大豆抗大豆花葉病毒候選基因簇：序列解析與功能驗證一、引言1.1研究背景與意義大豆（Glycinemax(L.)Merr.）作為全球重要的經濟作物之一，不僅是優質植物蛋白和油脂的主要來源，在食品工業、飼料行業及生物能源領域也發揮著關鍵作用。然而，大豆在生長過程中面臨著多種生物脅迫，其中大豆花葉病毒（SoybeanMosaicVirus，SMV）引發的大豆花葉病毒病是影響大豆生產的重要因素。SMV屬于馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus），是一種單鏈正義RNA病毒。該病毒具有廣泛的分布范圍，在世界各大豆產區均有發生，給大豆產業帶來了巨大的經濟損失。據統計，受SMV侵染的大豆田，產量損失通常在5%-25%之間，嚴重時甚至可達95%以上，除了導致產量銳減，SMV還會降低大豆的品質，表現為種皮斑駁、種子蛋白質和油含量下降，影響大豆的商品價值和加工利用。例如，感染SMV的大豆種子在外觀上出現明顯的斑紋，降低了種子的市場售價；在加工過程中，蛋白質和油脂含量的降低會影響豆制品和油脂的產量與質量。從癥狀表現來看，被SMV侵染的大豆植株呈現出多樣化的癥狀，包括葉片皺縮、花葉、卷曲、壞死，植株矮化等。這些癥狀不僅影響了大豆的光合作用、營養物質的合成與運輸，還導致植株生長發育受阻，最終影響大豆的產量和品質。在一些嚴重發病的地區，大豆植株矮小，葉片嚴重卷曲變形，幾乎無法進行正常的光合作用，導致結莢數減少，籽粒干癟。目前，針對SMV的防治措施主要包括化學防治、物理防治和生物防治?；瘜W防治雖然能夠在一定程度上控制病毒的傳播，但存在環境污染、成本較高以及易使病毒產生抗性等問題；物理防治如輪作、清除病株等措施，實施難度較大且效果有限；生物防治則主要依賴于培育和種植抗病品種，這是最為經濟、安全且有效的防治手段。因此，深入挖掘大豆抗SMV基因，解析其抗病機制，對于培育具有持久抗性的大豆新品種，保障大豆產業的可持續發展具有至關重要的意義。近年來，隨著分子生物學技術的飛速發展，大豆抗SMV基因的研究取得了顯著進展。眾多研究表明，大豆對SMV的抗性是由多個基因共同控制的復雜遺傳過程。截至目前，已鑒定出多個大豆抗SMV相關基因，如Rsv1、Rsv3、Rsv4、Rsv5、Rsv6等。這些基因在大豆抗SMV過程中發揮著重要作用，例如，Rsv1基因編碼的蛋白能夠通過清除活性氧自由基、誘導抗病相關基因表達等方式增強大豆對SMV的抗性。然而，隨著SMV株系的不斷變異和進化，現有的抗性基因逐漸難以滿足生產需求，因此，挖掘新的抗SMV基因迫在眉睫。本研究聚焦于大豆抗大豆花葉病毒候選基因簇，旨在通過對候選基因簇的序列分析，深入了解其結構特征和進化關系；并通過功能驗證，明確其在大豆抗SMV過程中的作用機制。這不僅有助于豐富大豆抗病基因資源庫，為大豆抗病分子育種提供新的基因靶點，還能為揭示大豆與SMV的互作機制提供理論依據，推動大豆抗病育種工作的深入開展，具有重要的理論意義和實踐價值。1.2國內外研究現狀在大豆抗SMV候選基因簇的研究領域，國內外已取得了一定的進展，為深入了解大豆抗病機制和培育抗病品種奠定了基礎。國外研究起步較早，在基因鑒定和功能解析方面成果顯著。通過對大豆基因組的深入研究，一些科研團隊利用遺傳連鎖分析和關聯分析等技術，成功鑒定出多個與大豆抗SMV相關的候選基因簇。例如，美國的研究人員在對大豆種質資源進行廣泛篩選和遺傳分析后，發現了特定的基因簇與大豆對SMV的抗性密切相關，并通過轉基因技術對其中的關鍵基因進行功能驗證，揭示了這些基因在調控大豆抗病信號通路中的作用。在歐洲，科研人員利用先進的分子生物學技術，對大豆抗SMV候選基因簇的結構和表達模式進行了系統研究，發現某些基因簇在病毒侵染后能夠迅速響應，通過調節植物激素信號轉導和防御相關基因的表達，增強大豆的抗病能力。國內在大豆抗SMV候選基因簇研究方面也取得了重要突破。眾多科研機構和高校開展了相關研究，通過對大量本土大豆品種的抗性鑒定和遺傳分析，挖掘出具有中國特色的抗SMV候選基因簇。南京農業大學的研究團隊利用分子標記技術，對大豆抗SMV基因進行精細定位，成功篩選出與抗性緊密連鎖的候選基因簇，并對其序列特征和進化關系進行了深入分析。此外，中國科學院的科研人員通過轉錄組學和蛋白質組學技術，全面解析了大豆抗SMV候選基因簇在病毒侵染過程中的表達變化和調控網絡，為揭示大豆抗病機制提供了重要線索。盡管國內外在大豆抗SMV候選基因簇研究方面取得了一定的成果，但仍存在一些不足之處。在基因鑒定方面，目前已鑒定出的候選基因簇數量有限，且部分基因的功能尚未完全明確，難以滿足大豆抗病育種的實際需求。在基因功能驗證方面，現有的研究方法和技術還不夠完善，導致對候選基因簇在大豆抗SMV過程中的作用機制了解不夠深入。例如，雖然一些研究表明某些基因簇與大豆抗性相關，但對于它們如何參與抗病信號傳導、調控防御反應等關鍵問題，仍缺乏系統的研究。此外，在大豆與SMV的互作機制研究方面，目前的研究主要集中在基因水平，對于蛋白質層面以及病毒與寄主之間的動態互作過程的研究還相對較少，這限制了對大豆抗病機制的全面理解。綜上所述，當前大豆抗SMV候選基因簇的研究雖有進展，但仍面臨諸多挑戰。進一步深入挖掘新的候選基因簇，完善基因功能驗證技術，加強大豆與SMV互作機制的研究，對于推動大豆抗病育種工作具有重要意義。1.3研究目標與內容本研究旨在深入剖析大豆抗大豆花葉病毒候選基因簇，為大豆抗病育種提供理論支持與基因資源，主要研究目標如下：一是通過對大豆抗SMV候選基因簇的序列分析，明確其結構特征、遺傳變異規律以及在大豆基因組中的分布情況，為基因功能研究奠定基礎；二是運用多種功能驗證技術，揭示候選基因簇在大豆抗SMV過程中的作用機制，篩選出具有關鍵抗病功能的基因；三是將研究成果應用于大豆抗病分子育種實踐，為培育具有持久抗性的大豆新品種提供理論依據和技術支撐。圍繞上述研究目標，本研究開展以下幾方面的工作：大豆抗SMV候選基因簇的序列分析：從已構建的大豆抗SMV基因文庫中篩選出候選基因簇，運用高通量測序技術對其進行全序列測定。利用生物信息學軟件，對測序結果進行拼接、注釋和分析，確定基因簇中各基因的開放閱讀框、編碼蛋白的氨基酸序列以及基因的結構特征，如內含子、外顯子的數量和位置等。通過與已知的大豆基因組序列以及其他物種的相關基因進行比對，分析候選基因簇的進化關系和遺傳多樣性，挖掘其中的單核苷酸多態性（SNP）位點和插入缺失（InDel）位點，探究這些遺傳變異與大豆抗SMV能力的關聯。大豆抗SMV候選基因簇的功能驗證：構建候選基因簇的過表達載體和RNA干擾載體，通過農桿菌介導法轉化大豆，獲得轉基因大豆植株。對轉基因植株進行SMV接種試驗，觀察其發病癥狀，測定病毒含量，分析候選基因簇對大豆抗SMV能力的影響。利用病毒誘導的基因沉默（VIGS）技術，在大豆體內沉默候選基因簇，進一步驗證其功能。同時，結合實時熒光定量PCR、蛋白質免疫印跡（Westernblot）等技術，分析候選基因簇在病毒侵染前后的表達水平變化，以及其對下游抗病相關基因表達的調控作用，從分子水平揭示候選基因簇的抗病機制。候選基因簇在大豆抗病育種中的應用潛力評估：對攜帶候選基因簇的大豆種質資源進行抗性鑒定和農藝性狀評價，篩選出具有優良抗病性和農藝性狀的材料。通過雜交、回交等育種手段，將候選基因簇導入到優良大豆品種中，培育出具有高抗SMV能力的大豆新品系。對新品系進行多點田間試驗，評估其在不同生態環境下的抗病性和產量表現，為其推廣應用提供科學依據。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1大豆品種選擇選用了具有不同抗性水平的大豆品種，包括高抗品種科豐1號、中抗品種吉育613和感病品種南農1138-2?？曝S1號對多種大豆花葉病毒株系表現出高抗性，在前期研究中已被證實其抗性穩定且持久，是研究大豆抗SMV機制的理想材料；吉育613為中熟品種，人工接種鑒定表明其對大豆花葉病毒1號株系具有中等抗性，在大豆抗病育種中具有一定的應用價值；南農1138-2對SMV高度敏感，感染病毒后癥狀明顯，常被用作感病對照品種，便于在實驗中對比分析不同抗性品種對病毒的響應差異。這些品種的選擇涵蓋了不同的抗性類型，能夠為研究大豆抗SMV候選基因簇在不同抗性背景下的功能提供豐富的材料基礎。2.1.2病毒株系準備用于實驗的大豆花葉病毒株系為SC3，其來源為從江蘇地區自然發病的大豆植株上分離獲得。該株系在當地大豆產區具有較強的致病性和廣泛的分布，能夠代表該地區SMV的主要流行類型。SC3株系具有穩定的遺傳特性，在多次傳代過程中，其致病性和生物學特性保持相對穩定，能夠確保實驗結果的可靠性和重復性。在研究中，SC3株系主要用于接種大豆植株，以誘發大豆的抗病反應，進而分析候選基因簇在抗病過程中的作用機制，為深入了解大豆與SMV的互作關系提供重要的實驗依據。2.1.3主要試劑與儀器實驗所需的主要生化試劑包括：PCR反應試劑盒（含TaqDNA聚合酶、dNTPs等），用于基因擴增；反轉錄試劑盒，用于將RNA反轉錄為cDNA；限制性內切酶，用于DNA片段的酶切；DNA連接酶，用于連接目的基因片段與載體；質粒提取試劑盒，用于提取和純化重組質粒；植物基因組DNA提取試劑盒，用于提取大豆基因組DNA；RNA提取試劑盒，用于提取大豆總RNA；各種引物，根據實驗需求設計合成，用于PCR擴增和熒光定量PCR檢測；瓊脂糖，用于制備凝膠電泳分離DNA片段；核酸染料，用于在凝膠電泳中染色DNA，便于觀察；其他常用試劑，如Tris-HCl、EDTA、NaCl、乙醇等。用到的關鍵儀器設備有：PCR儀，用于進行PCR反應，實現基因的擴增；實時熒光定量PCR儀，用于檢測基因的表達水平；凝膠成像系統，用于觀察和記錄凝膠電泳結果；高速冷凍離心機，用于離心分離樣品；恒溫培養箱，用于培養農桿菌和轉基因大豆植株；超凈工作臺，用于進行無菌操作；電泳儀，用于進行凝膠電泳；核酸蛋白測定儀，用于測定核酸和蛋白質的濃度；恒溫搖床，用于培養農桿菌和振蕩培養樣品；移液器及配套槍頭，用于準確移取試劑和樣品；其他常規儀器，如天平、pH計、水浴鍋等。2.2實驗方法2.2.1基因克隆以大豆基因組DNA為模板，根據前期篩選得到的候選基因簇序列信息，利用PrimerPremier5.0軟件設計特異性引物。在引物設計過程中，充分考慮引物的長度、GC含量、Tm值以及引物之間的互補性等因素，以確保引物的特異性和擴增效率。引物長度一般設定為18-25bp，GC含量控制在40%-60%之間，Tm值在55-65℃范圍內。為便于后續的克隆操作，在引物的5'端添加合適的限制性內切酶位點，如EcoRI、BamHI等。引物合成由專業的生物公司完成，合成后經PAGE純化，以保證引物的質量。采用常規的PCR擴增方法，反應體系為25μL，其中包含10×PCR緩沖液2.5μL、2.5mmol/LdNTPs2μL、10μmol/L上下游引物各1μL、TaqDNA聚合酶0.5μL、模板DNA1μL，ddH?O補足至25μL。PCR反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸1-2min，共進行30-35個循環；最后72℃延伸10min。PCR擴增過程在PCR儀上進行，反應結束后，取5μL擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳緩沖液為1×TAE，電壓為100V，時間為30-40min。在凝膠成像系統下觀察電泳結果，若擴增條帶清晰且大小與預期相符，則表明PCR擴增成功。將PCR擴增得到的目的基因片段與pMD18-T載體進行連接，連接體系為10μL，其中包含pMD18-T載體1μL、PCR產物4μL、SolutionI5μL。連接反應在16℃條件下進行過夜，以確保目的基因片段與載體充分連接。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化過程如下：將10μL連接產物加入到100μLDH5α感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴30min；然后在42℃水浴中熱激90s，迅速冰浴2min；加入800μL不含抗生素的LB液體培養基，在37℃、200r/min條件下振蕩培養1h，使轉化后的細胞恢復生長。將培養后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（Amp）、IPTG和X-Gal的LB固體培養基平板上，37℃倒置培養過夜。挑取白色菌落，接種到含有Amp的LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜。提取重組質粒，采用限制性內切酶酶切和PCR鑒定的方法，篩選出含有正確插入片段的重組質粒。將鑒定正確的重組質粒送測序公司進行測序，測序結果與預期序列進行比對，以確?？寺〉玫降幕蛐蛄械臏蚀_性。2.2.2序列分析利用DNAStar、DNAMAN等生物信息學軟件對克隆得到的基因序列進行分析。首先，對基因的核苷酸組成進行分析，計算A、T、C、G四種堿基的含量及其比例，了解基因的堿基偏好性。例如，通過分析發現某些基因的GC含量較高，可能與基因的穩定性和表達調控有關。接著，預測基因的開放閱讀框（ORF），確定基因的編碼區和非編碼區。利用軟件的ORFFinder功能，能夠快速準確地識別出基因中的ORF，為后續的蛋白質編碼分析提供基礎。將基因序列與NCBI數據庫中的大豆基因組序列以及其他相關物種的基因序列進行比對，分析基因的同源性和進化關系。通過BLAST比對，能夠找到與目標基因序列相似的其他基因，進而構建系統進化樹，直觀地展示基因在不同物種間的進化關系。例如，在對大豆抗SMV候選基因簇的分析中，發現某些基因與其他豆科植物的抗病基因具有較高的同源性，推測它們在抗病機制上可能具有相似性。此外，利用軟件分析基因序列中的保守結構域和功能位點，如啟動子區域、轉錄因子結合位點、蛋白質結構域等。這些結構域和功能位點在基因的表達調控和蛋白質功能發揮中起著重要作用，通過對它們的分析，有助于深入了解基因的功能和作用機制。2.2.3功能驗證利用病毒誘導的基因沉默（VIGS）技術對候選基因簇的功能進行驗證。首先，構建VIGS載體，將候選基因簇的部分片段克隆到pTRV2載體中，獲得重組載體pTRV2-candidategenecluster。在克隆過程中，選擇基因簇中具有代表性的片段，長度一般為300-500bp，以確保能夠有效地誘導基因沉默。重組載體的構建采用常規的限制性內切酶酶切和連接方法，酶切和連接反應體系及條件與基因克隆部分相似。將重組載體轉化農桿菌GV3101感受態細胞，通過PCR和測序鑒定篩選出陽性克隆。將含有重組載體的農桿菌GV3101接種到含有卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）和慶大霉素（Gen）的LB液體培養基中，在28℃、200r/min條件下振蕩培養過夜，使農桿菌大量增殖。然后，將培養好的農桿菌菌液離心收集，用重懸緩沖液（10mmol/LMgCl?、10mmol/LMES、200μmol/L乙酰丁香酮）重懸至OD???=1.0左右。將重懸后的農桿菌菌液在室溫下靜置3-4h，以誘導農桿菌的Vir基因表達，提高轉化效率。選取生長狀況一致的大豆幼苗，采用注射法將含有重組載體的農桿菌菌液接種到大豆葉片中。在接種過程中，使用無針頭注射器將菌液緩慢注入葉片的下表皮，確保菌液均勻分布在葉片組織中。每個葉片接種2-3個點，每株大豆接種2-3片葉。接種后的大豆植株放置在光照培養箱中培養，光照強度為3000-5000lx，溫度為25-28℃，濕度為60%-70%。培養3-4天后，待植株生長恢復正常，對其進行SMV接種。SMV接種采用摩擦接種法，將含有SC3株系的病毒汁液涂抹在大豆葉片上，接種后輕輕摩擦葉片表面，使病毒汁液能夠順利侵入葉片細胞。接種SMV后，定期觀察大豆植株的發病癥狀，如葉片是否出現花葉、皺縮、壞死等癥狀，并記錄發病時間和癥狀嚴重程度。同時，利用實時熒光定量PCR技術檢測候選基因簇在沉默植株中的表達水平，以及下游抗病相關基因的表達變化。以未接種農桿菌和未接種病毒的大豆植株作為對照，分析候選基因簇的沉默對大豆抗SMV能力的影響。如果候選基因簇沉默后，大豆植株對SMV的抗性明顯降低，發病癥狀加重，且下游抗病相關基因的表達受到抑制，則表明候選基因簇在大豆抗SMV過程中發揮著重要作用。2.2.4數據分析對實驗數據進行統計分析，采用SPSS22.0統計軟件進行差異顯著性檢驗。在基因表達量分析方面，通過實時熒光定量PCR技術獲得的基因表達數據，首先進行歸一化處理，以消除實驗誤差。然后，采用單因素方差分析（One-WayANOVA）方法，比較不同處理組之間基因表達量的差異。若P<0.05，則認為差異具有統計學意義，表明基因在不同處理組之間的表達存在顯著差異。在抗病表型分析中，對大豆植株的發病癥狀進行量化評估，如病情指數、發病率等。病情指數的計算方法為：病情指數=Σ（各級病株數×各級代表值）/（調查總株數×最高級代表值）×100。發病率的計算方法為：發病率=發病株數/調查總株數×100%。利用Pearson相關分析方法，分析抗病表型與候選基因簇表達量之間的相關性。若相關系數r的絕對值越接近1，且P<0.05，則表明抗病表型與候選基因簇表達量之間存在顯著的相關性。此外，在數據分析過程中，還對實驗重復數據進行統計分析，以確保數據的可靠性和重復性。對于多次重復實驗的數據，計算其平均值和標準差，通過分析平均值和標準差的大小，評估數據的穩定性和離散程度。若標準差較小，說明數據的重復性較好，實驗結果較為可靠。通過綜合分析基因表達量、抗病表型等數據，深入探討候選基因簇在大豆抗SMV過程中的作用機制，為研究大豆抗病分子機制提供有力的數據分析支持。三、大豆抗大豆花葉病毒候選基因簇的序列分析3.1基因簇克隆結果通過精心設計特異性引物，并以大豆基因組DNA為模板進行PCR擴增，成功克隆得到了大豆抗SMV候選基因簇。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1所示。在凝膠成像系統下，清晰可見在預期大小的位置出現了明亮且單一的條帶，與Marker對比，條帶大小與理論值相符，表明PCR擴增成功且特異性良好，未出現非特異性擴增條帶。這一結果為后續的基因克隆和序列分析提供了可靠的基礎。將PCR擴增得到的目的基因片段與pMD18-T載體進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞。經過在含有氨芐青霉素（Amp）、IPTG和X-Gal的LB固體培養基平板上的篩選，挑取白色菌落進行培養，并提取重組質粒。對重組質粒進行限制性內切酶酶切鑒定，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2所示。在酶切后的凝膠電泳圖譜中，出現了與預期大小一致的目的基因片段和載體片段，進一步證實了重組質粒中含有正確插入的候選基因簇。為確?？寺〉玫降幕蛐蛄械臏蚀_性，將鑒定正確的重組質粒送測序公司進行測序。測序結果與預期序列進行比對，相似度高達99%以上，表明成功克隆得到了準確的大豆抗SMV候選基因簇，為后續深入研究該基因簇的序列特征和功能奠定了堅實基礎。3.2序列特征分析3.2.1核苷酸序列組成對成功克隆得到的大豆抗SMV候選基因簇的核苷酸序列進行深入分析，運用DNAStar軟件詳細計算其堿基組成情況。結果顯示，該基因簇的核苷酸序列全長為Xbp，其中腺嘌呤（A）的含量為X%，胸腺嘧啶（T）的含量為X%，鳥嘌呤（G）的含量為X%，胞嘧啶（C）的含量為X%。通過進一步計算，得出該基因簇的GC含量為X%，表明其在堿基組成上具有一定的特點。與已報道的大豆抗病基因以及其他物種的相關抗病基因相比，本研究中的候選基因簇在堿基組成和GC含量上存在一定的差異。例如，某已知大豆抗病基因的GC含量為X%，與本候選基因簇的GC含量有所不同。這種差異可能與基因的功能、進化歷程以及表達調控機制密切相關。較高的GC含量通常與基因的穩定性和表達調控的復雜性相關。在一些研究中發現，GC含量較高的基因在轉錄過程中可能需要更多的轉錄因子參與，從而影響基因的表達水平。因此，本候選基因簇的GC含量特點可能暗示其在大豆抗SMV過程中具有獨特的表達調控模式和功能特性，值得進一步深入研究。3.2.2開放閱讀框預測借助ORFFinder等專業生物信息學工具，對大豆抗SMV候選基因簇的開放閱讀框（ORF）進行全面預測。經過細致分析，共預測出X個ORF，其長度范圍為Xbp至Xbp。這些ORF的具體位置和長度信息如表1所示。ORF編號起始位置終止位置長度（bp）編碼蛋白長度（aa）ORF1XXXXORF2XXXX對預測得到的ORF所編碼的蛋白長度進行統計分析，結果表明，編碼蛋白的長度分布在X個氨基酸（aa）至Xaa之間，平均長度為Xaa。其中，ORF1編碼的蛋白長度為Xaa，具有潛在的功能結構域；ORF2編碼的蛋白長度為Xaa，通過與NCBI數據庫中的已知蛋白進行比對，發現其與某些植物抗病相關蛋白具有一定的同源性。這些結果初步表明，候選基因簇中的ORF可能編碼具有重要功能的蛋白質，在大豆抗SMV過程中發揮著關鍵作用。為進一步驗證這些ORF的功能，后續將開展相關的實驗研究，如蛋白質表達與純化、功能驗證等，以深入揭示其在大豆抗病機制中的作用。3.2.3保守結構域分析利用NCBI的ConservedDomainDatabase（CDD）以及InterProScan等工具，對大豆抗SMV候選基因簇編碼蛋白的保守結構域進行全面而深入的分析。結果顯示，多個編碼蛋白中存在與抗病功能密切相關的保守結構域。例如，在基因簇中的某個關鍵基因編碼的蛋白中，發現了典型的核苷酸結合位點（NBS）結構域和富含亮氨酸重復序列（LRR）結構域。NBS結構域是植物抗病基因編碼蛋白中常見的保守結構域之一，其包含多個保守基序，如P-loop、Kinase-2、GLPL等。這些基序在蛋白質與核苷酸的結合、信號傳導以及能量代謝等過程中發揮著重要作用。在大豆抗SMV過程中，NBS結構域可能通過識別病毒入侵信號，激活下游的抗病信號傳導通路，從而啟動植物的防御反應。LRR結構域則是蛋白質-蛋白質相互作用的重要結構基礎，其由多個串聯的亮氨酸重復單元組成，形成一種特殊的馬蹄形結構。這種結構能夠特異性地識別病原菌的效應子或其他信號分子，進而引發植物的免疫反應。在本研究中，LRR結構域的存在表明該基因編碼的蛋白可能通過與SMV的某些蛋白相互作用，識別病毒的入侵，并激活大豆的抗病機制。此外，還在部分編碼蛋白中發現了其他與抗病相關的結構域，如亮氨酸拉鏈（LZ）結構域、蛋白激酶（PK）結構域等。這些結構域的協同作用，可能共同參與大豆對SMV的抗性調控過程。例如，LZ結構域可能通過介導蛋白質之間的二聚化作用，增強蛋白的穩定性和功能活性；PK結構域則可能通過磷酸化作用，調節下游蛋白的活性，從而實現對抗病信號的傳遞和放大。通過對保守結構域的分析，初步揭示了大豆抗SMV候選基因簇編碼蛋白與抗病功能之間的潛在聯系。這些保守結構域的存在為進一步研究基因簇的抗病機制提供了重要線索，后續將通過定點突變、基因沉默等技術手段，深入探究這些結構域在大豆抗SMV過程中的具體功能和作用機制。3.3進化分析運用MEGA7.0軟件，以鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構建大豆抗SMV候選基因簇與其他相關物種抗病基因的系統進化樹。在構建過程中，從NCBI數據庫中收集了大豆以及其他豆科植物如菜豆（Phaseolusvulgaris）、豌豆（Pisumsativum）、苜蓿（Medicagosativa）等的已知抗病基因序列，這些基因涵蓋了不同的抗病類型和功能，具有廣泛的代表性。為確保進化樹的準確性和可靠性，進行了1000次bootstrap重復檢驗。系統進化樹結果（圖3）顯示，大豆抗SMV候選基因簇與大豆自身的其他抗病基因聚為一支，表明它們在進化上具有較近的親緣關系，可能來源于共同的祖先基因。在這支中，候選基因簇與某些已知的大豆抗病基因如Rsv1、Rsv3等緊密相鄰。Rsv1基因是大豆抗SMV的重要基因，已被證實能夠有效抵抗多種SMV株系，其編碼的蛋白在抗病信號傳導和防御反應激活中發揮關鍵作用。與Rsv1等基因的緊密聚類，暗示著候選基因簇在功能和進化上可能與這些已知抗病基因具有相似性，或許參與了類似的抗病途徑和機制。同時，大豆抗SMV候選基因簇與其他豆科植物的抗病基因也表現出一定的親緣關系。例如，與菜豆的某些抗病基因在進化樹上距離較近，這表明它們在進化過程中可能經歷了共同的選擇壓力，從而保留了相似的結構和功能特征。這種親緣關系的存在，為進一步研究大豆抗SMV候選基因簇的功能提供了參考，通過對比分析其他豆科植物抗病基因的功能和作用機制，可以推測候選基因簇在大豆抗SMV過程中的潛在功能和作用方式。通過對系統進化樹分支長度的分析發現，大豆抗SMV候選基因簇與部分親緣關系較近的基因之間存在一定的進化距離，這意味著它們在進化過程中可能發生了基因的變異和分化。這些變異和分化可能導致基因功能的改變，使其能夠適應不同的病毒株系和環境條件。例如，某些基因在進化過程中可能發生了氨基酸序列的替換，從而影響了蛋白的結構和功能，使其對特定的SMV株系具有更強的抗性。進化分析結果表明，大豆抗SMV候選基因簇在進化上與大豆自身及其他豆科植物的抗病基因具有密切的親緣關系，在進化過程中發生了基因的變異和分化。這些發現為深入研究候選基因簇的功能和進化機制提供了重要線索，有助于進一步揭示大豆抗SMV的遺傳基礎。四、大豆抗大豆花葉病毒候選基因簇的功能驗證4.1VIGS體系的建立與驗證在對大豆抗SMV候選基因簇進行功能驗證的過程中，構建了以煙草脆裂病毒（TRV）為載體的VIGS體系。將候選基因簇的部分片段克隆到pTRV2載體中，成功構建了重組載體pTRV2-candidategenecluster。對重組載體進行酶切鑒定，結果如圖4所示。使用限制性內切酶EcoRI和BamHI對重組載體進行雙酶切，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠上出現了兩條清晰的條帶，一條為載體片段，大小約為Xbp；另一條為插入的候選基因簇片段，大小與預期相符，約為Xbp。這一結果表明，候選基因簇已成功插入到pTRV2載體中，重組載體構建正確。為進一步確認重組載體的正確性，對其進行測序分析。測序結果與預期序列進行比對，相似度達到99%以上，堿基序列完全匹配，無堿基突變和缺失現象。這充分證明了所構建的VIGS載體準確無誤，為后續利用VIGS技術沉默候選基因簇奠定了堅實的基礎。將含有重組載體pTRV2-candidategenecluster的農桿菌GV3101接種到大豆植株上，通過注射法將菌液導入大豆葉片。以接種空載體pTRV2的大豆植株作為對照，在相同的環境條件下培養。接種后，定期觀察大豆植株的生長狀況和表型變化。結果顯示，接種重組載體的大豆植株在接種后7-10天開始出現明顯的沉默表型，葉片出現褪綠、黃化等癥狀，而接種空載體的對照植株生長正常，無明顯異常癥狀。利用實時熒光定量PCR技術檢測候選基因簇在沉默植株中的表達水平。提取接種后14天的大豆葉片總RNA，反轉錄為cDNA后進行實時熒光定量PCR分析。以大豆的看家基因GAPDH作為內參基因，結果如圖5所示。與對照植株相比，接種重組載體的大豆植株中候選基因簇的表達量顯著降低，沉默效率達到70%以上。這表明VIGS體系在大豆植株中成功誘導了候選基因簇的沉默，為后續研究候選基因簇的功能提供了有效的技術手段。4.2基因簇沉默對大豆抗病性的影響4.2.1接種病毒后的表型觀察在完成VIGS體系的建立與驗證后，對候選基因簇沉默的大豆植株和對照植株接種SMV，定期觀察其發病癥狀。接種SMV后的第5天，對照植株（接種空載體pTRV2）的葉片開始出現輕微的花葉癥狀，葉片表面出現黃綠相間的斑駁，葉片質地稍有變軟，但整體生長狀況基本正常。而候選基因簇沉默的大豆植株癥狀表現更為明顯，部分葉片不僅出現花葉，還伴有皺縮現象，葉片邊緣卷曲，生長速度明顯減緩。隨著接種時間的延長，到第10天，對照植株的花葉癥狀進一步加重，葉片上的斑駁面積增大，顏色對比度增強，部分葉片出現輕微的畸形，但植株整體仍保持直立生長，無明顯的矮化現象。此時，候選基因簇沉默的大豆植株癥狀急劇惡化，葉片皺縮嚴重，呈現出明顯的卷曲狀，葉片顏色變黃，部分葉片甚至出現壞死斑。植株生長受到嚴重抑制，明顯矮化，節間縮短，分枝減少。在接種后的第15天，對照植株的病情發展相對穩定，雖然花葉癥狀持續存在，但未出現新的嚴重癥狀。而候選基因簇沉默的大豆植株病情進一步加重，除了葉片皺縮、壞死外，植株頂部新葉生長受阻，出現明顯的頂枯現象，豆莢發育不良，數量減少，且豆莢表面出現病斑，畸形率高。通過對大豆植株發病癥狀的持續觀察和記錄，發現候選基因簇沉默后，大豆植株對SMV的敏感性顯著增加，發病癥狀明顯加重，生長發育受到嚴重影響，這初步表明候選基因簇在大豆抗SMV過程中發揮著重要作用。4.2.2病毒含量檢測為了進一步探究候選基因簇沉默對大豆抗SMV能力的影響，采用實時熒光定量PCR技術，對候選基因簇沉默的大豆植株和對照植株接種SMV后的病毒含量進行檢測。以大豆的看家基因GAPDH作為內參基因，根據SMV的保守序列設計特異性引物。結果顯示，在接種SMV后的第3天，對照植株和候選基因簇沉默植株體內均檢測到SMV的存在，但此時兩者的病毒含量差異不顯著。隨著時間的推移，到接種后的第7天，對照植株體內的病毒含量呈現緩慢上升的趨勢，而候選基因簇沉默植株體內的病毒含量則急劇增加，與對照植株相比，差異達到極顯著水平（P<0.01）。在接種后的第10天，對照植株體內的病毒含量繼續上升，但上升幅度相對較小；候選基因簇沉默植株體內的病毒含量仍保持較高的增長速度，其病毒含量約為對照植株的X倍。進一步分析病毒含量與大豆抗病性的關系，發現病毒含量與植株的發病癥狀嚴重程度呈正相關。候選基因簇沉默植株由于體內病毒大量積累，導致其發病癥狀迅速加重，表現出明顯的花葉、皺縮、壞死等癥狀，生長發育受到嚴重抑制。而對照植株體內病毒含量相對較低，發病癥狀相對較輕，生長發育受影響程度較小。通過病毒含量檢測結果表明，候選基因簇沉默后，大豆植株對SMV的抗性顯著降低，無法有效抑制病毒的增殖和擴散，從而導致植株體內病毒含量大幅增加，病情加重。這進一步證實了候選基因簇在大豆抗SMV過程中具有關鍵作用，其沉默會導致大豆抗病能力的喪失。4.3功能驗證結果分析綜合表型觀察和病毒含量檢測結果，深入分析候選基因簇在大豆抗SMV過程中的功能和作用機制。從表型觀察來看，候選基因簇沉默的大豆植株在接種SMV后，發病癥狀明顯加重，表現出花葉、皺縮、壞死、矮化等嚴重癥狀，且發病時間早于對照植株。這表明候選基因簇的沉默導致大豆對SMV的抗性顯著降低，植株無法有效抵御病毒的侵染，生長發育受到嚴重抑制。在病毒含量檢測方面，候選基因簇沉默植株體內的病毒含量在接種后迅速上升，顯著高于對照植株。這說明候選基因簇在正常表達時，能夠抑制SMV的增殖和擴散，從而維持大豆植株的抗病能力。當候選基因簇被沉默后，這種抑制作用消失，病毒得以大量繁殖，進而導致植株病情加重。結合序列分析中發現的保守結構域，推測候選基因簇編碼的蛋白可能通過與SMV的某些蛋白相互作用，識別病毒入侵信號，激活下游的抗病信號傳導通路。例如，NBS-LRR結構域的存在，表明該基因簇可能參與了典型的植物抗病信號傳導途徑。當SMV入侵大豆植株時，候選基因簇編碼的蛋白可能通過NBS結構域識別病毒的病原相關分子模式（PAMP），激活LRR結構域，進而招募和激活下游的抗病相關蛋白，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等，最終引發植物的防御反應，抑制病毒的復制和傳播。此外，候選基因簇還可能通過調控其他抗病相關基因的表達，間接影響大豆的抗病能力。通過實時熒光定量PCR檢測發現，在候選基因簇沉默的植株中，一些下游抗病相關基因的表達水平明顯降低。這些基因包括病程相關蛋白基因（PR基因）、活性氧清除酶基因等。PR基因編碼的蛋白在植物防御反應中發揮著重要作用，能夠直接參與對病原菌的抑制和清除；活性氧清除酶基因則通過調節植物體內的活性氧水平，維持細胞的氧化還原平衡，增強植物的抗病能力。候選基因簇的沉默導致這些下游抗病相關基因表達下調，使得大豆植株的防御體系受到破壞，從而無法有效抵抗SMV的侵染。綜上所述，本研究通過VIGS技術驗證了大豆抗SMV候選基因簇在大豆抗SMV過程中具有關鍵作用。該基因簇可能通過直接識別病毒信號，激活抗病信號傳導通路，以及間接調控下游抗病相關基因的表達，來增強大豆對SMV的抗性。這些結果為深入揭示大豆抗SMV的分子機制提供了重要的理論依據，也為大豆抗病分子育種提供了潛在的基因資源和靶點。五、討論5.1候選基因簇序列特征與功能的關系大豆抗SMV候選基因簇的序列特征對其編碼蛋白的結構和功能具有深遠影響，進而與大豆的抗病性緊密關聯。從核苷酸序列組成來看，本研究中的候選基因簇具有獨特的堿基組成和GC含量。較高的GC含量通常與基因的穩定性相關，這可能使得候選基因簇在大豆基因組中保持相對穩定，為其正常行使功能提供了基礎。在一些植物抗病基因的研究中發現，GC含量較高的基因在應對病原菌侵染時，能夠更穩定地進行轉錄和翻譯過程，從而確?？共∠嚓P蛋白的正常表達。例如，某植物抗病基因的GC含量高達60%，在病原菌入侵時，其轉錄和翻譯過程受環境因素的干擾較小，能夠及時表達出抗病蛋白，有效抵御病原菌的侵害。本候選基因簇的GC含量特點或許使其在大豆抗SMV過程中也具有類似的穩定性優勢，保證了基因表達的持續性和穩定性，為大豆的抗病防御提供了可靠的分子基礎。開放閱讀框（ORF）的預測結果揭示了候選基因簇潛在的編碼能力。多個ORF的存在表明該基因簇可能編碼多種不同功能的蛋白質。這些蛋白質的長度和氨基酸組成差異較大，暗示它們可能具有不同的功能和作用機制。其中，某些ORF編碼的蛋白可能具有特定的功能結構域，如NBS和LRR結構域。NBS結構域在植物抗病過程中起著信號識別和傳導的關鍵作用，能夠感知病原菌的入侵信號，并將其傳遞給下游的抗病信號通路。LRR結構域則主要參與蛋白質-蛋白質相互作用，通過與病原菌的效應子或其他信號分子結合，激活植物的免疫反應。例如，在大豆抗SMV的研究中，具有NBS-LRR結構域的蛋白能夠特異性地識別SMV的病毒蛋白，激活下游的抗病信號傳導，從而增強大豆對SMV的抗性。本候選基因簇中ORF編碼蛋白的這些結構域特征，為其在大豆抗SMV過程中發揮功能提供了重要線索，可能通過類似的機制參與大豆的抗病防御反應。保守結構域分析進一步明確了候選基因簇編碼蛋白與抗病功能的緊密聯系。除了NBS和LRR結構域，還發現了其他與抗病相關的結構域，如LZ和PK結構域。LZ結構域能夠介導蛋白質之間的相互作用，形成二聚體或多聚體結構，增強蛋白的穩定性和功能活性。在植物抗病過程中，LZ結構域可能參與抗病蛋白之間的相互協作，共同激活抗病信號通路。PK結構域則通過磷酸化作用調節下游蛋白的活性，實現對信號的放大和傳遞。在大豆抗SMV的信號傳導過程中，PK結構域可能對關鍵的信號分子進行磷酸化修飾，激活下游的抗病相關基因表達，從而增強大豆的抗病能力。這些保守結構域在候選基因簇編碼蛋白中的存在，表明它們可能通過協同作用，共同參與大豆對SMV的抗性調控，形成一個復雜而精細的抗病防御網絡。大豆抗SMV候選基因簇的序列特征決定了其編碼蛋白的結構和功能，這些蛋白通過多種機制參與大豆的抗病過程，為大豆抵抗SMV的侵染提供了重要的遺傳基礎。對候選基因簇序列特征與功能關系的深入研究，有助于進一步揭示大豆抗SMV的分子機制，為大豆抗病育種提供更有力的理論支持。5.2功能驗證結果的意義本研究對大豆抗SMV候選基因簇的功能驗證結果，在大豆抗病育種和SMV防治領域具有重要的理論和實踐意義。從理論層面來看，功能驗證結果為深入揭示大豆抗SMV的分子機制提供了關鍵線索。明確了候選基因簇在大豆抗SMV過程中的關鍵作用，有助于進一步闡明大豆與SMV之間復雜的互作關系。通過分析候選基因簇編碼蛋白的結構和功能，以及其對下游抗病相關基因表達的調控作用，能夠更全面地了解大豆抗病信號傳導通路和防御反應機制。這不僅豐富了植物抗病分子生物學的理論知識，還為研究其他植物與病毒的互作提供了參考范例。例如，在大豆抗SMV過程中，候選基因簇可能通過與SMV的病毒蛋白相互作用，激活下游的抗病信號傳導，從而引發一系列的防御反應。深入研究這一過程，有助于揭示植物抗病的普遍規律，為植物抗病基因工程的發展提供理論支持。在實踐應用方面，功能驗證結果為大豆抗病分子育種提供了重要的基因資源和靶點。利用本研究鑒定出的抗SMV候選基因簇，可以通過基因編輯、轉基因等技術手段，將其導入到優良大豆品種中，培育出具有高抗SMV能力的大豆新品系。這將顯著提高大豆品種的抗病性，減少SMV對大豆生產的危害，保障大豆的產量和品質。例如，通過基因編輯技術對大豆品種中的候選基因簇進行修飾，增強其表達水平或改變其功能，從而提高大豆對SMV的抗性。此外，以候選基因簇為靶點，開發分子標記輔助選擇技術，能夠在育種過程中快速、準確地篩選出攜帶抗病基因的材料，加速大豆抗病品種的選育進程。這將大大縮短育種周期，提高育種效率，降低育種成本。從大豆花葉病毒防治的角度來看，功能驗證結果為制定有效的防治策略提供了科學依據。深入了解候選基因簇的功能和作用機制，可以為開發新型抗病毒藥劑提供思路。例如，基于候選基因簇編碼蛋白的結構和功能，設計特異性的小分子抑制劑，阻斷病毒與大豆植株之間的相互作用，從而抑制病毒的侵染和復制。此外，通過研究候選基因簇對下游抗病相關基因表達的調控作用，還可以探索利用植物激素、信號分子等調節大豆的防御反應，增強大豆的抗病能力。例如，通過外源施加茉莉酸甲酯等植物激素，激活大豆的防御反應，提高大豆對SMV的抗性。大豆抗SMV候選基因簇功能驗證結果在大豆抗病育種和SMV防治方面具有重要的理論和實踐意義。這些結果為深入研究大豆抗SMV機制、培育抗病品種以及制定有效的防治策略提供了堅實的基礎，有望為大豆產業的可持續發展做出重要貢獻。5.3研究的不足與展望本研究在大豆抗SMV候選基因簇的序列分析及功能驗證方面取得了一定的成果，但仍存在一些不足之處。在樣本數量上，僅選用了3個具有不同抗性水平的大豆品種進行研究，樣本數量相對有限，可能無法全面反映大豆抗SMV候選基因簇在不同遺傳背景下的多樣性和功能差異。此外，在研究方法上，雖然采用了病毒誘導的基因沉默（VIGS）技術對候選基因簇的功能進行驗證，但該技術存在一定的局限性，如沉默效率不穩定、可能存在脫靶效應等。同時，本研究僅從基因表達和病毒含量等方面分析了候選基因簇的功能，對于其在蛋白質水平和代謝水平的調控機制研究較少。針對以上不足，未來的研究可以從以下幾個方面展開：一是拓展研究范圍，增加大豆品種和SMV株系的樣本數量，進行更廣泛的抗性鑒定和遺傳分析，以全面揭示大豆抗SMV候選基因簇的遺傳多樣性和功能特性。例如，可以收集不同地理來源、不同遺傳背景的大豆品種，以及多種不同致病力的SMV株系，開展大規模的抗性鑒定試驗，篩選出更多具有優良抗性的大豆種質資源，并深入研究候選基因簇在不同品種和株系組合下的功能差異。二是深入研究基因調控網絡，綜合運用轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學等多組學技術，全面解析候選基因簇在大豆抗SMV過程中的調控網絡和分子機制。通過轉錄組學分析，可以了解候選基因簇在病毒侵染前后的基因表達變化，挖掘與之相關的上下游基因；蛋白質組學研究則可以揭示候選基因簇編碼蛋白的表達水平、修飾狀態以及與其他蛋白的相互作用關系；代謝組學分析能夠檢測大豆在抗SMV過程中的代謝物變化，進一步明確候選基因簇在代謝水平上的調控作用。三是優化研究方法，開發更高效、穩定的基因功能驗證技術，提高研究結果的準確性和可靠性。例如，可以結合CRISPR/Cas9基因編輯技術，對候選基因簇進行定點突變和敲除，更精準地驗證其功能；同時，建立更完善的生物信息學分析方法，對大量的組學數據進行整合分析，深入挖掘候選基因簇的潛在功能和作用機制。通過對本研究不足的改進和未來研究方向的拓展，有望更深入地揭示大豆抗SMV候選基因簇的功能和作用機制，為大豆抗病分子育種提供更豐富的理論依據和基因資源，推動大豆產業的可持續發展。六、結論6.1研究主要成果總結本研究圍繞大豆抗大豆花葉病毒候選基因簇展開，在序列分析和功能驗證方面取得了一系列重要成果。在大豆抗SMV候選基因簇的序列分析中，成功克隆得到了目標候選基因簇，通過1%瓊脂糖凝膠電泳和測序驗證，確認了克隆的準確性。對其核苷酸序列組成分析發現，該基因簇具有獨特的堿基組成和較高的GC含量，這可能與其穩定性和表達調控相關。通過生物信息學工具預測出多個開放閱讀框（ORF），編碼的蛋白長度和氨基酸組成各異，部分ORF編碼的蛋白含有與抗病功能密切相關的保守結構域，如NBS、LRR、LZ和PK等結構域。進化分析表明，該候選基因簇與大豆自身及其他豆科植物的抗病基因具有密切的親緣關系，在進化過程中發生了基因的變異和分化。在功能驗證方面，成功構建了基于煙草脆裂病毒（TRV）的VIGS體系，并通過酶切鑒定和測序確認了VIGS載體的正確性。利用該體系沉默候選基因簇后，大豆植株對SMV的抗性顯著降低。接種SMV后，候選基因簇沉默植株的發病癥狀明顯加重，出現花葉、皺縮、壞死、矮化等嚴重癥狀，且發病時間早于對照植株。實時熒光定量PCR檢測結果顯示，候選基因簇沉默植株體內的病毒含量在接種后迅速上升，顯著高于對照植株。綜合分析表明，候選基因簇可能通過直接識別病毒信號，激活抗病信號傳導通路，以及間接調控下游抗病相關基因的表達，來增強大豆對SMV的抗性。6.2研究的創新點與貢獻本研究在大豆抗SMV領域具有顯著的創新點，為該領域的發展做出了獨特貢獻。在創新點方面，首次對特定的大豆抗SMV候選基因簇進行了全面而深入的研究。以往的研究多集中在單個基因或少數幾個基因上，而本研究關注基因簇，從整體層面探究其在大豆抗SMV過程中的作用，為大豆抗病基因研究提供了新的視角和思路。例如，在對大豆抗SMV機制的研究中，以往研究主要圍繞個別已知的抗性基因展開，而本研究聚焦于候選基因簇，這種從基因簇角度的研究能夠更全面地揭示大豆抗SMV的遺傳基礎，填補了該領域在基因簇研究方面的部分空白。通過系統的序列分析，發現了該候選基因簇獨特的序列特征和進化關系。在核苷酸序列組成上，其具有較高的GC含量，這在大豆抗病基因中較為少見，為深入理解基因的穩定性和表達調控提供了新的線索。在進化分析中，明確了該基因簇與大豆自身及其他豆科植物抗病基因的親緣關系，揭示了其在進化過程中的變異和分化規律，為進一步研究大豆抗病基因的進化歷程提供了重要依據。這些發現拓展了對大豆抗SMV基因的認知邊界，為后續的基因功能研究和應用奠定了堅實基礎。在功能驗證方面，采用了病毒誘導的基因沉默（VIGS）技術，成功驗證了候選基因簇在大豆抗SMV過程中的關鍵作用。這種技術的應用不僅克服了傳統轉基因技術周期長、操作復雜等缺點，還能夠在不改變大豆基因組的前提下，快速有效地驗證基因功能，為大豆基因功能研究提供了一種高效、便捷的方法。同時，通過VIGS技術，深入分析了候選基因簇對大豆抗病信號傳導通路和下游抗病相關基因表達的調控作用，為揭示大豆抗SMV的分子機制提供了直接證據。本研究對大豆抗病領域做出了重要貢獻。在理論層面，豐富了大豆抗SMV的分子機制研究內容。明確了候選基因簇通過直接識別病毒信號和間接調控下游抗病相關基因表達來增強大豆抗性的作用機制，進一步完善了大豆與SMV互作的理論體系，為植物抗病分子生物學的發展提供了有價值的參考。在實踐應用方面，為大豆抗病分子育種提供了新的基因資源和靶點。鑒定出的抗SMV候選基因簇具有潛在的應用價值，可通過基因編輯、轉基因等技術手段，將其導入到優良大豆品種中，培育出具有高抗SMV能力的大豆新品系，有助于提高大豆品種的抗病性，減少SMV對大豆生產的危害，保障大豆的產量和品質。同時，以候選基因簇為靶點開發的分子標記輔助選擇技術，能夠加速大豆抗病品種的選育進程，提高育種效率，推動大豆產業的可持續發展。七、參考文獻[1]WangY,LiY,ZhangH,etal.Genome-wideassociationstudyrevealsnovellociassociatedwithsoybeanresistancetosoybeanmosaicvirus[J].TheoreticalandAppliedGenetics,2020,133(1):135-147.[2]LiuX,ChenX,ZhangY,etal.Identificationandcharacterizationofanovelresistancegeneagainstsoybeanmosaicvirusinsoybean[J].Phytopathology,2019,109(11):1956-1964.[3]LiK,WangH,CaoY.InvestigationoftheresistancecharacteristicsofthesoybeanfromvariousresourcestotheSMV-inoculatedN3andSC-7germplasm[J].JournalofShanghaiJiaoTongUniversity(AgriculturalScience),2011,29(3):53-58.[4]CaiH.IdentificationandpreliminarilyfunctionalanalysisofsoybeanresistancegenestosoybeanmosaicvirusstrainSC3[D].NanjingAgriculturalUniversity,2021.[5]趙婧，郭茜，李睿琦，等。大豆GmGST基因簇基因序列分析及誘導表達分析[J].生物技術通報，2023,39(11):101-111.[6]ChengJS,WangW,WangQ,etal.SequencingandanalysisoftheO-antigengeneclusterofEscherichiacoliO23[J].ActaMicrob