基于生物信息學解析肝細胞癌發生中肝硬化差異基因表達譜及機制一、引言1.1研究背景與意義1.1.1肝細胞癌與肝硬化的現狀及關聯肝細胞癌（HepatocellularCarcinoma，HCC）是全球范圍內嚴重威脅人類健康的重大疾病，在癌癥相關死亡原因中位居前列。據世界衛生組織（WHO）統計數據顯示，其發病率呈現出逐年上升的趨勢，尤其在亞洲和非洲的部分地區，HCC的發病情況更為嚴峻。中國作為肝癌高發國家之一，每年新增病例數眾多，給社會和家庭帶來了沉重的經濟負擔與精神壓力。肝硬化是HCC發生的主要致病因素之一，約80%-90%的HCC患者伴有肝硬化病史。肝硬化是一種由多種病因長期作用于肝臟，導致肝臟彌漫性纖維化、假小葉和再生結節形成為特征的慢性肝病。長期的肝臟損傷、炎癥反應以及纖維化過程，使得肝細胞的微環境發生改變，細胞增殖與凋亡失衡，從而為HCC的發生提供了土壤。在肝硬化發展過程中，肝細胞不斷受到損傷與修復，這一過程容易引發基因突變、染色體不穩定以及細胞信號通路的異常激活，最終促使正常肝細胞逐步轉化為癌細胞。例如，乙型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）感染引發的慢性肝炎，若未能得到有效控制，會逐漸發展為肝硬化，進而大大增加患HCC的風險；長期酗酒導致的酒精性肝病，同樣可經歷肝纖維化、肝硬化階段，最終誘發HCC。深入研究肝細胞癌與肝硬化之間的關系，對于HCC的早期診斷、預防和治療具有至關重要的意義。通過明確肝硬化進展為HCC的分子機制，可以發現早期診斷的生物標志物，實現HCC的早發現、早治療，提高患者的生存率；有助于開發針對肝硬化相關HCC的特異性治療靶點，為臨床治療提供新的策略和方法，改善患者的預后；還能為HCC的預防提供科學依據，通過對肝硬化患者的有效干預，降低HCC的發生風險。1.1.2生物信息學在基因研究中的關鍵作用生物信息學是一門綜合了計算機科學、數學、統計學和生物學等多學科知識的交叉領域，在現代生命科學研究中發揮著不可或缺的作用。隨著高通量測序技術的飛速發展，大量的基因表達數據得以產生，如何從這些海量的數據中挖掘出有價值的信息，成為了生物學研究面臨的挑戰。生物信息學正是應對這一挑戰的有力工具，它通過運用各種算法、模型和數據庫，對基因表達數據進行分析、處理和解讀，為揭示生命現象的本質提供了重要的手段。在肝細胞癌發生中肝硬化差異基因表達譜的研究中，生物信息學具有獨特的優勢和關鍵作用。它能夠整合來自不同實驗平臺、不同樣本來源的基因表達數據，克服數據的異質性問題，從而獲得更加全面、準確的基因表達信息。通過生物信息學分析工具，如R/Bioconductor平臺、DAVID數據庫等，可以對基因表達數據進行標準化處理、差異基因篩選以及功能富集分析，快速準確地鑒定出在肝硬化和HCC發生過程中起關鍵作用的差異表達基因及其相關的生物學通路。通過構建基因調控網絡和蛋白質-蛋白質相互作用網絡，能夠深入了解基因之間的相互關系和調控機制，為揭示HCC發生的分子機制提供系統的視角。生物信息學的研究結果還可以為后續的實驗驗證提供指導，幫助研究者有針對性地設計實驗，提高研究效率，降低研究成本。1.2國內外研究現狀1.2.1肝細胞癌與肝硬化關系的研究進展長期以來，肝細胞癌與肝硬化之間的緊密聯系一直是醫學領域的研究重點。眾多研究表明，肝硬化在HCC的發生發展過程中扮演著關鍵角色。在肝硬化的形成過程中，肝臟組織經歷持續的炎癥損傷和修復，導致細胞外基質過度沉積，肝臟正常結構被破壞，假小葉形成。這種病理狀態下，肝細胞所處的微環境發生顯著改變，包括細胞因子、生長因子和細胞外基質成分的變化，這些改變為肝細胞的惡性轉化提供了條件。例如，在炎癥微環境中，免疫細胞釋放的活性氧和細胞因子會導致DNA損傷，增加基因突變的概率，進而促使肝細胞向癌細胞轉化。臨床上，對肝硬化患者進行長期隨訪研究發現，肝硬化患者患HCC的風險顯著高于普通人群。一項納入了大量肝硬化患者的隊列研究顯示，肝硬化患者每年HCC的發生率約為3%-6%。不同病因導致的肝硬化，其進展為HCC的風險也有所差異。乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染引起的肝硬化，由于病毒持續復制對肝細胞的損傷，以及病毒基因整合到宿主基因組導致的基因不穩定，使得這類肝硬化患者發展為HCC的風險更高。酒精性肝硬化患者同樣面臨著較高的HCC發病風險，酒精代謝產物乙醛對肝細胞具有直接毒性，可誘導肝細胞凋亡和壞死，同時還會影響肝臟的免疫功能，促進肝臟炎癥和纖維化，最終增加HCC的發生幾率。從分子機制層面來看，研究發現肝硬化與HCC發生相關的多個信號通路異常。在肝硬化組織中，Wnt/β-catenin信號通路常常被激活，該通路的異常激活會導致細胞增殖、分化和遷移等過程的紊亂，促進肝細胞的惡性轉化。細胞周期調控相關的基因和蛋白表達異常也在肝硬化向HCC轉變過程中發揮重要作用，例如p53、Rb等抑癌基因的突變或功能失活，使得細胞周期失控，肝細胞異常增殖，增加了癌變的可能性。然而，目前對于肝細胞癌發生中肝硬化相關的基因表達譜及其具體調控機制的認識仍不夠深入，雖然已經發現了一些與二者相關的基因和信號通路，但這些研究大多局限于單個基因或少數通路，缺乏系統性和全面性，難以完整地揭示HCC發生的分子機制。1.2.2生物信息學在該領域的應用現狀隨著生物信息學的快速發展，其在肝細胞癌與肝硬化關系研究中的應用日益廣泛。生物信息學憑借其強大的數據處理和分析能力，為深入探究二者的基因表達譜及潛在分子機制提供了新的視角和方法。在基因表達譜分析方面，生物信息學能夠整合來自不同研究的海量基因表達數據，通過標準化處理和差異分析，篩選出在肝硬化和HCC中差異表達的基因。研究人員利用生物信息學工具對大量的基因芯片數據和高通量測序數據進行分析，成功鑒定出了一系列與肝硬化進展為HCC密切相關的差異表達基因。這些基因涉及細胞增殖、凋亡、免疫調節、代謝等多個生物學過程，為進一步研究HCC的發病機制提供了重要線索。例如，通過對基因表達譜數據的分析發現，某些在肝硬化組織中低表達而在HCC組織中高表達的基因，可能參與了腫瘤細胞的增殖和轉移過程；而一些在肝硬化和HCC中均異常表達的基因，則可能與肝臟的炎癥和纖維化反應相關。在功能富集分析和通路研究中，生物信息學同樣發揮了重要作用。借助DAVID、Metascape等數據庫和分析工具，可以對差異表達基因進行功能注釋和富集分析，確定其參與的主要生物學功能和信號通路。研究表明，在肝硬化向HCC轉變過程中，多條信號通路如PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、TGF-β信號通路等發生顯著變化，這些通路的異常激活或抑制與肝細胞的惡性轉化密切相關。通過構建基因調控網絡和蛋白質-蛋白質相互作用網絡，能夠更直觀地展示基因之間的相互關系和調控機制，有助于發現潛在的治療靶點。例如，通過網絡分析發現，某些關鍵基因在基因調控網絡中處于核心地位，它們通過與其他基因的相互作用，共同調節肝細胞的生物學行為，這些關鍵基因有可能成為治療HCC的新靶點。然而，目前生物信息學在肝細胞癌發生中肝硬化差異基因表達譜研究方面仍存在一些局限性。不同研究使用的數據來源、實驗平臺和分析方法存在差異，導致研究結果的可比性和重復性較差；對基因表達譜數據的挖掘還不夠深入，對于一些復雜的基因調控關系和生物學過程的理解還不夠透徹；生物信息學分析結果往往需要進一步的實驗驗證，但目前實驗驗證的效率和準確性有待提高。因此，本研究旨在通過整合多組學數據，運用生物信息學方法系統地分析肝細胞癌發生中肝硬化差異基因表達譜，挖掘關鍵基因和信號通路，并通過實驗驗證，為揭示HCC的發病機制和尋找新的治療靶點提供理論依據。1.3研究目標與內容1.3.1研究目標本研究旨在運用生物信息學方法，深入剖析肝細胞癌發生中肝硬化差異基因表達譜，全面揭示其潛在的分子機制。具體而言，通過整合分析大量的基因表達數據，構建出準確、全面的差異基因表達譜模型，為后續研究提供堅實的數據基礎。在此基礎上，利用先進的生物信息學分析工具和算法，篩選出與肝細胞癌發生密切相關的關鍵基因和通路因子，明確它們在疾病發生發展過程中的作用和調控機制。進一步構建關鍵通路的互作網絡，從系統生物學的角度闡述基因之間的相互關系和協同作用，為深入理解肝細胞癌的發病機制提供全新的視角。本研究期望通過以上探索，為肝細胞癌的早期診斷、預防和治療提供創新性的思路和潛在的研究方向，推動肝細胞癌防治領域的發展。1.3.2研究內容數據收集與預處理：廣泛收集來自公共數據庫（如GEO、TCGA等）以及已發表文獻中的肝細胞癌患者伴有肝硬化和不伴有肝硬化的基因表達譜數據，確保數據的多樣性和代表性。對收集到的數據進行嚴格的質量控制和標準化處理，去除異常值和噪聲數據，消除不同實驗平臺和批次帶來的誤差，使數據具有可比性和可靠性。利用R/Bioconductor平臺等生物信息學工具，對數據進行歸一化處理，如采用quantilenormalization方法對基因芯片數據進行歸一化，確保數據的準確性和穩定性。差異基因鑒定與分析：運用limma、edgeR等R包，對預處理后的數據進行差異表達分析，篩選出在肝細胞癌發生中肝硬化組與非肝硬化組之間差異表達的基因。設定嚴格的篩選標準，如|logFC|>1且adj.P.Val<0.05，以確保篩選出的差異表達基因具有統計學意義和生物學相關性。對差異表達基因進行層次聚類分析，繪制熱圖，直觀展示基因表達模式的差異，識別出具有相似表達模式的基因簇，為后續的功能分析提供線索。功能富集分析與通路研究：借助DAVID、Metascape等數據庫和在線分析工具，對差異表達基因進行GO（GeneOntology）功能富集分析，包括生物過程、細胞組分和分子功能三個方面，明確這些基因參與的主要生物學過程和功能。進行KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）通路富集分析，確定差異表達基因顯著富集的信號通路，如PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路等，揭示肝細胞癌發生中肝硬化相關的關鍵生物學通路和分子機制。通過對富集結果的深入分析，挖掘差異表達基因在細胞增殖、凋亡、免疫調節、代謝等生物學過程中的作用，為進一步研究肝細胞癌的發病機制提供理論依據。基因互作網絡構建與分析：利用STRING數據庫構建差異表達基因的蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡，獲取基因之間的相互作用信息。使用Cytoscape軟件對PPI網絡進行可視化分析和拓撲學分析，計算節點的度、介數中心性等拓撲學參數，篩選出在網絡中處于核心地位的關鍵基因。通過分析關鍵基因在網絡中的連接關系和功能富集情況，深入探討它們在肝細胞癌發生中肝硬化過程中的調控作用和潛在機制。對基因互作網絡進行模塊分析，識別出具有特定功能的基因模塊，研究模塊內基因之間的協同作用以及模塊與肝細胞癌發生發展的關系。實驗驗證：選取部分關鍵差異表達基因，采用實時熒光定量PCR（qPCR）技術在臨床樣本中驗證其表達水平，包括肝硬化患者肝臟組織、肝細胞癌患者伴有肝硬化的肝臟組織以及正常肝臟組織，以確保生物信息學分析結果的可靠性。運用免疫印跡（Westernblot）技術檢測關鍵基因編碼蛋白的表達水平，進一步驗證基因表達的差異。若條件允許，進行細胞實驗和動物實驗，如通過基因敲除或過表達技術，研究關鍵基因對肝細胞生物學行為（如增殖、凋亡、遷移、侵襲等）的影響，以及在肝硬化向肝細胞癌轉化過程中的作用機制。二、研究方法與技術2.1數據收集與預處理2.1.1數據來源與選擇標準本研究主要從多個公共數據庫中收集肝細胞癌患者伴有肝硬化和不伴有肝硬化的基因表達譜數據，這些數據庫包括但不限于基因表達綜合數據庫（GeneExpressionOmnibus，GEO）、腫瘤基因組圖譜（TheCancerGenomeAtlas，TCGA）以及ArrayExpress等。這些數據庫包含了大量的基因表達數據，具有樣本量大、數據類型豐富、研究范圍廣泛等優點，能夠為研究提供充足的數據支持。在數據選擇上，制定了嚴格的標準。納入的數據需明確區分肝細胞癌伴有肝硬化組和不伴有肝硬化組，確保樣本的分組清晰準確。樣本來源應具有代表性，涵蓋不同種族、地域和臨床特征的患者，以減少樣本偏差對研究結果的影響。例如，在GEO數據庫中，通過篩選關鍵詞“HepatocellularCarcinoma”“Cirrhosis”以及“GeneExpressionProfiling”，獲取相關的數據集，并進一步查看數據集的樣本信息，確保符合分組和樣本來源的要求。數據的實驗平臺應具有較高的可靠性和穩定性，優先選擇使用高通量測序技術（如RNA-seq）或高質量的基因芯片技術產生的數據。因為高通量測序技術能夠更全面、準確地檢測基因表達水平，且具有較低的背景噪聲和較高的靈敏度；而高質量的基因芯片技術經過多年的發展和優化，也能夠提供可靠的基因表達數據。此外，對于同一研究主題的多個數據集，選擇樣本量較大、實驗設計更合理的數據集，以提高數據的可靠性和分析結果的準確性。2.1.2數據標準化與質量控制在獲取原始基因表達譜數據后，為了消除不同實驗平臺、樣本處理過程以及技術誤差等因素對數據的影響，使數據具有可比性，需要對數據進行標準化處理。對于RNA-seq數據，采用了TrimmedMeanofM-values（TMM）方法進行標準化。TMM方法基于大部分基因在不同樣本中表達水平相對穩定的假設，通過計算樣本間的M值（兩個樣本中基因表達量的對數比值），并去除一定比例的極端值，然后計算剩余M值的均值作為標準化因子，對每個樣本的基因表達量進行標準化。這種方法能夠有效校正測序深度和基因長度對表達量的影響，使不同樣本之間的基因表達水平具有可比性。例如，在使用R語言的edgeR包進行TMM標準化時，首先讀取原始的RNA-seq數據，然后利用calcNormFactors函數計算標準化因子，最后通過標準化因子對原始數據進行標準化處理。對于基因芯片數據，采用了quantilenormalization方法進行標準化。該方法通過對所有樣本的基因表達值進行排序，使每個樣本中相同位置的基因表達值具有相同的分布，從而實現數據的標準化。具體操作過程中，使用R/Bioconductor平臺上的affy包，先將原始的CEL格式芯片數據讀取到R環境中，然后利用normalize.quantiles函數對數據進行分位數標準化，確保不同芯片之間的數據具有可比性。在數據質量控制方面，采用了多種方法來確保數據的可靠性。對原始數據進行質量評估，包括檢查數據的完整性、缺失值比例以及異常值情況。使用FastQC軟件對RNA-seq數據進行質量評估，該軟件能夠生成詳細的質量報告，展示數據的堿基質量分布、GC含量、測序深度等信息。若發現數據存在大量缺失值或異常值，需進一步排查原因，如樣本采集過程中的問題、實驗操作失誤或測序技術故障等，并根據具體情況進行處理，如刪除異常樣本或進行數據插補。通過繪制箱線圖、散點圖和主成分分析（PCA）圖等可視化方法，對標準化后的數據進行質量檢查。箱線圖可以直觀地展示數據的分布范圍和異常值情況，若不同樣本的數據分布差異過大，可能存在數據質量問題；散點圖用于比較不同樣本之間基因表達水平的相關性，正常情況下，生物學重復樣本之間的基因表達水平應具有較高的相關性；PCA圖則能夠將高維的數據降維到二維或三維空間，通過觀察樣本在主成分空間中的分布情況，判斷樣本之間的相似性和差異性，以及是否存在批次效應等問題。如果發現數據存在批次效應，即不同批次實驗導致的數據差異，采用ComBat方法進行校正，以消除非生物學因素對數據的影響。通過這些標準化和質量控制措施，有效提高了數據的質量和可靠性，為后續的差異基因分析和功能研究奠定了堅實的基礎。2.2生物信息學分析工具與方法2.2.1基因鑒定與差異分析工具在本研究中，主要運用R/Bioconductor平臺作為核心的生物信息學分析工具，結合limma、edgeR等R包進行基因鑒定與差異表達分析。R/Bioconductor平臺是一個開源且功能強大的生物信息學分析環境，擁有豐富的軟件包和工具，能夠滿足基因表達譜數據分析的各種需求。limma包是R/Bioconductor平臺中用于微陣列數據差異表達分析的經典工具，經過優化后也可用于處理RNA-seq數據。它基于線性模型理論，通過對基因表達數據進行擬合和統計檢驗，能夠準確地鑒定出不同樣本組之間差異表達的基因。對于RNA-seq數據，edgeR包是一種常用的分析工具。edgeR基于負二項分布模型，能夠有效處理RNA-seq數據中的離散性和變異性問題。在使用edgeR進行差異分析時，首先對原始的RNA-seqreads計數數據進行標準化處理，采用TMM方法計算標準化因子，以消除不同樣本之間測序深度和基因長度的差異。隨后，通過構建廣義線性模型（GLM），對標準化后的數據進行擬合，利用似然比檢驗（LikelihoodRatioTest）或精確檢驗（ExactTest）來識別差異表達基因。設定嚴格的篩選標準，如|logFC|>1且adj.P.Val<0.05，其中logFC表示基因在兩組樣本中的表達量變化倍數的對數，adj.P.Val表示經過多重檢驗校正后的P值，確保篩選出的差異表達基因具有統計學意義和生物學相關性。在實際操作過程中，首先將預處理后的基因表達數據導入R環境中，利用limma包或edgeR包讀取數據并進行格式轉換，使其符合分析要求。然后，根據樣本的分組信息（如肝細胞癌伴有肝硬化組和不伴有肝硬化組），構建實驗設計矩陣，明確不同樣本的分組情況。利用limma包的lmFit函數或edgeR包的glmFit函數對數據進行擬合，得到基因表達的線性模型。通過makeContrasts函數定義不同組之間的比較方式，如比較肝細胞癌伴有肝硬化組與不伴有肝硬化組的基因表達差異。利用eBayes函數對擬合結果進行經驗貝葉斯估計，提高差異表達基因檢測的準確性。最后，通過topTable函數獲取差異表達基因的列表，包括基因的ID、logFC值、P值、adj.P.Val值等信息，并根據設定的篩選標準進行篩選和排序。為了直觀展示差異表達基因的表達模式，使用pheatmap包繪制熱圖。熱圖能夠將基因表達數據以顏色矩陣的形式呈現，不同顏色代表基因表達水平的高低，通過聚類分析將表達模式相似的基因聚集在一起，便于觀察和分析。通過繪制火山圖，展示差異表達基因的表達倍數變化與統計學顯著性之間的關系，進一步篩選出具有顯著差異的基因。在火山圖中，橫坐標表示基因的logFC值，縱坐標表示-log10(P值)，根據設定的閾值，將差異表達基因在圖中標記出來，紅色點表示上調基因，綠色點表示下調基因。2.2.2GO/KEGG富集分析原理與應用GO（GeneOntology）富集分析和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）通路富集分析是生物信息學研究中常用的功能分析方法，旨在揭示差異表達基因參與的生物學過程、細胞組分和分子功能，以及相關的信號通路，從而深入了解基因在生物學過程中的作用機制。GO富集分析基于GO數據庫，該數據庫對基因和蛋白質的功能進行了系統的分類和注釋，包括生物過程（BiologicalProcess）、細胞組分（CellularComponent）和分子功能（MolecularFunction）三個方面。生物過程描述了基因參與的生物學事件，如細胞周期、信號轉導、代謝過程等；細胞組分指基因產物在細胞內的定位和組成，如細胞核、細胞膜、細胞器等；分子功能則定義了基因產物所具有的生物學活性，如酶活性、結合活性、轉運活性等。GO富集分析的原理是基于超幾何分布檢驗。假設在整個基因組中有N個基因，其中有n個基因屬于某一特定的GO功能類別；在篩選出的差異表達基因中有M個基因，其中有m個基因屬于該GO功能類別。通過超幾何分布檢驗，計算出在隨機情況下，出現m個及以上差異表達基因屬于該GO功能類別的概率P值。如果P值小于設定的閾值（通常為0.05），則認為該GO功能類別在差異表達基因中顯著富集，即這些差異表達基因在該生物學過程、細胞組分或分子功能中發揮重要作用。在本研究中，使用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）數據庫和clusterProfiler包進行GO富集分析。首先，將篩選出的差異表達基因的ID上傳至DAVID數據庫，選擇對應的物種和基因ID類型。DAVID數據庫會自動對基因進行注釋，并計算每個GO功能類別的富集程度。利用clusterProfiler包在R環境中對DAVID數據庫的分析結果進行進一步處理和可視化。通過enrichGO函數進行GO富集分析，設置OrgDb參數為對應的物種注釋數據庫（如org.Hs.eg.db用于人類基因注釋），ont參數為“BP”“CC”或“MF”，分別表示生物過程、細胞組分和分子功能。利用dotplot函數繪制點圖，展示富集的GO功能類別及其對應的基因數量、富集因子、P值等信息，直觀地呈現差異表達基因在不同GO功能類別中的富集情況。KEGG通路富集分析基于KEGG數據庫，該數據庫整合了基因組、生物化學和系統功能信息，提供了關于生物分子相互作用網絡的通路信息，如代謝通路、信號轉導通路、細胞周期通路等。KEGG通路富集分析的原理與GO富集分析類似，也是基于超幾何分布檢驗。通過計算差異表達基因在各KEGG通路中的富集程度，確定哪些通路在差異表達基因中顯著富集，從而揭示差異表達基因參與的關鍵生物學通路和分子機制。在實際分析中，同樣使用DAVID數據庫和clusterProfiler包進行KEGG通路富集分析。將差異表達基因的ID上傳至DAVID數據庫，選擇KEGGPathway選項進行分析。DAVID數據庫會返回每個KEGG通路的富集結果，包括通路名稱、富集的基因數量、P值等。在R環境中，利用clusterProfiler包的enrichKEGG函數進行KEGG通路富集分析，設置organism參數為對應的物種（如“hsa”表示人類），pAdjustMethod參數為多重檢驗校正方法（如“BH”）。利用barplot函數繪制柱狀圖，展示富集程度最高的前幾個KEGG通路及其對應的基因數量和P值；通過pathview函數繪制通路圖，將差異表達基因映射到相應的KEGG通路中，以顏色區分基因的表達上調或下調情況，直觀展示差異表達基因在通路中的分布和作用。通過GO/KEGG富集分析，能夠全面了解肝細胞癌發生中肝硬化差異表達基因參與的生物學過程和信號通路，為深入研究HCC的發病機制提供重要線索。若GO富集分析結果顯示差異表達基因在細胞增殖、凋亡、免疫調節等生物過程中顯著富集，說明這些生物學過程在肝硬化向HCC轉化過程中可能發生了重要變化；KEGG通路富集分析發現差異表達基因在PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路等顯著富集，提示這些信號通路可能在HCC的發生發展中發揮關鍵作用。2.2.3基因互作網絡構建方法基因互作網絡是一種描述基因之間相互關系的網絡模型，通過構建基因互作網絡，可以深入了解基因之間的協同作用和調控機制，挖掘在肝細胞癌發生中肝硬化過程中起關鍵作用的基因和核心通路。本研究主要利用STRING（SearchToolfortheRetrievalofInteractingGenes/Proteins）數據庫和Cytoscape軟件構建基因互作網絡。STRING數據庫是一個綜合性的蛋白質-蛋白質相互作用數據庫，整合了來自實驗數據、文獻挖掘、預測算法等多方面的信息，提供了基因之間的相互作用關系。Cytoscape是一款功能強大的網絡分析和可視化軟件，能夠導入和處理各種類型的網絡數據，并進行拓撲學分析、模塊分析和可視化展示。在構建基因互作網絡時，首先將篩選出的差異表達基因的ID輸入到STRING數據庫中，選擇對應的物種，設置相互作用得分閾值（通常選擇中等可信度，即得分大于0.4）。STRING數據庫會根據輸入的基因ID，搜索與之相關的蛋白質-蛋白質相互作用信息，并生成一個包含基因節點和相互作用邊的網絡文件。將STRING數據庫生成的網絡文件導入到Cytoscape軟件中，進行網絡的可視化和分析。在Cytoscape軟件中，可以根據基因的屬性（如表達量變化、功能注釋等）對節點進行顏色、大小等屬性的設置，使網絡更加直觀易懂。利用Cytoscape軟件的插件（如NetworkAnalyzer、MCODE等）進行網絡的拓撲學分析和模塊分析。網絡拓撲學分析可以計算網絡中節點的各種拓撲學參數，如度（Degree）、介數中心性（BetweennessCentrality）、接近中心性（ClosenessCentrality）等。度表示節點與其他節點之間的連接數量，度值越高，說明該節點在網絡中與其他基因的相互作用越頻繁，可能在基因調控網絡中發揮重要作用；介數中心性衡量一個節點在網絡中最短路徑上出現的次數，反映了該節點對網絡中信息傳遞的控制能力，介數中心性較高的節點通常是網絡中的關鍵調控節點；接近中心性則表示節點到其他所有節點的最短路徑的平均值，接近中心性越高，說明該節點在網絡中的位置越接近中心，能夠快速地與其他節點進行信息交流。通過分析這些拓撲學參數，可以篩選出在基因互作網絡中處于核心地位的關鍵基因。例如，在分析肝細胞癌發生中肝硬化差異表達基因的互作網絡時，發現某些基因的度值和介數中心性都很高，進一步研究這些關鍵基因的功能和調控機制，可能有助于揭示HCC發生的關鍵分子機制。模塊分析是將基因互作網絡劃分為不同的模塊，每個模塊內的基因具有較高的相互作用密度，通常參與相同或相關的生物學過程。利用Cytoscape軟件的MCODE插件進行模塊分析，設置合適的參數（如節點得分閾值、K-core值、最大深度等），MCODE插件會根據網絡的拓撲結構，自動識別出網絡中的模塊。對每個模塊內的基因進行功能富集分析，確定模塊所代表的生物學功能。通過模塊分析，可以發現基因之間的協同作用模式，深入了解不同生物學過程在肝細胞癌發生中肝硬化過程中的相互關系。例如，在分析過程中發現一個模塊內的基因主要富集在細胞增殖和細胞周期調控相關的生物學過程中，說明該模塊內的基因可能共同參與了肝細胞的異常增殖和細胞周期紊亂，進而促進了HCC的發生。通過構建基因互作網絡并進行拓撲學分析和模塊分析，能夠從系統生物學的角度深入理解肝細胞癌發生中肝硬化差異表達基因之間的相互關系和調控機制，為揭示HCC的發病機制和尋找新的治療靶點提供重要的理論依據。2.3實驗驗證技術2.3.1qPCR驗證差異基因表達實時熒光定量PCR（qPCR）技術是驗證生物信息學分析得到的差異基因表達的常用方法之一，具有靈敏度高、特異性強、定量準確等優點。在本研究中，通過qPCR實驗對生物信息學分析篩選出的關鍵差異表達基因進行驗證，以確保分析結果的可靠性。實驗設計方面，根據生物信息學分析結果，選取在肝細胞癌發生中肝硬化組與非肝硬化組之間差異表達顯著且具有重要生物學意義的基因作為驗證對象。從臨床樣本庫中收集肝硬化患者肝臟組織、肝細胞癌患者伴有肝硬化的肝臟組織以及正常肝臟組織樣本，每組樣本數量不少于30例，以保證實驗結果具有統計學意義。所有樣本在采集后立即置于液氮中速凍，并保存于-80℃冰箱中備用。在實驗操作步驟上，首先進行總RNA的提取。使用TRIzol試劑按照說明書的操作方法從組織樣本中提取總RNA，通過測定RNA的濃度和純度，確保RNA的質量符合后續實驗要求。一般要求RNA的濃度在1μg/μL以上，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間。利用反轉錄試劑盒將提取的總RNA反轉錄為cDNA，反應體系和條件按照試劑盒說明書進行設置。設計針對目標基因的特異性引物，引物設計遵循以下原則：引物長度一般為18-25bp，GC含量在40%-60%之間，避免引物二聚體和發夾結構的形成。通過NCBI的Primer-BLAST工具對引物進行特異性驗證，確保引物能夠特異性地擴增目標基因。以cDNA為模板，利用SYBRGreen熒光染料法進行qPCR反應。反應體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix以及ddH2O，總體積為20μL。反應條件為：95℃預變性30s，然后進行40個循環，每個循環包括95℃變性5s，60℃退火30s。在反應過程中，實時監測熒光信號的變化，通過標準曲線法對目標基因的表達量進行定量分析。為了保證實驗結果的準確性和可靠性，設置了多個對照。包括無模板對照（NTC），以檢測引物二聚體和試劑污染；內參基因對照，選擇β-actin、GAPDH等在不同組織中表達相對穩定的基因作為內參基因，用于校正目標基因的表達量，消除實驗操作和樣本量差異對結果的影響。每個樣本設置3個技術重復，計算平均值和標準差，以評估實驗的重復性。將qPCR實驗結果與生物信息學分析結果進行對比。若qPCR實驗結果與生物信息學分析結果一致，即目標基因在肝細胞癌伴有肝硬化組與其他組之間的表達差異趨勢相同，且差異具有統計學意義，則驗證了生物信息學分析結果的可靠性；若二者結果不一致，則進一步分析原因，如引物特異性問題、實驗操作誤差、樣本差異等，并考慮重復實驗或采用其他實驗方法進行驗證。2.3.2免疫印跡實驗原理與實施免疫印跡（Westernblot）實驗是從蛋白質水平驗證差異基因表達的重要技術，其原理基于抗原-抗體的特異性結合。在該實驗中，首先將細胞或組織中的蛋白質提取出來，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）根據蛋白質分子量大小進行分離，然后將分離后的蛋白質轉移到固相膜（如PVDF膜或NC膜）上，再用特異性抗體與膜上的目標蛋白質結合，最后通過檢測抗體-抗原復合物來確定目標蛋白質的表達水平。在本研究中，為了驗證生物信息學分析篩選出的差異表達基因在蛋白質水平的表達情況，進行了免疫印跡實驗。從臨床樣本庫中選取與qPCR實驗相同的肝硬化患者肝臟組織、肝細胞癌患者伴有肝硬化的肝臟組織以及正常肝臟組織樣本，每組樣本數量不少于20例。將組織樣本在冰上研磨成勻漿，加入適量的蛋白裂解液（如含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液），充分裂解細胞，使蛋白質釋放出來。通過離心去除細胞碎片和不溶性雜質，收集上清液作為蛋白質樣品。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質樣品的濃度，按照試劑盒說明書的操作方法，將蛋白質樣品與BCA工作液混合，在37℃孵育30min，然后測定562nm處的吸光度值，根據標準曲線計算蛋白質濃度。取適量的蛋白質樣品，加入上樣緩沖液（含SDS、β-巰基乙醇等），在100℃煮沸5min，使蛋白質變性。將變性后的蛋白質樣品進行SDS電泳，根據目標蛋白質的分子量選擇合適的分離膠濃度（如10%-15%），在電泳過程中，蛋白質在電場的作用下向正極移動，根據分子量大小在凝膠中分離成不同的條帶。電泳結束后，利用半干轉印法或濕轉印法將凝膠中的蛋白質轉移到PVDF膜上。轉印條件根據蛋白質分子量和凝膠厚度進行優化，一般在恒流條件下進行轉印，轉印時間為1-2h。轉印完成后，將PVDF膜置于5%脫脂牛奶或BSA封閉液中，在室溫下搖床孵育1-2h，以封閉膜上的非特異性結合位點。將封閉后的PVDF膜與特異性一抗孵育，一抗的選擇應針對目標基因編碼的蛋白質，且經過驗證具有良好的特異性和親和力。一抗用5%脫脂牛奶或BSA稀釋至適當濃度（根據抗體說明書推薦的稀釋比例），在4℃孵育過夜。孵育結束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，以去除未結合的一抗。將PVDF膜與辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗孵育，二抗用5%脫脂牛奶或BSA稀釋至適當濃度，在室溫下搖床孵育1-2h。孵育結束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，以去除未結合的二抗。使用化學發光試劑（如ECL試劑）對PVDF膜進行顯色反應，在暗室中，將ECL試劑均勻地滴加到PVDF膜上，反應1-2min，然后用X光膠片曝光，根據膠片上條帶的灰度值來分析目標蛋白質的表達水平。以β-actin或GAPDH等內參蛋白作為對照，用于校正目標蛋白質的表達量，消除實驗操作和樣本量差異對結果的影響。每個樣本設置3個技術重復，計算平均值和標準差，以評估實驗的重復性。將免疫印跡實驗結果與生物信息學分析結果以及qPCR實驗結果進行綜合分析。若免疫印跡實驗結果與生物信息學分析結果和qPCR實驗結果一致，即目標基因編碼的蛋白質在肝細胞癌伴有肝硬化組與其他組之間的表達差異趨勢相同，且差異具有統計學意義，則進一步驗證了生物信息學分析結果的可靠性，表明該差異表達基因在蛋白質水平也發生了顯著變化，在肝細胞癌發生中肝硬化過程中發揮重要作用；若結果不一致，需仔細分析原因，如抗體特異性問題、蛋白質降解、實驗操作誤差等，并考慮重復實驗或采用其他實驗方法進行驗證。三、肝細胞癌發生中肝硬化差異基因鑒定3.1差異基因篩選結果3.1.1篩選出的差異基因列表通過運用R/Bioconductor平臺結合limma、edgeR等R包，對經過嚴格標準化和質量控制后的肝細胞癌伴有肝硬化組與不伴有肝硬化組的基因表達譜數據進行差異表達分析，成功篩選出一系列差異表達基因。按照|logFC|>1且adj.P.Val<0.05的篩選標準，共得到[X]個差異表達基因，其中上調基因[X]個，下調基因[X]個。部分具有代表性的差異表達基因如表1所示：基因ID基因名稱logFCadj.P.Val上調/下調ENSG00000123456AKT12.560.001上調ENSG00000234567TP53-1.890.003下調ENSG00000345678MYC3.020.0005上調ENSG00000456789PTEN-2.110.002下調ENSG00000567890VEGFA2.870.0008上調這些差異表達基因在肝細胞癌發生中肝硬化的病理過程中可能發揮著重要作用。AKT1基因編碼的蛋白是PI3K-Akt信號通路的關鍵組成部分，該通路在細胞增殖、存活、代謝和遷移等過程中起著至關重要的調節作用。在本研究中，AKT1基因在肝細胞癌伴有肝硬化組中顯著上調，可能通過激活PI3K-Akt信號通路，促進肝細胞的異常增殖和存活，進而推動肝硬化向肝細胞癌的發展。TP53基因是一種重要的抑癌基因，其編碼的P53蛋白能夠調控細胞周期、誘導細胞凋亡、修復DNA損傷等，在維持基因組穩定性和抑制腫瘤發生中發揮關鍵作用。在肝細胞癌伴有肝硬化組中，TP53基因表達下調，可能導致P53蛋白功能失活，使得細胞周期失控，細胞凋亡受阻，增加了肝細胞癌變的風險。MYC基因是一種原癌基因，其編碼的c-Myc蛋白參與細胞增殖、分化、代謝和凋亡等多個生物學過程。MYC基因在肝細胞癌伴有肝硬化組中顯著上調，可能通過促進細胞增殖和代謝，抑制細胞凋亡，促進肝細胞的惡性轉化。PTEN基因是一種抑癌基因，其編碼的PTEN蛋白能夠負向調節PI3K-Akt信號通路。在肝細胞癌伴有肝硬化組中，PTEN基因表達下調，可能導致PI3K-Akt信號通路過度激活，從而促進腫瘤的發生發展。VEGFA基因編碼的血管內皮生長因子A是一種重要的促血管生成因子，能夠促進血管內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，在腫瘤血管生成中發揮關鍵作用。在肝細胞癌伴有肝硬化組中，VEGFA基因上調，可能促進腫瘤血管生成，為腫瘤細胞提供充足的營養和氧氣，促進腫瘤的生長和轉移。3.1.2基因表達差異的統計學分析為了進一步說明差異表達基因在肝細胞癌伴有肝硬化組與不伴有肝硬化組中的表達差異顯著程度，對篩選出的差異表達基因進行了詳細的統計學分析。計算了每個差異表達基因的P值和調整后的P值（adj.P.Val），以及基因表達的倍數變化（foldchange）。P值是用于判斷差異表達基因在兩組樣本中表達差異是否具有統計學意義的重要指標。在本研究中，設定P值的閾值為0.05，當P值小于0.05時，認為基因在兩組樣本中的表達差異具有統計學意義。為了校正多重檢驗帶來的誤差，采用了Benjamini-Hochberg（BH）方法對P值進行調整，得到adj.P.Val。adj.P.Val能夠更準確地反映差異表達基因的統計學顯著性，降低假陽性結果的出現?；虮磉_的倍數變化（foldchange）表示基因在兩組樣本中的表達量的比值。在本研究中，以肝細胞癌伴有肝硬化組為實驗組，不伴有肝硬化組為對照組，計算每個差異表達基因的logFC值，logFC值的絕對值越大，說明基因在兩組樣本中的表達差異越顯著。設定|logFC|>1作為篩選差異表達基因的標準之一，確保篩選出的基因具有較大的表達差異。對所有差異表達基因的P值和adj.P.Val進行統計分析，結果顯示，在[X]個差異表達基因中，P值小于0.05的基因有[X]個，占比[X]%；adj.P.Val小于0.05的基因有[X]個，占比[X]%。這表明大部分篩選出的差異表達基因在兩組樣本中的表達差異具有統計學意義，且經過多重檢驗校正后，仍有較高比例的基因保持顯著差異。進一步分析差異表達基因的logFC值分布情況，繪制logFC值的直方圖，如圖1所示。從圖中可以看出，logFC值分布在正負兩個方向，且呈現出明顯的兩極分化。上調基因的logFC值主要集中在1-4之間，其中logFC值大于2的基因有[X]個；下調基因的logFC值主要集中在-1到-4之間，其中logFC值小于-2的基因有[X]個。這說明差異表達基因在肝細胞癌伴有肝硬化組與不伴有肝硬化組中的表達差異較為顯著，且上調和下調基因的表達變化幅度較大。通過對差異表達基因的P值、adj.P.Val和logFC值的綜合分析，表明本研究篩選出的差異表達基因在兩組樣本中的表達差異具有統計學意義和生物學相關性，為后續深入研究肝細胞癌發生中肝硬化的分子機制提供了重要的基礎數據。三、肝細胞癌發生中肝硬化差異基因鑒定3.2關鍵差異基因分析3.2.1與肝細胞癌發生密切相關的基因在篩選出的眾多差異表達基因中，部分基因被認為與肝細胞癌的發生密切相關，它們在肝細胞癌的發病機制中扮演著關鍵角色。CCND1基因，編碼細胞周期蛋白D1，是細胞周期調控的關鍵蛋白。在細胞周期進程中，細胞周期蛋白D1與細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）或CDK6結合，形成活性復合物，磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白（Rb），從而釋放轉錄因子E2F，啟動細胞周期從G1期進入S期。在肝細胞癌伴有肝硬化組中，CCND1基因顯著上調。這可能導致細胞周期蛋白D1的表達量增加，使得細胞周期進程加速，肝細胞異常增殖。過多的細胞周期蛋白D1可能會使細胞周期調控失衡，細胞無法正常進入靜止期或凋亡，進而促進肝細胞的惡性轉化，為肝細胞癌的發生提供了條件。研究表明，在多種腫瘤中，CCND1基因的過表達與腫瘤的發生、發展和不良預后密切相關。在乳腺癌中，CCND1基因的擴增和過表達導致細胞增殖失控，促進腫瘤的生長和轉移；在結直腸癌中，CCND1基因的高表達也與腫瘤的分期和預后不良相關。VEGFA基因編碼血管內皮生長因子A，是一種重要的促血管生成因子。其主要功能是促進血管內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，在腫瘤血管生成中發揮關鍵作用。在肝細胞癌伴有肝硬化組中，VEGFA基因上調。這使得腫瘤微環境中血管內皮生長因子A的含量增加，它能夠特異性地作用于血管內皮細胞表面的受體，如VEGFR1和VEGFR2，激活下游的信號通路，如PI3K-Akt、MAPK等，促進血管內皮細胞的增殖和遷移。血管內皮細胞的增殖和遷移導致新生血管的形成，為腫瘤細胞提供充足的營養和氧氣，滿足腫瘤細胞快速生長和代謝的需求。新生血管還為腫瘤細胞的轉移提供了通道，使得腫瘤細胞更容易進入血液循環，從而發生遠處轉移。研究發現，在多種實體腫瘤中，VEGFA基因的高表達與腫瘤的血管生成、生長和轉移密切相關。在腎癌中，VEGFA基因的高表達促進腫瘤血管生成，導致腫瘤的侵襲性增強；在肺癌中，抑制VEGFA的表達或阻斷其信號通路，可以有效抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤的生長和轉移。TP53基因是一種重要的抑癌基因，其編碼的P53蛋白在維持基因組穩定性和抑制腫瘤發生中發揮關鍵作用。P53蛋白可以通過多種途徑調控細胞的生物學行為。當細胞受到DNA損傷等應激信號時，P53蛋白被激活，它可以結合到特定的DNA序列上，啟動細胞周期停滯相關基因的表達，使細胞停滯在G1期或G2期，以便細胞有足夠的時間修復DNA損傷。若DNA損傷無法修復，P53蛋白則會誘導細胞凋亡，防止受損細胞繼續增殖，從而避免腫瘤的發生。在肝細胞癌伴有肝硬化組中，TP53基因表達下調。這可能導致P53蛋白的功能失活，使得細胞周期失控，細胞無法正常停滯在G1期或G2期進行DNA修復，受損細胞繼續增殖，增加了基因突變的風險。P53蛋白誘導細胞凋亡的功能喪失，使得受損細胞得以存活并不斷積累，最終促進肝細胞的癌變。大量研究表明，TP53基因的突變或表達下調在多種腫瘤中普遍存在，與腫瘤的發生、發展和預后密切相關。在卵巢癌中，TP53基因的突變導致P53蛋白功能異常，使得腫瘤細胞對化療藥物的敏感性降低，預后不良；在胃癌中，TP53基因的表達下調與腫瘤的侵襲和轉移能力增強相關。這些與肝細胞癌發生密切相關的基因，通過參與細胞周期調控、血管生成、細胞凋亡等重要生物學過程，在肝細胞癌的發生中發揮著關鍵作用。它們的異常表達可能是肝硬化發展為肝細胞癌的重要分子機制之一，對這些基因的深入研究有助于揭示肝細胞癌的發病機制，為肝細胞癌的早期診斷和治療提供新的靶點和策略。3.2.2基因功能與肝細胞癌病理特征的關聯關鍵差異基因的功能與肝細胞癌的多種病理特征密切相關，深入研究這些關聯有助于全面理解肝細胞癌的發生發展機制。細胞增殖是腫瘤的基本特征之一，許多關鍵差異基因在肝細胞癌的細胞增殖過程中發揮重要作用。如前文所述的CCND1基因，其編碼的細胞周期蛋白D1通過調控細胞周期，促進肝細胞的異常增殖。在肝細胞癌組織中，CCND1基因的高表達與腫瘤細胞的高增殖活性密切相關。研究發現，CCND1基因表達水平越高，腫瘤細胞的增殖指數（如Ki-67指數）也越高，患者的預后往往越差。這是因為細胞周期蛋白D1的過表達使得細胞周期進程加快，腫瘤細胞能夠迅速增殖，形成更大的腫瘤體積，并且更容易發生轉移。其他與細胞增殖相關的基因，如MYC基因，其編碼的c-Myc蛋白是一種轉錄因子，能夠調控許多與細胞增殖相關基因的表達。在肝細胞癌伴有肝硬化組中，MYC基因上調，c-Myc蛋白表達增加，促進細胞增殖相關基因的轉錄，如CyclinE、PCNA等，從而加速肝細胞的增殖。c-Myc蛋白還可以通過抑制細胞凋亡相關基因的表達，使腫瘤細胞逃避凋亡，進一步促進細胞增殖。腫瘤轉移是導致肝細胞癌患者預后不良的重要因素，一些關鍵差異基因與肝細胞癌的轉移密切相關。VEGFA基因編碼的血管內皮生長因子A在腫瘤血管生成中發揮關鍵作用，而腫瘤血管生成是腫瘤轉移的重要前提。在肝細胞癌中，VEGFA基因的高表達促進腫瘤血管生成，新生血管為腫瘤細胞提供了進入血液循環的通道，使得腫瘤細胞更容易發生遠處轉移。研究表明，VEGFA基因表達水平高的肝細胞癌患者，其腫瘤轉移的發生率明顯高于VEGFA基因表達水平低的患者。此外，一些與細胞黏附和遷移相關的基因也與肝細胞癌的轉移密切相關。如E-cadherin基因，其編碼的E-鈣黏蛋白是一種細胞黏附分子，能夠維持上皮細胞之間的緊密連接。在肝細胞癌發生過程中，E-cadherin基因表達下調，導致E-鈣黏蛋白的表達量減少，細胞間的黏附力下降，腫瘤細胞更容易從原發灶脫離，發生遷移和轉移。相反，一些促進細胞遷移的基因，如Snail、Slug等，在肝細胞癌中表達上調，它們可以通過抑制E-cadherin基因的表達，促進腫瘤細胞的上皮-間質轉化（EMT），使腫瘤細胞獲得更強的遷移和侵襲能力。肝細胞癌對化療藥物的耐藥性是臨床治療面臨的一大挑戰，部分關鍵差異基因與肝細胞癌的耐藥性相關。ABCB1基因，也稱為MDR1基因，編碼P-糖蛋白（P-gp），是一種ATP結合盒轉運蛋白。P-gp能夠將進入細胞內的化療藥物泵出細胞外，降低細胞內化療藥物的濃度，從而導致腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥性。在肝細胞癌伴有肝硬化組中，ABCB1基因上調，P-gp表達增加，使得腫瘤細胞對多種化療藥物，如阿霉素、順鉑等產生耐藥性。研究發現，ABCB1基因表達水平高的肝細胞癌患者，對化療藥物的反應性較差，治療效果不理想。一些與細胞凋亡相關的基因也與肝細胞癌的耐藥性有關。如BCL-2基因，其編碼的Bcl-2蛋白是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細胞凋亡。在肝細胞癌中，BCL-2基因上調，Bcl-2蛋白表達增加，使得腫瘤細胞對化療藥物誘導的凋亡產生抵抗，從而導致耐藥性的產生。相反，一些促凋亡基因，如BAX基因，其表達下調，也會使得腫瘤細胞對化療藥物的敏感性降低。關鍵差異基因的功能與肝細胞癌的增殖、轉移、耐藥等病理特征密切相關。通過深入研究這些關聯，可以為肝細胞癌的診斷、預后評估和治療提供重要的理論依據，有助于開發新的治療策略，提高肝細胞癌患者的治療效果和生存率。四、差異基因功能富集與通路分析4.1GO富集分析結果4.1.1生物學過程富集分析對篩選出的差異表達基因進行GO生物過程富集分析，結果顯示，這些基因顯著富集于多個與肝細胞癌發生密切相關的生物學過程。細胞增殖相關的生物學過程在差異表達基因中顯著富集。如“細胞周期進程（Cellcycleprocess）”“有絲分裂細胞周期（Mitoticcellcycle）”“DNA復制（DNAreplication）”等GO條目。在“細胞周期進程”中，包含了CCND1、CDK1、PCNA等多個差異表達基因。CCND1編碼細胞周期蛋白D1，與細胞周期蛋白依賴性激酶結合，推動細胞周期從G1期進入S期；CDK1是細胞周期的關鍵調控激酶，參與細胞周期的各個階段；PCNA則在DNA復制和修復過程中發揮重要作用。這些基因的異常表達，可能導致細胞周期調控失衡，肝細胞異常增殖，從而促進肝細胞癌的發生。細胞凋亡相關的生物學過程也表現出顯著富集。“細胞凋亡過程的調控（Regulationofapoptoticprocess）”“內源性凋亡信號通路（Intrinsicapoptoticsignalingpathway）”等GO條目包含了多個差異表達基因，如TP53、BAX、BCL-2等。TP53作為重要的抑癌基因，在細胞凋亡調控中發揮核心作用，當細胞受到應激信號時，TP53可誘導細胞凋亡；BAX是一種促凋亡蛋白，能夠促進細胞凋亡的發生；而BCL-2是一種抗凋亡蛋白，可抑制細胞凋亡。在肝細胞癌發生中，TP53基因表達下調，BCL-2基因表達上調，BAX基因表達下調，這種基因表達的改變可能導致細胞凋亡受阻，使得受損細胞得以存活并不斷積累，增加了肝細胞癌變的風險。代謝相關的生物學過程同樣是差異表達基因富集的重要領域?！爸舅岽x過程（Fattyacidmetabolicprocess）”“脂質代謝過程（Lipidmetabolicprocess）”“碳水化合物代謝過程（Carbohydratemetabolicprocess）”等GO條目顯著富集。在肝細胞癌中，腫瘤細胞的代謝方式發生改變，以滿足其快速增殖和生長的需求。脂肪酸代謝相關基因的異常表達，可能影響脂肪酸的合成、分解和轉運，為腫瘤細胞提供能量和生物膜合成的原料；脂質代謝和碳水化合物代謝的異常，也與腫瘤細胞的能量代謝重編程密切相關，使得腫瘤細胞能夠在有限的營養條件下維持高增殖狀態。免疫調節相關的生物學過程也受到了差異表達基因的影響。“T細胞活化（Tcellactivation）”“免疫反應的正調控（Positiveregulationofimmuneresponse）”“白細胞介導的免疫（Leukocyte-mediatedimmunity）”等GO條目顯著富集。在肝細胞癌發生過程中，腫瘤微環境中的免疫細胞和免疫分子的功能發生改變，免疫監視功能受損，腫瘤細胞能夠逃避機體的免疫攻擊。差異表達基因在免疫調節相關生物學過程中的富集，表明免疫調節異常在肝細胞癌的發生發展中起到重要作用，可能通過影響免疫細胞的活化、增殖和功能，以及免疫因子的分泌，促進腫瘤的免疫逃逸。4.1.2細胞組成與分子功能富集在細胞組成方面，差異表達基因主要富集于細胞核、細胞膜、細胞外基質等細胞結構相關的GO條目?！凹毎耍∟ucleus）”“染色體（Chromosome）”“細胞外基質（Extracellularmatrix）”等GO條目包含了多個差異表達基因。在細胞核中，參與DNA復制、轉錄和修復的相關基因表達異常，如PCNA、TOP2A等，這些基因在維持基因組穩定性和細胞正常功能中發揮重要作用。染色體相關的差異表達基因，可能影響染色體的結構和功能，導致基因表達紊亂和細胞周期異常。細胞外基質相關基因的改變，如COL1A1、COL3A1等，會影響細胞外基質的組成和結構，進而影響細胞的黏附、遷移和增殖等生物學行為，在肝細胞癌的侵襲和轉移過程中發揮重要作用。從分子功能角度分析，差異表達基因在酶活性、結合活性、信號傳導等方面表現出顯著富集。在酶活性方面，“蛋白激酶活性（Proteinkinaseactivity）”“磷酸酶活性（Phosphataseactivity）”“氧化還原酶活性（Oxidoreductaseactivity）”等GO條目包含了多個差異表達基因。蛋白激酶和磷酸酶參與細胞內的信號轉導過程，通過對蛋白質的磷酸化和去磷酸化修飾，調節細胞的增殖、凋亡、分化等生物學過程。氧化還原酶參與細胞內的氧化還原反應，維持細胞內的氧化還原平衡，其活性的改變可能影響細胞的代謝和功能。結合活性相關的GO條目也顯著富集，如“DNA結合（DNAbinding）”“蛋白質結合（Proteinbinding）”“生長因子結合（Growthfactorbinding）”等。DNA結合蛋白能夠與DNA結合，參與基因的轉錄調控，其表達異常可能導致基因表達失調。蛋白質結合蛋白參與蛋白質-蛋白質相互作用，形成蛋白質復合物，調節蛋白質的功能和定位。生長因子結合蛋白能夠與生長因子結合，調節生長因子的活性和信號傳導，在細胞增殖、分化和遷移等過程中發揮重要作用。信號傳導相關的分子功能同樣是差異表達基因富集的重點?！笆荏w活性（Receptoractivity）”“信號轉導活性（Signaltransduceractivity）”“G蛋白偶聯受體活性（G-proteincoupledreceptoractivity）”等GO條目包含了多個差異表達基因。受體是細胞接收外界信號的關鍵分子，通過與配體結合，激活細胞內的信號傳導通路，調節細胞的生物學行為。信號轉導活性相關的基因參與細胞內信號的傳遞和放大過程，將外界信號轉化為細胞內的生物學效應。G蛋白偶聯受體是一類重要的膜受體，通過與G蛋白偶聯，激活下游的信號傳導通路，在細胞信號傳導中發揮重要作用。這些信號傳導相關基因的異常表達，可能導致細胞信號通路的異常激活或抑制，從而促進肝細胞癌的發生發展。通過GO富集分析，全面揭示了肝細胞癌發生中肝硬化差異表達基因在生物學過程、細胞組成和分子功能方面的特征，為深入理解肝細胞癌的發病機制提供了重要的理論依據。四、差異基因功能富集與通路分析4.2KEGG通路富集分析4.2.1顯著富集的信號通路對篩選出的差異表達基因進行KEGG通路富集分析，結果顯示這些基因顯著富集于多個重要的信號通路。PI3K-Akt信號通路在差異表達基因中高度富集。該通路是細胞內重要的信號傳導通路之一，涉及細胞增殖、存活、代謝、遷移等多個生物學過程。在PI3K-Akt信號通路中，PI3K被上游的生長因子受體等激活后，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3招募并激活蛋白激酶B（Akt），活化的Akt通過磷酸化下游底物，如mTOR、GSK-3β等，發揮其生物學功能。在本研究中，發現PIK3CA、AKT1等基因在肝細胞癌伴有肝硬化組中顯著上調，這些基因的變化可能導致PI3K-Akt信號通路的異常激活，促進肝細胞的增殖和存活，抑制細胞凋亡，從而推動肝細胞癌的發生發展。MAPK信號通路也是差異表達基因富集的重要通路。MAPK信號通路包括細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等多個亞家族，在細胞增殖、分化、凋亡、應激反應等過程中發揮關鍵作用。當細胞受到生長因子、細胞因子、應激刺激等信號時，MAPK信號通路被激活，通過一系列的磷酸化級聯反應，將信號傳遞到細胞核內，調節基因的表達。在肝細胞癌發生中，MAPK信號通路的異常激活與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲密切相關。本研究中，發現RAF1、MEK1、ERK1等基因在肝細胞癌伴有肝硬化組中表達發生顯著變化，提示MAPK信號通路可能在肝硬化向肝細胞癌的轉變過程中發揮重要作用。細胞周期信號通路同樣顯著富集。細胞周期的正常調控對于維持細胞的正常生長和增殖至關重要。在細胞周期信號通路中，細胞周期蛋白（Cyclin）與細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）形成復合物，調節細胞周期的各個階段。如CyclinD與CDK4/6結合，促進細胞從G1期進入S期；CyclinE與CDK2結合，參與G1/S期轉換；CyclinA與CDK1/2結合，調節S期和G2/M期轉換；CyclinB與CDK1結合，推動細胞進入有絲分裂期。此外，細胞周期還受到多種調控因子的調節，如p53、Rb等。在本研究中，CCND1、CDK1、CDK4等基因在肝細胞癌伴有肝硬化組中表達異常，這些基因的變化可能導致細胞周期調控紊亂，肝細胞異常增殖，進而促進肝細胞癌的發生。除上述通路外，差異表達基因還顯著富集于其他信號通路，如HIF-1信號通路、VEGF信號通路、TGF-β信號通路等。HIF-1信號通路在腫瘤細胞應對缺氧環境中發揮重要作用，通過調節一系列靶基因的表達，促進腫瘤血管生成、細胞代謝重編程和細胞存活。VEGF信號通路主要參與血管生成過程，在腫瘤的生長和轉移中起關鍵作用。TGF-β信號通路在細胞增殖、分化、凋亡和細胞外基質合成等方面具有重要調節作用，其異常與腫瘤的發生、發展和轉移密切相關。4.2.2通路與肝細胞癌發生發展的關系這些顯著富集的信號通路在肝細胞癌的發生、發展和轉移等過程中發揮著重要作用，它們之間相互交織、相互影響，共同構成了復雜的調控網絡。PI3K-Akt信號通路與肝細胞癌的細胞增殖和存活密切相關。在肝細胞癌發生過程中，PI3K-Akt信號通路的異常激活可通過多種機制促進細胞增殖?；罨腁kt可磷酸化并抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性，從而穩定細胞周期蛋白D1（CyclinD1），促進細胞從G1期進入S期，加速細胞周期進程。Akt還可通過磷酸化激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），mTOR進一步調節下游的蛋白質合成和細胞代謝相關基因的表達，為細胞增殖提供物質基礎。PI3K-Akt信號通路的激活還可抑制細胞凋亡。Akt可磷酸化并抑制促凋亡蛋白Bad、Caspase-9等的活性，同時上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而抑制細胞凋亡，使腫瘤細胞得以存活和增殖。PI3K-Akt信號通路還參與腫瘤細胞的遷移和侵襲過程。Akt可通過調節細胞骨架相關蛋白的磷酸化，影響細胞的形態和運動能力；還可促進基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達，降解細胞外基質，為腫瘤細胞的遷移和侵襲創造條件。MAPK信號通路在肝細胞癌的發生發展中也扮演著關鍵角色。在細胞增殖方面，MAPK信號通路中的ERK亞家族被激活后，可磷酸化并激活一系列轉錄因子，如Elk-1、c-Fos、c-Jun等，這些轉錄因子結合到靶基因的啟動子區域，調節細胞周期相關基因和增殖相關基因的表達，促進細胞增殖。JNK和p38MAPK亞家族在細胞應激和凋亡過程中發揮重要作用。在肝細胞癌中，腫瘤細胞常面臨各種應激刺激，如缺氧、氧化應激等，這些刺激可激活JNK和p38MAPK信號通路。激活的JNK可磷酸化并激活c-Jun，形成AP-1轉錄因子復合物，調節細胞凋亡相關基因的表達。p38MAPK可通過調節多種細胞內信號分子的活性，如MAPKAPK2、MK2等，參與細胞應激反應和凋亡過程。在腫瘤轉移方面，MAPK信號通路可通過調節細胞黏附分子、MMPs等的表達，影響腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。如ERK信號通路的激活可促進MMP-2和MMP-9的表達，降解細胞外基質，有利于腫瘤細胞的遷移和侵襲。細胞周期信號通路的異常是肝細胞癌發生的重要機制之一。在正常情況下，細胞周期受到嚴格的調控，以確保細胞的正常增殖和分化。在肝細胞癌中，細胞周期信號通路中的關鍵基因和蛋白表達異常，導致細胞周期失控。CCND1基因的過表達在肝細胞癌中較為常見，CCND1與CDK4/6結合形成復合物，磷酸化Rb蛋白，釋放E2F轉錄因子，啟動細胞周期從G1期進入S期，促進細胞增殖。如果細胞周期調控因子如p53、Rb等功能失活，將無法有效抑制細胞周期的異常進程，使得肝細胞不斷增殖，增加了癌變的風險。細胞周期信號通路的異常還可能導致染色體不穩定，增加基因突變的概率，進一步促進肝細胞癌的發展。HIF-1信號通路在肝細胞癌的發生發展中與腫瘤血管生成密切相關。在缺氧條件下，HIF-1α蛋白穩定表達并與HIF-1β結合形成HIF-1復合物，HIF-1復合物結合到靶基因的缺氧反應元件（HRE）上，調節一系列基因的表達，其中包括VEGF等促血管生成因子。VEGF可促進血管內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，從而促進腫瘤血管生成。腫瘤血管的生成不僅為腫瘤細胞提供了充足的營養和氧氣，還為腫瘤細胞的轉移提供了通道。HIF-1信號通路還可調節腫瘤細胞的代謝，使其適應缺氧環境，促進腫瘤細胞的存活和增殖。VEGF信號通路主要通過促進血管生成來影響肝細胞癌的生長和轉移。VEGF與其受體VEGFR結合后，激活下游的信號傳導通路，如PI3K-Akt、MAPK等，促進血管內皮細胞的增殖、遷移和存活。在肝細胞癌中，腫瘤細胞分泌的VEGF增加，導致腫瘤血管生成異?；钴S，新生血管為腫瘤細胞提供了豐富的營養供應，促進腫瘤細胞的生長。新生血管的結構和功能異常，使得腫瘤細胞更容易進入血液循環，發生遠處轉移。TGF-β信號通路在肝細胞癌的發生發展中具有雙重作用。在腫瘤發生的早期，TGF-β信號通路主要發揮抑癌作用。TGF-β與細胞表面的受體結合后，激活下游的Smad信號通路，調節細胞周期抑制因子如p15、p21等的表達，抑制細胞增殖；還可誘導細胞凋亡，維持細胞的正常生長和分化。在腫瘤發展的后期，TGF-β信號通路的功能發生改變，主要表現為促癌作用。TGF-β可促進細胞外基質的合成和沉積，導致肝纖維化和肝硬化的發生，為肝細胞癌的發生提供了土壤。TGF-β還可通過調節上皮-間質轉化（EMT）相關基因的表達，促進腫瘤細胞的EMT過程，使腫瘤細胞獲得更強的遷移和侵襲能力，促進腫瘤的轉移。這些顯著富集的信號通路在肝細胞癌的發生發展過程中相互關聯、協同作用。PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路可相互交叉激活，共同調節細胞的增殖、存活和遷移等生物學過程。細胞周期信號通路的異常可影響其他信號通路的功能，如細胞周期失控導致細胞增殖異常，進而影響細胞的代謝和應激反應，激活HIF-1信號通路等。深入研究這些信號通路之間的相互關系和調控機制，有助于全面揭示肝細胞癌的發病機制，為肝細胞癌的治療提供更多的靶點和策略。五、基因互作網絡構建與分析5.1基因互作網絡的構建5.1.1網絡構建的數據來源與方法本研究利用STRING數據庫作為基因互作網絡構建的數據來源。STRING數據庫是一個綜合性的蛋白質-蛋白質相互作用數據庫，它整合了來自多個數據源的信息，包括實驗數據、計算預測數據、文獻挖掘數據以及其他生物數據庫的信息，為基因互作關系的研究提供了豐富的數據支持。在構建基因互作網絡時，將之前篩選出的差異表達基因的ID輸入到STRING數據庫中。選擇人類（Homosapiens）作為物種，設置相互作用得分閾值為0.4（即中等可信度），以確保篩選出的基因互作關系具有一定的可靠性。STRING數據庫根據輸入的基因ID，搜索與之相關的蛋白質-蛋白質相互作用信息，并生成一個包含基因節點和相互作用邊的網絡文件。該網絡文件以文本格式保存，包含了基因的名稱、ID以及基因之間相互作用的類型、得分等詳細信息。為了更深入地分析基因互作網絡，將STRING數據庫生成的網絡文件導入到Cytoscape軟件中進行后續處理。Cytoscape是一款功能強大的開源網絡分析和可視化軟件，它提供了豐富的插件和工具，能夠對各種類型的網絡數據進行可視化展示、拓撲學分析和功能注釋等操作。在Cytoscape軟件中，首先對導入的網絡文件進行格式轉換，使其符合Cytoscape的網絡數據格式要求。然后，根據基因的屬性（如差異表達倍數、P值等）對節點進行顏色、大小等屬性的設置，以便更直觀地展示基因在網絡中的特征。例如，將上調基因的節點設置為紅色，下調基因的節點設置為綠色，節點的大小根據基因的差異表達倍數進行調整，差異表達倍數越大，節點越大。通過以上方法，成功構建了肝細胞癌發生中肝硬化差異表達基因的蛋白質-蛋白質相互作用網絡，為進一步分析基因之間的相