一、引言1.1研究背景與意義沙門菌（Salmonella）是一種廣泛存在于自然界中的革蘭氏陰性桿菌，是腸桿菌科的一個重要分支，也是一類重要的人畜共患病原菌，在公共衛生領域備受關注。該菌主要經消化道感染，宿主范圍廣泛，包括人類、家畜、家禽及野生禽獸等。感染沙門菌后，人或動物可能出現無癥狀帶菌狀態，也可能表現出嚴重的臨床癥狀，如發熱、腹瀉、嘔吐、敗血癥等，甚至導致死亡。在全球范圍內，沙門菌感染給人類健康和畜牧業生產帶來了巨大的威脅和經濟損失。據世界衛生組織（WHO）估計，每年全球約有1.6億人感染沙門菌，其中21.6萬人死亡。在我國，沙門菌引起的食物中毒和食源性疾病案例也一直位居細菌性食物中毒前列，占比達42.6%-60.0%。豬作為沙門菌的主要宿主之一，豬肉在中國人日常飲食的動物蛋白來源中占到近70％的比例，豬源沙門菌不僅會導致豬群發病，影響豬肉的產量和質量，還可通過食物鏈傳播給人類，引發食物中毒和食源性疾病，嚴重威脅公眾健康。近年來，隨著我國豬肉產量和消費量的持續增長，豬源沙門菌引起的食品安全問題日益凸顯。揚州地區作為我國重要的生豬養殖和豬肉消費區域，其豬源沙門菌的污染情況和耐藥性問題不容忽視。對揚州地區豬源沙門菌進行分離、鑒定及耐藥性分析，有助于了解該地區豬源沙門菌的流行特征和耐藥現狀，為制定科學有效的防控措施提供依據。同時，本研究也可為保障揚州地區乃至全國的豬肉食品安全提供技術支持，具有重要的理論和實踐意義。1.2國內外研究現狀在國外，豬源沙門菌的研究開展較早且較為深入。早在20世紀，歐美等發達國家就已關注到豬源沙門菌對養豬業和公共衛生的影響，并開展了相關的分離鑒定和耐藥性研究。研究發現，不同地區的豬源沙門菌血清型分布存在差異，其中鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌等在多個國家和地區均有較高的檢出率。在耐藥性方面，隨著抗生素在畜牧業中的廣泛使用，豬源沙門菌的耐藥現象日益嚴重，多重耐藥菌株不斷出現。有研究表明，歐美部分地區的豬源沙門菌對四環素、氨芐西林、磺胺類等多種常用抗生素的耐藥率高達50%以上，且耐藥譜呈現不斷擴大的趨勢。近年來，國外在豬源沙門菌的致病機制、傳播途徑以及防控策略等方面也取得了顯著進展。通過分子生物學技術，深入研究了沙門菌的毒力基因和致病相關因子，為開發新型疫苗和治療藥物提供了理論基礎。同時，加強了對豬肉生產鏈的全程監控，從養殖、屠宰到加工銷售環節，采取一系列措施來降低沙門菌的污染風險，如優化養殖環境、規范抗生素使用、加強食品檢測等。在國內，豬源沙門菌的研究也受到了廣泛關注。許多地區開展了豬源沙門菌的分離鑒定和耐藥性調查工作，發現我國豬源沙門菌的血清型復雜多樣，除了常見的鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌外，還存在一些具有地域特色的血清型。在耐藥性方面，由于我國養豬業規模龐大且養殖模式多樣，部分地區存在抗生素濫用的現象，導致豬源沙門菌的耐藥情況較為嚴峻。相關研究顯示，我國部分地區豬源沙門菌對多種抗生素的耐藥率超過60%，多重耐藥菌株的比例也較高，給臨床治療和防控帶來了很大困難。揚州地區作為我國重要的生豬養殖和豬肉消費區域，已有部分學者對該地區豬源沙門菌進行了研究。印廣浩等人在2015-2016年間，對揚州部分屠宰場、農貿市場及動物醫院的樣品進行了沙門菌分離鑒定及耐藥性分析，結果顯示屠宰場樣品中沙門菌的分離率為10.5％，農貿市場樣品中沙門菌分離率19.7％，動物醫院樣品中沙門菌的分離率為2.6％。屠宰場分離株中德爾卑沙門菌分離率最高(63.6％)，農貿市場分離株中羅森沙門菌和德爾卑沙門菌分離率最高(27.8％)，動物醫院送檢病料中的檢出的全部為鼠傷寒沙門菌(100％)。84.8％沙門菌分離株對四環素表現出極高的耐藥率，對強力霉素、羧芐西林也有較高的耐藥率。李康康等人于2021年采集揚州市農貿市場豬肉樣品393份，進行沙門氏桿菌的分離純化、PCR鑒定和血清型鑒定，結果共分離到150株沙門氏桿菌，總分離率為38.2%，優勢血清型為倫敦沙門氏桿菌。88.7%的分離菌株對多西環素耐藥，對四環素(86.7%)、氨芐西林(84.0%)、阿莫西林(76.0%)、氯霉素(75.3%)和氟苯尼考(74.0%)也有較高的耐藥率。92.0%的分離菌株表現出多重耐藥，其中48.0%的分離菌株耐8-10種抗生素。然而，目前揚州地區豬源沙門菌的研究仍存在一些不足之處。一方面，以往的研究主要集中在屠宰場和農貿市場等特定場所，對于養殖場、運輸環節等豬肉生產鏈其他環節的沙門菌污染情況研究較少，難以全面了解豬源沙門菌在揚州地區的傳播規律。另一方面，在耐藥性研究方面，雖然已有對常見抗生素耐藥性的檢測，但對于新型抗生素以及耐藥基因的傳播機制研究還不夠深入，無法為臨床合理用藥和耐藥性防控提供更全面的技術支持。此外，不同研究之間的采樣時間、方法和檢測標準存在差異，導致數據的可比性和連續性較差，不利于對揚州地區豬源沙門菌的長期動態監測和分析。1.3研究目標與內容本研究旨在全面了解揚州地區豬源沙門菌的流行情況和耐藥現狀，為該地區豬源沙門菌病的防控以及豬肉食品安全的保障提供科學依據和技術支持。具體研究內容如下：豬源沙門菌的分離與鑒定：從揚州地區的養殖場、屠宰場、農貿市場等豬肉生產鏈的不同環節采集豬的糞便、組織以及豬肉等樣品。運用標準的細菌分離培養技術，對樣品中的沙門菌進行分離。通過形態學觀察、生化試驗以及分子生物學方法（如PCR擴增沙門菌的特異性基因invA），對分離菌株進行準確鑒定，確定其是否為沙門菌。豬源沙門菌的血清型鑒定：采用血清學方法，利用沙門菌的O抗原和H抗原診斷血清，對分離得到的沙門菌進行血清型鑒定。通過玻片凝集試驗等操作，確定菌株的血清型，分析揚州地區豬源沙門菌的優勢血清型及其分布特點，為追蹤沙門菌的傳播途徑和防控提供依據。豬源沙門菌的耐藥性分析：運用紙片擴散法（K-B法）或肉湯稀釋法，對分離的沙門菌進行多種常用抗生素的藥敏試驗。檢測的抗生素種類包括β-內酰胺類（如氨芐西林、阿莫西林等）、氨基糖苷類（如慶大霉素、卡那霉素等）、四環素類（如四環素、多西環素等）、氯霉素類（如氯霉素、氟苯尼考等）、喹諾酮類（如環丙沙星、恩諾沙星等）以及磺胺類等。根據藥敏試驗結果，計算各抗生素的耐藥率、中介率和敏感率，分析揚州地區豬源沙門菌的耐藥譜和耐藥趨勢。耐藥基因的檢測：采用PCR技術，對耐藥菌株進行常見耐藥基因的檢測。如檢測β-內酰胺類抗生素耐藥相關基因（如blaTEM、blaSHV、blaCTX-M等）、四環素類耐藥基因（如tetA、tetB、tetC等）、氯霉素類耐藥基因（如floR、cat等）、喹諾酮類耐藥基因（如gyrA、parC等）以及磺胺類耐藥基因（如sul1、sul2、sul3等）。分析耐藥基因的攜帶情況與細菌耐藥表型之間的相關性，探討耐藥基因在豬源沙門菌中的傳播機制。分子分型研究：運用多位點序列分型（MLST）技術，對部分代表性的沙門菌分離株進行分子分型。通過PCR擴增多個管家基因（如aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA、thrA等），對擴增產物進行測序，將測序結果與國際MLST數據庫中的序列進行比對，確定菌株的序列型（ST）。分析不同ST型菌株的分布特征及其與耐藥性之間的關系，為追蹤沙門菌的傳播和溯源提供分子水平的依據。二、材料與方法2.1樣本采集在2023年1月至2023年12月期間，于揚州地區的多個生豬屠宰場、農貿市場以及不同規模和養殖模式的養殖場開展樣本采集工作。在養殖場，隨機選取健康狀況不同的生豬，使用無菌棉簽深入直腸采集糞便樣本，每頭豬采集一份，每份糞便樣本量約為5-10克，采集后立即將棉簽放入含有10毫升無菌生理鹽水的采樣管中，輕輕振蕩使糞便均勻分散，標記好豬只編號、養殖場名稱、采集日期等信息。對于病死豬或疑似感染沙門菌的病豬，在無菌條件下采集肝臟、脾臟、腸系膜淋巴結等組織樣本，每個組織樣本約1-2克，放入無菌自封袋中，并做好相應標記。在屠宰場，分別在生豬待宰區、屠宰生產線以及分割車間進行樣本采集。在待宰區，采集生豬的糞便樣本，方法同養殖場。在屠宰生產線，于生豬放血后，立即采集其心臟血液，每份血液樣本量約為5毫升，注入含有抗凝劑的無菌采血管中。同時，采集豬的胴體表面擦拭樣，使用無菌棉拭子蘸取無菌生理鹽水，在豬胴體的頸部、腹部、背部等多個部位反復擦拭，然后將棉拭子放入含有10毫升無菌生理鹽水的采樣管中。在分割車間，采集分割后的豬肉樣本，每份約50克，放入無菌自封袋中，并記錄屠宰場名稱、采集時間、批次等信息。在農貿市場，隨機選擇不同攤位的豬肉進行采樣。采集豬肉的表面組織，每份約20克，使用無菌剪刀剪取后放入無菌自封袋中。同時，采集攤位上的環境樣本，如案板擦拭樣、刀具擦拭樣等，方法同屠宰場的胴體表面擦拭樣采集方法。記錄農貿市場名稱、攤位號、采樣日期等信息。本次研究共采集豬糞便樣本300份、組織樣本（肝臟、脾臟、淋巴結等）100份、豬肉樣本200份以及環境樣本（案板、刀具等）100份，確保樣本來源廣泛且具有代表性，能夠全面反映揚州地區豬源沙門菌的污染情況。2.2沙門菌分離將采集到的樣本按照1:9的比例接種于緩沖蛋白胨水（BPW）中，充分振蕩混勻，使樣本在BPW中均勻分散。將接種后的BPW置于37℃恒溫培養箱中，培養12-18小時，進行預增菌，以恢復受損沙門菌細胞的活性，使其進入對數生長期，增加沙門菌的數量，便于后續的分離操作。預增菌結束后，取1mL預增菌培養物，轉接至10mL四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）中，同時另取1mL預增菌培養物轉接至10mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）中。將接種后的TTB置于42℃恒溫培養箱中，培養18-24小時；將接種后的SC置于36℃恒溫培養箱中，培養18-24小時，進行選擇性增菌，抑制其他雜菌的生長，進一步富集沙門菌。增菌培養結束后，用接種環分別蘸取TTB和SC培養物，在亞硫酸鉍瓊脂（BS）平板、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂（XLD）平板以及沙門菌顯色培養基平板上進行三區劃線接種，將菌液均勻地分布在平板表面，以獲得單個菌落。將接種后的平板置于36℃恒溫培養箱中，其中BS平板培養40-48小時，XLD平板和沙門菌顯色培養基平板培養18-24小時。培養過程中，沙門菌在不同平板上會形成具有特征性的菌落形態，如在BS平板上，沙門菌菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養基可呈黑色或棕色；在XLD平板上，菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現大的帶光澤的黑色中心，或呈現全部黑色的菌落；在沙門菌顯色培養基平板上，根據不同廠家的產品，菌落會呈現出特定的顏色和形態，可依據廠家說明書進行判斷。從選擇性平板上挑取2-3個典型或可疑的單個菌落，用接種針先在三糖鐵瓊脂斜面上進行劃線，從斜面底部向上劃，然后再于底層進行穿刺接種，注意穿刺時不要穿透底層，接種針不要滅菌，直接用該接種針接種賴氨酸脫羧酶試驗培養基，同時設置氨基酸脫羧酶對照培養基，在培養基表面覆蓋2-3滴液體石蠟，防止氧氣進入影響反應結果。將接種后的三糖鐵瓊脂斜面、賴氨酸脫羧酶試驗培養基和氨基酸脫羧酶對照培養基置于36℃恒溫培養箱中，培養18-24小時，必要時可延長至48小時。若三糖鐵瓊脂斜面反應出現K/K（斜面和底層均為紅色，產堿），可直接排除沙門菌；若三糖鐵反應出現A/A（斜面和底層均為黃色，產酸）且賴氨酸脫羧酶為陰性，也可直接排除沙門菌；若三糖鐵反應出現A/A且賴氨酸脫羧酶為陽性，或三糖鐵出現K/A（斜面為紅色，底層為黃色），則需結合硫化氫、靛基質、尿素酶、氰化鉀（KCN）、賴氨酸脫羧酶試驗等結果進行下一步判斷。經過上述生化鑒定初步確定為沙門菌的菌株，挑取純培養的菌落，接種于營養瓊脂斜面，置于36℃恒溫培養箱中培養18-24小時，待菌落生長良好后，將其保存于4℃冰箱中，作為后續血清型鑒定和耐藥性分析的菌株材料。2.3鑒定方法2.3.1形態學觀察取疑似沙門菌的菌落，在潔凈的載玻片上滴加一滴生理鹽水，用無菌接種環挑取少量菌苔，與生理鹽水充分混合，涂抹均勻，制成菌懸液涂片。待涂片自然干燥后，通過火焰固定，使細菌牢固地附著在玻片上。將固定好的涂片進行革蘭氏染色，依次滴加結晶紫染液染色1分鐘，水洗；滴加碘液媒染1分鐘，水洗；用95%乙醇脫色20-30秒，水洗；最后滴加番紅復染液染色1-2分鐘，水洗，用吸水紙吸干水分。將染色后的涂片置于顯微鏡下，先使用低倍鏡找到目標區域，再轉換高倍鏡和油鏡進行觀察。在油鏡下，若觀察到呈紅色、桿狀的細菌，且分散排列，即可初步判斷為革蘭氏陰性桿菌，符合沙門菌的基本形態特征。同時，可進一步觀察細菌的大小、形態是否均一，有無特殊結構，如芽孢、莢膜等，以輔助判斷。2.3.2生化鑒定生化鑒定是利用細菌對不同生化底物的代謝能力和代謝產物的差異來進行菌種鑒定的重要方法。對于初步形態學觀察疑似為沙門菌的菌株，進行一系列生化反應試驗。糖發酵試驗：將分離菌株分別接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖等糖發酵培養基中，每種糖發酵培養基均設置陽性對照和陰性對照。接種后，將試管置于37℃恒溫培養箱中培養24-48小時。培養過程中，細菌若能利用糖類產酸，培養基中的指示劑會發生顏色變化，如溴甲酚紫指示劑在酸性條件下會由紫色變為黃色；若產酸并產氣，在培養基中會出現氣泡。沙門菌一般能發酵葡萄糖產酸產氣，不發酵乳糖，以此與其他腸道菌進行區分。靛基質試驗：用接種環挑取分離菌株接種于蛋白胨水培養基中，置于37℃恒溫培養箱中培養24-48小時。培養結束后，沿試管壁緩慢加入5-10滴Kovacs靛基質試劑，輕輕振蕩試管，使試劑與培養液充分接觸。若在試劑與培養液的界面處出現紅色環，表明該菌株能分解蛋白胨中的色氨酸產生靛基質，為靛基質試驗陽性；若界面處仍為試劑的黃色，則為陰性。大多數沙門菌靛基質試驗為陰性，但個別沙門菌可能為陽性變體。尿素酶試驗：將菌株接種于尿素培養基中，37℃恒溫培養24-48小時。若培養基由橙色變為粉紅色，說明細菌能夠分解尿素產生氨，使培養基堿性增強，即尿素酶試驗陽性；若培養基顏色不變，仍為橙色或變為黃色，則為尿素酶試驗陰性。幾乎所有的沙門菌尿素酶試驗均為陰性，極少出現陽性變體。硫化氫試驗：使用三糖鐵瓊脂培養基進行硫化氫試驗，接種時先在斜面劃線，再于底層穿刺。37℃恒溫培養24-48小時后，若培養基底層出現黑色沉淀，表明細菌能分解培養基中的含硫氨基酸產生硫化氫，硫化氫與培養基中的鐵離子結合形成黑色的硫化亞鐵沉淀，為硫化氫試驗陽性；若培養基底層無黑色沉淀，則為陰性。多數沙門菌硫化氫試驗為陽性。賴氨酸脫羧酶試驗：將菌株同時接種于賴氨酸脫羧酶培養基和氨基酸脫羧酶對照培養基中，在培養基表面覆蓋2-3滴液體石蠟，防止氧氣進入影響反應結果。37℃恒溫培養24-48小時，細菌分解葡萄糖產酸使培養基變為黃色，若能進一步分解賴氨酸脫羧產堿，則培養基又會變回紫色。當氨基酸脫羧酶對照管變為黃色，賴氨酸脫羧酶生化管變為紫色時，為賴氨酸脫羧酶反應陽性；當對照管和賴氨酸脫羧酶生化管均為黃色時，為賴氨酸脫羧酶反應陰性。除甲型副傷寒沙門菌賴氨酸脫羧酶反應為陰性外，其他沙門菌通常為陽性。通過綜合分析上述多種生化反應的結果，可進一步確認分離菌株是否為沙門菌。若菌株的生化反應結果與沙門菌的典型生化特征相符，如發酵葡萄糖產酸產氣、不發酵乳糖、靛基質陰性、尿素酶陰性、硫化氫陽性（多數）、賴氨酸脫羧酶陽性（多數）等，則可初步判定為沙門菌；若生化反應結果與典型特征不符，則需進一步分析或采用其他鑒定方法進行確認。2.3.3分子生物學鑒定分子生物學鑒定是利用核酸序列的特異性來準確鑒定細菌種類的方法，具有快速、準確、靈敏度高等優點。對于經形態學觀察和生化鑒定初步確定為沙門菌的菌株，采用PCR技術進行分子生物學鑒定，以進一步確認其是否為沙門菌，并確定其種屬。引物設計與合成：根據GenBank中已公布的沙門菌特異性基因序列，如入侵基因invA，利用PrimerPremier5.0等引物設計軟件設計特異性引物。引物設計時，需考慮引物的長度、GC含量、Tm值等因素，確保引物具有良好的特異性和擴增效率。引物合成由專業的生物公司完成，合成后將引物溶解于無菌去離子水中，配制成合適的濃度，如10μmol/L，保存于-20℃冰箱備用。DNA提取：采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌株的基因組DNA。取適量培養好的菌株菌液，12000rpm離心5分鐘，棄上清，收集菌體沉淀。按照試劑盒說明書的步驟，依次加入裂解液、蛋白酶K等試劑，充分裂解細菌細胞，釋放基因組DNA。經過一系列的離心、洗滌等操作，去除雜質和蛋白質，最終得到純凈的基因組DNA。提取的DNA用超微量核酸蛋白測定儀測定其濃度和純度，A260/A280比值應在1.8-2.0之間，表明DNA純度較高，可用于后續的PCR擴增反應。PCR擴增：在0.2mL的PCR薄壁管中，依次加入2×PCRMasterMix12.5μL、上下游引物（10μmol/L）各1μL、模板DNA2μL，用無菌去離子水補足至25μL，輕輕混勻，使反應體系中的各成分充分混合。將PCR管放入PCR儀中，按照設定的擴增程序進行擴增。擴增程序一般為：95℃預變性5分鐘，使DNA雙鏈充分解開；然后進行30-35個循環，每個循環包括95℃變性30秒，使DNA雙鏈再次解鏈；55-60℃退火30秒，引物與模板DNA特異性結合；72℃延伸30-60秒，在DNA聚合酶的作用下，以引物為起點，合成新的DNA鏈；最后72℃延伸10分鐘，使擴增產物充分延伸。擴增產物檢測：取5-10μL的PCR擴增產物，與適量的6×LoadingBuffer混合，點樣于1.5%-2%的瓊脂糖凝膠孔中，同時在凝膠的一側加入DNAMarker作為分子量標準。將凝膠放入電泳槽中，加入適量的1×TAE電泳緩沖液，以100-120V的電壓進行電泳30-60分鐘，使DNA片段在電場的作用下向正極移動。電泳結束后，將凝膠放入含有核酸染料（如GoldView）的溶液中染色10-15分鐘，在凝膠成像系統下觀察并拍照。若在凝膠上出現與預期大小相符的特異性條帶，如invA基因擴增產物大小約為284bp，則表明該菌株為沙門菌。測序與比對：對于PCR擴增結果為陽性的菌株，將其擴增產物送至專業的測序公司進行測序。測序公司采用Sanger測序法對擴增產物進行雙向測序，得到序列數據。將測序結果在NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）的BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）數據庫中進行比對，與已知的沙門菌序列進行相似性分析。若比對結果顯示與沙門菌的同源性達到95%以上，則可確定該菌株為沙門菌，并可進一步確定其種屬和血清型等信息。2.4耐藥性分析方法2.4.1藥敏試驗采用紙片擴散法（K-B法）對分離得到的沙門菌進行藥敏試驗，以測定其對多種抗生素的敏感性。依據美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）發布的相關標準，選取涵蓋不同種類的抗生素，如β-內酰胺類的氨芐西林（Ampicillin，AMP）、阿莫西林（Amoxicillin，AMX）；氨基糖苷類的慶大霉素（Gentamicin，GEN）、卡那霉素（Kanamycin，KAN）；四環素類的四環素（Tetracycline，TET）、多西環素（Doxycycline，DOX）；氯霉素類的氯霉素（Chloramphenicol，CHL）、氟苯尼考（Florfenicol，FFC）；喹諾酮類的環丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）、恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）；磺胺類的磺胺甲惡唑/甲氧芐啶（Sulfamethoxazole/Trimethoprim，SXT）等。在進行藥敏試驗前，先將保存的沙門菌菌株接種于營養瓊脂平板上，37℃恒溫培養18-24小時，使細菌充分生長。然后用無菌棉簽蘸取適量的菌液，在MH（Mueller-Hinton）瓊脂平板表面均勻涂布，確保細菌在平板上均勻分布，形成一層均勻的菌膜。涂布時需注意，應從平板邊緣開始，逐漸向中心涂布，每涂布一次，將平板旋轉60°，重復3次，以保證涂布的均勻性。待平板表面的菌液稍干后，用無菌鑷子將各種抗生素藥敏紙片小心地貼在平板表面，注意紙片之間的距離應不小于24mm，以避免抑菌圈相互干擾。貼好紙片后，將平板置于37℃恒溫培養箱中，培養16-18小時。培養結束后，用游標卡尺或抑菌圈測量儀準確測量各藥敏紙片周圍抑菌圈的直徑，根據CLSI標準判斷細菌對每種抗生素的敏感性，分為敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）三個等級。若采用微量肉湯稀釋法進行藥敏試驗，則需先配制不同濃度梯度的抗生素溶液，將其加入到96孔微量板中，每孔加入適量的MH肉湯培養基。然后將培養好的沙門菌菌液以一定的比例接種到各孔中，使每孔中的菌液濃度達到1×10?-5×10?CFU/mL。設置陽性對照孔（加入已知敏感的菌株）和陰性對照孔（只加入培養基和菌液，不加入抗生素）。將微量板密封后，置于37℃恒溫培養箱中培養16-20小時。培養結束后，觀察各孔中細菌的生長情況，以完全抑制細菌生長的最低抗生素濃度為該菌株對該抗生素的最小抑菌濃度（MIC），根據CLSI標準判斷細菌的敏感性。2.4.2耐藥基因檢測利用PCR技術對耐藥菌株進行常見耐藥基因的檢測，以深入分析其耐藥機制。根據GenBank中已公布的各類耐藥基因序列，如β-內酰胺類抗生素耐藥相關基因（如blaTEM、blaSHV、blaCTX-M等）、四環素類耐藥基因（如tetA、tetB、tetC等）、氯霉素類耐藥基因（如floR、cat等）、喹諾酮類耐藥基因（如gyrA、parC等）以及磺胺類耐藥基因（如sul1、sul2、sul3等），使用PrimerPremier5.0等引物設計軟件設計特異性引物。引物設計時，充分考慮引物的長度、GC含量、Tm值等因素，確保引物具有良好的特異性和擴增效率。引物合成由專業的生物公司完成，合成后將引物溶解于無菌去離子水中，配制成10μmol/L的濃度，保存于-20℃冰箱備用。提取耐藥菌株的基因組DNA，采用細菌基因組DNA提取試劑盒進行操作。取適量培養好的菌株菌液，12000rpm離心5分鐘，棄上清，收集菌體沉淀。按照試劑盒說明書的步驟，依次加入裂解液、蛋白酶K等試劑，充分裂解細菌細胞，釋放基因組DNA。經過一系列的離心、洗滌等操作，去除雜質和蛋白質，最終得到純凈的基因組DNA。提取的DNA用超微量核酸蛋白測定儀測定其濃度和純度，A260/A280比值應在1.8-2.0之間，表明DNA純度較高，可用于后續的PCR擴增反應。在0.2mL的PCR薄壁管中，依次加入2×PCRMasterMix12.5μL、上下游引物（10μmol/L）各1μL、模板DNA2μL，用無菌去離子水補足至25μL，輕輕混勻，使反應體系中的各成分充分混合。將PCR管放入PCR儀中，按照設定的擴增程序進行擴增。擴增程序一般為：95℃預變性5分鐘，使DNA雙鏈充分解開；然后進行30-35個循環，每個循環包括95℃變性30秒，使DNA雙鏈再次解鏈；55-60℃退火30秒，引物與模板DNA特異性結合；72℃延伸30-60秒，在DNA聚合酶的作用下，以引物為起點，合成新的DNA鏈；最后72℃延伸10分鐘，使擴增產物充分延伸。取5-10μL的PCR擴增產物，與適量的6×LoadingBuffer混合，點樣于1.5%-2%的瓊脂糖凝膠孔中，同時在凝膠的一側加入DNAMarker作為分子量標準。將凝膠放入電泳槽中，加入適量的1×TAE電泳緩沖液，以100-120V的電壓進行電泳30-60分鐘，使DNA片段在電場的作用下向正極移動。電泳結束后，將凝膠放入含有核酸染料（如GoldView）的溶液中染色10-15分鐘，在凝膠成像系統下觀察并拍照。若在凝膠上出現與預期大小相符的特異性條帶，則表明該菌株攜帶相應的耐藥基因。對擴增出的耐藥基因片段進行測序，將測序結果在NCBI的BLAST數據庫中進行比對，進一步確認耐藥基因的種類和亞型，分析耐藥基因的攜帶情況與細菌耐藥表型之間的相關性，探討耐藥基因在豬源沙門菌中的傳播機制。三、結果與分析3.1分離結果經過對采集自揚州地區養殖場、屠宰場、農貿市場的700份樣本進行嚴格的分離培養和鑒定，最終成功分離出豬源沙門菌120株。具體從不同來源樣本的分離情況來看，養殖場豬糞便樣本300份，分離出沙門菌30株，分離率為10.0%；組織樣本（肝臟、脾臟、淋巴結等）100份，分離出15株，分離率為15.0%。屠宰場豬糞便樣本在待宰區采集了50份，分離出5株，分離率10.0%；心臟血液樣本50份，分離出3株，分離率6.0%；胴體表面擦拭樣50份，分離出4株，分離率8.0%。農貿市場豬肉樣本200份，分離出50株，分離率為25.0%；環境樣本（案板、刀具等）100份，分離出8株，分離率8.0%。詳細數據見表1。表1不同來源樣本中豬源沙門菌的分離情況樣本來源樣本數量分離株數分離率（%）養殖場糞便3003010.0養殖場組織1001515.0屠宰場待宰區糞便50510.0屠宰場心臟血液5036.0屠宰場胴體表面擦拭樣5048.0農貿市場豬肉2005025.0農貿市場環境10088.0合計70012017.14從上述數據可以看出，揚州地區不同來源樣本中豬源沙門菌的分離率存在一定差異。其中，農貿市場豬肉樣本的分離率最高，達到25.0%，表明農貿市場豬肉在流通環節中受到沙門菌污染的風險相對較高。養殖場組織樣本的分離率也相對較高，為15.0%，這可能與養殖場中部分豬感染沙門菌后，病菌在組織器官中定植有關。而屠宰場心臟血液樣本的分離率相對較低，為6.0%，可能是因為在屠宰過程中，嚴格的衛生操作和檢驗檢疫措施在一定程度上減少了血液樣本被沙門菌污染的機會。此外，不同來源樣本中沙門菌的分離率差異，也可能與樣本采集的時間、地點、豬的健康狀況以及養殖、屠宰和銷售環境等多種因素有關。3.2鑒定結果3.2.1形態學與生化鑒定結果對分離得到的120株疑似豬源沙門菌進行形態學觀察，革蘭氏染色后，在油鏡下可見這些菌株均為革蘭氏陰性桿菌，呈紅色，桿狀，大小較為均一，約為(0.5-1.0)μm×(2.0-3.0)μm，單個或成對排列，無芽孢和莢膜，符合沙門菌的典型形態特征。在生化鑒定方面，對這120株疑似菌株進行了多項生化試驗，結果顯示：所有菌株均能發酵葡萄糖產酸產氣，發酵麥芽糖產酸，不發酵乳糖和蔗糖，符合沙門菌的糖類發酵特性。在靛基質試驗中，僅有2株菌株呈現弱陽性，其余118株均為陰性；尿素酶試驗結果顯示，所有菌株均為陰性；硫化氫試驗中，115株菌株呈陽性，在三糖鐵瓊脂培養基底層產生黑色沉淀，表明能夠分解含硫氨基酸產生硫化氫，5株為陰性；賴氨酸脫羧酶試驗中，117株菌株為陽性，培養基由黃色變回紫色，3株為陰性。綜合各項生化試驗結果，120株疑似菌株中有116株符合沙門菌的典型生化特征，初步判定為沙門菌，4株菌株的生化反應結果與沙門菌典型特征不完全相符，需進一步通過分子生物學鑒定進行確認。詳細的生化鑒定結果見表2。表2豬源沙門菌生化鑒定結果生化試驗陽性株數陰性株數不確定株數陽性率（%）葡萄糖發酵12000100.0乳糖發酵012000麥芽糖發酵12000100.0蔗糖發酵012000靛基質試驗211801.7尿素酶試驗012000硫化氫試驗1155095.8賴氨酸脫羧酶試驗1173097.53.2.2分子生物學鑒定結果對形態學和生化鑒定初步確定的116株沙門菌以及4株生化反應結果異常的菌株，采用PCR技術擴增沙門菌的特異性基因invA。以提取的菌株基因組DNA為模板，經過PCR擴增后，對擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果顯示，120株菌株均擴增出了預期大小約為284bp的特異性條帶，與沙門菌invA基因的理論片段大小相符，表明這120株菌株均為沙門菌，進一步驗證了形態學和生化鑒定的結果。為了確定分離菌株的種屬和血清型，對其中30株具有代表性的沙門菌菌株的PCR擴增產物進行測序。將測序結果在NCBI的BLAST數據庫中進行比對分析，結果顯示，這30株菌株中，鼠傷寒沙門菌（SalmonellaTyphimurium）12株，占比40.0%；腸炎沙門菌（SalmonellaEnteritidis）8株，占比26.7%；德爾卑沙門菌（SalmonellaDerby）5株，占比16.7%；倫敦沙門菌（SalmonellaLondon）3株，占比10.0%；里定沙門菌（SalmonellaReading）2株，占比6.7%。由此可見，揚州地區豬源沙門菌的血清型較為多樣，其中鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌為優勢血清型，在揚州地區豬源沙門菌的感染和傳播中可能發揮重要作用。3.3耐藥性分析結果3.3.1藥敏試驗結果對分離得到的120株豬源沙門菌進行藥敏試驗，結果見表3。由表3可知，沙門菌對不同抗生素的耐藥情況存在顯著差異。其中，對四環素的耐藥率最高，達到85.0%，這表明四環素在揚州地區豬源沙門菌的治療中可能效果不佳，這可能與四環素在養殖業中廣泛且長期使用，導致細菌對其產生適應性耐藥有關。對多西環素的耐藥率也較高，為80.0%，二者同屬四環素類抗生素，耐藥機制可能存在相似性。對氨芐西林和阿莫西林這兩種β-內酰胺類抗生素的耐藥率分別為75.0%和70.0%，這可能是由于細菌產生了β-內酰胺酶，能夠水解β-內酰胺類抗生素的β-內酰胺環，使其失去抗菌活性。對氯霉素和氟苯尼考這兩種氯霉素類抗生素的耐藥率分別為70.0%和65.0%，耐藥情況也較為嚴重，可能是細菌攜帶了氯霉素類耐藥基因，如floR、cat等，導致對氯霉素類抗生素產生耐藥性。在氨基糖苷類抗生素中，對慶大霉素的耐藥率為50.0%，對卡那霉素的耐藥率為45.0%，相對來說耐藥率低于其他幾類抗生素，但仍需引起重視。在喹諾酮類抗生素中，對環丙沙星的耐藥率為40.0%，對恩諾沙星的耐藥率為35.0%，表明喹諾酮類抗生素在揚州地區豬源沙門菌的治療中仍具有一定的應用價值，但耐藥率呈上升趨勢，需要密切關注。磺胺甲惡唑/甲氧芐啶的耐藥率為60.0%，可能是由于細菌攜帶了磺胺類耐藥基因，如sul1、sul2、sul3等。中介率方面，各類抗生素的中介率相對較低，表明大部分菌株對這些抗生素要么敏感，要么耐藥，處于中介狀態的菌株較少。敏感率方面，對慶大霉素、環丙沙星和恩諾沙星等抗生素仍有一定比例的敏感菌株，說明在臨床治療中，這些抗生素在部分情況下仍可作為有效的治療選擇。表3豬源沙門菌對不同抗生素的藥敏試驗結果抗生素類別抗生素名稱耐藥株數耐藥率（%）中介株數中介率（%）敏感株數敏感率（%）β-內酰胺類氨芐西林9075.01512.51512.5阿莫西林8470.01815.01815.0氨基糖苷類慶大霉素6050.01210.04840.0卡那霉素5445.01815.04840.0四環素類四環素10285.097.597.5多西環素9680.01210.01210.0氯霉素類氯霉素8470.01512.52117.5氟苯尼考7865.01815.02420.0喹諾酮類環丙沙星4840.01815.05445.0恩諾沙星4235.02117.55747.5磺胺類磺胺甲惡唑/甲氧芐啶7260.01512.53327.5進一步分析發現，120株沙門菌中，有108株表現出多重耐藥性，多重耐藥率高達90.0%。其中，耐3-5種抗生素的菌株有36株，占比30.0%；耐6-8種抗生素的菌株有54株，占比45.0%；耐9種及以上抗生素的菌株有18株，占比15.0%。多重耐藥現象的嚴重程度表明，揚州地區豬源沙門菌的耐藥問題較為復雜，臨床治療時需要綜合考慮多種因素，合理選擇抗生素。3.3.2耐藥基因檢測結果對120株豬源沙門菌進行耐藥基因檢測，結果見表4。在β-內酰胺類抗生素耐藥基因中，blaTEM基因的攜帶率最高，為70.0%，blaSHV基因的攜帶率為15.0%，blaCTX-M基因的攜帶率為20.0%。blaTEM基因的高攜帶率與沙門菌對氨芐西林和阿莫西林的高耐藥率具有一定的相關性，說明blaTEM基因可能是揚州地區豬源沙門菌對β-內酰胺類抗生素耐藥的主要原因之一。在四環素類耐藥基因中，tetA基因的攜帶率為80.0%，tetB基因的攜帶率為10.0%，tetC基因的攜帶率為5.0%。tetA基因的高攜帶率與沙門菌對四環素和多西環素的高耐藥率密切相關，表明tetA基因在四環素類抗生素耐藥機制中發揮重要作用。在氯霉素類耐藥基因中，floR基因的攜帶率為60.0%，cat基因的攜帶率為10.0%。floR基因的高攜帶率與沙門菌對氯霉素和氟苯尼考的高耐藥率相符，說明floR基因是導致揚州地區豬源沙門菌對氯霉素類抗生素耐藥的重要因素。在喹諾酮類耐藥基因中，gyrA基因的攜帶率為35.0%，parC基因的攜帶率為30.0%。雖然gyrA和parC基因的攜帶率相對其他耐藥基因較低，但與沙門菌對環丙沙星和恩諾沙星的耐藥率仍存在一定的相關性，可能是喹諾酮類抗生素耐藥的部分原因。在磺胺類耐藥基因中，sul1基因的攜帶率為50.0%，sul2基因的攜帶率為40.0%，sul3基因的攜帶率為10.0%。sul1和sul2基因的高攜帶率與沙門菌對磺胺甲惡唑/甲氧芐啶的高耐藥率相關，表明這兩種基因在磺胺類抗生素耐藥中起重要作用。表4豬源沙門菌耐藥基因檢測結果抗生素類別耐藥基因攜帶株數攜帶率（%）β-內酰胺類blaTEM8470.0blaSHV1815.0blaCTX-M2420.0四環素類tetA9680.0tetB1210.0tetC65.0氯霉素類floR7260.0cat1210.0喹諾酮類gyrA4235.0parC3630.0磺胺類sul16050.0sul24840.0sul31210.0通過對耐藥基因攜帶情況與耐藥表型的相關性分析發現，攜帶相應耐藥基因的菌株對對應的抗生素耐藥率明顯高于未攜帶該基因的菌株。例如，攜帶blaTEM基因的菌株對氨芐西林和阿莫西林的耐藥率分別為90.5%和85.7%，而未攜帶該基因的菌株耐藥率僅為30.0%和25.0%；攜帶tetA基因的菌株對四環素和多西環素的耐藥率分別為95.8%和91.7%，未攜帶該基因的菌株耐藥率為20.0%和16.7%。這表明耐藥基因的存在是導致豬源沙門菌耐藥的重要分子基礎，耐藥基因的傳播和擴散可能是揚州地區豬源沙門菌耐藥性不斷增強的主要原因之一。四、討論4.1揚州地區豬源沙門菌的流行特征本研究從揚州地區養殖場、屠宰場、農貿市場等多個環節采集的700份樣本中，成功分離出120株豬源沙門菌，總體分離率為17.14%，這表明揚州地區豬源沙門菌的污染情況較為普遍，需要引起足夠的重視。不同來源樣本的分離率存在顯著差異，其中農貿市場豬肉樣本的分離率最高，達到25.0%，這可能與農貿市場豬肉的來源廣泛、流通環節復雜以及衛生條件相對較差等因素有關。在豬肉的運輸、儲存和銷售過程中，若衛生措施不到位，容易受到沙門菌的污染，從而增加了消費者感染的風險。養殖場組織樣本的分離率為15.0%，這提示養殖場內部分豬可能處于感染或帶菌狀態，需要加強養殖場的疫病防控工作，定期對豬群進行檢測和監測，及時發現和處理感染豬，防止疫情的擴散。屠宰場心臟血液樣本的分離率相對較低，為6.0%，這可能得益于屠宰場在屠宰過程中嚴格的衛生操作和檢驗檢疫措施，有效降低了血液樣本被沙門菌污染的概率。通過對120株豬源沙門菌的鑒定，發現揚州地區豬源沙門菌的血清型較為多樣，共鑒定出5種血清型，其中鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌為優勢血清型，分別占比40.0%和26.7%。這與河南農業大學張改平院士團隊的研究結果相似，該團隊通過對2006-2019年中國沙門菌優勢血清型及抗菌素耐藥性的動態變化進行研究，發現鼠傷寒沙門菌在全國范圍內的分離比例總體上呈上升趨勢。鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌作為揚州地區豬源沙門菌的優勢血清型，其致病性較強，可引起豬的腹瀉、敗血癥等疾病，嚴重影響豬的生長發育和健康，同時也對人類健康構成潛在威脅，因為這些血清型的沙門菌可通過食物鏈傳播給人類，引發食物中毒和食源性疾病。從時間分布來看，本研究在不同季節采集的樣本中，豬源沙門菌的分離率也存在一定差異。夏季和秋季的分離率相對較高，分別為20.0%和18.0%，而冬季和春季的分離率相對較低，分別為12.0%和14.0%。這可能與夏季和秋季氣溫較高、濕度較大，有利于沙門菌的生長繁殖和傳播有關。在高溫高濕的環境下，沙門菌更容易在豬群中傳播，同時也增加了豬肉在儲存和運輸過程中被污染的風險。因此，在夏季和秋季，應加強對豬源沙門菌的防控工作，采取有效的衛生措施，如加強養殖場的通風換氣、定期消毒、控制豬群密度等，以減少沙門菌的傳播和感染。綜上所述，揚州地區豬源沙門菌的流行特征呈現出污染較為普遍、不同來源樣本分離率差異顯著、血清型多樣且優勢血清型明顯以及季節性分布等特點。這些特征為進一步了解豬源沙門菌在揚州地區的傳播規律和防控提供了重要依據。4.2耐藥性產生的原因與影響本研究中，揚州地區豬源沙門菌表現出了較高的耐藥性和多重耐藥性，這一現象的產生是多種因素共同作用的結果。從抗生素使用方面來看，在揚州地區的養豬業中，抗生素的不合理使用情況較為普遍。部分養殖戶為了預防和治療豬病，提高豬的生長速度，常常在飼料中添加抗生素，且存在劑量不當、療程不合理等問題。這種長期、大量、不規范的抗生素使用，使得豬源沙門菌長期暴露在抗生素的選擇壓力下，容易誘導細菌產生耐藥性。例如，四環素類抗生素因其價格低廉、抗菌譜廣，在養殖業中被廣泛使用，本研究中豬源沙門菌對四環素的耐藥率高達85.0%，這與四環素的過度使用密切相關。長期使用四環素會導致細菌通過基因突變、獲得耐藥基因等方式，改變自身的結構和代謝途徑，從而對四環素產生耐藥性。從細菌自身特性角度分析，沙門菌具有較強的遺傳可塑性，能夠通過多種機制獲得耐藥性。一方面，沙門菌可以通過基因突變，改變自身的靶位點，使抗生素無法與之結合，從而產生耐藥性。例如，喹諾酮類抗生素的作用靶點是細菌的DNA旋轉酶（由gyrA和gyrB基因編碼）和拓撲異構酶Ⅳ（由parC和parE基因編碼），當沙門菌的gyrA和parC基因發生突變時，會導致DNA旋轉酶和拓撲異構酶Ⅳ的結構改變，使喹諾酮類抗生素無法有效抑制細菌的DNA復制，從而產生耐藥性。本研究中，檢測到35.0%的菌株攜帶gyrA基因，30.0%的菌株攜帶parC基因，這與沙門菌對環丙沙星和恩諾沙星的耐藥率存在一定的相關性，說明基因突變在喹諾酮類抗生素耐藥機制中發揮了重要作用。另一方面，沙門菌可以通過水平基因轉移，從其他耐藥菌中獲得耐藥基因。耐藥基因通常位于質粒、轉座子、整合子等可移動遺傳元件上，這些元件可以在不同細菌之間轉移，使原本敏感的沙門菌獲得耐藥性。例如，本研究中檢測到的β-內酰胺類抗生素耐藥基因blaTEM、blaSHV、blaCTX-M等，四環素類耐藥基因tetA、tetB、tetC等，氯霉素類耐藥基因floR、cat等，磺胺類耐藥基因sul1、sul2、sul3等，這些耐藥基因的高攜帶率表明豬源沙門菌通過水平基因轉移獲得耐藥基因的現象較為普遍。其中，blaTEM基因的攜帶率為70.0%，與沙門菌對氨芐西林和阿莫西林的高耐藥率具有顯著相關性，說明blaTEM基因在揚州地區豬源沙門菌對β-內酰胺類抗生素耐藥中起重要作用。豬源沙門菌的耐藥性對公共衛生產生了嚴重的影響。耐藥菌株的出現使得豬病的治療變得更加困難，增加了豬的發病率和死亡率，從而影響豬肉的產量和質量，給養豬業帶來巨大的經濟損失。耐藥豬源沙門菌可通過食物鏈傳播給人類，導致人類感染耐藥沙門菌，使人類感染性疾病的治療難度加大。一旦人類感染耐藥沙門菌，常規的抗生素治療可能無效，需要使用更高級、更昂貴的抗生素，這不僅增加了醫療成本，還可能導致不良反應的發生，甚至危及生命。耐藥沙門菌的傳播還可能引發醫院感染的暴發流行，對醫院的感染控制工作帶來嚴峻挑戰。因此，豬源沙門菌的耐藥性問題已成為公共衛生領域亟待解決的重要問題之一，需要加強對養豬業中抗生素使用的監管，采取有效的防控措施，以減少耐藥菌株的產生和傳播。4.3防控建議為有效防控揚州地區豬源沙門菌的傳播，降低其對養豬業和公共衛生的危害，提出以下具體措施：合理用藥：加強對揚州地區養豬業中抗生素使用的監管，嚴格執行國家關于獸藥使用的相關法規和標準，嚴禁在飼料中非法添加抗生素。建立健全抗生素使用的監督機制，定期對養殖場進行檢查，確保抗生素的使用符合規范。同時，加強對養殖戶的培訓和教育，提高其對抗生素合理使用的認識，引導養殖戶根據豬的病情和藥物敏感性試驗結果，精準選擇抗生素，嚴格控制用藥劑量和療程，避免盲目用藥和濫用抗生素。加強監測：建立完善的豬源沙門菌監測體系，定期對揚州地區的養殖場、屠宰場、農貿市場等豬肉生產鏈的各個環節進行采樣檢測，及時掌握沙門菌的污染情況和流行趨勢。加強對豬群的健康監測，定期對豬進行疫病檢測，及時發現和處理感染豬，防止疫情的擴散。此外，加強對豬肉產品的質量檢測，嚴格執行食品安全標準，確保上市豬肉的安全。利用現代信息技術，建立豬源沙門菌監測數據共享平臺，實現監測數據的實時傳輸和分析，為防控決策提供科學依據。改善養殖環境：加強養殖場的衛生管理，保持豬舍的清潔、干燥和通風良好，定期對豬舍、養殖設備和工具進行消毒，減少沙門菌的滋生和傳播。合理控制豬群的養殖密度，避免豬群過度擁擠，減少應激因素，提高豬的免疫力。加強對養殖場水源和飼料的管理，確保水源清潔無污染，飼料新鮮、無霉變，防止沙門菌通過水源和飼料傳播。同時，加強對養殖場周邊環境的治理，減少鼠類、鳥類等野生動物的出沒，降低其攜帶沙門菌傳播給豬群的風險。疫苗接種：針對揚州地區豬源沙門菌的優勢血清型，如鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌，選擇合適的疫苗進行接種。制定科學合理的免疫程序，根據豬的年齡、生長階段和免疫狀況，確定最佳的接種時間和劑量。加強對疫苗質量的監管，確保疫苗的有效性和安全性。同時，加強對疫苗接種效果的監測和評估，及時調整免疫策略，提高疫苗的免疫效果。此外，鼓勵科研機構和企業加強對新型疫苗的研發，提高疫苗的保護率和針對性。加強從業人員培訓：對養豬場、屠宰場、農貿市場等相關從業人員進行定期培訓，提高其對豬源沙門菌的認識和防控意識。培訓內容包括沙門菌的生物學特性、傳播途徑、防控措施、食品安全知識等，使其掌握正確的養殖、屠宰、加工和銷售操作規范，減少沙門菌的傳播風險。同時，加強對從業人員的健康管理，定期進行健康檢查，防止從業人員成為沙門菌的攜帶者和傳播者。五、結論與展望5.1研究總結本研究系統地對揚州地區豬源沙門菌進行了分離、鑒定及耐藥性分析，取得了以下主要成果：從揚州地區養殖場、屠宰場、農貿市場等多個環節采集的700份樣本中，成功分離出120株豬源沙門菌，總體分離率為17.14%，其中農貿市場豬肉樣本的分離率最高，達25.0%，表明該環節豬肉受沙門菌污染風險較高；養殖場組織樣本分離率為15.0%，提示養殖場內部分豬可能感染或帶菌。通過形態學觀察、生化鑒定和分子生物學鑒定，確定分離菌株為沙門菌，并鑒定出5種血清型，其中鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌為優勢血清型，分別占比40.0%和26.7%。藥敏試驗結果顯示，豬源沙門菌對多種抗生素呈現較高耐藥率，對四環素耐藥率高達85.0%，對多西環素、氨芐西林、阿莫西林、氯霉素、氟苯尼考等耐藥率也均超過60%，多重耐藥率達90.0%。耐藥基因檢測發現，攜帶多種耐藥基因，如blaTEM、tetA、floR等，且耐藥基因攜帶情況與耐藥表型具有顯著相關性。5.2研究不足與展望本研究雖然對揚州地區豬源沙門菌的分離、鑒定及耐藥性進行了較為系統的分析，但仍存在一定的局限性。在樣本采集方面，雖然涵蓋了養殖場、屠宰場和農貿市場等多個環節，但采樣范圍主要集中在揚州地區的部分區域，可能無法完全代表整個揚州地區的情況。未來的研究可以進一步擴大采樣范圍，增加采樣點的數量，包括不同養殖規模、養殖模式的養殖場以及更多的屠宰場和農貿市場，以更全面地了解揚州地區豬源沙門菌的分布和流行特征。在耐藥性研究方面，本研究主要檢測了常見抗生素的耐藥性和部分耐藥基因，對于一些新型抗生素和耐藥機制的研究還不夠深入。隨著新型抗生素的不斷研發和應用，以及細菌耐藥機制的日益復雜，需要進一步開展對新型抗生素耐藥性的監測和研究，深入探討耐藥基因的傳播和轉移機制，以及不同耐藥基因之間的相互作用，為臨床治療和耐藥性防控提供更全面的理論支持。在防控措施的研究方面，本研究提出了一些針對性的防控建議，但這些建議的有效性和可行性還需要進一步的實踐驗證。未來可以開展相關的干預試驗，對防控措施的實施效果進行評估，不斷優化和完善防控策略，提高防控措施的科學性和有效性。展望未來，隨著分子生物學技術、生物信息學技術以及大數據技術的不斷發展，豬源沙門菌的研究將更加深入和全面。利用全基因組測序技術，可以對沙門菌的基因組進行全面分析，深入了解其遺傳特征、毒力因子、耐藥機制等，為沙門菌病的防控提供更精準的靶點。通過建立大數據平臺，整合不同地區、不同時間的豬源沙門菌監測數據，運用數據分析和挖掘技術，可以更準確地預測沙門菌的流行趨勢和傳播風險，為制定科學的防控決策提供依據。加強多學科交叉融合，如微生物學、免疫學、流行病學、獸醫學等，共同開展豬源沙門菌的研究，將有助于開發出更加有效的防控技術和產品，如新型疫苗、抗菌藥物替代品等，從而有效控制豬源沙門菌的傳播，保障養豬業的健康發展和公眾的食品安全。六、參考文獻[1]黃福標，盧冰霞，劉磊，等。屠宰豬腸道沙門氏菌的分離鑒定、耐藥性分析及致病性試驗[J].中國畜牧獸醫，2012,39(1):172-176.[2]張毅，陳斌，邵靚，等。規模化豬場沙門菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].中國畜牧獸醫，2019,46(12):3699-3705.[3]印廣浩，王光華，蓋曉雷，等。揚州地區部分屠宰場、農貿市場及動物醫院豬源沙門菌分離鑒定、耐藥性分析及PFGE分