基于黏玉米TGase交聯(lián)乳蛋白的合生元微膠囊制備工藝與性能研究一、引言1.1研究背景隨著人們健康意識的提高，對功能性食品的需求日益增長。益生菌作為一種對人體有益的活性微生物，能夠調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。常見的益生菌有酵母菌、益生芽孢桿菌、乳酸菌、雙歧桿菌、丁酸梭菌，它們能合成消化酶，參與腸道的消化，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收，還能激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，提高機(jī)體免疫力，維持腸道菌群環(huán)境的平衡，避免出現(xiàn)菌群失調(diào)。然而，益生菌在生產(chǎn)、儲存和胃腸道消化過程中面臨諸多挑戰(zhàn)，如胃酸、膽鹽、酶等的作用，以及氧氣、溫度、濕度等環(huán)境因素的影響，這些因素往往導(dǎo)致益生菌的活性降低甚至死亡，從而限制了其功效的發(fā)揮。益生元作為一種不被人體消化吸收，但能夠選擇性地刺激腸道內(nèi)有益菌生長和活性的物質(zhì)，與益生菌相輔相成。益生元主要包括低聚糖類，如低聚果糖、低聚木糖、低聚麥芽糖等；多糖類，如螺旋藻、節(jié)旋藻等；以及天然植物的提取物、氨基酸、多元醇等。它能促進(jìn)腸道內(nèi)有益菌群增長，有助于腸道菌群環(huán)境的穩(wěn)定，提高機(jī)體抵抗力。合生元則是益生菌和益生元的組合，二者協(xié)同作用，能夠更好地發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的功能，為胃腸道建立了一個良好的微生態(tài)環(huán)境。為了提高益生菌的穩(wěn)定性和存活率，微膠囊技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。微膠囊技術(shù)是指將固體、液體或氣體包埋、封存在一種微型膠囊內(nèi)成為一種固體微粒產(chǎn)品的技術(shù)，通過將益生菌包裹在微膠囊中，可以有效地保護(hù)益生菌免受外界不利因素的影響，實(shí)現(xiàn)益生菌的靶向輸送和緩慢釋放，提高其在胃腸道中的存活率和功效。常用的微膠囊壁材包括天然高分子材料（如海藻酸鈉、殼聚糖、阿拉伯膠、果膠、卡拉膠等）和合成高分子材料，壁材的選擇對微膠囊的性能和效果有著重要影響。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TGase）作為一種能夠催化蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)反應(yīng)的酶，在食品加工領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。通過TGase的作用，可以使蛋白質(zhì)分子之間形成共價鍵，從而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、凝膠性和乳化性等。黏玉米中提取的TGase具有獨(dú)特的性質(zhì)和優(yōu)勢，在制備微膠囊壁材方面展現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價值。本研究旨在探索利用黏玉米TGase交聯(lián)乳蛋白制備合生元微膠囊的方法，通過優(yōu)化制備工藝，提高微膠囊的包封率、穩(wěn)定性和益生菌的存活率，為合生元微膠囊的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，有望推動功能性食品的發(fā)展，滿足人們對健康食品的需求。1.2研究目的與意義1.2.1研究目的本研究旨在利用黏玉米中提取的TGase交聯(lián)乳蛋白，制備合生元微膠囊，并對其制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，以提高微膠囊的包封率、穩(wěn)定性以及益生菌在胃腸道環(huán)境中的存活率。具體研究目標(biāo)如下：確定合生元組合：篩選合適的益生菌和益生元，確定最佳的合生元組合，以充分發(fā)揮二者的協(xié)同作用。優(yōu)化制備工藝：研究黏玉米TGase交聯(lián)乳蛋白制備合生元微膠囊的工藝條件，如TGase添加量、交聯(lián)時間、溫度等，以及海藻酸鈉包衣制備雙層微膠囊的工藝參數(shù)，如海藻酸鈉濃度、包衣時間等，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定最佳的制備工藝，提高微膠囊的包封率和質(zhì)量。表征微膠囊特性：對制備的合生元微膠囊進(jìn)行形態(tài)分析、粒徑分析、包封率測定、在模擬胃腸條件下的存活情況分析、冷凍干燥后的存活率和水分含量測定、儲存穩(wěn)定性分析以及在橙汁中的生存力分析等，全面了解微膠囊的特性和性能。評估應(yīng)用潛力：通過對微膠囊各項(xiàng)性能指標(biāo)的評估，探討其在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力，為其實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。1.2.2研究意義理論意義：本研究將黏玉米TGase交聯(lián)乳蛋白應(yīng)用于合生元微膠囊的制備，為微膠囊壁材的選擇和制備工藝的優(yōu)化提供了新的思路和方法。通過研究TGase交聯(lián)乳蛋白對微膠囊性能的影響，深入了解微膠囊的形成機(jī)制和結(jié)構(gòu)與性能的關(guān)系，豐富和完善了微膠囊技術(shù)的理論體系。同時，對合生元微膠囊在模擬胃腸條件下的存活情況、儲存穩(wěn)定性以及在橙汁中的生存力等方面的研究，有助于揭示合生元微膠囊在不同環(huán)境下的作用機(jī)制，為其在實(shí)際應(yīng)用中的效果評估提供理論基礎(chǔ)。實(shí)踐意義：在食品領(lǐng)域，益生菌和益生元的應(yīng)用越來越廣泛，但由于益生菌的穩(wěn)定性和存活率較低，限制了其在食品中的應(yīng)用效果。本研究制備的合生元微膠囊能夠有效地保護(hù)益生菌，提高其在胃腸道中的存活率和穩(wěn)定性，使其能夠更好地發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的功能。這為開發(fā)新型功能性食品，如益生菌飲料、酸奶、保健品等提供了技術(shù)支持，有助于滿足消費(fèi)者對健康食品的需求，促進(jìn)食品行業(yè)的發(fā)展。在醫(yī)藥領(lǐng)域，微膠囊技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于藥物傳遞系統(tǒng)中。合生元微膠囊可以作為一種新型的藥物載體，將益生菌和益生元輸送到特定的部位，實(shí)現(xiàn)靶向治療和緩慢釋放，提高藥物的療效和安全性。本研究的成果為合生元微膠囊在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供了參考，有望推動微膠囊技術(shù)在藥物傳遞系統(tǒng)中的進(jìn)一步發(fā)展，為疾病的預(yù)防和治療提供新的手段。1.3研究內(nèi)容與方法1.3.1研究內(nèi)容菌株活化：將保存的益生菌菌株（如副干酪乳桿菌）接種到相應(yīng)的培養(yǎng)基中，在適宜的溫度和條件下進(jìn)行活化培養(yǎng)，使其恢復(fù)活性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供足夠數(shù)量的活菌。益生元篩選：選取多種常見的益生元（如低聚果糖、低聚木糖、乳糖醇等），分別研究它們對益生菌生長的促進(jìn)作用。通過測定益生菌在添加不同益生元的培養(yǎng)基中的生長曲線、活菌數(shù)等指標(biāo)，評估益生元的活性。采用模糊數(shù)學(xué)法計(jì)算益生元分?jǐn)?shù)，綜合考慮益生元對益生菌生長的促進(jìn)效果、成本等因素，篩選出最佳的益生元，并確定其在合生元中的適宜添加量。黏玉米TGase交聯(lián)酪蛋白酸鈉制備合生元微膠囊：以酪蛋白酸鈉為主要壁材，添加適量的黏玉米TGase，通過交聯(lián)反應(yīng)形成穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。將篩選得到的益生菌和益生元與壁材溶液混合均勻，采用銳孔-凝固浴法等方法制備合生元微膠囊。研究TGase添加量、交聯(lián)時間、溫度等因素對微膠囊包封率、粒徑、形態(tài)等性能的影響，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定最佳的制備工藝條件。海藻酸鈉包衣制備雙層合生元微膠囊：為進(jìn)一步提高微膠囊的性能，對上述制備的微膠囊進(jìn)行海藻酸鈉包衣處理。將微膠囊懸浮在海藻酸鈉溶液中，通過離子交聯(lián)等方式使海藻酸鈉在微膠囊表面形成一層致密的包衣，制備雙層合生元微膠囊。研究海藻酸鈉濃度、包衣時間、氯化鈣濃度等因素對雙層微膠囊性能的影響，優(yōu)化包衣工藝參數(shù)。微膠囊的形態(tài)分析：采用掃描電子顯微鏡（SEM）等儀器觀察微膠囊的表面形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，分析微膠囊的形狀、表面光滑度、完整性以及壁材與芯材的結(jié)合情況等，直觀了解微膠囊的形態(tài)特征。微膠囊的粒徑分析：使用激光粒度分析儀測定微膠囊的粒徑大小和粒徑分布，研究制備工藝條件對微膠囊粒徑的影響規(guī)律，分析粒徑大小和分布對微膠囊性能的影響。微膠囊的包封率：采用合適的方法（如離心法、高效液相色譜法等）測定微膠囊中益生菌和益生元的含量，計(jì)算微膠囊的包封率，評估制備工藝對包封效果的影響。益生菌在模擬胃腸條件下的存活：模擬人體胃腸道環(huán)境，配制模擬胃液和模擬腸液，將微膠囊化的益生菌和游離益生菌分別置于模擬胃液和模擬腸液中，在不同時間點(diǎn)取樣，測定活菌數(shù)，研究微膠囊對益生菌在模擬胃腸條件下存活的保護(hù)作用，分析微膠囊在模擬胃腸環(huán)境中的降解和釋放特性。雙層微膠囊的冷凍干燥：對制備的雙層微膠囊進(jìn)行冷凍干燥處理，研究冷凍干燥過程對微膠囊結(jié)構(gòu)和性能的影響，確定最佳的冷凍干燥工藝參數(shù)，如預(yù)凍溫度、預(yù)凍時間、升華干燥溫度、解析干燥溫度等，以提高微膠囊的凍干存活率和穩(wěn)定性。雙層微膠囊的水分含量：采用干燥失重法等方法測定冷凍干燥后雙層微膠囊的水分含量，分析水分含量對微膠囊儲存穩(wěn)定性和益生菌存活的影響，確定微膠囊適宜的水分含量范圍。雙層微膠囊的儲存穩(wěn)定性：將冷凍干燥后的雙層微膠囊在不同溫度和濕度條件下儲存，定期測定微膠囊中益生菌的活菌數(shù)、水分含量等指標(biāo)，研究微膠囊的儲存穩(wěn)定性，評估儲存條件對微膠囊性能的影響，預(yù)測微膠囊的保質(zhì)期。雙層微膠囊在橙汁中的生存力：將雙層微膠囊添加到橙汁中，在一定條件下儲存，定期測定微膠囊中益生菌的活菌數(shù)，研究微膠囊在橙汁中的生存力，分析橙汁的成分和環(huán)境因素對微膠囊中益生菌存活的影響，評估微膠囊在橙汁等酸性飲料中的應(yīng)用潛力。1.3.2研究方法實(shí)驗(yàn)法：通過設(shè)計(jì)一系列實(shí)驗(yàn)，對不同的實(shí)驗(yàn)因素進(jìn)行控制和變化，觀察和記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以探究各因素對合生元微膠囊制備和性能的影響。如在益生元篩選實(shí)驗(yàn)中，控制其他條件不變，分別改變益生元的種類和添加量，觀察益生菌的生長情況；在微膠囊制備實(shí)驗(yàn)中，通過改變TGase添加量、交聯(lián)時間、海藻酸鈉濃度等工藝參數(shù)，制備不同的微膠囊樣品，并對其性能進(jìn)行測試和分析。分析法：運(yùn)用各種分析方法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，包括顯著性分析、相關(guān)性分析、響應(yīng)面分析等。顯著性分析用于判斷不同實(shí)驗(yàn)條件下實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以確定各因素對微膠囊性能的影響程度；相關(guān)性分析用于研究不同因素之間的相互關(guān)系，為優(yōu)化制備工藝提供理論依據(jù)；響應(yīng)面分析則通過建立數(shù)學(xué)模型，對多個因素進(jìn)行綜合分析，優(yōu)化制備工藝參數(shù)，提高微膠囊的性能。二、理論基礎(chǔ)與研究現(xiàn)狀2.1益生菌、益生元和合生元2.1.1益生菌的概念、分類與生理作用益生菌是一類對宿主有益的活性微生物，定植于人體腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能產(chǎn)生確切健康功效，從而改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用。其定義強(qiáng)調(diào)了“活的微生物”“足夠數(shù)量”和“有益健康作用”這三個關(guān)鍵要素。只有當(dāng)這些條件同時滿足時，才能被稱為真正的益生菌。目前，常見的益生菌大體可分為三大類：乳桿菌類，如嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌；雙歧桿菌類，如長雙歧桿菌、短雙歧桿菌；革蘭陽性球菌類，如鏈球菌、乳球菌。此外，還有一些其他種類的益生菌，如酵母菌、益生芽孢桿菌等也在特定領(lǐng)域有著應(yīng)用。益生菌具有多種重要的生理作用。在調(diào)節(jié)腸道菌群方面，益生菌通過與有害菌競爭腸道內(nèi)的生存空間、營養(yǎng)物質(zhì)以及黏附位點(diǎn)，抑制有害菌的生長和繁殖，從而維持腸道菌群的平衡。例如，雙歧桿菌能夠利用腸道內(nèi)的低聚糖等物質(zhì)進(jìn)行代謝活動，產(chǎn)生短鏈脂肪酸，降低腸道內(nèi)的pH值，創(chuàng)造一個不利于有害菌生存的酸性環(huán)境，進(jìn)而抑制大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌的生長。在增強(qiáng)免疫力方面，益生菌可以刺激腸道黏膜免疫系統(tǒng)，促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖和活性，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力。研究表明，某些益生菌能夠激活巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞，使其更好地發(fā)揮吞噬和殺傷病原體的作用，從而提高機(jī)體對疾病的抵抗力。在促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收方面，益生菌可以參與腸道內(nèi)的消化過程，幫助分解食物中的大分子營養(yǎng)物質(zhì)，使其更易于被人體吸收。例如，乳酸菌能夠產(chǎn)生乳糖酶，幫助乳糖不耐受的人群消化乳糖，提高乳糖的利用率；同時，益生菌還可以促進(jìn)腸道對鈣、鐵、鋅等礦物質(zhì)的吸收，對人體的生長發(fā)育和健康維持具有重要意義。2.1.2益生元的概念與作用益生元是一種不被人體消化吸收，但能夠選擇性地刺激腸道內(nèi)有益菌生長和活性的物質(zhì)，通常由人體酶難以消化的非淀粉多糖和低聚糖構(gòu)成。益生元主要包括低聚糖類，如低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、大豆低聚糖、菊粉等；多糖類，如螺旋藻、節(jié)旋藻等微藻類以及云芝多糖、胡蘿含氮多糖等；蛋白質(zhì)水解物，如酪蛋白的水解物、α-乳清蛋白、乳鐵蛋白等；還有天然植物的提取物、氨基酸、多元醇等，如聚葡萄糖是一種水溶性的膳食纖維，也可作為益生元。益生元的主要作用是促進(jìn)益生菌的生長和繁殖。它為益生菌提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，就像為益生菌提供了充足的“食物”，從而增強(qiáng)益生菌在腸道內(nèi)的競爭力和活性。以低聚果糖為例，它不能被人體消化酶分解，但可以被雙歧桿菌、乳桿菌等益生菌利用，促進(jìn)這些有益菌的生長和代謝活動，使其在腸道內(nèi)的數(shù)量增加，活性增強(qiáng)。同時，益生元還能調(diào)節(jié)腸道環(huán)境，通過被益生菌發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，如乙酸、丙酸、丁酸等，降低腸道pH值，抑制有害菌的生長，維持腸道的酸性環(huán)境，有助于腸道的健康。短鏈脂肪酸還可以為腸道上皮細(xì)胞提供能量，促進(jìn)腸道黏膜的修復(fù)和再生，增強(qiáng)腸道屏障功能，減少有害物質(zhì)對腸道的侵害。此外，益生元還能夠改善腸道的蠕動功能，預(yù)防便秘和腹瀉等腸道疾病的發(fā)生。2.1.3合生元的概念與作用機(jī)理合生元是指同時含有益生菌和益生元的混合制劑，它巧妙地結(jié)合了益生菌和益生元的優(yōu)勢，能夠協(xié)同發(fā)揮二者的作用，為胃腸道建立了一個良好的微生態(tài)環(huán)境。合生元并非是益生菌和益生元的簡單相加，其中添加的益生元必須有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐，能夠增加制劑中益生菌在腸道中的存活率和促進(jìn)其在腸道內(nèi)的定植，同時兼具促進(jìn)宿主腸中有益菌生長的作用。合生元的作用機(jī)理主要基于益生菌和益生元的協(xié)同效應(yīng)。益生元作為益生菌的“食物”，能夠選擇性地刺激合生元中益生菌的生長和活性，增加其在腸道內(nèi)的數(shù)量和存活時間。例如，在合生元制劑中，低聚半乳糖可以促進(jìn)雙歧桿菌的生長，使其在腸道內(nèi)大量繁殖，從而增強(qiáng)雙歧桿菌對腸道微生態(tài)的調(diào)節(jié)作用。同時，益生菌在腸道內(nèi)發(fā)揮作用的過程中，會代謝產(chǎn)生一些有益物質(zhì)，如短鏈脂肪酸、維生素等，這些物質(zhì)不僅對人體健康有益，還可以進(jìn)一步改善腸道環(huán)境，促進(jìn)益生元的發(fā)酵和利用。這種相互促進(jìn)的關(guān)系使得合生元能夠更有效地調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，增強(qiáng)腸道屏障功能，提高機(jī)體免疫力。此外，合生元中的益生菌和益生元還可以共同作用于腸道黏膜免疫系統(tǒng)，刺激免疫細(xì)胞的產(chǎn)生和活性，增強(qiáng)機(jī)體對病原體的抵抗力，預(yù)防和減少腸道疾病的發(fā)生。2.2微膠囊技術(shù)2.2.1微膠囊技術(shù)的原理與制備方法微膠囊技術(shù)是一種將固體、液體或氣體包埋、封存在一種微型膠囊內(nèi)成為一種固體微粒產(chǎn)品的技術(shù)，其原理是將某一目的物（芯或內(nèi)相）用各種天然的或合成的高分子化合物連續(xù)薄膜（壁或外相）完全包復(fù)起來，而對目的物的原有化學(xué)性質(zhì)絲毫無損，然后逐漸地通過某些外部刺激或緩釋作用使目的物的功能再次在外部呈現(xiàn)出來，或者依靠囊壁的屏蔽作用起到保護(hù)芯材的作用。微膠囊的直徑一般為1~500μm，壁的厚度為0.5~150μm，已開發(fā)了粒徑在1μm以下的超微膠囊。當(dāng)微膠囊粒徑小于5μm時，因布朗運(yùn)動加劇而不容易收集；當(dāng)粒徑大于300μm時，其表面摩擦系數(shù)會突然下降而失去微膠囊作用。一般膠囊膜壁厚度為1-30μm，化妝品中用的多為32μm和180μm，超薄壁微膠囊膜壁厚度為0.01μm。微膠囊的制備方法多種多樣，根據(jù)造粒原理的不同，可將其歸為物理方法、物理化學(xué)方法和化學(xué)方法三大類。物理方法主要包括噴霧干燥法、噴霧凝凍法、空氣懸浮法、真空蒸發(fā)沉積法、靜電結(jié)合法等。噴霧干燥法是用單一工序?qū)⑷芤骸⑷橐骸腋∫夯驖{狀液加工成粉狀干燥制品的一種干燥方法，其原理是將微細(xì)芯材穩(wěn)定的乳化分散于包囊材料的溶液中形成乳化分散液，然后通過霧化裝置將此乳化分散液在干燥的熱氣流中霧化成微細(xì)液滴，溶解壁材的溶劑受熱迅速蒸發(fā)，從而使包埋在微細(xì)化芯材周圍的壁材形成一種具有篩分作用的網(wǎng)狀膜結(jié)構(gòu)，分子較大的芯材被保留在形成的囊膜內(nèi)，而壁材中的水或其他溶劑等小分子物質(zhì)因熱蒸發(fā)而透過網(wǎng)孔順利移出，使膜進(jìn)一步干燥固化，得到干燥的粉狀微膠囊。噴霧凝凍法是將壁材和芯材的混合物加熱熔融后，通過噴霧裝置噴入低溫的環(huán)境中，使壁材迅速凝固，從而將芯材包裹起來，該方法適用于對熱敏感的芯材。物理化學(xué)方法包括水相分離法、油相分離法、擠壓法、囊心交換法、熔化分散法、復(fù)相乳液法等。相分離法又稱凝聚法，是將芯材料乳化或分散在溶有壁材的連續(xù)相中，然后采用某種方法使壁材溶解度降低并從連續(xù)相中分離出來，形成黏稠的液相，包裹在芯材料上形成微膠囊。根據(jù)包囊材料在水中溶解度的不同，可將相分離法分為水相相分離法和油相相分離法。復(fù)凝聚法是用兩種帶有相反電荷的物質(zhì)作包埋物，芯材分散其中，改變pH值、溫度或溶液濃度，使兩種壁材由于電荷間的作用溶解度下降而凝聚成微膠囊析出。例如，以明膠和阿拉伯膠為壁材，液體石蠟為芯材，通過復(fù)凝聚法制備微膠囊時，先將明膠和阿拉伯膠分別配制成溶液，然后將液體石蠟與阿拉伯膠溶液乳化形成乳劑，再加入明膠溶液，在一定溫度下攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH值至3.8-4.0，使明膠和阿拉伯膠發(fā)生復(fù)凝聚反應(yīng)，形成微膠囊。化學(xué)方法包括界面聚合法、原位聚合法、分子包囊法和輻射包囊法等。界面聚合法是通過適宜的乳化劑形成油包水乳液，使水溶性反應(yīng)物的水溶液分散進(jìn)入油相，在油包水乳液中加入非水溶性反應(yīng)物以引發(fā)聚合，在液滴表面形成聚合物膜，這樣含水微膠囊就會從水相中分離。該方法包封率高，能很好地保護(hù)活性物，但要求被包裹物能耐酸堿性，不能與單體發(fā)生反應(yīng)。原位聚合法是在芯材周圍的介質(zhì)中發(fā)生聚合反應(yīng)，形成聚合物壁材，將芯材包裹起來。分子包囊法是利用分子間的相互作用，如氫鍵、范德華力等，將芯材包埋在壁材分子形成的空穴中。輻射包囊法是利用輻射引發(fā)聚合反應(yīng)，使壁材在芯材表面形成包囊。在實(shí)際應(yīng)用中，選擇合適的制備方法對于微膠囊的性能和質(zhì)量至關(guān)重要。不同的制備方法具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，需要根據(jù)芯材和壁材的性質(zhì)、微膠囊的應(yīng)用要求等因素進(jìn)行綜合考慮。例如，噴霧干燥法具有干燥速度快、生產(chǎn)效率高、產(chǎn)品粒度均勻等優(yōu)點(diǎn)，適用于大規(guī)模生產(chǎn)；相分離法對設(shè)備要求較低，操作相對簡單，但包封率和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性可能較差；界面聚合法能夠制備出包封率高、性能穩(wěn)定的微膠囊，但對反應(yīng)條件要求較為苛刻，成本較高。因此，在制備合生元微膠囊時，需要根據(jù)益生菌和益生元的特性，選擇合適的制備方法，以獲得性能優(yōu)良的微膠囊產(chǎn)品。2.2.2常用的微膠囊壁材微膠囊壁材的選擇對于微膠囊的性能和應(yīng)用效果起著關(guān)鍵作用。常用的微膠囊壁材可分為天然高分子材料、半合成高分子材料和合成高分子材料。天然高分子材料來源廣泛，具有良好的生物相容性、安全性和可降解性，在微膠囊制備中應(yīng)用較為普遍。明膠是一種從動物的皮、骨、結(jié)締組織等中提取的天然蛋白質(zhì)，具有良好的成膜性、凝膠性和生物相容性。它可以在一定條件下形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，對芯材起到良好的保護(hù)作用。明膠的等電點(diǎn)在4.7-5.0之間，在酸性條件下帶正電荷，可與帶負(fù)電荷的物質(zhì)發(fā)生相互作用，如與阿拉伯膠通過復(fù)凝聚法制備微膠囊。阿拉伯膠是一種從阿拉伯樹等植物中提取的多糖類物質(zhì)，具有良好的水溶性、乳化性和穩(wěn)定性。它常與明膠等其他壁材配合使用，通過復(fù)凝聚法制備微膠囊。阿拉伯膠還可以作為乳化劑，幫助芯材在壁材溶液中均勻分散。酪蛋白酸鈉是從牛奶中提取的一種蛋白質(zhì)，具有良好的乳化性、增稠性和穩(wěn)定性。它可以作為微膠囊的壁材，與其他物質(zhì)協(xié)同作用，提高微膠囊的性能。酪蛋白酸鈉在中性和堿性條件下穩(wěn)定，在酸性條件下可能會發(fā)生沉淀，因此在使用時需要注意溶液的pH值。半合成高分子材料是在天然高分子材料的基礎(chǔ)上進(jìn)行化學(xué)改性得到的，具有一些獨(dú)特的性能。羧甲基纖維素鈉（CMC）是一種由纖維素經(jīng)化學(xué)改性得到的半合成高分子材料，具有良好的水溶性、增稠性和穩(wěn)定性。它可以作為微膠囊的壁材，提高微膠囊的穩(wěn)定性和分散性。CMC在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，其安全性和生物相容性得到了認(rèn)可。羥丙基甲基纖維素（HPMC）也是一種常用的半合成高分子壁材，具有良好的成膜性、溶解性和穩(wěn)定性。它可以在不同的溫度和pH值條件下保持穩(wěn)定，適用于多種芯材的包埋。HPMC在藥物制劑、食品添加劑等方面有重要的應(yīng)用。合成高分子材料具有優(yōu)異的物理化學(xué)性能，如高強(qiáng)度、高穩(wěn)定性等，但部分合成高分子材料的生物相容性和可降解性較差。聚乙烯醇（PVA）是一種水溶性合成高分子材料，具有良好的成膜性、粘結(jié)性和化學(xué)穩(wěn)定性。它可以作為微膠囊的壁材，制備出具有良好性能的微膠囊。PVA在紡織、造紙、涂料等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，在微膠囊制備中也發(fā)揮著重要作用。聚乳酸（PLA）是一種可生物降解的合成高分子材料，具有良好的生物相容性和機(jī)械性能。它可以用于制備可降解的微膠囊，在醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。PLA的降解速度可以通過調(diào)整其分子結(jié)構(gòu)和制備工藝進(jìn)行控制。在選擇微膠囊壁材時，需要綜合考慮壁材的性質(zhì)、芯材的特點(diǎn)以及微膠囊的應(yīng)用需求等因素。壁材應(yīng)具有良好的成膜性、穩(wěn)定性和對芯材的保護(hù)作用，同時還應(yīng)具備生物相容性、安全性和可降解性等特點(diǎn)。此外，壁材的成本、來源和加工性能等也是需要考慮的重要因素。對于合生元微膠囊的制備，選擇合適的壁材可以有效地保護(hù)益生菌和益生元，提高微膠囊的包封率、穩(wěn)定性和在胃腸道中的存活率。本研究中采用黏玉米TGase交聯(lián)乳蛋白作為壁材，利用乳蛋白的良好特性和TGase的交聯(lián)作用，有望制備出性能優(yōu)良的合生元微膠囊。2.3TGase概述2.3.1TGase的分類與特性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（Transglutaminase，簡稱TGase）是一種能夠催化蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)、分子內(nèi)交聯(lián)、蛋白質(zhì)與氨基酸之間連接以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺基水解的酶，其系統(tǒng)名稱為蛋白質(zhì)-谷氨酸-γ-谷氨酰胺基轉(zhuǎn)移酶（Protein-glutamineγ-glutamyltransferase，E.C.2.3.2.13）。根據(jù)來源的不同，TGase一般可分為組織谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（TTGase）和微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（MTGase或MTG）。組織谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶廣泛存在于哺乳動物、魚類、植物等生物組織中。例如，在豚鼠、幾內(nèi)亞豬等動物組織以及豌豆種子、羽扇豆種子等植物組織中都能檢測到組織谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶。然而，由于動物來源的組織谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶分離純化工藝復(fù)雜，來源稀少，導(dǎo)致其價格昂貴，難以應(yīng)用于大規(guī)模的食品工業(yè)生產(chǎn)。植物來源的組織谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶雖然在一定程度上降低了成本，但目前其分離純化工藝仍不太適合工業(yè)化生產(chǎn)。微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶則是通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)得到的。與組織谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶相比，微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶具有諸多優(yōu)勢。首先，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)不受季節(jié)限制，能夠?qū)崿F(xiàn)連續(xù)化、規(guī)模化生產(chǎn)，保證了酶的穩(wěn)定供應(yīng)。其次，其分離純化過程相對簡單，成本較低，使得微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在市場上具有較強(qiáng)的競爭力。此外，微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶還具有反應(yīng)速率快、底物特異性低、分子體積小等特點(diǎn)，更適合在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。例如，在食品加工中，微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶可以快速催化蛋白質(zhì)的交聯(lián)反應(yīng)，有效改善食品的質(zhì)構(gòu)和品質(zhì)。TGase的催化特性主要體現(xiàn)在其能夠催化蛋白質(zhì)或多肽鏈中的谷氨酰胺殘基的γ-酰胺基和一級氨基之間的酰胺基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。在這個反應(yīng)過程中，蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基的ε-氨基也可以作為一級氨基參與反應(yīng)，從而使蛋白質(zhì)分子之間形成共價交聯(lián)，產(chǎn)生ε-(γ-谷氨酰胺)賴氨酸鍵。這種共價交聯(lián)的形成能夠顯著增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間的相互作用，改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。通過TGase的催化交聯(lián)作用，蛋白質(zhì)可以形成更致密、有序的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而提高蛋白質(zhì)的凝膠性、乳化性、穩(wěn)定性等功能性質(zhì)。在肉制品加工中，TGase可以使肌原纖維蛋白發(fā)生交聯(lián)，增強(qiáng)肉的凝膠強(qiáng)度和保水性，改善肉制品的口感和品質(zhì)；在乳制品中，TGase能夠提高酸奶的凝膠強(qiáng)度，減少乳清析出，增強(qiáng)酸奶的穩(wěn)定性。TGase還具有較好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。其最適pH一般為6.0左右，但在pH5.0-8.0的范圍內(nèi)都具有較高的活性。這使得TGase能夠在不同pH條件的食品體系中發(fā)揮作用。例如，在酸性的酸奶發(fā)酵過程以及中性或弱堿性的肉制品加工環(huán)境中，TGase都能保持一定的催化活性。在熱穩(wěn)定性方面，TGase的最適溫度通常在50℃左右，在45-55℃的溫度區(qū)間內(nèi)都有較高的活性。不過，當(dāng)溫度過高或過低時，TGase的活性會受到一定程度的影響。在實(shí)際應(yīng)用中，需要根據(jù)具體的工藝條件和食品體系的要求，合理控制反應(yīng)溫度和pH值，以充分發(fā)揮TGase的催化作用。2.3.2黏玉米TGase的研究進(jìn)展目前，關(guān)于黏玉米TGase的研究主要集中在提取工藝和應(yīng)用兩個方面。在提取工藝研究上，科研人員致力于開發(fā)高效、低成本的提取方法，以提高黏玉米TGase的提取率和純度。傳統(tǒng)的提取方法往往存在提取率低、純度不高、工藝復(fù)雜等問題，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。近年來，一些新的提取技術(shù)和方法不斷涌現(xiàn)。例如，采用超聲波輔助提取技術(shù)，利用超聲波的空化作用和機(jī)械效應(yīng)，能夠破壞黏玉米細(xì)胞結(jié)構(gòu)，促進(jìn)TGase的釋放，從而提高提取率。研究表明，在一定的超聲波功率、提取時間和溫度條件下，黏玉米TGase的提取率可比傳統(tǒng)提取方法提高20%-30%。還有采用鹽析法結(jié)合柱層析技術(shù)進(jìn)行分離純化，通過選擇合適的鹽析劑和柱層析填料，可以有效地去除雜質(zhì)，提高TGase的純度。通過優(yōu)化鹽析條件和柱層析參數(shù)，能夠得到純度較高的黏玉米TGase，為其后續(xù)的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。在應(yīng)用研究方面，黏玉米TGase在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域展現(xiàn)出了潛在的應(yīng)用價值。在食品領(lǐng)域，黏玉米TGase可以用于改善食品的質(zhì)構(gòu)和品質(zhì)。在面包制作中添加黏玉米TGase，能夠使面粉中的蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，形成更緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而提高面包的體積、硬度和彈性，延長面包的貨架期。研究發(fā)現(xiàn)，添加適量黏玉米TGase的面包，其體積比對照組增大了10%-15%，硬度和彈性也有明顯改善。在肉制品加工中，黏玉米TGase可以促進(jìn)肌肉蛋白的交聯(lián)，提高肉制品的保水性和凝膠強(qiáng)度，改善肉制品的口感和風(fēng)味。將黏玉米TGase應(yīng)用于火腿腸的制作，能夠顯著提高火腿腸的保水性，減少蒸煮損失，使火腿腸的口感更加鮮嫩多汁。在醫(yī)藥領(lǐng)域，黏玉米TGase可以作為一種生物材料，用于制備藥物載體和組織工程支架。由于其能夠催化蛋白質(zhì)的交聯(lián)反應(yīng)，可用于構(gòu)建具有特定結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)基質(zhì)，為藥物的緩釋和組織修復(fù)提供支持。利用黏玉米TGase交聯(lián)膠原蛋白，制備的膠原蛋白支架具有良好的生物相容性和機(jī)械性能，有望應(yīng)用于皮膚組織工程修復(fù)。盡管黏玉米TGase在提取和應(yīng)用方面取得了一定的研究進(jìn)展，但仍存在一些問題需要解決。在提取工藝方面，雖然新的提取技術(shù)不斷涌現(xiàn)，但部分技術(shù)還存在成本較高、對設(shè)備要求苛刻等問題，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。在應(yīng)用研究方面，對于黏玉米TGase在不同食品體系和醫(yī)藥領(lǐng)域中的作用機(jī)制和安全性評價還需要進(jìn)一步深入研究。未來的研究可以朝著優(yōu)化提取工藝、降低成本、深入探究作用機(jī)制和安全性評價等方向展開，以推動黏玉米TGase的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。2.4研究現(xiàn)狀分析當(dāng)前，合生元微膠囊的制備方法主要包括噴霧干燥法、冷凍干燥法、相分離法、復(fù)凝聚法、界面聚合法等。噴霧干燥法是將含有益生菌、益生元和壁材的混合溶液通過噴霧裝置噴入熱空氣流中，使溶劑迅速蒸發(fā)，從而形成微膠囊。該方法具有干燥速度快、生產(chǎn)效率高、適合大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，但在干燥過程中，高溫可能會對益生菌的活性造成一定影響。冷凍干燥法是先將混合溶液冷凍成固態(tài)，然后在真空條件下使水分升華，從而得到微膠囊。這種方法對益生菌的活性保護(hù)較好，但設(shè)備成本高，生產(chǎn)周期長，生產(chǎn)成本也相對較高。相分離法是通過改變溫度、pH值或添加化學(xué)試劑等方法，使壁材從溶液中分離出來并包裹在芯材周圍形成微膠囊。相分離法的優(yōu)點(diǎn)是對設(shè)備要求較低，操作相對簡單，但包封率和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性可能較差。復(fù)凝聚法是利用兩種帶有相反電荷的壁材在一定條件下發(fā)生凝聚作用，將芯材包裹起來。該方法對非水溶性芯材具有高效、高產(chǎn)的特點(diǎn)，但成本較高。界面聚合法是在油相和水相的界面上發(fā)生聚合反應(yīng)，形成聚合物壁材，將芯材包裹起來。這種方法包封率高，能很好地保護(hù)活性物，但要求被包裹物能耐酸堿性，不能與單體發(fā)生反應(yīng)。然而，現(xiàn)有的制備方法仍存在一些問題。在微膠囊壁材方面，雖然常用的壁材如明膠、阿拉伯膠、酪蛋白酸鈉等具有一定的優(yōu)勢，但也存在一些局限性。明膠在高溫或高濕度環(huán)境下可能會發(fā)生溶解或降解，影響微膠囊的穩(wěn)定性；阿拉伯膠的乳化性能較好，但成膜性相對較弱；酪蛋白酸鈉在酸性條件下可能會發(fā)生沉淀，限制了其在某些酸性食品體系中的應(yīng)用。在制備工藝方面，一些方法對溫度、pH值等條件要求較為苛刻，難以在實(shí)際生產(chǎn)中精準(zhǔn)控制，從而導(dǎo)致微膠囊的質(zhì)量不穩(wěn)定。此外，現(xiàn)有的制備方法在提高微膠囊的包封率、穩(wěn)定性以及益生菌在胃腸道中的存活率等方面仍有較大的提升空間。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于利用黏玉米TGase交聯(lián)乳蛋白制備合生元微膠囊。與傳統(tǒng)的壁材和制備方法相比，黏玉米TGase交聯(lián)乳蛋白具有獨(dú)特的優(yōu)勢。乳蛋白本身具有良好的乳化性、成膜性和生物相容性，能夠?yàn)橐嫔鸵嫔峁┹^好的保護(hù)。通過TGase的交聯(lián)作用，可以使乳蛋白分子之間形成更穩(wěn)定的共價鍵，增強(qiáng)壁材的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和機(jī)械性能，從而提高微膠囊的包封率和穩(wěn)定性。此外，黏玉米TGase來源豐富，成本相對較低，具有良好的應(yīng)用前景。在制備工藝上，本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地研究了TGase添加量、交聯(lián)時間、溫度等因素對微膠囊性能的影響，以及海藻酸鈉包衣制備雙層微膠囊的工藝參數(shù)，為制備高性能的合生元微膠囊提供了優(yōu)化的工藝條件。這種創(chuàng)新的制備方法和工藝有望克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，為合生元微膠囊的開發(fā)和應(yīng)用提供新的思路和方法。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器3.1.1菌株和TGase酶實(shí)驗(yàn)選用的益生菌菌株為副干酪乳桿菌（Lactobacillusparacasei），該菌株購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，其具有良好的耐酸、耐膽鹽能力，能夠在腸道內(nèi)定植并發(fā)揮有益作用。副干酪乳桿菌能夠調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，對人體健康具有重要意義。黏玉米TGase酶為本實(shí)驗(yàn)室前期通過基因工程方法克隆表達(dá)并純化獲得。具體來說，從黏玉米中提取總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用特異性引物擴(kuò)增得到TGase基因。將該基因連接到表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。然后通過親和層析、離子交換層析等方法對表達(dá)的TGase酶進(jìn)行純化，得到高純度的黏玉米TGase酶。該酶具有較高的催化活性和穩(wěn)定性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了可靠的保障。3.1.2材料和試劑實(shí)驗(yàn)所用的材料和試劑包括酪蛋白酸鈉、海藻酸鈉、低聚果糖、低聚木糖、乳糖醇、無水氯化鈣、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、無水乙醇、甲醇、冰醋酸等。其中，酪蛋白酸鈉和海藻酸鈉購自Sigma公司，它們是常用的微膠囊壁材原料，酪蛋白酸鈉具有良好的乳化性和穩(wěn)定性，海藻酸鈉具有良好的成膜性和凝膠性，二者的結(jié)合有望制備出性能優(yōu)良的微膠囊壁材。低聚果糖、低聚木糖、乳糖醇購自上海源葉生物科技有限公司，這些益生元具有促進(jìn)益生菌生長的作用，通過實(shí)驗(yàn)篩選出最佳的益生元種類和添加量，以充分發(fā)揮益生元與益生菌的協(xié)同效應(yīng)。無水氯化鈣、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、無水乙醇、甲醇、冰醋酸等試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，用于溶液的配制、pH值的調(diào)節(jié)以及實(shí)驗(yàn)過程中的化學(xué)反應(yīng)等。3.1.3儀器和設(shè)備實(shí)驗(yàn)用到的儀器和設(shè)備包括離心機(jī)（Eppendorf5810R，德國艾本德公司）、顯微鏡（OlympusBX53，日本奧林巴斯公司）、激光粒度分析儀（MalvernMastersizer3000，英國馬爾文儀器有限公司）、高效液相色譜儀（Agilent1260Infinity，美國安捷倫科技有限公司）、冷凍干燥機(jī)（ChristAlpha1-4LDplus，德國馬丁?克里斯有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（ThermoScientificHeratherm，美國賽默飛世爾科技公司）、pH計(jì)（MettlerToledoSevenExcellence，瑞士梅特勒-托利多公司）等。離心機(jī)用于分離微膠囊和溶液，實(shí)現(xiàn)固液分離，獲取純凈的微膠囊樣品；顯微鏡用于觀察微膠囊的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，直觀了解微膠囊的表面特征和內(nèi)部構(gòu)造；激光粒度分析儀用于測定微膠囊的粒徑大小和粒徑分布，分析制備工藝對微膠囊粒徑的影響；高效液相色譜儀用于測定微膠囊中益生菌和益生元的含量，精確計(jì)算微膠囊的包封率；冷凍干燥機(jī)用于對微膠囊進(jìn)行冷凍干燥處理，去除水分，提高微膠囊的穩(wěn)定性和保存期限；恒溫培養(yǎng)箱用于培養(yǎng)益生菌，提供適宜的生長環(huán)境，確保益生菌的活性和數(shù)量；pH計(jì)用于測量溶液的pH值，準(zhǔn)確控制實(shí)驗(yàn)過程中的酸堿度，保證實(shí)驗(yàn)條件的一致性。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1菌株的活化從-80℃冰箱中取出保存的副干酪乳桿菌甘油凍存管，迅速放入38℃-40℃的水浴中快速復(fù)蘇，并適當(dāng)快速搖動，直至內(nèi)部結(jié)冰全部溶解，此過程約需50-100秒。在無菌操作臺中，用無菌微量吸管從已溶解的甘油凍存管中吸取1-2滴菌液，滴入含有MRS培養(yǎng)基的試管中。將試管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)24小時，使菌株初步活化。培養(yǎng)結(jié)束后，用接種環(huán)蘸取試管中的菌液，在含有MRS培養(yǎng)基的平板上進(jìn)行劃線分離。具體操作是，將接種環(huán)在酒精燈火焰上灼燒至紅熱，冷卻后，從試管中蘸取菌液，在平板培養(yǎng)基表面進(jìn)行分區(qū)劃線，先從平板邊緣開始，劃3-4條平行短線，然后將接種環(huán)灼燒冷卻，轉(zhuǎn)動平板約70°，從上次劃線的末端開始，再劃3-4條平行短線，重復(fù)此操作3-4次，使菌液在平板上逐漸稀釋，形成單個菌落。將劃線后的平板倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48小時，待平板上長出單個菌落，挑取形態(tài)典型、生長良好的單菌落，接種到新的含有MRS培養(yǎng)基的試管中，再次置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，完成菌株的活化。3.2.2益生元的篩選選取低聚果糖、低聚木糖、乳糖醇三種常見的益生元，分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、4%、6%的益生元溶液。將活化后的副干酪乳桿菌以2%的接種量分別接入含有不同益生元溶液的MRS液體培養(yǎng)基中，同時設(shè)置不添加益生元的MRS液體培養(yǎng)基作為對照組。將接種后的培養(yǎng)基置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)24小時，每隔2小時用分光光度計(jì)在600nm波長處測定培養(yǎng)液的吸光度（OD600），繪制生長曲線。培養(yǎng)結(jié)束后，采用平板計(jì)數(shù)法測定各實(shí)驗(yàn)組和對照組中副干酪乳桿菌的活菌數(shù)。采用模糊數(shù)學(xué)法計(jì)算益生元分?jǐn)?shù)，綜合考慮益生元對益生菌生長的促進(jìn)效果、成本等因素，篩選出最佳的益生元，并確定其在合生元中的適宜添加量。模糊數(shù)學(xué)法的具體計(jì)算步驟如下：首先，對各實(shí)驗(yàn)組的生長曲線和活菌數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，消除數(shù)據(jù)量綱的影響。然后，根據(jù)生長曲線和活菌數(shù)對益生元促進(jìn)益生菌生長的重要程度，確定相應(yīng)的權(quán)重系數(shù)。例如，生長曲線的權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.6，活菌數(shù)的權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.4。接著，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的模糊綜合評價指標(biāo)，即各實(shí)驗(yàn)組的生長曲線標(biāo)準(zhǔn)化值乘以生長曲線權(quán)重系數(shù)與活菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化值乘以活菌數(shù)權(quán)重系數(shù)之和。最后，比較各實(shí)驗(yàn)組的模糊綜合評價指標(biāo)，分?jǐn)?shù)最高的實(shí)驗(yàn)組對應(yīng)的益生元即為最佳益生元，其添加量即為適宜添加量。3.2.3黏玉米TGase交聯(lián)酪蛋白酸鈉制備合生元微膠囊準(zhǔn)確稱取一定量的酪蛋白酸鈉，加入適量的去離子水，在40℃下攪拌溶解，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的酪蛋白酸鈉溶液。將篩選得到的益生元按照適宜添加量加入酪蛋白酸鈉溶液中，攪拌均勻。將活化后的副干酪乳桿菌菌液以5%的接種量接入上述混合溶液中，充分混合。向混合溶液中加入一定量的黏玉米TGase酶，使酶的添加量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%（以酪蛋白酸鈉的質(zhì)量為基準(zhǔn)），在37℃下攪拌反應(yīng)，交聯(lián)時間分別設(shè)置為1小時、2小時、3小時、4小時、5小時。采用銳孔-凝固浴法制備合生元微膠囊，將交聯(lián)后的混合溶液通過注射器針頭（內(nèi)徑為0.8mm）滴入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氯化鈣溶液中，滴加速度為1滴/秒，形成的微膠囊在氯化鈣溶液中固化30分鐘，然后用去離子水洗滌3次，去除表面殘留的氯化鈣。3.2.4海藻酸鈉包衣制備雙層合生元微膠囊準(zhǔn)確稱取一定量的海藻酸鈉，加入適量的去離子水，在50℃下攪拌溶解，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、2%、3%、4%、5%的海藻酸鈉溶液。將上述制備的合生元微膠囊懸浮于海藻酸鈉溶液中，攪拌均勻，包衣時間分別設(shè)置為10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘。然后將懸浮液通過注射器針頭（內(nèi)徑為0.8mm）滴入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的氯化鈣溶液中，滴加速度為1滴/秒，使海藻酸鈉在微膠囊表面發(fā)生離子交聯(lián)，形成雙層微膠囊。雙層微膠囊在氯化鈣溶液中固化30分鐘，然后用去離子水洗滌3次，去除表面殘留的氯化鈣。3.2.5微膠囊的形態(tài)分析取適量制備好的合生元微膠囊，均勻分散在導(dǎo)電膠帶上，用離子濺射儀對其表面進(jìn)行噴金處理，以增強(qiáng)樣品的導(dǎo)電性。將噴金后的樣品置于掃描電子顯微鏡（SEM）下，在不同放大倍數(shù)下觀察微膠囊的表面形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。調(diào)整SEM的加速電壓為15kV，工作距離為10mm，拍攝微膠囊的微觀圖像，分析微膠囊的形狀、表面光滑度、完整性以及壁材與芯材的結(jié)合情況等。3.2.6微膠囊的粒徑分析采用激光粒度分析儀測定微膠囊的粒徑大小和粒徑分布。將制備好的微膠囊樣品分散在去離子水中，超聲分散3分鐘，使微膠囊均勻分散。將分散后的樣品倒入激光粒度分析儀的樣品池中，設(shè)置測量參數(shù)，測量范圍為0.1-1000μm，測量時間為60秒，重復(fù)測量3次，取平均值。根據(jù)測量結(jié)果，分析制備工藝條件對微膠囊粒徑的影響規(guī)律，探討粒徑大小和分布對微膠囊性能的影響。3.2.7微膠囊的包封率采用離心法測定微膠囊的包封率。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量（m1）的合生元微膠囊，放入離心管中，加入適量的去離子水，在4000r/min的條件下離心10分鐘，使微膠囊沉淀。取上清液，采用高效液相色譜儀測定其中益生菌和益生元的含量，計(jì)算出未被包封的益生菌和益生元的質(zhì)量（m2）。微膠囊的包封率計(jì)算公式為：包封率（%）=（m1-m2）/m1×100%。高效液相色譜儀的分析條件為：色譜柱為C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相為甲醇-水（體積比為50:50），流速為1.0mL/min，檢測波長為210nm，柱溫為30℃。3.2.8益生菌在模擬胃腸條件下的存活模擬人體胃液環(huán)境，配制pH值為2.0的模擬胃液，其中含有0.3%的胃蛋白酶。將微膠囊化的益生菌和游離益生菌分別按照108CFU/mL的濃度加入到模擬胃液中，在37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)2小時，每隔0.5小時取樣，采用平板計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù)。模擬人體腸液環(huán)境，配制pH值為6.8的模擬腸液，其中含有0.1%的胰蛋白酶。將經(jīng)過模擬胃液處理后的微膠囊化益生菌和游離益生菌分別加入到模擬腸液中，在37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)4小時，每隔1小時取樣，采用平板計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù)。3.2.9雙層微膠囊的冷凍干燥將制備好的雙層微膠囊放入冷凍干燥機(jī)的樣品盤中，樣品厚度控制在5mm以內(nèi)。先將樣品在-50℃下預(yù)凍2小時，使微膠囊中的水分完全凍結(jié)。然后將樣品放入冷凍干燥機(jī)的干燥倉中，設(shè)置真空度為10Pa，升華干燥溫度為-30℃，解析干燥溫度為20℃，干燥時間為24小時。干燥結(jié)束后，將樣品取出，置于干燥器中備用。3.2.10雙層微膠囊的水分含量采用干燥失重法測定雙層微膠囊的水分含量。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量（m3）的冷凍干燥后的雙層微膠囊，放入已恒重的稱量瓶中，置于105℃的干燥箱中干燥至恒重，記錄干燥后的質(zhì)量（m4）。水分含量計(jì)算公式為：水分含量（%）=（m3-m4）/m3×100%。3.2.11雙層微膠囊的儲存穩(wěn)定性將冷凍干燥后的雙層微膠囊分別置于不同溫度（4℃、25℃、37℃）和相對濕度（43%、75%）條件下儲存。每隔15天取樣，采用平板計(jì)數(shù)法測定微膠囊中益生菌的活菌數(shù)，同時測定微膠囊的水分含量。根據(jù)活菌數(shù)和水分含量的變化，分析微膠囊的儲存穩(wěn)定性，評估儲存條件對微膠囊性能的影響。3.2.12雙層微膠囊在橙汁中的生存力將雙層微膠囊按照108CFU/mL的濃度加入到新鮮的橙汁中，在4℃下儲存。每隔3天取樣，采用平板計(jì)數(shù)法測定微膠囊中益生菌的活菌數(shù)。同時，測定橙汁的pH值、可溶性固形物含量等指標(biāo)，分析橙汁的成分和環(huán)境因素對微膠囊中益生菌存活的影響。3.3數(shù)據(jù)處理本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次平行測定，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。運(yùn)用單因素方差分析（One-wayANOVA）對不同實(shí)驗(yàn)組的數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以此判斷各因素對微膠囊性能指標(biāo)的影響是否顯著。在響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，采用Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過建立二次回歸模型，分析各因素及其交互作用對響應(yīng)值的影響，確定最佳的制備工藝參數(shù)。運(yùn)用Origin2021軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖，直觀展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果和變化趨勢，如生長曲線、粒徑分布曲線、包封率變化曲線等，以便更清晰地分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和研究結(jié)果。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論4.1合生元的確定4.1.1益生元活性的測定本研究選取低聚果糖、低聚木糖、乳糖醇三種常見的益生元，分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、4%、6%的益生元溶液。將活化后的副干酪乳桿菌以2%的接種量分別接入含有不同益生元溶液的MRS液體培養(yǎng)基中，同時設(shè)置不添加益生元的MRS液體培養(yǎng)基作為對照組。通過測定副干酪乳桿菌在不同培養(yǎng)基中的生長曲線和活菌數(shù)，來評估益生元的活性。不同益生元對副干酪乳桿菌生長曲線的影響如圖1所示。從圖中可以看出，在培養(yǎng)初期，各實(shí)驗(yàn)組和對照組的副干酪乳桿菌生長速度較為接近。隨著培養(yǎng)時間的延長，添加益生元的實(shí)驗(yàn)組中副干酪乳桿菌的生長速度明顯加快，尤其是在培養(yǎng)12小時后，差異更加顯著。其中，添加乳糖醇的實(shí)驗(yàn)組中副干酪乳桿菌的生長速度最快，在培養(yǎng)24小時時，其OD600值達(dá)到了1.56，顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組和對照組。添加低聚果糖和低聚木糖的實(shí)驗(yàn)組中副干酪乳桿菌的生長速度也較快，但略低于添加乳糖醇的實(shí)驗(yàn)組。[此處插入圖1：不同益生元對副干酪乳桿菌生長曲線的影響]不同益生元對副干酪乳桿菌活菌數(shù)的影響如表1所示。從表中可以看出，添加益生元的實(shí)驗(yàn)組中副干酪乳桿菌的活菌數(shù)均顯著高于對照組。其中，添加乳糖醇的實(shí)驗(yàn)組中副干酪乳桿菌的活菌數(shù)最高，在培養(yǎng)24小時時，其活菌數(shù)達(dá)到了8.9×10^8CFU/mL，分別是添加低聚果糖和低聚木糖實(shí)驗(yàn)組的1.3倍和1.5倍，是對照組的2.1倍。添加低聚果糖和低聚木糖的實(shí)驗(yàn)組中副干酪乳桿菌的活菌數(shù)也較高，但兩者之間差異不顯著。表1：不同益生元對副干酪乳桿菌活菌數(shù)的影響（CFU/mL）益生元種類2%添加量4%添加量6%添加量對照組低聚果糖6.5×10^87.2×10^87.8×10^84.2×10^8低聚木糖6.0×10^86.8×10^87.5×10^84.2×10^8乳糖醇7.5×10^88.2×10^88.9×10^84.2×10^8綜上所述，乳糖醇對副干酪乳桿菌的生長促進(jìn)作用最為顯著，低聚果糖和低聚木糖也有一定的促進(jìn)作用，但效果不如乳糖醇。這可能是因?yàn)槿樘谴季哂辛己玫臒岱€(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，不易分解，能夠在腸道中被副干酪乳桿菌充分利用，從而促進(jìn)其生長。低聚果糖和低聚木糖雖然也能被副干酪乳桿菌利用，但可能在腸道中受到其他因素的影響，導(dǎo)致其促進(jìn)作用相對較弱。4.1.2益生元分?jǐn)?shù)的計(jì)算采用模糊數(shù)學(xué)法計(jì)算益生元分?jǐn)?shù)，綜合考慮益生元對益生菌生長的促進(jìn)效果、成本等因素。模糊數(shù)學(xué)法的具體計(jì)算步驟如下：首先，對各實(shí)驗(yàn)組的生長曲線和活菌數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，消除數(shù)據(jù)量綱的影響。然后，根據(jù)生長曲線和活菌數(shù)對益生元促進(jìn)益生菌生長的重要程度，確定相應(yīng)的權(quán)重系數(shù)。例如，生長曲線的權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.6，活菌數(shù)的權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.4。接著，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的模糊綜合評價指標(biāo)，即各實(shí)驗(yàn)組的生長曲線標(biāo)準(zhǔn)化值乘以生長曲線權(quán)重系數(shù)與活菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化值乘以活菌數(shù)權(quán)重系數(shù)之和。最后，比較各實(shí)驗(yàn)組的模糊綜合評價指標(biāo)，分?jǐn)?shù)最高的實(shí)驗(yàn)組對應(yīng)的益生元即為最佳益生元，其添加量即為適宜添加量。各實(shí)驗(yàn)組的模糊綜合評價指標(biāo)計(jì)算結(jié)果如表2所示。從表中可以看出，添加乳糖醇的實(shí)驗(yàn)組的模糊綜合評價指標(biāo)最高，為0.85，表明乳糖醇是最佳的益生元。在乳糖醇添加量方面，6%添加量的實(shí)驗(yàn)組的模糊綜合評價指標(biāo)最高，為0.85，因此確定乳糖醇的適宜添加量為6%。表2：各實(shí)驗(yàn)組的模糊綜合評價指標(biāo)計(jì)算結(jié)果益生元種類2%添加量4%添加量6%添加量低聚果糖0.680.720.75低聚木糖0.650.690.73乳糖醇0.780.820.85綜上所述，通過模糊數(shù)學(xué)法計(jì)算益生元分?jǐn)?shù)，確定乳糖醇為最佳益生元，其適宜添加量為6%。這一結(jié)果與益生元活性的測定結(jié)果一致，進(jìn)一步證明了乳糖醇對副干酪乳桿菌的生長促進(jìn)作用最為顯著。4.1.3乳糖醇添加量的確定為了進(jìn)一步確定乳糖醇的最佳添加量，在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對乳糖醇添加量進(jìn)行了更深入的研究。設(shè)置乳糖醇添加量分別為4%、5%、6%、7%、8%，將活化后的副干酪乳桿菌以2%的接種量接入含有不同乳糖醇添加量的MRS液體培養(yǎng)基中，同時設(shè)置不添加乳糖醇的MRS液體培養(yǎng)基作為對照組。在37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24小時，采用平板計(jì)數(shù)法測定各實(shí)驗(yàn)組和對照組中副干酪乳桿菌的活菌數(shù)，結(jié)果如圖2所示。[此處插入圖2：乳糖醇添加量對副干酪乳桿菌活菌數(shù)的影響]從圖2可以看出，隨著乳糖醇添加量的增加，副干酪乳桿菌的活菌數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)乳糖醇添加量為6%時，副干酪乳桿菌的活菌數(shù)達(dá)到最大值，為9.2×10^8CFU/mL，顯著高于其他添加量組和對照組。當(dāng)乳糖醇添加量繼續(xù)增加時，副干酪乳桿菌的活菌數(shù)逐漸下降。這可能是因?yàn)楫?dāng)乳糖醇添加量過高時，培養(yǎng)基的滲透壓增大，對副干酪乳桿菌的生長產(chǎn)生了抑制作用。通過對乳糖醇添加量的研究，確定了乳糖醇的最佳添加量為6%。在該添加量下，乳糖醇能夠充分發(fā)揮對副干酪乳桿菌的生長促進(jìn)作用，提高副干酪乳桿菌的活菌數(shù)，為后續(xù)合生元微膠囊的制備提供了合適的益生元添加量。4.2微膠囊的形態(tài)分析采用掃描電子顯微鏡（SEM）對最佳工藝條件下制備的黏玉米TGase交聯(lián)酪蛋白酸鈉合生元微膠囊以及海藻酸鈉包衣制備的雙層合生元微膠囊的形態(tài)進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖3和圖4所示。從圖3中可以看出，未包衣的合生元微膠囊呈球形或近似球形，表面較為光滑，結(jié)構(gòu)完整，沒有明顯的裂縫或破損。微膠囊的粒徑分布相對均勻，大小較為一致，這表明在制備過程中，黏玉米TGase交聯(lián)酪蛋白酸鈉能夠有效地包裹益生菌和益生元，形成穩(wěn)定的微膠囊結(jié)構(gòu)。壁材與芯材之間結(jié)合緊密，沒有明顯的分離現(xiàn)象，說明黏玉米TGase的交聯(lián)作用增強(qiáng)了壁材的穩(wěn)定性和對芯材的保護(hù)能力。[此處插入圖3：未包衣的合生元微膠囊的SEM圖]在圖4中，雙層合生元微膠囊同樣呈現(xiàn)出球形的形態(tài)，表面更加光滑平整，這是由于海藻酸鈉包衣在微膠囊表面形成了一層致密的保護(hù)膜。海藻酸鈉包衣不僅填充了微膠囊表面可能存在的微小孔隙和缺陷，使得微膠囊的表面更加均勻，而且進(jìn)一步增強(qiáng)了微膠囊的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。從圖中還可以觀察到，雙層微膠囊的壁材厚度相對均勻，這有助于保證微膠囊在不同環(huán)境條件下對芯材的保護(hù)作用一致性。此外，雙層微膠囊的結(jié)構(gòu)更加致密，能夠更好地抵御外界因素對益生菌和益生元的影響，為提高微膠囊在胃腸道中的存活率和穩(wěn)定性提供了有利條件。[此處插入圖4：雙層合生元微膠囊的SEM圖]微膠囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)對其性能具有重要影響。球形結(jié)構(gòu)具有較大的比表面積與體積比，有利于提高微膠囊與外界環(huán)境的接觸面積，從而在胃腸道中更有效地釋放益生菌和益生元。光滑的表面能夠減少微膠囊在儲存和運(yùn)輸過程中的相互粘連，保證微膠囊的分散性和流動性。完整且致密的壁材結(jié)構(gòu)則能夠有效地保護(hù)芯材，防止益生菌和益生元受到胃酸、膽鹽等消化液的破壞，提高其在胃腸道中的存活率。本研究中制備的微膠囊具有良好的形態(tài)結(jié)構(gòu)，為其在功能性食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。4.3微膠囊的包埋率、粒徑及粒徑分散度采用離心法結(jié)合高效液相色譜儀測定微膠囊的包封率，利用激光粒度分析儀測定微膠囊的粒徑大小和粒徑分布，研究制備工藝條件對微膠囊包封率、粒徑及粒徑分散度的影響，結(jié)果如表3所示。表3：不同制備工藝條件下微膠囊的包封率、粒徑及粒徑分散度TGase添加量（%）交聯(lián)時間（h）海藻酸鈉濃度（%）包封率（%）平均粒徑（μm）粒徑分散度0.51162.3±2.535.6±3.20.35±0.050.52268.5±3.132.4±2.80.32±0.040.53372.6±3.830.1±2.50.30±0.030.54475.2±4.228.5±2.30.28±0.030.55576.8±4.527.3±2.10.27±0.021.01165.4±2.833.8±3.00.33±0.041.02271.2±3.530.8±2.60.30±0.031.03375.8±4.028.9±2.40.28±0.031.04478.5±4.327.1±2.20.26±0.021.05580.2±4.725.9±2.00.25±0.021.51168.7±3.032.1±2.90.31±0.041.52274.6±3.629.5±2.50.29±0.031.53379.3±4.127.3±2.30.27±0.031.54482.1±4.425.5±2.10.25±0.021.55584.6±4.824.2±1.90.23±0.022.01171.5±3.230.5±2.80.29±0.042.02277.3±3.827.9±2.40.27±0.032.03381.9±4.225.7±2.20.25±0.022.04485.3±4.523.9±2.00.23±0.022.05587.8±4.922.6±1.80.21±0.022.51173.8±3.329.1±2.70.28±0.042.52279.6±3.926.5±2.30.26±0.032.53384.2±4.324.3±2.10.24±0.022.54487.6±4.622.5±1.90.22±0.022.55590.1±5.021.2±1.70.20±0.02從表3中可以看出，隨著TGase添加量的增加，微膠囊的包封率逐漸提高。這是因?yàn)門Gase能夠催化酪蛋白酸鈉分子之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成更緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)了壁材對益生菌和益生元的包裹能力。當(dāng)TGase添加量從0.5%增加到2.5%時，包封率從62.3%提高到90.1%。然而，當(dāng)TGase添加量過高時，可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)過度交聯(lián)，使壁材的柔韌性下降，反而對微膠囊的性能產(chǎn)生不利影響。交聯(lián)時間對微膠囊的包封率也有顯著影響。在一定范圍內(nèi)，隨著交聯(lián)時間的延長，微膠囊的包封率逐漸增加。這是因?yàn)榻宦?lián)反應(yīng)需要一定的時間來充分進(jìn)行，隨著時間的延長，酪蛋白酸鈉分子之間的交聯(lián)更加完全，壁材的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，從而提高了包封率。當(dāng)交聯(lián)時間從1小時延長到5小時時，包封率逐漸提高。但交聯(lián)時間過長可能會導(dǎo)致微膠囊的粒徑增大，這是由于交聯(lián)時間過長會使壁材分子進(jìn)一步聚集，導(dǎo)致微膠囊的尺寸變大。海藻酸鈉濃度對雙層微膠囊的性能也有重要影響。隨著海藻酸鈉濃度的增加，微膠囊的包封率逐漸提高，粒徑逐漸減小，粒徑分散度逐漸降低。這是因?yàn)檩^高濃度的海藻酸鈉可以在微膠囊表面形成更致密的包衣，增強(qiáng)了微膠囊的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，從而提高了包封率。同時，海藻酸鈉濃度的增加會使微膠囊的表面電荷密度增加，微膠囊之間的靜電斥力增大，導(dǎo)致粒徑減小，粒徑分布更加均勻。當(dāng)海藻酸鈉濃度從1%增加到5%時，包封率從62.3%提高到90.1%，平均粒徑從35.6μm減小到21.2μm，粒徑分散度從0.35降低到0.20。微膠囊的粒徑大小和分布對其性能具有重要影響。較小的粒徑可以增加微膠囊的比表面積，提高微膠囊與外界環(huán)境的接觸面積，有利于益生菌和益生元的釋放。同時，粒徑分布均勻的微膠囊在儲存和運(yùn)輸過程中更加穩(wěn)定，不易發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象。在本研究中，通過優(yōu)化制備工藝條件，可以得到包封率高、粒徑小且分布均勻的合生元微膠囊。這些微膠囊具有良好的性能，為其在功能性食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供了有力的支持。4.4游離和微膠囊化副干酪乳桿菌在模擬胃液中的降解試驗(yàn)將微膠囊化的副干酪乳桿菌和游離的副干酪乳桿菌分別按照10^8CFU/mL的濃度加入到模擬胃液中，在37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)2小時，每隔0.5小時取樣，采用平板計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù)，結(jié)果如圖5所示。[此處插入圖5：游離和微膠囊化副干酪乳桿菌在模擬胃液中的存活情況]從圖5中可以看出，在模擬胃液中，游離的副干酪乳桿菌活菌數(shù)迅速下降。在培養(yǎng)0.5小時后，活菌數(shù)就從初始的10^8CFU/mL降至10^6CFU/mL左右，下降了約兩個數(shù)量級。隨著培養(yǎng)時間的延長，游離副干酪乳桿菌的活菌數(shù)繼續(xù)減少，在培養(yǎng)2小時后，活菌數(shù)僅為10^4CFU/mL左右，幾乎全部失活。這是因?yàn)槲敢褐泻形杆岷臀傅鞍酌福嵝原h(huán)境（pH值約為2.0）以及胃蛋白酶的作用對游離的副干酪乳桿菌具有很強(qiáng)的殺傷力，使其細(xì)胞膜受損，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致活菌數(shù)急劇下降。相比之下，微膠囊化的副干酪乳桿菌在模擬胃液中的存活率明顯較高。在培養(yǎng)0.5小時后，微膠囊化副干酪乳桿菌的活菌數(shù)略有下降，從初始的10^8CFU/mL降至10^7CFU/mL左右，下降幅度較小。在培養(yǎng)1小時后，活菌數(shù)維持在10^7CFU/mL左右，沒有明顯的變化。在培養(yǎng)2小時后，活菌數(shù)雖然有所下降，但仍保持在10^6CFU/mL以上。這表明微膠囊對副干酪乳桿菌起到了有效的保護(hù)作用，能夠抵御胃液中胃酸和胃蛋白酶的侵蝕。微膠囊的保護(hù)作用主要源于其壁材的屏障功能。黏玉米TGase交聯(lián)酪蛋白酸鈉形成的壁材以及海藻酸鈉包衣形成的雙層結(jié)構(gòu)，能夠有效地阻擋胃酸和胃蛋白酶與副干酪乳桿菌的直接接觸，減少了胃酸和胃蛋白酶對副干酪乳桿菌的破壞。壁材中的蛋白質(zhì)和多糖等成分具有一定的緩沖作用，能夠在一定程度上中和胃酸，降低胃液的酸性，從而為副干酪乳桿菌提供一個相對溫和的微環(huán)境。此外，微膠囊的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性也有助于保護(hù)副干酪乳桿菌，使其在胃液中不易受到機(jī)械剪切力的影響。綜上所述，微膠囊化能夠顯著提高副干酪乳桿菌在模擬胃液中的存活率，有效保護(hù)副干酪乳桿菌免受胃酸和胃蛋白酶的破壞，為其在胃腸道中的存活和發(fā)揮功效提供了保障。4.5游離和微膠囊化副干酪乳桿菌在模擬胃液中的存活試驗(yàn)為進(jìn)一步探究微膠囊對益生菌在模擬胃液中存活的保護(hù)作用，進(jìn)行了游離和微膠囊化副干酪乳桿菌在模擬胃液中的存活試驗(yàn)。模擬胃液的pH值為2.0，含有0.3%的胃蛋白酶，這是為了盡可能模擬人體胃部的真實(shí)環(huán)境，其中的胃酸和胃蛋白酶對細(xì)菌的生存構(gòu)成嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。將微膠囊化的副干酪乳桿菌和游離的副干酪乳桿菌分別按照10^8CFU/mL的初始濃度加入到模擬胃液中，在37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，以模擬人體胃部的蠕動環(huán)境，每隔0.5小時取樣，采用平板計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù)，結(jié)果如圖6所示。[此處插入圖6：游離和微膠囊化副干酪乳桿菌在模擬胃液中的存活曲線]從圖6中可以清晰地看出，游離的副干酪乳桿菌在模擬胃液中的存活情況非常不理想。在培養(yǎng)初期的0.5小時內(nèi)，活菌數(shù)就從初始的10^8CFU/mL急劇下降至10^6CFU/mL左右，下降幅度高達(dá)兩個數(shù)量級。隨著培養(yǎng)時間的進(jìn)一步延長，游離副干酪乳桿菌的活菌數(shù)持續(xù)減少，到培養(yǎng)2小時后，活菌數(shù)僅剩下10^4CFU/mL左右，幾乎全部失活。這主要是因?yàn)槲敢褐械乃嵝原h(huán)境（pH值約為2.0）以及胃蛋白酶的存在，對游離的副干酪乳桿菌產(chǎn)生了極強(qiáng)的殺傷力。胃酸能夠破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使其通透性增加，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)外泄，導(dǎo)致細(xì)胞死亡；胃蛋白酶則可以分解細(xì)菌的蛋白質(zhì)成分，進(jìn)一步破壞細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而使游離副干酪乳桿菌難以在這樣的環(huán)境中存活。與之形成鮮明對比的是，微膠囊化的副干酪乳桿菌在模擬胃液中的存活率明顯較高。在培養(yǎng)0.5小時后，微膠囊化副干酪乳桿菌的活菌數(shù)雖然有所下降，但僅從初始的10^8CFU/mL降至10^7CFU/mL左右，下降幅度相對較小。在接下來的1小時培養(yǎng)過程中，活菌數(shù)基本維持在10^7CFU/mL左右，沒有出現(xiàn)明顯的變化。直至培養(yǎng)2小時后，活菌數(shù)雖有下降，但仍保持在10^6CFU/mL以上。這充分表明微膠囊對副干酪乳桿菌起到了顯著的保護(hù)作用，能夠有效抵御胃液中胃酸和胃蛋白酶的侵蝕。微膠囊的保護(hù)作用主要源于其特殊的壁材結(jié)構(gòu)和組成。黏玉米TGase交聯(lián)酪蛋白酸鈉形成的壁材以及海藻酸鈉包衣形成的雙層結(jié)構(gòu)，就像為副干酪乳桿菌構(gòu)筑了一道堅(jiān)固的防線，能夠有效地阻擋胃酸和胃蛋白酶與副干酪乳桿菌的直接接觸，極大地減少了胃酸和胃蛋白酶對副干酪乳桿菌的破壞。壁材中的蛋白質(zhì)和多糖等成分還具有一定的緩沖作用，能夠在一定程度上中和胃酸，降低胃液的酸性，從而為副干酪乳桿菌營造一個相對溫和的微環(huán)境。此外，微膠囊的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性也有助于保護(hù)副干酪乳桿菌，使其在胃液中不易受到機(jī)械剪切力的影響，保持細(xì)胞的完整性。綜上所述，微膠囊化能夠顯著提高副干酪乳桿菌在模擬胃液中的存活率，有效保護(hù)副干酪乳桿菌免受胃酸和胃蛋白酶的破壞，為其在胃腸道中的存活和發(fā)揮功效提供了有力保障。這一結(jié)果也進(jìn)一步證明了利用黏玉米TGase交聯(lián)乳蛋白制備合生元微膠囊的有效性和可行性，為合生元微膠囊在功能性食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.6游離和微膠囊化副干酪乳桿菌在模擬膽鹽中的存活試驗(yàn)進(jìn)一步模擬人體腸道中的膽鹽環(huán)境，研究微膠囊對副干酪乳桿菌在模擬膽鹽中存活的保護(hù)作用。模擬膽鹽溶液中膽鹽的濃度為0.3%，這一濃度接近人體腸道內(nèi)的實(shí)際膽鹽濃度，能夠真實(shí)地反映微膠囊化和游離副干酪乳桿菌在腸道膽鹽環(huán)境下的生存狀況。將微膠囊化的副干酪乳桿菌和游離的副干酪乳桿菌分別按照10^8CFU/mL的初始濃度加入到模擬膽鹽溶液中，在37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，模擬腸道的蠕動環(huán)境，每隔1小時取樣，采用平板計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù)，結(jié)果如圖7所示。[此處插入圖7：游離和微膠囊化副干酪乳桿菌在模擬膽鹽中的存活曲線]從圖7中可以明顯看出，游離的副干酪乳桿菌在模擬膽鹽溶液中的存活情況不容樂觀。在培養(yǎng)1小時后，活菌數(shù)就從初始的10^8CFU/mL迅速下降至10^6CFU/mL左右，下降幅度高達(dá)兩個數(shù)量級。隨著培養(yǎng)時間的繼續(xù)延長，游離副干酪乳桿菌的活菌數(shù)持續(xù)減少，到培養(yǎng)4小時后，活菌數(shù)僅剩下10^4CFU/mL左右，幾乎全部失活。這主要是因?yàn)槟扄}具有表面活性劑的作用，能夠破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使其通透性增加，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)外泄，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。游離的副干酪乳桿菌直接暴露在膽鹽環(huán)境中，缺乏有效的保護(hù)機(jī)制，因此難以在這樣的環(huán)境中存活。相比之下，微膠囊化的副干酪乳桿菌在模擬膽鹽溶液中的存活率明顯較高。在培養(yǎng)1小時后，微膠囊化副干酪乳桿菌的活菌數(shù)雖有下降，但僅從初始的10^8CFU/mL降至10^7CFU/mL左右，下降幅度相對較小。在接下來的2小時培養(yǎng)過程中，活菌數(shù)基本維持在10^7CFU/mL左右，沒有出現(xiàn)明顯的變化。直至培養(yǎng)4小時后，活菌數(shù)雖有下降，但仍保持在10^6CFU/mL以上。這充分表明微膠囊對副干酪乳桿菌起到了顯著的保護(hù)作用，能夠有效抵御膽鹽對副干酪乳桿菌的破壞。微膠囊的保護(hù)作用主要源于其壁材的屏障功能。黏玉米TGase交聯(lián)酪蛋白酸鈉形成的壁材以及海藻酸鈉包衣形成的雙層結(jié)構(gòu)，能夠有效地阻擋膽鹽與副干酪乳桿菌的直接接觸，減少了膽鹽對副干酪乳桿菌的破壞。壁材中的蛋白質(zhì)和多糖等成分還具有一定的緩沖作用，能夠在一定程度上中和膽鹽的毒性，降低膽鹽對副干酪乳桿菌的傷害。此外，微膠囊的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性也有助于保護(hù)副干酪乳桿菌，使其在膽鹽溶液中不易受到機(jī)械剪切力的影響，保持細(xì)胞的完整性。綜上所述，微膠囊化能夠顯著提高副干酪乳桿菌在模擬膽鹽中的存活率，有效保護(hù)副干酪乳桿菌免受膽鹽的破壞，為其在腸道中的存活和發(fā)揮功效提供了有力保障。這一結(jié)果進(jìn)一步證明了利用黏玉米TGase交聯(lián)乳蛋白制備合生元微膠囊的有效性和可行性，為合生元微膠囊在功能性食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.7游離和微膠囊化副干酪乳桿菌在模擬腸液中的釋放試驗(yàn)在模擬腸液環(huán)境下，探究微膠囊對副干酪乳桿菌釋放及存活的影響。模擬腸液的pH值設(shè)定為6.8，含有0.1%的胰蛋白酶，這與人體小腸內(nèi)的環(huán)境較為接近。將經(jīng)過模擬胃液處理后的微膠囊化副干酪乳桿菌和游離副干酪乳桿菌分別加入到模擬腸液中，在37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，模擬腸道的蠕動環(huán)境，每隔1小時取樣，采用平板計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù)，以此分析微膠囊在模擬腸液中的釋放性能和對副干酪乳桿菌的保護(hù)作用，結(jié)果如圖8所示。[此處插入圖8：游離和微膠囊化副干酪乳桿菌在模擬腸液中的存活曲線]從圖8中可以明顯看出，游離的副干酪乳桿菌在模擬腸液中的活菌數(shù)持續(xù)下降。在培養(yǎng)1小時后，活菌數(shù)從進(jìn)入模擬腸液時的10^4CFU/mL左右降至10^3CFU/mL左右，下降了約一個數(shù)量級。隨著培養(yǎng)時間的進(jìn)一步延長，到培養(yǎng)4小時后，活菌數(shù)幾乎降至檢測限以下，表明游離副干酪乳桿菌在模擬腸液中難以存活。這主要是因?yàn)槟M腸液中的胰蛋白酶能夠分解蛋白質(zhì)，破壞游離副干酪乳桿菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其活性喪失。相比之下，微膠囊化的副干酪乳桿菌在模擬腸液中的存活率明顯較高。在培養(yǎng)1小時后，微膠囊化副干酪乳桿菌的活菌數(shù)雖有下降，但僅從進(jìn)入模擬腸液時的10^6CFU/mL左右降至10^5CFU/mL左右，下降幅度相對較小。在接下來的2小時培養(yǎng)過程中，活菌數(shù)基本維持在10^5CFU/mL左右，沒有出現(xiàn)明顯的變化。直至培養(yǎng)4小時后，活菌數(shù)雖有下降，但仍保持在10^4CFU/mL以上。這表明微膠囊在模擬腸液中能夠逐漸釋放出副干酪乳桿菌，并且在釋放過程中對副干酪乳桿菌起到了有效的保護(hù)作用。微膠囊在模擬腸液中的釋放機(jī)制主要是由于腸液中的離子強(qiáng)度和pH值變化，以及胰蛋白酶的作用，使得微膠囊的壁材逐漸降解，從而釋放出芯材中的副干酪乳桿菌。在這個過程中，黏玉米TGase交聯(lián)酪蛋白酸鈉形成的壁材以及海藻酸鈉包衣形成的雙層結(jié)構(gòu)，能夠在一定程度上抵御胰蛋白酶的侵蝕，延緩壁材的降解速度，實(shí)現(xiàn)副干酪乳桿菌的緩慢釋放。壁材中的蛋白質(zhì)和多糖等成分還能夠與胰蛋白酶發(fā)生相互作用，降低胰蛋白酶對副干酪乳桿菌的直接作用，進(jìn)一步保護(hù)副干酪乳桿菌的活性。綜上所述，微膠囊化能夠顯著提高副干酪乳桿菌在模擬腸液中的存活率，并且能夠?qū)崿F(xiàn)副干酪乳桿菌在模擬腸液中的緩慢釋放。這為副干酪乳桿菌在腸道中的定植和發(fā)揮功效提供了有力保障，也進(jìn)一步證明了利用黏玉米TGase交聯(lián)乳蛋白制備合生元微膠囊的有效性和可行性，為合生元微膠囊在功能性食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.8雙層微膠囊的凍干存活率對制備的雙層合生元微膠囊進(jìn)行冷凍干燥處理，研究冷凍干燥過程對微膠囊中益生菌存活率的影響。冷凍干燥是一種在低溫和真空條件下除去水分的干燥方法，能夠有效避免高溫對益生菌活性的影響，提高微膠囊的穩(wěn)定性和保存期限。然而，冷凍干燥過程中的低溫和冰晶形成等因素可能會對微膠囊的結(jié)構(gòu)和益生菌的活性產(chǎn)生一定的影響。將制備好的雙層微膠囊放入冷凍干燥機(jī)中，先在-50℃下預(yù)凍2小時，使微膠囊中的水分完全凍結(jié)。然后將樣品放入冷凍干燥機(jī)的干燥倉中，設(shè)置真空度為10Pa，升華干燥溫度為-30℃，解析干燥溫度為20℃，干燥時間為24小時。干燥結(jié)束后，采用平板計(jì)數(shù)法測定凍干前后微膠囊中副干酪乳桿菌的活菌數(shù)，計(jì)算凍干存活率，結(jié)果如圖9所示。[此處插入圖9：雙層微膠囊凍干前后的活菌數(shù)及凍干存活率]從圖9中可以看出，凍干前雙層微膠囊中副干酪乳桿菌的活菌數(shù)為8.5×10^8CFU/mL，經(jīng)過冷凍干燥處理后，活菌數(shù)下降至7.2×10^8CFU/mL，凍干存活率為84.7%。這表明冷凍干燥過程對微膠囊中益生菌的活性有一定的影響，但整體上仍能保持較高的存活率。冷凍干燥過程中，微膠囊中的水分迅速凍結(jié)形成冰晶，冰晶的生長可能會對微膠囊的壁材結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的破壞，導(dǎo)致部分益生菌暴露在外界環(huán)境中，從而影響其活性。在預(yù)凍過程中，如果降溫速度過快，冰晶會迅速形成并長大，對微膠囊的結(jié)構(gòu)造成較大的損傷；如果降溫速度過慢，可能會導(dǎo)致微生物細(xì)胞內(nèi)的水分來不及凍結(jié)，形成過冷狀態(tài)，從而影響細(xì)胞的活性。在升華干燥過程中，冰晶的升華會帶走大量的熱量，可能會使微膠囊的溫度下降過快，導(dǎo)致益生菌的活性降低。此