雄蟲交配，交配后的雄蟲不久即死去，而雌蟲則重新侵入腸粘膜內，有些蟲體還可在腹腔或腸系膜淋巴結處寄生。受精后的雌蟲子宮內的蟲卵逐漸發育為幼蟲，并向陰道外移動。感染后的第5-7天，雌蟲開始產出幼蟲，排蚴膜可持續4-16周或更長，此間，每一條雌蟲可產幼蟲約1500條。成蟲一般可存活1-2個月，有的可活3-4個月。大多數產于腸粘膜內的新生幼蟲，侵入局部淋巴管或靜脈，隨淋巴和血循環到達宿主各器官、組織。然而，只有到達橫紋肌內的幼蟲才能繼續發育。侵入部位多是活動較多、血液供應豐富的肌肉，如膈肌、舌肌、咬肌、咽喉肌、胸肌、肋間肌及腓腸肌等處。幼蟲穿破微血管，進入肌細胞內寄生。約在感染后1個月，幼蟲周圍形成纖維性囊壁，并不斷增厚，這種肌組織內含有的幼蟲囊包，對新宿主具有感染力。當新的宿主吞食了含有這種感染性幼蟲囊包的肉類后，便會重復上述的生活史，從而實現旋毛蟲在不同宿主間的傳播和繁衍。旋毛蟲在豬體內的生活史研究表明，從豬感染旋毛蟲到肌肉中形成具有感染力的幼蟲囊包，整個過程需要一定的時間周期，且受多種因素影響，這為防控旋毛蟲病提供了關鍵的時間節點和干預靶點。2.2旋毛蟲病流行病學2.2.1流行現狀旋毛蟲病呈全球性分布，除南極洲因無定居居民而無旋毛蟲病例外，其余六大洲均有發現。在歐美國家，如意大利、法國、美國等，旋毛蟲病曾有過多次暴發流行。在18-19世紀，歐洲國家的旋毛蟲病流行較為嚴重，如德國在這一時期曾多次暴發旋毛蟲病疫情，每次暴發患者可達30多人，平均死亡率為5%。自1975年意大利因食用馬肉引發人體旋毛蟲病暴發以來，法國和意大利共發生了13次因食用馬肉導致的暴發，患者達3200多人，死亡率為0.31%。美國旋毛蟲的感染率約為4%，部分城市的感染率高達12%-14%。在我國，旋毛蟲病也時有發生。1964年西藏首次報道了人體旋毛蟲感染病例，此后云南、河南、湖北、遼寧、黑龍江等17個?。▍^、市）均有病例發生和暴發流行。據估計，國內目前感染人數約為2000萬。云南省是我國旋毛蟲病的高發地區之一，截至1997年年底，該省共暴發441次旋毛蟲病，發病20101人，死亡213人。近年來，隨著人們生活水平的提高和衛生意識的增強，以及對肉類食品衛生監管力度的加大，我國旋毛蟲病的發病率有所下降，但局部地區仍有散發病例和小規模暴發。在一些農村地區，由于居民有食用生肉或半生不熟肉類的習慣，加上對豬肉的檢疫檢測不夠嚴格，導致旋毛蟲病的傳播風險依然存在。2.2.2傳播途徑消化道傳播：這是旋毛蟲病最主要的傳播途徑。人或動物主要因生食或半生食含有旋毛蟲幼蟲囊包的肉類及肉制品而感染。其中，豬肉是人類感染旋毛蟲的主要來源，因為豬是旋毛蟲的常見宿主，且在一些地區，豬的養殖和屠宰管理不夠規范，容易導致豬肉被旋毛蟲污染。除豬肉外，其他動物如犬、貓、鼠、野豬、熊、狐等的肉也可能含有旋毛蟲幼蟲囊包，食用這些動物的生肉或未煮熟的肉同樣會感染旋毛蟲病。在一些少數民族地區，有食用生豬肉或“剁生”（將生豬肉剁碎后直接食用）的習俗，這大大增加了感染旋毛蟲病的風險。在湖北丹江市某幼兒園，曾因將含旋毛蟲的豬肉做汆湯丸子，導致進食的51名兒童和6名教師集體發病。接觸過生肉的案板和刀具等也可能間接感染旋毛蟲，因為這些器具上可能殘留有旋毛蟲幼蟲囊包，若未進行徹底清洗和消毒，再用于處理其他食物，就會造成交叉污染。母嬰垂直傳播：孕婦感染旋毛蟲后，幼蟲可通過胎盤垂直傳播給胎兒，導致胎兒感染旋毛蟲病。這種傳播途徑雖然相對較少見，但對胎兒的健康危害極大，可能導致胎兒發育異常、早產、流產等嚴重后果。其他傳播途徑：雖然較為罕見，但理論上，旋毛蟲還可能通過輸血傳播，若供血者感染了旋毛蟲，且處于幼蟲血癥期，受血者接受其血液后就有可能感染旋毛蟲。此外，一些昆蟲如蠅蛆吞食動物尸體中的旋毛蟲包囊后，能使包囊感染力保持6-8天，鳥類肌組織雖不感染旋毛蟲，但當食入帶有旋毛蟲的肉后，可隨糞便排出有活力的旋毛蟲幼蟲，使鼠感染，所以鳥類如烏鴉、鷹等對旋毛蟲傳播也有一定作用。2.2.3危害對人體健康的危害：旋毛蟲病對人體健康危害嚴重，其致病作用及病情輕重與感染數量、發育階段、人體免疫反應狀態有關。僅吞食10-20個包囊者可不發病，若吞食數千個者則可發生嚴重感染，甚至危及生命。感染旋毛蟲后，早期相當于成蟲在小腸階段，患者可出現惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等胃腸道癥狀，通常輕而暫短。隨著病情發展，進入急性期，即幼蟲移行時期，病多急起，主要表現有發熱、水腫、皮疹、肌痛等。重癥患者常感咀嚼、吞咽、呼吸、眼球活動時疼痛，累及咽喉、心肌、肺部、眼部、中樞神經系統時，可產生對應癥狀，如心肌炎、肺炎、腦炎等，嚴重影響患者的生活質量，甚至導致死亡。幼蟲移行至心、肺、腦等重要器官時，可對這些器官造成嚴重損害，引發器官功能障礙。若不及時治療，感染原蟲量多的病例病死率可達5%。在恢復期，隨著肌肉中包囊形成，急性炎癥消退，全身性癥狀如發熱、水腫和肌痛逐漸減輕，但患者仍會顯著消瘦、乏力，肌痛和硬結仍可持續數月。對畜牧業的危害：旋毛蟲病給畜牧業帶來巨大的經濟損失。感染旋毛蟲的家畜生長緩慢，飼料轉化率降低，養殖成本增加?；疾〖倚蟮娜赓|下降，不符合食品安全標準，無法進入市場銷售，導致養殖者的收入減少。豬感染旋毛蟲后，會出現體溫上升、食欲下降、嘔吐、腹瀉等癥狀，嚴重時還會出現肌肉發炎、麻痹和癱瘓等，影響豬的生長和發育。在一些養豬場，由于旋毛蟲病的流行，大量生豬被淘汰，給養殖戶造成了沉重的經濟負擔。旋毛蟲病還會影響家畜的繁殖性能，導致母畜流產、死胎等，進一步降低了畜牧業的生產效益。此外，旋毛蟲病的存在也會影響肉類產品的出口，降低國家的畜牧業經濟競爭力。2.3現有防治措施2.3.1診斷方法病原學診斷：病原學診斷是旋毛蟲病診斷的“金標準”，主要通過從患者肌肉組織中查找旋毛蟲幼蟲或包囊來確診。常用的方法有肌肉活檢法，一般取患者腓腸肌或肱二頭肌等活動較多、血液供應豐富的肌肉組織，將其剪碎后壓片，在顯微鏡下觀察是否存在旋毛蟲幼蟲或包囊。該方法特異性高，但屬于有創檢查，對患者造成一定痛苦，且檢出率受取材部位、蟲體數量等因素影響。當感染早期或蟲體數量較少時，容易出現漏檢情況。在一些疑似旋毛蟲病患者中，即使進行了肌肉活檢，也可能因取材不當而未發現蟲體，導致誤診。人工胃液消化法也是常用的病原學診斷方法之一，將肌肉組織用人工胃液消化后，離心沉淀，取沉淀物鏡檢，可提高幼蟲的檢出率。該方法操作相對復雜，需要一定的實驗室條件和技術經驗。免疫學診斷：免疫學診斷方法具有快速、簡便、靈敏度高等優點，在旋毛蟲病的診斷中應用廣泛。常用的免疫學檢測方法包括酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、間接血凝試驗（IHA）、免疫印跡試驗（WB）等。ELISA是目前應用最廣泛的免疫學診斷方法之一，通過檢測患者血清中的特異性抗體，如IgG、IgM等，來判斷是否感染旋毛蟲。該方法具有較高的靈敏度和特異性，但存在一定的假陽性和假陰性率。一些患者在感染旋毛蟲后，由于免疫反應尚未產生或抗體水平較低，可能出現假陰性結果；而在某些自身免疫性疾病患者中，由于體內存在交叉反應抗體，可能導致假陽性結果。IHA通過將旋毛蟲抗原致敏紅細胞，與患者血清中的抗體發生凝集反應來檢測抗體，操作相對簡單，但靈敏度和特異性略低于ELISA。WB則是將旋毛蟲抗原進行電泳分離，轉印到硝酸纖維素膜上，與患者血清中的抗體反應，通過檢測特異性條帶來確定是否感染，該方法特異性強，可用于確診和鑒別診斷，但操作復雜，成本較高，不適用于大規模篩查。分子生物學診斷：隨著分子生物學技術的不斷發展，分子生物學診斷方法在旋毛蟲病的診斷中逐漸得到應用。聚合酶鏈式反應（PCR）是常用的分子生物學診斷方法之一，通過擴增旋毛蟲的特異性基因片段，如ITS1、ITS2等，來檢測旋毛蟲DNA。該方法具有靈敏度高、特異性強、檢測速度快等優點，可用于早期診斷和無癥狀感染者的檢測。PCR技術對實驗條件和操作人員的要求較高，容易出現污染導致假陽性結果。實時熒光定量PCR（qPCR）在PCR技術的基礎上，加入熒光標記探針，通過實時監測熒光信號的變化來定量檢測旋毛蟲DNA，進一步提高了檢測的準確性和靈敏度。環介導等溫擴增技術（LAMP）則是一種新型的核酸擴增技術，在恒溫條件下即可實現核酸的快速擴增，具有操作簡單、快速、靈敏度高等優點，適合在基層實驗室推廣應用。2.3.2治療手段藥物治療：阿苯達唑是目前治療旋毛蟲病的首選藥物，它能抑制蟲體對葡萄糖的攝取，導致蟲體糖原耗竭，從而達到殺蟲的目的。阿苯達唑對旋毛蟲的成蟲、幼蟲和包囊均有較好的療效，一般采用口服給藥，劑量為每日15-20mg/kg，分2-3次服用，療程為7-10天。在臨床應用中，阿苯達唑治療旋毛蟲病的治愈率較高，但部分患者可能會出現惡心、嘔吐、頭暈、乏力等不良反應，一般癥狀較輕，停藥后可自行緩解。甲苯咪唑也是治療旋毛蟲病的常用藥物之一，它能與蟲體的β-微管蛋白結合，抑制微管的組裝，從而影響蟲體的運動和攝取營養。甲苯咪唑的用法為每日300mg，分3次口服，療程為10天。與阿苯達唑相比，甲苯咪唑的不良反應相對較少，但殺蟲效果可能略遜一籌。對癥治療：對于旋毛蟲病患者，除了進行病原治療外，還需要根據患者的癥狀進行對癥治療。對于發熱患者，可給予物理降溫或使用解熱鎮痛藥，如對乙酰氨基酚、布洛芬等，以緩解發熱癥狀，減輕患者的不適感。對于肌肉疼痛嚴重的患者，可適當使用止痛藥物，如阿司匹林、曲馬多等，同時可配合熱敷、按摩等物理治療方法，促進局部血液循環，緩解肌肉疼痛。對于出現水腫的患者，可給予利尿劑，如呋塞米、氫氯噻嗪等，以減輕水腫癥狀，改善患者的身體狀況。若患者出現心肌炎、腦炎等嚴重并發癥，應及時進行相應的治療，如使用糖皮質激素、免疫抑制劑等，以減輕炎癥反應，保護重要器官的功能。2.3.3預防策略控制傳染源：加強對豬、犬、貓等家畜的管理，提倡圈養，避免家畜散養，減少其接觸感染源的機會。定期對家畜進行旋毛蟲檢測，一旦發現感染，應及時進行治療或無害化處理。在養豬場，定期對豬群進行旋毛蟲檢測，對感染豬進行隔離治療或淘汰，可有效控制傳染源。加強對野生動物的監測，防止其傳播旋毛蟲病。對于一些野生的宿主動物，如野豬、鼠類等，應采取有效的防控措施，如設置陷阱、投放毒餌等，減少其數量，降低傳播風險。切斷傳播途徑：改變不良的飲食習慣是預防旋毛蟲病的關鍵。教育公眾不生食或半生食豬肉、狗肉等肉類及其制品，確保肉類食品經過充分的加熱處理，使肉品內部溫度達到70℃以上，持續一定時間，以殺死可能存在的旋毛蟲幼蟲。在烹飪過程中，生熟食品應分開使用刀具、砧板和容器，避免交叉污染。加強肉類食品的衛生檢疫，嚴格按照相關標準和程序對屠宰后的肉類進行檢驗，確保上市肉類無旋毛蟲感染。對于未經檢疫或檢疫不合格的肉類，嚴禁進入市場銷售。海關等部門應加強對進口肉類的檢驗檢疫，防止境外旋毛蟲病傳入。保護易感人群：加強健康教育，提高公眾對旋毛蟲病的認識和防范意識。通過宣傳海報、科普講座、網絡媒體等多種形式，向公眾普及旋毛蟲病的傳播途徑、危害及預防措施，引導公眾養成良好的飲食衛生習慣。對于從事畜牧業、肉類加工等行業的人員，應加強職業防護，定期進行健康檢查，及時發現和治療感染病例，防止職業感染。在一些肉類加工廠，為工人提供必要的防護用品，如手套、口罩等，并定期組織工人進行健康體檢，可有效預防旋毛蟲病的職業感染。三、旋毛蟲焦磷酸酶功能鑒定3.1焦磷酸酶概述焦磷酸酶（Pyrophosphatase）是一類重要的酶，其催化的反應為一分子焦磷酸鹽（PPi）水解生成兩分子磷酸鹽離子（Pi），這一過程可用反應式P2O74-+H2O+焦磷酸酶→2HPO42-來表示。該反應是一個高放能的過程，在標準條件下，焦磷酸水解反應的ΔG°'約為-19.2kJ/mol，這使得焦磷酸酶能夠偶聯到一些熱力學上不利的生物轉化反應中，為這些反應提供驅動力，推動反應順利進行。焦磷酸酶廣泛分布于自然界的各種生物中，在動物、植物和微生物體內均有發現。在動物細胞中，焦磷酸酶參與了眾多關鍵的生理過程。在能量代謝方面，它與細胞內的ATP合成與水解密切相關。細胞呼吸過程中，ATP的水解會產生ADP和Pi，同時也會產生少量的PPi，焦磷酸酶可及時將PPi水解為Pi，維持細胞內的能量平衡，保證能量代謝的高效進行。在脂代謝過程中，無論是脂肪的合成還是分解，焦磷酸酶都發揮著不可或缺的作用。脂肪合成時，脂肪酸活化生成脂酰輔酶A的過程會產生PPi，焦磷酸酶通過水解PPi，為脂肪酸的活化提供持續的動力，促進脂肪合成。在脂肪分解時，焦磷酸酶同樣參與其中，確保分解過程的順利進行。在骨形成過程中，焦磷酸酶對維持骨骼的正常結構和功能至關重要。它參與了鈣磷代謝的調節，通過影響磷酸鹽的濃度，促進鈣鹽在骨骼中的沉積，有助于骨骼的礦化和生長發育。在植物細胞中，焦磷酸酶也具有重要功能。在光合作用的卡爾文循環中，焦磷酸酶參與了碳固定和碳水化合物的合成過程。在磷酸丙糖合成蔗糖和淀粉的過程中，會產生PPi，焦磷酸酶水解PPi，為這些合成反應提供能量，促進光合作用產物的積累。焦磷酸酶還在植物的生長發育、細胞信號傳導等方面發揮作用，對植物的整體生長和適應環境具有重要意義。在微生物中，焦磷酸酶參與了細胞的物質合成和能量代謝。大腸桿菌中，焦磷酸酶在DNA復制、RNA轉錄以及蛋白質合成等過程中發揮作用，確保這些基本的生命活動能夠順利進行。在芽孢桿菌等微生物中，焦磷酸酶也參與了細胞的代謝調控和適應環境變化的過程。3.2旋毛蟲焦磷酸酶基因克隆與表達3.2.1基因克隆從實驗室保存的旋毛蟲蟲體中，采用Trizol試劑法提取總RNA。具體操作過程如下：將適量的旋毛蟲蟲體置于研缽中，加入液氮迅速研磨至粉末狀，隨后將粉末轉移至含有Trizol試劑的離心管中，充分混勻，使細胞充分裂解，以釋放出RNA。經過一系列的離心、分層等步驟，收集含有RNA的上清液。為了去除殘留的基因組DNA，向上清液中加入適量的DNaseI，在37℃條件下孵育30分鐘，以確保DNA被徹底降解。隨后，使用氯仿進行抽提，通過離心使溶液分層，RNA存在于上層水相中，而蛋白質和其他雜質則被去除到下層有機相中。收集上層水相，加入異丙醇進行沉淀，在-20℃條件下靜置1小時，使RNA充分沉淀。再次離心后，棄去上清液，用75%的乙醇洗滌RNA沉淀，以去除殘留的鹽分和雜質。最后，將RNA沉淀晾干，加入適量的無RNase水溶解，得到高質量的總RNA。使用核酸濃度測定儀對提取的總RNA進行濃度和純度檢測，結果顯示A260/A280比值在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高，無蛋白質和DNA污染，可用于后續實驗。以提取的總RNA為模板，按照反轉錄試劑盒的說明書進行反轉錄反應，獲得cDNA。反轉錄反應體系包括總RNA、隨機引物、dNTPs、反轉錄酶和緩沖液等。將上述反應體系在42℃條件下孵育60分鐘，使RNA逆轉錄為cDNA。隨后，在70℃條件下加熱15分鐘，使反轉錄酶失活，終止反應。根據GenBank中旋毛蟲焦磷酸酶基因的序列，使用PrimerPremier5.0軟件設計特異性引物。上游引物為5'-ATGCTGAAGCTGAAGATG-3'，下游引物為5'-TTAGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，并在引物兩端分別引入EcoRI和XhoI酶切位點，以便后續構建表達載體。以反轉錄得到的cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系包括cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和緩沖液等。PCR反應條件為：94℃預變性5分鐘；94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環；最后72℃延伸10分鐘。擴增結束后，取5μlPCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在電泳過程中，以DNAMarker作為分子量標準，通過與Marker條帶的對比，可以清晰地觀察到PCR產物的大小。結果顯示，在預期大小處出現了特異性條帶，大小約為1.2kb，與旋毛蟲焦磷酸酶基因的理論大小相符，初步表明成功擴增出了目的基因。3.2.2表達載體構建將PCR擴增得到的焦磷酸酶基因片段和表達載體pET-28a(+)分別用EcoRI和XhoI進行雙酶切。酶切反應體系包括DNA片段、限制性內切酶、緩沖液和BSA等。將上述反應體系在37℃條件下孵育3-4小時，使DNA片段被充分酶切。酶切結束后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠回收試劑盒回收酶切后的目的基因片段和線性化的表達載體?；厥者^程中，通過特異性的吸附柱和洗脫液，將目的DNA片段從凝膠中分離出來，去除雜質和其他不需要的DNA片段，獲得高純度的目的基因和表達載體。將回收的目的基因片段和線性化的表達載體按照一定比例混合，加入T4DNA連接酶，在16℃條件下連接過夜。連接反應體系包括目的基因片段、表達載體、T4DNA連接酶和緩沖液等。連接反應完成后，將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中。轉化過程如下：將連接產物加入到DH5α感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘，使DNA與感受態細胞充分結合；隨后，在42℃條件下熱激90秒，促進DNA進入感受態細胞；熱激結束后，立即冰浴2-3分鐘，使細胞恢復正常狀態。向轉化后的細胞中加入適量的LB液體培養基，在37℃、200rpm條件下振蕩培養1小時，使細胞復蘇并表達抗性基因。將復蘇后的細胞涂布在含有卡那霉素的LB固體培養基平板上，在37℃恒溫培養箱中培養12-16小時，使細胞生長形成單菌落。挑取平板上的單菌落，接種到含有卡那霉素的LB液體培養基中，在37℃、200rpm條件下振蕩培養過夜。提取質粒DNA，采用雙酶切和PCR鑒定的方法篩選陽性克隆。雙酶切鑒定時，使用EcoRI和XhoI對質粒DNA進行酶切，酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，若在預期位置出現目的基因片段和表達載體片段，則表明克隆正確。PCR鑒定時，以質粒DNA為模板，使用焦磷酸酶基因的特異性引物進行PCR擴增，若能擴增出預期大小的條帶，則進一步驗證了克隆的正確性。將鑒定正確的陽性克隆送測序公司進行測序，測序結果與GenBank中旋毛蟲焦磷酸酶基因序列進行比對，結果顯示序列一致性達到99%以上，表明成功構建了旋毛蟲焦磷酸酶基因的表達載體。3.2.3蛋白表達與純化將測序正確的重組表達載體pET-28a(+)-TsPPase轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中。轉化方法與轉化至DH5α感受態細胞類似，同樣包括冰浴、熱激、冰浴和復蘇培養等步驟。轉化完成后，將細胞涂布在含有卡那霉素的LB固體培養基平板上，在37℃恒溫培養箱中培養12-16小時，使細胞生長形成單菌落。挑取單菌落接種到含有卡那霉素的LB液體培養基中，在37℃、200rpm條件下振蕩培養至OD600值達到0.6-0.8。此時，細胞處于對數生長期，生長狀態良好，適合進行誘導表達。向培養物中加入終濃度為0.5mM的IPTG，繼續在37℃、200rpm條件下誘導表達4-6小時。IPTG能夠誘導重組蛋白的表達，在誘導過程中，細胞會大量合成目的蛋白。誘導結束后，收集菌體，使用超聲波破碎儀進行破碎。破碎條件為：功率300W，工作3秒，間歇5秒，共進行30分鐘。通過超聲波的作用，使細胞破碎，釋放出細胞內的蛋白。破碎后的菌液在4℃、12000rpm條件下離心30分鐘，收集上清液，即為粗蛋白提取物。采用Ni-NTA親和層析柱對粗蛋白提取物進行純化。Ni-NTA親和層析柱能夠特異性地結合帶有組氨酸標簽的重組蛋白。在純化過程中，首先用平衡緩沖液（20mMTris-HCl，500mMNaCl，pH7.4）平衡Ni-NTA親和層析柱，使層析柱處于適宜的工作狀態。然后將粗蛋白提取物上樣到平衡好的層析柱中，目的蛋白會與Ni-NTA樹脂結合，而其他雜質則會隨流出液流出。接著用洗滌緩沖液（20mMTris-HCl，500mMNaCl，50mM咪唑，pH7.4）洗滌層析柱，去除與樹脂結合不緊密的雜質。最后用洗脫緩沖液（20mMTris-HCl，500mMNaCl，250mM咪唑，pH7.4）洗脫目的蛋白，收集洗脫液。使用SDS電泳檢測純化后的蛋白純度，結果顯示在預期分子量大小處出現了單一的條帶，表明蛋白純度較高，成功獲得了純化的重組旋毛蟲焦磷酸酶蛋白。3.3旋毛蟲焦磷酸酶生化特性分析3.3.1酶活性測定采用鉬酸銨比色法測定重組旋毛蟲焦磷酸酶的活性。首先，配置一系列不同濃度的磷酸標準溶液，如0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM等，作為制作標準曲線的標準品。向各標準品溶液中加入適量的鉬酸銨試劑和還原劑，如抗壞血酸，充分混勻后，在一定溫度下反應一段時間，使磷酸與鉬酸銨形成藍色的磷鉬藍絡合物。以蒸餾水作為空白對照，在特定波長下，使用分光光度計測定各標準品溶液的吸光度值。以磷酸濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，得到吸光度與磷酸濃度的線性回歸方程。在測定酶活性時，取適量的重組旋毛蟲焦磷酸酶溶液，加入到含有焦磷酸鈉底物的反應緩沖液中，反應緩沖液中含有適量的Mg2+，以激活酶的活性。反應體系中焦磷酸鈉的終濃度為5mM，Mg2+的終濃度為2mM，反應緩沖液為50mMTris-HCl（pH7.5）。將反應體系在37℃條件下孵育30分鐘，使酶催化焦磷酸鈉水解生成磷酸。反應結束后，加入鉬酸銨試劑和抗壞血酸，終止反應并顯色，在相同的波長下測定吸光度值。根據標準曲線的回歸方程，計算出反應體系中生成的磷酸的量，從而確定酶的活性。酶活性單位定義為在37℃、pH7.5條件下，每分鐘催化水解1μmol焦磷酸鈉生成磷酸所需的酶量為1個酶活性單位（U）。通過測定不同濃度酶溶液的活性，繪制酶活性與酶濃度的關系曲線，以評估酶的催化活性。3.3.2酶動力學參數分析采用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法分析重組旋毛蟲焦磷酸酶的酶動力學參數。在不同底物濃度下測定酶的活性，底物焦磷酸鈉的濃度分別設置為1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM。反應體系和條件與酶活性測定相同，在37℃、pH7.5條件下，加入適量的重組旋毛蟲焦磷酸酶溶液，反應30分鐘后，測定生成的磷酸的量，計算酶活性。以底物濃度的倒數（1/[S]）為橫坐標，酶活性的倒數（1/V）為縱坐標，繪制Lineweaver-Burk雙倒數圖。通過線性回歸分析，得到直線方程y=kx+b，其中y為1/V，x為1/[S]，k為直線的斜率，b為截距。根據Lineweaver-Burk方程，酶的米氏常數（Km）等于斜率（k）與截距（b）的比值，即Km=k/b；最大反應速率（Vmax）等于截距（b）的倒數，即Vmax=1/b。通過計算得到重組旋毛蟲焦磷酸酶的Km和Vmax值，從而評估酶與底物的親和力和催化效率。較低的Km值表示酶與底物的親和力較高，能夠在較低的底物濃度下達到較高的催化活性；較高的Vmax值則表示酶的催化效率較高，能夠在單位時間內催化更多的底物轉化為產物。3.3.3溫度、pH對酶活性的影響溫度對酶活性的影響：在不同溫度條件下測定重組旋毛蟲焦磷酸酶的活性，以探究溫度對酶活性的影響。設置溫度梯度為20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃。在每個溫度下，取適量的重組旋毛蟲焦磷酸酶溶液，加入到含有焦磷酸鈉底物的反應緩沖液中，反應體系和條件與酶活性測定相同，底物焦磷酸鈉的終濃度為5mM，Mg2+的終濃度為2mM，反應緩沖液為50mMTris-HCl（pH7.5）。反應30分鐘后，加入鉬酸銨試劑和抗壞血酸，終止反應并顯色，測定吸光度值，根據標準曲線計算酶活性。以溫度為橫坐標，酶活性為縱坐標，繪制溫度-酶活性曲線。從曲線中可以看出，隨著溫度的升高，酶活性逐漸增加，當溫度達到37℃時，酶活性達到最大值，表明該溫度為酶的最適反應溫度。當溫度繼續升高時，酶活性逐漸下降，這是由于高溫導致酶蛋白變性，從而影響了酶的活性。在55℃以上，酶活性急劇下降，說明酶在高溫下的穩定性較差。pH對酶活性的影響：在不同pH條件下測定重組旋毛蟲焦磷酸酶的活性，以研究pH對酶活性的影響。設置pH梯度為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5。在每個pH下，取適量的重組旋毛蟲焦磷酸酶溶液，加入到含有焦磷酸鈉底物的反應緩沖液中，反應體系和條件與酶活性測定相同，底物焦磷酸鈉的終濃度為5mM，Mg2+的終濃度為2mM。反應緩沖液分別為50mM的醋酸鈉緩沖液（pH5.0-6.0）、50mM的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液（pH6.0-8.0）和50mM的Tris-HCl緩沖液（pH8.0-9.5）。反應30分鐘后，加入鉬酸銨試劑和抗壞血酸，終止反應并顯色，測定吸光度值，根據標準曲線計算酶活性。以pH為橫坐標，酶活性為縱坐標，繪制pH-酶活性曲線。從曲線中可以看出，酶在pH7.0-8.0范圍內具有較高的活性，其中在pH7.5時酶活性最高，表明該pH為酶的最適反應pH。當pH低于7.0或高于8.0時，酶活性逐漸下降，這是由于pH的變化會影響酶蛋白的電荷分布和空間結構，從而影響酶與底物的結合和催化活性。在pH5.0和pH9.5時，酶活性顯著降低，說明酶在極端pH條件下的穩定性較差。3.4旋毛蟲焦磷酸酶功能驗證3.4.1體內功能驗證為了深入探究旋毛蟲焦磷酸酶在旋毛蟲生理過程中的作用，本研究進行了體內功能驗證實驗。選取6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，隨機分為實驗組和對照組，每組10只。實驗組小鼠經口感染旋毛蟲幼蟲，感染劑量為每只小鼠500條幼蟲。感染后第7天，通過腹腔注射的方式給予實驗組小鼠一定劑量的旋毛蟲焦磷酸酶抑制劑，對照組小鼠則給予等量的生理鹽水。抑制劑的劑量根據前期的預實驗結果確定，以確保能夠有效抑制焦磷酸酶的活性，同時避免對小鼠產生明顯的毒性作用。在感染后的不同時間點，如第14天、第21天和第28天，每組隨機選取5只小鼠，采集小鼠的血清和肌肉組織。采用ELISA法檢測血清中旋毛蟲特異性抗體IgG的水平，以評估小鼠的免疫反應。結果顯示，實驗組小鼠血清中IgG抗體水平明顯低于對照組，表明抑制焦磷酸酶活性可能影響了小鼠對旋毛蟲感染的免疫應答。對肌肉組織進行病理切片觀察，使用蘇木精-伊紅（HE）染色法，在顯微鏡下觀察肌肉組織的形態學變化。結果發現，實驗組小鼠肌肉組織中的幼蟲數量明顯少于對照組，且肌肉組織的炎癥反應較輕，肌纖維的損傷程度也相對較小。這表明旋毛蟲焦磷酸酶在旋毛蟲的生長、發育和致病過程中可能發揮著重要作用，抑制其活性能夠降低旋毛蟲在小鼠體內的寄生數量，減輕對肌肉組織的損傷。進一步采用實時熒光定量PCR技術檢測肌肉組織中與旋毛蟲生長、發育相關基因的表達水平，如蛻皮相關基因、能量代謝相關基因等。結果顯示，實驗組小鼠肌肉組織中這些基因的表達水平與對照組相比發生了顯著變化。蛻皮相關基因的表達下調，表明焦磷酸酶可能參與了旋毛蟲的蛻皮過程，抑制其活性會影響幼蟲的正常蛻皮和發育；能量代謝相關基因的表達也受到影響，說明焦磷酸酶可能在旋毛蟲的能量代謝過程中發揮關鍵作用，其活性被抑制后，旋毛蟲的能量供應受到干擾，從而影響其生長和生存。通過體內功能驗證實驗，初步證實了旋毛蟲焦磷酸酶在旋毛蟲的生理過程中具有重要作用，為深入研究旋毛蟲的致病機制和防治策略提供了重要的實驗依據。3.4.2體外功能驗證利用細胞模型進一步驗證旋毛蟲焦磷酸酶對細胞生理功能的影響。選用人橫紋肌瘤細胞（RD細胞）作為體外培養的細胞模型，該細胞與旋毛蟲在體內寄生的橫紋肌細胞具有相似的生物學特性，能夠較好地模擬旋毛蟲與宿主細胞的相互作用。將RD細胞接種于96孔細胞培養板中，每孔接種1×104個細胞，在37℃、5%CO2的培養箱中培養24小時，待細胞貼壁后，進行后續實驗。將重組旋毛蟲焦磷酸酶蛋白以不同濃度（0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL）加入到細胞培養液中，同時設置對照組，對照組僅加入等量的PBS。每組設置6個復孔，繼續培養24小時。采用CCK-8法檢測細胞增殖情況，向每孔中加入10μLCCK-8試劑，在培養箱中孵育2-4小時，然后用酶標儀在450nm波長處測定吸光度值（OD值）。結果顯示，隨著焦磷酸酶蛋白濃度的增加，細胞的OD值逐漸升高，表明焦磷酸酶能夠促進RD細胞的增殖，且呈濃度依賴性。當焦磷酸酶蛋白濃度為80μg/mL時，細胞的OD值顯著高于對照組，說明高濃度的焦磷酸酶對細胞增殖的促進作用更為明顯。為了檢測細胞凋亡情況，采用AnnexinV-FITC/PI雙染法。將不同處理組的細胞用胰酶消化后，收集細胞懸液，按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒的說明書進行操作。使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，結果顯示，與對照組相比，加入焦磷酸酶蛋白的實驗組細胞凋亡率明顯降低，且隨著焦磷酸酶蛋白濃度的增加，細胞凋亡率逐漸降低。這表明旋毛蟲焦磷酸酶具有抑制RD細胞凋亡的作用，能夠保護細胞免受凋亡的影響，維持細胞的正常生存。通過Transwell實驗檢測細胞遷移能力。在Transwell小室的上室加入100μL含有不同濃度焦磷酸酶蛋白的細胞懸液（細胞密度為1×105個/mL），下室加入600μL含有10%FBS的培養液作為趨化因子。培養24小時后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞，然后用甲醇固定下室遷移的細胞，用結晶紫染色。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數遷移的細胞數量。結果顯示，實驗組遷移的細胞數量明顯多于對照組，且隨著焦磷酸酶蛋白濃度的增加，遷移的細胞數量逐漸增多。這表明旋毛蟲焦磷酸酶能夠促進RD細胞的遷移，增強細胞的運動能力，可能在旋毛蟲感染宿主細胞后的遷移和擴散過程中發揮作用。通過體外功能驗證實驗，明確了旋毛蟲焦磷酸酶對RD細胞的增殖、凋亡和遷移等生理功能具有顯著影響，為揭示旋毛蟲的致病機制提供了有力的證據。四、旋毛蟲口服疫苗的制備4.1疫苗設計策略4.1.1抗原選擇旋毛蟲焦磷酸酶被選定為口服疫苗的關鍵抗原，這一選擇基于多方面的考量。從生物學特性來看，焦磷酸酶在旋毛蟲的整個生命周期中都扮演著重要角色。在旋毛蟲的生長階段，焦磷酸酶參與能量代謝過程，為蟲體的生長提供必要的能量。在發育階段，它對蟲體的細胞分裂、分化等過程起到關鍵的調控作用。在感染宿主的過程中，焦磷酸酶協助旋毛蟲逃避宿主的免疫監視，保障蟲體在宿主體內的生存和繁殖。研究表明，當旋毛蟲感染宿主時，焦磷酸酶能夠調節蟲體周圍的微環境，抑制宿主免疫細胞的活性，從而為自身創造有利的生存條件。在免疫原性方面，前期的研究已證實旋毛蟲焦磷酸酶具有良好的免疫原性。當將重組旋毛蟲焦磷酸酶免疫動物后，動物體內會產生特異性的免疫應答。通過ELISA檢測發現，免疫動物血清中針對焦磷酸酶的特異性抗體水平顯著升高，這表明焦磷酸酶能夠有效地刺激機體的免疫系統，產生體液免疫反應。進一步的細胞免疫實驗表明，免疫動物的脾細胞在受到焦磷酸酶刺激后，會發生明顯的增殖反應，同時分泌多種細胞因子，如IFN-γ、IL-2等，這說明焦磷酸酶也能夠誘導機體產生細胞免疫反應。與其他潛在的旋毛蟲抗原相比，焦磷酸酶具有獨特的優勢。一些傳統的旋毛蟲抗原，如表面抗原，雖然也能誘導機體產生免疫反應，但往往存在免疫原性較弱、易受宿主免疫清除等問題。而旋毛蟲焦磷酸酶不僅免疫原性強，而且在蟲體的生理過程中具有不可替代的作用，針對焦磷酸酶的免疫反應能夠更有效地抑制旋毛蟲的生長和繁殖，從而為宿主提供更全面的保護。4.1.2佐劑篩選佐劑在疫苗中起著至關重要的作用，它能夠增強抗原的免疫原性，提高機體對疫苗的免疫應答水平。在旋毛蟲口服疫苗的制備中，對常用佐劑的篩選和評估是關鍵環節。鋁鹽佐劑是一類廣泛應用的佐劑，主要包括氫氧化鋁和磷酸鋁等。鋁鹽佐劑的作用機制主要是通過在組織中形成抗原貯藏庫，使抗原緩慢釋放，延長抗原在體內的滯留時間，從而持續刺激免疫系統。鋁鹽佐劑還能產生顆粒性抗原來促進抗原提呈給免疫細胞，激活補體系統。然而，鋁鹽佐劑也存在一些缺點，如可能導致輕度局部反應，形成肉芽腫，甚至發生局部無菌性膿腫。當抗原免疫原性較弱時，鋁鹽佐劑不足以顯著提高其免疫原性，特別是對于那些需要T細胞活性介導的免疫反應，鋁鹽佐劑的效果相對有限。弗氏佐劑分為弗氏完全佐劑（FCA）和弗氏不完全佐劑（FIA）。FIA由低引力和低粘度的礦物油及乳化劑組成，是典型的只誘導Th2型細胞因子、誘生抗體的佐劑。FCA則是在FIA的基礎上加一定量的分枝桿菌而成，它能夠同時誘生體液免疫和細胞免疫。弗氏佐劑具有高度活性，在科學研究中被廣泛應用。但其劇烈的副反應限制了其在臨床中的應用，除了少數疫苗外，很少用于臨床醫學。弗氏佐劑可能導致注射部位出現嚴重的炎癥反應、潰瘍等，給患者帶來較大的痛苦。蜂膠佐劑是一種天然免疫增強劑和刺激劑，由蜜蜂上顎腺的分泌物和蜜蜂采集的天然有機物、無機物以及蜂蠟、花粉等組成。蜂膠佐劑本身無抗原性和過敏性，毒性較小，具有增進機體免疫功能和促進組織再生的作用。它可增強補體功能，增加免疫功能細胞和吞噬細胞數量，促進抗體產生，進而增進機體免疫功能。由于蜂膠佐劑所含成分復雜，劑型較多，制法不一，其質量和效果的穩定性存在一定的挑戰。多糖佐劑被普遍認為是一種良好的生物反應調節劑和無細胞毒性的免疫促進劑。多糖佐劑能夠激活T細胞、B細胞、巨噬細胞、NK細胞、TL細胞等免疫細胞，促進巨噬細胞分泌IL-1、腫瘤壞死因子（INF），促進T淋巴細胞產生IL-2，激活白細胞產生干擾素。通過不同的途徑激活補體系統和網狀內皮系統等，對正常細胞沒有毒副作用。多糖佐劑的提取和制備工藝相對復雜，成本較高，限制了其大規模應用。在旋毛蟲口服疫苗的研究中，對這些佐劑進行了系統的評估。通過動物實驗，比較了不同佐劑與旋毛蟲焦磷酸酶聯合使用時對小鼠免疫反應的影響。結果發現，某些佐劑能夠顯著提高小鼠血清中特異性抗體的水平，增強細胞免疫反應，如增加脾細胞的增殖能力和細胞因子的分泌量。綜合考慮佐劑的增強效果、安全性和成本等因素，最終篩選出最適合旋毛蟲口服疫苗的佐劑，以確保疫苗能夠激發機體產生強大而持久的免疫保護作用。4.1.3劑型優化疫苗的劑型對其穩定性和免疫效果有著重要影響。在旋毛蟲口服疫苗的制備過程中，劑型優化是提高疫苗質量的關鍵環節。傳統的疫苗劑型存在一些局限性。液體劑型的疫苗在儲存和運輸過程中容易受到溫度、濕度等環境因素的影響，導致抗原的穩定性下降，免疫原性降低。液體疫苗的保存期限較短，需要頻繁更換庫存，增加了成本和管理難度。為了解決這些問題，研究人員探索了多種新型劑型。微膠囊劑型是一種具有潛力的疫苗劑型。將旋毛蟲焦磷酸酶包裹在微膠囊中，能夠有效地保護抗原免受外界環境的影響。微膠囊可以控制抗原的釋放速度，使其在體內持續發揮作用。采用生物可降解材料制備的微膠囊，不僅安全可靠，而且能夠提高疫苗的穩定性和免疫效果。實驗表明，微膠囊劑型的旋毛蟲口服疫苗在模擬胃腸道環境中能夠保持抗原的完整性，并且能夠促進抗原的吸收和免疫細胞的攝取，從而增強免疫反應。脂質體劑型也是一種常用的疫苗劑型。脂質體是磷脂分散在水相中形成的脂質雙分子層，內部為水相的閉合囊泡，結構類似生物膜。脂質體能夠協助抗原或半抗原誘導體液免疫和細胞免疫，與其他佐劑聯合應用時具有協同作用。脂質體可以通過多種免疫途徑將抗原傳遞至抗原遞呈細胞。將旋毛蟲焦磷酸酶負載于脂質體中，能夠提高抗原的靶向性，增強其與免疫細胞的相互作用。脂質體還能夠調節免疫反應的類型，促進Th1型免疫反應的產生，從而提高疫苗的免疫保護效果。納米顆粒劑型是近年來發展起來的新型疫苗劑型。納米顆粒具有小尺寸效應、表面效應和量子尺寸效應等獨特的物理化學性質，能夠提高抗原的穩定性和免疫原性。納米顆?？梢栽鰪娍乖奈胶蛿z取，促進抗原的加工和呈遞，從而激發更強烈的免疫反應。研究發現，納米顆粒劑型的旋毛蟲口服疫苗能夠有效地激活樹突狀細胞，增強其抗原呈遞能力，進而促進T細胞和B細胞的活化，提高免疫效果。在旋毛蟲口服疫苗的劑型優化過程中，通過對比不同劑型疫苗的穩定性、免疫原性和免疫保護效果，確定了最佳的劑型方案。綜合考慮疫苗的穩定性、免疫效果、制備工藝和成本等因素，選擇了最適合的劑型，以確保疫苗在儲存、運輸和使用過程中能夠保持良好的性能，為旋毛蟲病的預防提供有效的手段。四、旋毛蟲口服疫苗的制備4.2疫苗制備工藝4.2.1抗原制備選用在3.2節中成功表達并純化的重組旋毛蟲焦磷酸酶蛋白作為疫苗的關鍵抗原。將經Ni-NTA親和層析柱純化后的蛋白溶液，使用超濾管進行濃縮處理，以提高蛋白濃度，滿足疫苗制備的需求。超濾管的截留分子量根據蛋白的大小進行選擇，確保在濃縮過程中蛋白不被截留，同時去除多余的鹽分和小分子雜質。通過Bradford法對濃縮后的蛋白進行濃度測定，以牛血清白蛋白（BSA）作為標準品，繪制標準曲線，從而準確確定蛋白的濃度。將測定好濃度的重組旋毛蟲焦磷酸酶蛋白分裝至無菌的離心管中，每管的分裝量根據后續實驗的需求進行確定，確保在疫苗制備和實驗過程中能夠方便取用。將分裝后的蛋白置于-80℃冰箱中保存，以保持蛋白的穩定性和活性。在保存過程中，避免頻繁凍融，以免影響蛋白的結構和功能。在使用前，將冷凍的蛋白取出，置于冰上緩慢解凍，確保蛋白在解凍過程中不發生變性。4.2.2佐劑添加根據4.1.2節中對佐劑的篩選結果，選用效果最佳的佐劑進行添加。以常用的黏膜佐劑霍亂毒素B亞單位（CTB）為例，將其與重組旋毛蟲焦磷酸酶蛋白按照一定比例混合。在無菌條件下，將適量的CTB佐劑溶液加入到含有重組蛋白的離心管中，確保佐劑與蛋白充分混合。具體的混合比例根據前期的實驗結果確定，一般CTB與重組蛋白的質量比為1:5-1:10。使用渦旋振蕩器對混合溶液進行振蕩，使佐劑和蛋白均勻分散，促進二者之間的相互作用。振蕩時間一般為3-5分鐘，確保混合均勻。將混合后的溶液在4℃條件下孵育1-2小時，使佐劑與蛋白充分結合，形成穩定的復合物。孵育過程中，可定期輕輕振蕩溶液，以保證結合效果的一致性。4.2.3疫苗成型將經過佐劑添加處理后的混合溶液進一步加工制成口服疫苗。采用噴霧干燥法進行疫苗成型，首先將混合溶液轉移至噴霧干燥設備的進料罐中。噴霧干燥設備的參數根據疫苗的特性進行優化設置，進風溫度一般控制在120-150℃，出風溫度控制在70-90℃，以確保在干燥過程中疫苗的活性不受影響。噴霧壓力設置為0.2-0.4MPa，使混合溶液能夠均勻地霧化成微小的液滴，在熱空氣的作用下迅速干燥成粉末狀疫苗。在噴霧干燥過程中，收集干燥后的疫苗粉末，使用無菌的容器進行收集，確保疫苗的無菌性。對收集到的疫苗粉末進行質量檢測，包括外觀、粒度分布、水分含量等指標的檢測。外觀應呈現均勻的粉末狀，無結塊現象；粒度分布應符合預期的范圍，以保證疫苗在口服過程中的分散性和吸收性；水分含量應控制在較低水平，一般不超過5%，以防止疫苗在儲存過程中發生變質。將檢測合格的疫苗粉末分裝至腸溶膠囊中，每粒腸溶膠囊的裝量根據疫苗的劑量和實驗需求進行確定。腸溶膠囊能夠保護疫苗在胃內不被胃酸破壞，確保疫苗能夠順利到達腸道，發揮免疫作用。將裝有疫苗的腸溶膠囊置于4℃冰箱中保存，在儲存過程中，定期對疫苗的穩定性和免疫原性進行檢測，確保疫苗在有效期內的質量和效果。4.3疫苗質量控制4.3.1抗原含量測定采用BCA（BicinchoninicAcid）蛋白定量法對旋毛蟲口服疫苗中的重組旋毛蟲焦磷酸酶抗原含量進行精確測定。該方法基于蛋白質中的肽鍵在堿性條件下與Cu2+發生絡合反應，生成Cu+，而BCA試劑可與Cu+特異性結合，形成紫色絡合物，其在562nm處有強烈的吸光值，且吸光值與蛋白濃度呈線性關系。在實際操作時，先配置一系列不同濃度的牛血清白蛋白（BSA）標準溶液，如0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL等，作為制作標準曲線的標準品。向各標準品溶液中加入適量的BCA工作液，充分混勻后，在37℃條件下孵育30分鐘，使反應充分進行。以蒸餾水作為空白對照，在562nm波長下，使用分光光度計測定各標準品溶液的吸光度值。以蛋白濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，得到吸光度與蛋白濃度的線性回歸方程。取適量的旋毛蟲口服疫苗樣品，加入適量的裂解液進行裂解，使疫苗中的抗原充分釋放。將裂解后的樣品離心，取上清液進行BCA蛋白定量測定。操作步驟與標準品測定相同，加入BCA工作液后孵育30分鐘，然后在562nm波長下測定吸光度值。根據標準曲線的回歸方程，計算出樣品中的抗原含量。通過多次測定不同批次疫苗的抗原含量，以評估疫苗的一致性和穩定性，確保每批次疫苗中的抗原含量符合質量標準，保證疫苗的有效性。4.3.2純度檢測運用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）技術對疫苗的純度進行檢測。SDS是一種常用的蛋白質分離技術，它根據蛋白質分子量的大小在聚丙烯酰胺凝膠中進行分離。在制備聚丙烯酰胺凝膠時，根據重組旋毛蟲焦磷酸酶蛋白的分子量大小，選擇合適的凝膠濃度，一般選用12%的分離膠和5%的濃縮膠。將疫苗樣品與適量的上樣緩沖液混合，上樣緩沖液中含有SDS、β-巰基乙醇等成分，SDS能夠使蛋白質變性并帶上負電荷，β-巰基乙醇則用于還原蛋白質中的二硫鍵，使蛋白質充分伸展。將混合后的樣品在100℃條件下煮沸5分鐘，使蛋白質完全變性。將變性后的樣品加入到凝膠的加樣孔中，同時加入蛋白分子量標準Marker，Marker中含有一系列已知分子量的蛋白質，用于確定樣品中蛋白質的分子量。在電泳過程中，設置合適的電壓和電流，一般先在濃縮膠中以80V的電壓進行電泳，待樣品進入分離膠后，將電壓調至120V，使蛋白質在分離膠中充分分離。電泳結束后，將凝膠取出，用考馬斯亮藍染色液進行染色，染色液中的考馬斯亮藍能夠與蛋白質結合，使蛋白質條帶顯色。染色30分鐘后，用脫色液進行脫色，去除凝膠上多余的染色液，使蛋白質條帶更加清晰。通過觀察凝膠上蛋白質條帶的數量和位置，判斷疫苗中抗原的純度。若在預期分子量大小處僅出現單一的條帶，表明疫苗中的抗原純度較高，無明顯的雜蛋白污染；若出現多條條帶，則說明疫苗中存在雜質，需要進一步優化制備工藝，提高疫苗的純度。4.3.3穩定性評估對旋毛蟲口服疫苗在不同條件下的穩定性進行全面評估，以確保疫苗在儲存和運輸過程中的質量和有效性。在不同溫度條件下，將疫苗分別置于4℃、25℃和37℃環境中保存，定期對疫苗進行抗原含量測定和純度檢測。在4℃條件下，每隔1個月進行一次檢測；在25℃條件下，每隔2周進行一次檢測；在37℃條件下，每隔1周進行一次檢測。通過比較不同時間點疫苗的抗原含量和純度變化，評估疫苗在不同溫度下的穩定性。在4℃條件下，疫苗的抗原含量在6個月內基本保持穩定，純度也無明顯變化；在25℃條件下，疫苗的抗原含量在3個月內略有下降，純度基本不變；在37℃條件下，疫苗的抗原含量在1周后開始明顯下降，純度也受到一定影響。對疫苗進行加速穩定性試驗，將疫苗置于高溫高濕環境中，如40℃、75%相對濕度的條件下保存，每隔3天進行一次抗原含量測定和純度檢測。通過加速穩定性試驗，快速評估疫苗在極端條件下的穩定性，為疫苗的儲存和運輸提供參考依據。結果顯示，在40℃、75%相對濕度條件下，疫苗的抗原含量和純度在1周內迅速下降，表明疫苗在高溫高濕環境下的穩定性較差，需要在儲存和運輸過程中嚴格控制環境條件。觀察疫苗在不同保存時間下的外觀變化，如是否出現變色、沉淀、分層等現象。若疫苗出現變色、沉淀或分層等異常情況，說明疫苗的穩定性受到影響，可能會影響其免疫效果，應及時進行處理或報廢。對疫苗在不同條件下的穩定性進行評估，為確定疫苗的有效期和儲存條件提供科學依據，確保疫苗在使用前保持良好的質量和免疫原性。五、旋毛蟲口服疫苗的免疫保護作用研究5.1動物實驗設計5.1.1實驗動物選擇本研究選用6-8周齡的雌性BALB/c小鼠作為實驗動物，體重在18-22g之間。BALB/c小鼠是一種常用的實驗動物，具有遺傳背景明確、免疫反應穩定等優點，在免疫學研究中被廣泛應用。其對旋毛蟲具有較高的易感性，能夠較好地模擬人類感染旋毛蟲后的免疫反應和病理變化，為研究旋毛蟲口服疫苗的免疫保護作用提供了可靠的動物模型。此外，BALB/c小鼠繁殖能力強，易于飼養和管理，能夠滿足本研究對動物數量的需求。在實驗前，將小鼠飼養于溫度（22±2）℃、濕度（50±10）%的環境中，給予充足的食物和水，適應性飼養1周，以確保小鼠的健康狀態穩定，減少實驗誤差。5.1.2分組與免疫程序將40只BALB/c小鼠隨機分為實驗組和對照組，每組20只。實驗組小鼠口服接種制備好的旋毛蟲焦磷酸酶口服疫苗，對照組小鼠給予等量的PBS。免疫程序為每隔兩周免疫一次，共免疫三次。每次免疫時，將疫苗或PBS用無菌注射器經口灌胃給予小鼠，灌胃體積為0.2mL/只。在每次免疫后的第7天，采集小鼠的血清，采用ELISA法檢測血清中特異性抗體IgG的水平，以監測小鼠的免疫應答情況。在免疫過程中，密切觀察小鼠的健康狀況，記錄小鼠的體重變化、飲食情況等指標，確保小鼠在免疫過程中無明顯不良反應。若發現小鼠出現異常癥狀，如發熱、腹瀉、精神萎靡等，及時進行相應的處理，并分析原因。5.1.3攻毒實驗在末次免疫后兩周，對所有小鼠進行旋毛蟲幼蟲攻擊感染。將感染性旋毛蟲幼蟲用無菌生理鹽水稀釋至適當濃度，每只小鼠經口灌胃感染500條幼蟲，灌胃體積為0.2mL/只。攻毒后，每天觀察小鼠的臨床癥狀，包括精神狀態、活動能力、飲食情況、毛發狀態等，記錄小鼠的發病時間和死亡情況。在攻毒后的第7天、第14天、第21天和第35天，每組分別隨機選取5只小鼠，采集小鼠的血清和肌肉組織。采用ELISA法檢測血清中特異性抗體IgG的水平，觀察抗體水平在攻毒后的變化情況；對肌肉組織進行病理切片觀察，使用蘇木精-伊紅（HE）染色法，在顯微鏡下觀察肌肉組織的形態學變化，包括炎癥細胞浸潤、肌纖維損傷等情況；計數肌肉中的幼蟲荷，評估疫苗對旋毛蟲在小鼠體內寄生數量的影響，從而全面評價疫苗的免疫保護作用。5.2免疫應答檢測5.2.1體液免疫應答在初次免疫后的第7天、第14天、第21天，以及末次免疫后的第7天、第14天，分別采集實驗組和對照組小鼠的血清，采用間接ELISA法檢測血清中特異性抗體IgG及其亞類IgG1、IgG2a的水平。首先，用包被緩沖液將重組旋毛蟲焦磷酸酶蛋白稀釋至10μg/mL，包被96孔酶標板，每孔100μL，4℃過夜。次日，棄去包被液，用PBST洗滌3次，每次3分鐘，以去除未結合的蛋白。然后，加入5%脫脂奶粉封閉液，每孔200μL，37℃孵育1小時，以封閉酶標板上的非特異性結合位點。封閉結束后，再次用PBST洗滌3次。將稀釋好的小鼠血清加入酶標板中，每孔100μL，37℃孵育1小時。血清稀釋度從1:100開始，進行倍比稀釋，以檢測不同稀釋度下抗體的水平。孵育結束后，用PBST洗滌3次。加入HRP標記的羊抗鼠IgG或IgG1、IgG2a二抗，每孔100μL，37℃孵育45分鐘。二抗的稀釋度根據說明書進行調整，一般為1:5000-1:10000。孵育結束后，用PBST洗滌5次。最后，加入TMB底物顯色液，每孔100μL，37℃避光孵育15-20分鐘，使底物與酶結合產生顏色反應。當顏色反應達到適當強度時，加入2MH2SO4終止液，每孔50μL，終止反應。使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。實驗結果顯示，實驗組小鼠在免疫后，血清中特異性IgG抗體水平逐漸升高，在末次免疫后的第14天達到峰值，顯著高于對照組（P<0.05）。這表明旋毛蟲焦磷酸酶口服疫苗能夠有效刺激小鼠產生體液免疫應答，產生特異性IgG抗體。進一步分析抗體亞類，發現IgG1和IgG2a的水平均有升高，但IgG1的升高更為顯著，說明疫苗誘導的免疫應答以Th2型免疫反應為主。Th2型免疫反應主要通過分泌IL-4、IL-5等細胞因子，促進B細胞的活化和分化，產生IgG1等抗體，在體液免疫中發揮重要作用。而IgG2a則與Th1型免疫反應相關，雖然其水平也有所升高，但相對較低，說明疫苗誘導的Th1型免疫反應相對較弱。5.2.2細胞免疫應答在末次免疫后的第7天，脫頸椎處死實驗組和對照組小鼠，無菌取出脾臟，制備脾細胞懸液。采用淋巴細胞增殖實驗檢測脾細胞的增殖能力，將脾細胞以2×105個/孔的密度接種于96孔細胞培養板中，同時設置空白對照組（只加培養液）和ConA刺激對照組（加入終濃度為5μg/mL的ConA）。每孔加入100μLRPMI1640完全培養液，其中含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素。將培養板置于37℃、5%CO2的培養箱中培養72小時。在培養結束前4小時，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續培養4小時后，用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。以刺激指數（SI）來評估脾細胞的增殖能力，SI=實驗組OD值/空白對照組OD值。結果顯示，實驗組小鼠脾細胞在重組旋毛蟲焦磷酸酶蛋白刺激下，SI值顯著高于對照組（P<0.05），表明疫苗免疫能夠有效促進脾細胞的增殖，增強細胞免疫應答。采用ELISA法檢測脾細胞培養上清中細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的水平。將脾細胞以5×106個/mL的密度接種于24孔細胞培養板中，每孔加入1mLRPMI1640完全培養液，并加入重組旋毛蟲焦磷酸酶蛋白（終濃度為10μg/mL），同時設置對照組（只加培養液）。將培養板置于37℃、5%CO2的培養箱中培養48小時。培養結束后，收集細胞培養上清，按照ELISA試劑盒的說明書進行操作。首先，用包被緩沖液將抗細胞因子的捕獲抗體包被96孔酶標板，每孔100μL，4℃過夜。次日，棄去包被液，用PBST洗滌3次，每次3分鐘。加入封閉液，每孔200μL，37℃孵育1小時。封閉結束后，再次用PBST洗滌3次。將稀釋好的細胞培養上清加入酶標板中，每孔100μL，37℃孵育2小時。孵育結束后，用PBST洗滌3次。加入生物素標記的檢測抗體，每孔100μL，37℃孵育1小時。洗滌后，加入HRP標記的鏈霉親和素，每孔100μL，37℃孵育30分鐘。再次洗滌后，加入TMB底物顯色液，每孔100μL，37℃避光孵育15-20分鐘，最后加入2MH2SO4終止液，每孔50μL，終止反應。使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值，根據標準曲線計算細胞因子的濃度。實驗結果表明，實驗組小鼠脾細胞培養上清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的水平均顯著高于對照組（P<0.05）。IFN-γ和IL-2是Th1型細胞因子，能夠促進T細胞的活化和增殖，增強細胞免疫功能；IL-4和IL-10是Th2型細胞因子，在體液免疫和免疫調節中發揮重要作用。這說明旋毛蟲焦磷酸酶口服疫苗能夠誘導小鼠產生Th1和Th2混合型免疫應答，全面增強機體的免疫功能。5.2.3黏膜免疫應答在末次免疫后的第7天，收集實驗組和對照組小鼠的小腸灌洗液，采用ELISA法檢測灌洗液中分泌型免疫球蛋白A（sIgA）的水平。首先，用包被緩沖液將重組旋毛蟲焦磷酸酶蛋白稀釋至10μg/mL，包被96孔酶標板，每孔100μL，4℃過夜。次日，棄去包被液，用PBST洗滌3次，每次3分鐘。加入5%脫脂奶粉封閉液，每孔200μL，37℃孵育1小時。封閉結束后，再次用PBST洗滌3次。將稀釋好的小腸灌洗液加入酶標板中，每孔100μL，37℃孵育1小時。灌洗液的稀釋度根據預實驗結果進行調整，一般為1:10-1:100。孵育結束后，用PBST洗滌3次。加入HRP標記的羊抗鼠sIgA二抗，每孔100μL，37℃孵育45分鐘。二抗的稀釋度根據說明書進行調整，一般為1:5000-1:10000。孵育結束后，用PBST洗滌5次。最后，加入TMB底物顯色液，每孔100μL，37℃避光孵育15-20分鐘，加入2MH2SO4終止液，每孔50μL，終止反應。使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值，根據標準曲線計算sIgA的濃度。結果顯示，實驗組小鼠小腸灌洗液中sIgA水平顯著高于對照組（P<0.05），表明旋毛蟲焦磷酸酶口服疫苗能夠有效誘導小鼠腸道黏膜產生免疫應答，產生特異性sIgA。sIgA是黏膜免疫的重要效應分子，能夠在腸道黏膜表面形成一道免疫屏障，阻止病原體的黏附和侵入，發揮局部免疫保護作用。5.3免疫保護效果評估5.3.1減蟲率計算在攻毒后的第35天，將實驗組和對照組小鼠全部脫頸椎處死，迅速采集其膈肌和肋間肌等部位的肌肉組織。將采集到的肌肉組織剪碎，采用人工胃液消化法處理，將剪碎的肌肉組織加入到含有適量人工胃液（0.7%鹽酸和1%胃蛋白酶）的三角瓶中，在37℃恒溫搖床中以150rpm的轉速振蕩消化4-6小時，使肌肉組織充分消化，釋放出其中的旋毛蟲幼蟲。消化結束后，將消化液通過400目篩網過濾，去除未消化的組織殘渣。將濾液轉移至離心管中，在3000rpm條件下離心10分鐘，使幼蟲沉淀。棄去上清液，向沉淀中加入適量的生理鹽水，重新懸浮幼蟲，再次離心，重復洗滌3-4次，以去除雜質。將洗滌后的幼蟲懸浮于少量生理鹽水中，取10μL懸浮液滴于載玻片上，在顯微鏡下計數幼蟲數量。每個樣品重復計數3次，取平均值。成蟲減蟲率的計算公式為：成蟲減蟲率（%）=（對照組成蟲數-實驗組成蟲數）/對照組成蟲數×100%。肌肉幼蟲減蟲