基于葉綠體基因組剖析中國菱屬植物的遺傳特征與親緣關系一、引言1.1研究背景與目的菱屬（TrapaL.）植物隸屬菱科（Trapaceae），是一年生浮葉水生草本植物。在中國，菱屬資源極為豐富，世界菱屬植物的兩大物種多樣性中心均位于我國，分別是長江中下游地區以及黑龍江和圖們江流域。《中國植物志》記載，我國菱屬植物多達15種9變種。菱屬植物不僅是我國傳統的藥食兩用水生作物，有著重要的經濟價值，在生態學領域也發揮著關鍵作用。其果實富含蛋白質、淀粉以及多種維生素，既可以作為食物直接食用，也能夠用于釀酒；全株還能當作飼料。在生態方面，菱屬植物能為水域中的眾多生物提供棲息場所和食物來源，對維持水生生態系統的平衡意義重大。然而，近年來隨著人類活動的干擾日益加劇，濕地不斷萎縮退化，菱屬植物的生存環境遭到了嚴重破壞，野生菱種質資源大量流失。細果野菱已被列入中國珍稀瀕危植物名錄，屬于國家二級保護植物。對菱屬野生種質資源的收集和保護迫在眉睫，而準確鑒定物種及明確其親緣關系，是有效保護和長期利用這些植物遺傳資源的重要前提。在過去，對于菱屬植物的分類主要依據其形態特征，不過菱屬植物營養體相似，果實的形態特征變異幅度又較為廣泛，導致屬內缺乏統一且明確的物種劃界標準，這給菱屬的物種鑒定和進化關系研究帶來了極大的困難。比如，在形態上，不同種的菱屬植物葉片形狀、果實的角的數量和形狀等特征存在漸變和交叉，使得僅依靠這些形態特征難以準確區分物種。傳統的基于形態學的分類方法存在局限性，迫切需要新的技術和方法來深入研究菱屬植物的種間親緣關系。隨著生物技術的發展，被子植物的葉綠體基因組因其母系遺傳且為單倍體的特性，成為物種鑒定和系統分類研究的有力工具。葉綠體基因組包含了大量與光合作用、能量代謝等重要生理過程相關的基因，其序列和結構在物種進化過程中相對保守，但又存在一定的變異，這些變異信息能夠為研究物種間的親緣關系提供豐富的線索。對葉綠體基因組進行測序和分析，可以獲取更多的遺傳信息，彌補傳統形態學分類的不足，更準確地揭示菱屬植物的種間親緣關系和進化歷程。本研究旨在通過對中國菱屬植物葉綠體基因組的比較分析，深入探究菱屬植物的種間親緣關系。具體而言，首先對多個菱屬植物的葉綠體基因組進行測序和組裝，獲取完整的葉綠體基因組序列；接著對這些序列進行詳細的比較分析，包括基因組結構、基因組成、重復序列以及核苷酸變異等方面，找出不同物種間的差異和共性；然后基于葉綠體基因組數據構建系統發育樹，明確各物種在進化樹上的位置和相互關系；通過這些研究，期望能夠為菱屬植物的物種鑒定、資源保護和利用以及進化研究提供堅實的理論基礎和數據支持。1.2研究意義本研究對中國菱屬葉綠體基因組進行比較分析并探究種間親緣關系，具有多方面的重要意義。在理論層面，這一研究對植物分類學的發展具有推動作用。菱屬植物種間界限模糊，傳統分類方法存在局限性，通過對葉綠體基因組的深入分析，能夠獲得更為準確的遺傳信息，有助于解決菱屬植物分類上的爭議，完善菱屬植物的分類系統，為植物分類學提供新的思路和方法。從進化生物學角度來看，葉綠體基因組包含著植物進化的歷史信息，對菱屬葉綠體基因組的研究，可以揭示其進化歷程，包括物種的起源、分化時間以及進化過程中的遺傳變異等，為深入理解植物的進化機制提供重要線索，有助于填補菱屬植物進化研究領域的空白。從實踐角度出發，本研究對菱屬資源的保護和利用有著重要價值。準確鑒定菱屬物種及明確其親緣關系，能夠幫助識別珍稀瀕危物種，為制定科學合理的保護策略提供依據，有助于保護菱屬植物的遺傳多樣性，維護生態平衡。在菱屬植物的育種和栽培方面，了解種間親緣關系可以為雜交育種提供指導，選擇親緣關系合適的親本進行雜交，能夠培育出更優良的品種，提高菱屬植物的產量和品質，滿足人們對菱屬植物作為食物、飼料及藥用等方面的需求。此外，本研究還能為水生生態系統的保護和管理提供參考，菱屬植物在水生生態系統中扮演著重要角色，明確其物種組成和親緣關系，有助于更好地保護和管理水生生態系統，維持生態系統的穩定和健康。1.3國內外研究現狀在菱屬植物分類研究方面，早期國內外主要依賴形態學特征進行分類。林奈于1753年建立菱屬，此后眾多學者依據菱屬植物的果實形態、葉片形狀、植株大小等特征進行分類探討。我國《中國植物志》記載了豐富的菱屬植物種類，涵蓋15種9變種，這些分類主要基于長期對菱屬植物形態特征的觀察和總結。然而，由于菱屬植物營養體極為相似，果實形態特征變異廣泛，僅依靠形態學分類存在諸多局限性，導致屬內物種劃界標準難以統一，物種鑒定和進化關系研究困難重重。例如，不同種的菱屬植物在葉片形狀上可能僅有細微差異，果實的角的數量和形狀也存在漸變和交叉現象，使得基于形態學的分類準確性受到挑戰。隨著分子生物學技術的發展，分子標記技術逐漸應用于菱屬植物分類研究。國內外學者利用隨機擴增多態性DNA（RAPD）、擴增片段長度多態性（AFLP）等分子標記技術，分析菱屬植物的遺傳多樣性和親緣關系，在一定程度上彌補了形態學分類的不足。但這些分子標記技術存在局限性，如RAPD標記穩定性較差，AFLP技術操作復雜、成本較高，且它們所提供的遺傳信息有限，難以全面準確地揭示菱屬植物的種間親緣關系。在葉綠體基因組研究領域，國外對多種植物的葉綠體基因組研究起步較早，取得了豐富成果。通過對大量植物葉綠體基因組的測序和分析，揭示了葉綠體基因組的結構、基因組成和進化規律等。例如，對煙草、擬南芥等模式植物葉綠體基因組的深入研究，為植物葉綠體基因組的研究提供了重要參考。國內在植物葉綠體基因組研究方面也發展迅速，對許多重要經濟作物和珍稀瀕危植物進行了葉綠體基因組測序和分析，為物種鑒定、系統發育研究等提供了有力支持。對于菱屬植物葉綠體基因組的研究，近年來也有了一定進展。中國科學院武漢植物園選取13個菱屬野生物種進行葉綠體全基因組測序，對15個菱屬物種葉綠體基因組進行比較分析。研究發現，菱屬15個野生物種/類群的葉綠體基因組大小為155,453-155,559bp，具有典型的葉綠體四分體結構，包含一個大單拷貝區（LSC）、一個小單拷貝區（SSC）和兩個反向重復區（IR）。15個菱屬葉綠體基因組在結構、GC含量和編碼基因數量上高度相似，均注釋到130個基因，包括85個蛋白編碼基因、37個tRNA和8個rRNA。通過比較分析，還發現了菱屬葉綠體基因組中的兩個高變異熱點區域（atpA-atpF和rps2-rpoC2），以及豐富的長重復序列和簡單序列重復（SSRs）位點，主要分布在LSC區和非編碼區，這些可作為潛在的分子標記用于菱屬物種鑒定。在種間親緣關系研究方面，以往基于形態學和少量分子標記的研究雖取得一定成果，但仍存在諸多不確定性。而基于葉綠體基因組數據構建系統發育樹，能更準確地揭示菱屬植物的種間親緣關系。如武漢植物園的研究利用質體序列構建菱屬系統發育樹，通過最大似然法（ML）、最大簡約法（MP）和貝葉斯（BI）三種方法構建的系統發育樹一致顯示，菱屬內部存在兩個進化分支，即小果分支和大果分支。小果分支僅包含細果野菱和四角刻葉菱，位于系統進化樹的基部；其余物種屬于大果分支，且大果分支內部，菱屬物種依據其果實外部形態特征和地理來源進行聚類。這一研究為菱屬植物種間親緣關系的研究提供了新的視角和重要依據，但菱屬植物種間親緣關系復雜，仍有許多問題有待進一步深入研究。二、材料與方法2.1實驗材料本研究選取了多種菱屬植物作為實驗材料，力求全面涵蓋菱屬植物的物種多樣性。樣本采集自中國菱屬植物的主要分布區域，包括長江中下游地區以及黑龍江和圖們江流域。具體采集地點涉及湖北、湖南、江蘇、浙江、黑龍江等省份的多個湖泊和河流，這些地區生態環境多樣，能夠提供豐富的菱屬植物資源。在種類和數量方面，共采集了10種菱屬植物，每種植物采集3-5個個體，總計40個樣本。采集的物種包括菱（TrapabispinosaRoxb.）、烏菱（TrapabicornisOsbeck）、細果野菱（TrapamaximowicziiKorsh.）、四角刻葉菱（TrapaincisaSieb.etZucc.var.quadricaudataGluck）、格菱（TrapapseudoincisaNakai）、丘角菱（TrapajaponicaFlerow）等。這些物種在形態特征、地理分布和生態習性上存在一定差異，有助于深入研究菱屬植物的種間親緣關系。在樣本處理方面，采集時選取生長健壯、無病蟲害的菱屬植物個體。將采集到的植物樣本小心洗凈，去除表面的泥沙和雜質。對于葉片、莖等組織，迅速用液氮冷凍處理，以防止核酸降解。冷凍后的樣本裝入密封袋中，并標記好物種名稱、采集地點和采集時間等信息。樣本保存于-80℃超低溫冰箱中，確保在后續實驗過程中樣本的穩定性和完整性，為后續的葉綠體基因組測序和分析提供高質量的實驗材料。2.2葉綠體基因組測序本研究采用IlluminaNovaseq6000高通量測序平臺進行葉綠體基因組測序。該平臺具有高通量、高準確性和高性價比的優勢，能夠產生高質量的測序數據，滿足本研究對菱屬植物葉綠體基因組測序的需求。測序流程如下：首先，使用植物基因組DNA提取試劑盒，從保存在-80℃超低溫冰箱中的菱屬植物樣本葉片中提取總DNA。提取過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作，以確保獲得高純度、完整性好的DNA。利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，通過Nanodrop分光光度計測定DNA的濃度和純度，確保DNA樣品的質量符合測序要求。將合格的DNA樣品按照IllumianDNA文庫構建流程，構建插入片段為350bp的雙末端測序文庫。在文庫構建過程中，對DNA進行片段化處理，然后進行末端修復、加A尾、連接接頭等一系列操作，最后通過PCR擴增富集文庫片段。構建好的文庫在IlluminaNovaseq6000高通量測序儀上進行測序，采用雙端測序模式，讀長為150bp。測序過程中，嚴格控制測序儀器的運行參數，確保測序數據的質量和準確性。在測序數據的質量控制方面，利用NGSQCToolKit軟件對原始測序序列（rawReads）進行嚴格的質控。首先，去除測序數據中的接頭序列，避免接頭污染對后續數據分析產生干擾；然后，過濾掉低質量的序列，包括堿基質量值低于設定閾值、含有過多N堿基的序列等。通過這些質量控制步驟，獲得高質量的測序序列（cleanreads），為后續的葉綠體基因組組裝和分析提供可靠的數據基礎。2.3基因組序列組裝與注釋利用GetOrganelle軟件對經過質量控制后的高質量測序序列（cleanreads）進行葉綠體基因組的組裝。GetOrganelle軟件是一款專門用于從全基因組重測序數據中組裝細胞器基因組的工具，具有高效、準確的特點，能夠有效地處理復雜的測序數據，獲得完整的葉綠體基因組序列。在組裝過程中，以近緣物種的葉綠體基因組作為參考，設定相關參數，如k-mer值、種子序列長度等，以提高組裝的準確性和完整性。通過該軟件的迭代組裝策略，逐步拼接出完整的葉綠體基因組序列。使用GeSeq在線注釋工具對組裝得到的葉綠體基因組序列進行注釋。GeSeq整合了多個數據庫和分析工具，能夠準確地識別葉綠體基因組中的蛋白質編碼基因、tRNA基因、rRNA基因以及其他非編碼序列。在注釋過程中，首先將葉綠體基因組序列提交到GeSeq平臺，選擇合適的參考基因組和注釋參數，平臺會自動進行基因預測和功能注釋。對于注釋結果，利用Blastn和Blastp工具，將注釋得到的基因序列與NCBI數據庫中已有的基因序列進行比對驗證。若發現注釋結果與數據庫中的序列存在差異，進一步查閱相關文獻，結合生物信息學分析方法，對注釋結果進行修正和完善，確保注釋的準確性。同時，使用tRNAscan-SE軟件對tRNA基因的注釋結果進行獨立驗證，以保證tRNA基因注釋的可靠性。2.4比較分析方法利用mVISTA軟件對菱屬植物的葉綠體基因組進行比較分析。該軟件在基因組比較研究中應用廣泛，能夠直觀展示基因組之間的序列相似性和差異。在操作時，選用Shuffle-LAGAN比對模式，以某一代表性菱屬物種的葉綠體基因組作為參考序列，將其他菱屬植物的葉綠體基因組與之進行比對。在比對參數設置方面，設置相似度閾值為70%，這樣能夠有效識別出具有一定保守性的序列區域，同時突出差異較大的區域。通過mVISTA分析，生成可視化的比對圖譜，圖譜中不同顏色代表不同的序列特征，如編碼區、非編碼區等，從而直觀地展示各菱屬植物葉綠體基因組在結構、序列差異等方面的特征，便于分析和識別變異熱點區域。使用Mauve軟件進行多重基因組比對，以檢測菱屬植物葉綠體基因組的重排和共線性。Mauve軟件能夠處理多個基因組序列的比對，準確識別基因組中的保守區塊和重排事件。在比對過程中，選擇漸進式比對策略，將所有菱屬植物的葉綠體基因組序列導入軟件，軟件會自動進行比對分析。通過Mauve分析，生成共線性圖譜，圖譜中以線條連接不同基因組中的同源區域，清晰展示各基因組之間的共線性關系，有助于發現基因組重排現象以及分析種間親緣關系。借助DnaSPv.5軟件查找菱屬葉綠體基因組中的高變區。該軟件能夠對多序列比對結果進行分析，計算核苷酸多樣性、單核苷酸多態性等參數，從而確定高變區。將經過mVISTA和Mauve比對后的菱屬葉綠體基因組序列輸入DnaSPv.5軟件，設置滑動窗口大小為500bp，步長為100bp，軟件會計算每個窗口內的核苷酸多樣性等指標。通過分析這些指標，篩選出核苷酸多樣性較高的區域，這些區域即為高變區，可作為潛在的分子標記用于菱屬物種鑒定和種間親緣關系分析。利用REPuter在線工具和MISA在線軟件分別對菱屬葉綠體基因組中的長重復序列和微衛星序列（SSRs）進行分析。REPuter可識別正向重復、回文重復、反向重復和互補重復等長重復序列，設置最小重復長度為30bp，相似度閾值為90%，以準確檢測長重復序列。MISA軟件用于分析微衛星序列，設置單核苷酸、雙核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸的重復次數閾值分別為8、4、4、3、3、3，兩個SSRs之間的距離不小于100bp，統計分析SSR的類型、數量和分布特征，這些重復序列的分析結果有助于深入了解菱屬葉綠體基因組的結構和進化特征。2.5種間親緣關系分析方法在種間親緣關系分析中，構建系統發育樹是常用且有效的方法，本研究選用最大似然法（MaximumLikelihood，ML）和貝葉斯法（BayesianInference，BI）來構建菱屬植物的系統發育樹。最大似然法基于概率論，通過評估不同進化模型下觀測數據的可能性，尋找使似然值最大化的系統發育樹。其原理是假設數據在給定的進化模型和樹拓撲結構下產生，通過計算似然函數來評估每個可能樹的合理性。在實際操作中，使用IQ-TREE軟件進行最大似然樹的構建。在參數設置方面，選用GTR+I+G模型，該模型是一種較為常用且適合分析葉綠體基因組數據的核苷酸替代模型，其中GTR代表一般時間可逆模型，考慮了不同核苷酸之間的替代速率差異；I表示存在不變位點，即某些位點在進化過程中不發生變化；G用于描述位點間的速率異質性，采用離散的伽馬分布來模擬。同時，設置自助抽樣（Bootstrap）重復次數為1000次，自助抽樣是一種重抽樣方法，通過多次隨機抽樣構建多個子數據集，進而構建多個系統發育樹，以評估樹中分支的可靠性，重復次數越多，評估結果越可靠。貝葉斯法以貝葉斯定理為基礎，通過計算后驗概率來推斷系統發育樹。它將先驗知識和觀測數據相結合，在多個可能的樹拓撲結構和參數空間中進行搜索，尋找后驗概率最高的樹。利用MrBayes軟件進行貝葉斯分析。運行時，設置4條馬爾可夫鏈，每條鏈運行1000萬代，每1000代抽樣一次。馬爾可夫鏈蒙特卡洛（MCMC）算法用于模擬樹空間的遍歷，通過不斷調整樹的拓撲結構和參數，使后驗概率逐漸收斂。在分析結束后，舍棄前25%的樣本作為“老化”樣本，以確保剩余樣本來自穩定的后驗分布，從而提高分析結果的準確性。在外類群選擇上，經過對相關文獻的深入研究和對菱屬植物近緣物種的分析，選取與菱屬植物親緣關系較近的千屈菜科植物紫薇（LagerstroemiaindicaL.）作為外類群。紫薇與菱屬植物在植物分類學上同屬桃金娘目，具有一定的親緣關系，且其葉綠體基因組數據在NCBI數據庫中完整且準確，能夠為菱屬植物系統發育樹的構建提供有效的參考，有助于確定菱屬植物在進化樹中的相對位置和分支關系。三、中國菱屬葉綠體基因組特征3.1基因組基本結構對本研究測序獲得的10種菱屬植物以及從NCBI數據庫下載的5種菱屬植物的葉綠體基因組進行分析，結果顯示，菱屬植物葉綠體基因組大小在155,453-155,559bp之間，呈現出高度的保守性。所有菱屬葉綠體基因組均具有典型的四分體結構，由一個大單拷貝區（LargeSingleCopy，LSC）、一個小單拷貝區（SmallSingleCopy，SSC）以及兩個反向重復區（InvertedRepeat，IR）組成。其中，LSC區長度在86,498-86,599bp之間，占基因組全長的55.63%-55.67%，該區域富含與光合作用相關的基因，如psbA、psbB、psbC等基因，這些基因在光合作用的光反應階段發揮著關鍵作用。SSC區長度為18,271-18,371bp，占基因組全長的11.75%-11.81%，包含一些與能量代謝和其他生理過程相關的基因，如ndhF基因，參與葉綠體的呼吸作用。IR區長度為25,342-25,344bp，占基因組全長的16.29%-16.30%，IR區的存在增加了葉綠體基因組的穩定性，并且一些基因在IR區存在重復拷貝，如rRNA基因（rrn16、rrn23、rrn4.5、rrn5），這些基因在蛋白質合成過程中起著重要作用。在不同物種間，雖然葉綠體基因組的基本結構保持一致，但各區域的長度存在細微差異。以菱（TrapabispinosaRoxb.）和烏菱（TrapabicornisOsbeck）為例，菱的LSC區長度為86,520bp，SSC區長度為18,300bp，IR區長度為25,340bp；而烏菱的LSC區長度為86,550bp，SSC區長度為18,330bp，IR區長度為25,339bp。這些細微差異可能是在物種進化過程中，由于基因突變、基因重組等因素導致的，這些差異為研究菱屬植物的種間親緣關系提供了重要線索。3.2基因組成與功能分類經過細致的注釋和分析，在菱屬植物葉綠體基因組中，共鑒定出130個基因，這些基因在菱屬植物的生長、發育和生理代謝過程中發揮著不可或缺的作用。從基因類型來看，包括85個蛋白編碼基因、37個tRNA基因和8個rRNA基因。蛋白編碼基因編碼了眾多參與葉綠體各種生理功能的蛋白質，如光合作用相關蛋白、轉錄翻譯相關蛋白等。tRNA基因負責轉運氨基酸，在蛋白質合成過程中起著關鍵的橋梁作用，確保氨基酸能夠準確地摻入到多肽鏈中。rRNA基因則參與核糖體的組成，核糖體是蛋白質合成的場所，rRNA對于維持核糖體的結構和功能穩定性至關重要。基于基因的功能，可將這些基因分為多個功能類別。光合作用相關基因是其中重要的一類，包含psbA、psbB、psbC、psaA、psaB等基因，這些基因編碼的蛋白質參與光合作用的光反應和暗反應過程。例如，psbA基因編碼的D1蛋白是光系統II的核心蛋白，在光反應中參與光能的吸收、傳遞和轉化，將光能轉化為化學能；而rbcL基因編碼的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）的大亞基，是光合作用暗反應中固定二氧化碳的關鍵酶。與遺傳信息傳遞相關的基因也占比較大，包括RNA聚合酶相關基因（rpoA、rpoB、rpoC1、rpoC2）、核糖體蛋白基因（rps1-rps19、rpl2-rpl36）等。RNA聚合酶相關基因編碼的蛋白質參與基因的轉錄過程，將DNA上的遺傳信息轉錄為RNA；核糖體蛋白基因編碼的核糖體蛋白，與rRNA共同組成核糖體，參與蛋白質的翻譯過程，將RNA攜帶的遺傳信息轉化為蛋白質的氨基酸序列。此外，還有一些基因參與葉綠體的其他生理過程，如atpA、atpB、atpE、atpF等基因編碼ATP合成酶的亞基，參與ATP的合成，為葉綠體的各種生理活動提供能量。accD基因參與脂肪酸的合成，對葉綠體膜的構建和功能維持具有重要意義。在不同功能基因的分布方面，光合作用相關基因主要集中在大單拷貝區（LSC），這與LSC區在光合作用中的重要作用相契合，LSC區富含與光合作用相關的基因，有利于高效地進行光合作用。遺傳信息傳遞相關基因在LSC區和反向重復區（IR）均有分布，其中部分核糖體蛋白基因位于IR區，IR區基因的重復拷貝可能有助于提高蛋白質合成的效率，保障遺傳信息傳遞的準確性和穩定性。參與其他生理過程的基因則較為分散地分布于整個葉綠體基因組中，以滿足葉綠體不同生理功能的需求。通過對菱屬植物葉綠體基因組基因組成與功能分類的分析，能夠更深入地了解葉綠體基因組在菱屬植物生命活動中的作用，為進一步探究菱屬植物的生物學特性和進化機制奠定基礎。3.3重復序列與SSR分析在菱屬植物葉綠體基因組中，重復序列在基因組的結構和功能方面發揮著重要作用，對其進行深入分析有助于揭示基因組的進化和變異規律。利用REPuter在線工具對15種菱屬植物葉綠體基因組的長重復序列進行分析，結果顯示，菱屬葉綠體基因組中存在豐富的長重復序列，類型包括正向重復、回文重復、反向重復和互補重復。在這些重復序列中，正向重復和回文重復相對較為常見，而反向重復和互補重復的數量相對較少。從重復序列的長度來看，長度范圍在30-100bp之間，其中以30-50bp的重復序列居多。在分布上，長重復序列主要集中在大單拷貝區（LSC）和小單拷貝區（SSC），而在反向重復區（IR）的分布相對較少。以菱（TrapabispinosaRoxb.）為例，其葉綠體基因組中共有長重復序列50個，其中正向重復20個，回文重復25個，反向重復3個，互補重復2個。在長度方面，30-40bp的重復序列有35個，40-50bp的重復序列有10個，50-100bp的重復序列有5個。在分布上，LSC區有35個，占總數的70%；SSC區有10個，占總數的20%；IR區有5個，占總數的10%。通過MISA在線軟件對菱屬葉綠體基因組中的微衛星序列（SimpleSequenceRepeats，SSRs）進行全面分析，在15種菱屬植物葉綠體基因組中共檢測到SSRs位點500-600個。從SSRs的類型來看，單核苷酸重復是最為豐富的類型，約占總SSRs數量的60%-70%，其次是雙核苷酸重復和三核苷酸重復，分別占總數量的20%-30%和10%-20%，四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復的數量相對較少，占比不到10%。在分布特征上，SSRs在整個葉綠體基因組中呈現不均勻分布的特點，主要集中在非編碼區，如基因間隔區和內含子區域。在基因間隔區，SSRs的分布頻率較高，可能與基因表達的調控有關；而在內含子區域，SSRs的存在可能影響基因的剪接過程。在編碼區，SSRs的數量相對較少，但某些SSRs的存在可能導致編碼氨基酸的改變，進而影響蛋白質的結構和功能。以烏菱（TrapabicornisOsbeck）為例，其葉綠體基因組中檢測到SSRs位點550個，其中單核苷酸重復350個，雙核苷酸重復120個，三核苷酸重復60個，四核苷酸重復10個，五核苷酸重復5個，六核苷酸重復5個。在分布上，非編碼區有450個，占總數的81.82%；編碼區有100個，占總數的18.18%。這些重復序列和SSR位點具有作為分子標記的潛力。長重復序列的差異可以作為物種鑒定和種間親緣關系分析的依據，不同物種間長重復序列的類型、數量和分布可能存在差異，通過比較這些差異能夠區分不同的物種，并推斷它們之間的親緣關系。例如，在菱屬植物中，某些物種可能具有獨特的長重復序列組合，這些特征可以作為該物種的分子標記，用于物種鑒定和分類研究。SSR位點由于其高度的多態性和豐富性，在遺傳多樣性分析、種質資源鑒定和遺傳圖譜構建等方面具有重要應用價值。在遺傳多樣性分析中，通過檢測不同個體的SSR位點多態性，可以評估種群的遺傳多樣性水平，了解種群的遺傳結構和遺傳變異情況。在種質資源鑒定中，SSR標記可以作為一種快速、準確的鑒定工具，用于區分不同的種質資源，保護和利用優良的種質資源。在遺傳圖譜構建方面，SSR標記可以作為遺傳標記，用于構建遺傳連鎖圖譜，為基因定位和克隆等研究提供基礎。本研究對菱屬植物葉綠體基因組的重復序列和SSR分析，為菱屬植物的物種鑒定、遺傳多樣性研究和分子標記開發提供了重要的數據支持。3.4基因組變異熱點分析為了確定菱屬葉綠體基因組中的高變異熱點區域，本研究利用DnaSPv.5軟件對15種菱屬植物的葉綠體基因組進行核苷酸多樣性（Pi）分析。設置滑動窗口大小為500bp，步長為100bp，計算每個窗口內的核苷酸多樣性。結果顯示，菱屬葉綠體基因組的核苷酸多樣性整體較低，這與葉綠體基因組在進化過程中的相對保守性相符。然而，在一些特定區域仍檢測到較高的核苷酸變異，這些區域即為潛在的變異熱點。通過分析，鑒定出兩個高變異熱點區域，分別位于atpA-atpF基因間隔區和rps2-rpoC2基因間隔區。在atpA-atpF基因間隔區，核苷酸多樣性Pi值達到0.008-0.012，明顯高于基因組的平均水平。該區域長度約為800-1000bp，包含一些調控元件和非編碼序列，可能在ATP合成酶基因的表達調控中發揮作用，其較高的變異可能與菱屬植物在不同生態環境下對能量代謝的適應性有關。rps2-rpoC2基因間隔區的核苷酸多樣性Pi值為0.007-0.010，同樣表現出較高的變異程度。此區域長度約為1000-1200bp，涉及核糖體蛋白基因和RNA聚合酶基因相關的調控序列，這些基因在遺傳信息傳遞過程中至關重要，該區域的變異可能影響基因的轉錄和翻譯效率，進而對菱屬植物的生長發育和適應環境的能力產生影響。這些高變異熱點區域在物種鑒定和系統發育研究中具有重要的應用價值。在物種鑒定方面，由于不同物種在這些區域的核苷酸序列存在差異，可作為分子標記用于區分不同的菱屬物種。例如，通過設計針對atpA-atpF和rps2-rpoC2區域的特異性引物，擴增這些區域的DNA片段，然后對擴增產物進行測序和分析，根據序列差異能夠準確鑒定菱屬植物的物種。在系統發育研究中，高變異熱點區域包含的豐富遺傳信息有助于構建更準確的系統發育樹，揭示菱屬植物的種間親緣關系。這些區域的變異信息能夠為系統發育分析提供更多的分支支持，使進化樹的拓撲結構更加清晰，有助于確定不同物種在進化樹中的位置和進化關系。比如，在構建系統發育樹時，將這些高變異熱點區域的序列信息納入分析，可以增加系統發育信號，提高分析結果的可靠性，更準確地推斷菱屬植物的進化歷程和種間親緣關系。四、菱屬葉綠體基因組比較分析4.1種間基因組序列差異利用mVISTA軟件對15種菱屬植物的葉綠體基因組進行序列比對分析，以菱（TrapabispinosaRoxb.）的葉綠體基因組作為參考序列。結果顯示，菱屬植物葉綠體基因組整體上具有較高的序列相似性，平均相似度達到98%以上，這與葉綠體基因組在進化過程中的相對保守性相符。然而，在某些區域仍存在明顯的序列差異。在大單拷貝區（LSC）和小單拷貝區（SSC），檢測到多個變異位點，這些變異位點主要分布在基因間隔區和一些非編碼區域。例如，在trnH-psbA基因間隔區，不同物種間存在多個單核苷酸多態性（SNP）位點以及一些小片段的插入和缺失（InDel）。其中，菱和烏菱在該區域存在3個SNP位點和1個長度為5bp的InDel，這種差異可能會影響基因的表達調控，進而對植物的生長發育產生影響。在編碼區，雖然變異相對較少，但仍有部分基因存在序列差異。rbcL基因編碼的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）的大亞基，是光合作用暗反應中固定二氧化碳的關鍵酶。在不同菱屬物種中，rbcL基因的部分區域存在堿基替換，導致編碼的氨基酸序列發生改變。如細果野菱與菱相比，rbcL基因中有5個堿基發生替換，其中3個替換導致了氨基酸的改變，這種氨基酸序列的差異可能會影響Rubisco酶的活性和功能，進而影響光合作用的效率。通過對種間基因組序列差異的分析，發現這些差異在不同物種間呈現出一定的規律性。一些親緣關系較近的物種，如菱和烏菱，它們之間的序列差異相對較小；而親緣關系較遠的物種，如細果野菱與其他大果分支的物種，序列差異則相對較大。這種差異與基于形態學和傳統分子標記所推斷的種間親緣關系具有一定的一致性，進一步表明葉綠體基因組序列差異可以作為研究菱屬植物種間親緣關系的重要依據。同時，這些序列差異也為菱屬植物的物種鑒定提供了潛在的分子標記，通過檢測特定區域的序列變異，可以準確地區分不同的菱屬物種。4.2結構變異分析利用Mauve軟件對15種菱屬植物的葉綠體基因組進行多重比對，以檢測基因組的結構變異情況。結果顯示，菱屬植物葉綠體基因組整體上具有較高的共線性，表明它們在進化過程中保持了相對穩定的基因組結構。然而，在部分區域仍檢測到基因重排和倒位現象。在一些物種中，發現trnK-matK基因區域發生了基因重排。在菱（TrapabispinosaRoxb.）和烏菱（TrapabicornisOsbeck）中，trnK基因與matK基因的相對位置一致；但在細果野菱（TrapamaximowicziiKorsh.）中，trnK-matK基因區域發生了約1000bp的片段重排，matK基因的位置相對于trnK基因發生了改變。這種基因重排可能影響基因的表達調控，因為基因的相對位置改變可能導致其啟動子、增強子等調控元件與基因的相互作用發生變化，進而影響基因轉錄的起始和效率，最終對植物的生長發育產生影響。在rpl22-rps19基因間隔區，部分物種出現了倒位現象。例如，格菱（TrapapseudoincisaNakai）與其他多數菱屬物種相比，該區域發生了約800bp的倒位。倒位會改變基因的排列順序，可能使原本相鄰的基因在空間上分離，影響基因之間的協同表達。在植物進化過程中，基因的協同表達對于維持正常的生理功能至關重要，倒位導致的基因表達變化可能促使植物在形態、生理等方面發生適應性改變。基因重排和倒位等結構變異在菱屬植物的進化中具有重要意義。從進化角度來看，這些結構變異是基因組進化的重要驅動力之一。基因重排和倒位可以改變基因的表達模式，產生新的基因組合，為自然選擇提供更多的遺傳變異素材。在不同的生態環境中，具有特定結構變異的個體可能具有更好的適應性，從而在進化過程中被保留下來。在物種形成方面，結構變異可能導致生殖隔離的產生。當不同種群的植物發生基因重排或倒位后，染色體的結構和基因排列發生改變，在雜交過程中，可能會出現染色體配對異常、基因表達紊亂等問題，從而阻礙基因交流，促進新物種的形成。例如，在菱屬植物中，某些物種間的結構變異差異可能是它們在進化過程中逐漸分化的重要原因，使得它們在形態、生態習性等方面產生差異，最終形成不同的物種。本研究對菱屬植物葉綠體基因組結構變異的分析，為深入理解菱屬植物的進化歷程和種間親緣關系提供了重要線索。通過揭示基因重排和倒位等結構變異的發生及其影響，有助于進一步探究菱屬植物在進化過程中的遺傳機制和適應性變化。4.3共線性分析利用Mauve軟件對15種菱屬植物的葉綠體基因組進行共線性分析，以探究不同物種間基因組的相似性和進化關系。共線性是指不同物種染色體上同源基因以相同順序排列的現象，兩個物種之間的共線性程度可以作為衡量它們之間進化距離的尺度，進而推斷物種間的親緣關系。分析結果顯示，菱屬植物葉綠體基因組之間具有較高的共線性，表明它們在進化過程中保持了相對穩定的基因組結構。在共線性圖譜中，各物種的葉綠體基因組被劃分為多個共線性區塊，這些區塊之間以線條連接，清晰地展示了同源區域的對應關系。大多數菱屬植物的葉綠體基因組在基因排列順序和方向上具有高度一致性，這進一步支持了菱屬植物在進化上的親緣關系較近的觀點。然而，在部分區域仍檢測到一些細微的差異，這些差異主要表現為基因重排和倒位現象。例如，在細果野菱（TrapamaximowicziiKorsh.）與其他大果分支的物種相比，在trnK-matK基因區域和rpl22-rps19基因間隔區檢測到明顯的基因重排和倒位現象。這種基因重排和倒位可能是由于染色體的斷裂、重組等事件導致的，這些結構變異在物種進化過程中可能起到重要作用，如促進新基因的產生、改變基因的表達模式等。從共線性分析結果來看，親緣關系較近的物種，如菱（TrapabispinosaRoxb.）和烏菱（TrapabicornisOsbeck），它們的葉綠體基因組共線性程度更高，共線性區塊之間的差異更小；而親緣關系較遠的物種，如細果野菱與菱和烏菱相比，共線性程度相對較低，存在更多的基因重排和倒位現象。這表明葉綠體基因組的共線性程度與菱屬植物的種間親緣關系密切相關，共線性分析結果與基于形態學和傳統分子標記所推斷的種間親緣關系具有一定的一致性。共線性分析還能夠為菱屬植物的進化研究提供線索。通過比較不同物種葉綠體基因組的共線性關系，可以推斷出物種之間的進化分歧時間和進化路徑。例如，在共線性圖譜中，與其他物種共線性差異較大的物種，可能在進化過程中較早地發生了分化；而共線性程度較高的物種，則可能在較晚的時期才發生分化。本研究通過對菱屬植物葉綠體基因組的共線性分析，揭示了不同物種間基因組的相似性和差異，為進一步研究菱屬植物的種間親緣關系和進化歷程提供了重要依據。五、基于葉綠體基因組的種間親緣關系分析5.1系統發育樹構建為了深入探究菱屬植物的種間親緣關系，本研究分別采用最大似然法（ML）和貝葉斯法（BI），基于15種菱屬植物的葉綠體基因組全序列構建系統發育樹，同時選取千屈菜科的紫薇（LagerstroemiaindicaL.）作為外類群，以確定菱屬植物在進化樹中的相對位置。在最大似然法構建系統發育樹時，使用IQ-TREE軟件，選用GTR+I+G模型，設置自助抽樣（Bootstrap）重復次數為1000次。最終構建的最大似然樹拓撲結構清晰，各分支的支持率能夠直觀地反映出不同物種之間親緣關系的遠近。從樹的拓撲結構來看，菱屬植物明顯分為兩個主要分支，即小果分支和大果分支。小果分支僅包含細果野菱（TrapamaximowicziiKorsh.）和四角刻葉菱（TrapaincisaSieb.etZucc.var.quadricaudataGluck），且該分支位于系統進化樹的基部，這表明細果野菱和四角刻葉菱在菱屬植物的進化歷程中相對較為古老。大果分支則包含了其余的菱屬物種，在大果分支內部，各物種依據其果實外部形態特征和地理來源呈現出一定的聚類規律。例如，菱（TrapabispinosaRoxb.）和烏菱（TrapabicornisOsbeck）由于果實形態相似且地理分布存在一定重疊，在進化樹上緊密聚為一支，它們之間的分支支持率高達98%，這充分說明兩者的親緣關系非常近。而格菱（TrapapseudoincisaNakai）與其他大果分支物種在果實形態和地理分布上存在差異，在進化樹上形成了相對獨立的分支，其與相鄰分支的支持率為85%，表明它與其他大果分支物種的親緣關系相對較遠。利用貝葉斯法構建系統發育樹時，借助MrBayes軟件，設置4條馬爾可夫鏈，每條鏈運行1000萬代，每1000代抽樣一次，舍棄前25%的樣本作為“老化”樣本。構建的貝葉斯樹在拓撲結構上與最大似然樹具有高度的一致性，同樣清晰地劃分出小果分支和大果分支。小果分支中細果野菱和四角刻葉菱緊密相連，位于進化樹基部，這與最大似然樹的結果相互印證，進一步表明這兩個物種在菱屬進化中的特殊地位。在大果分支內，各物種的聚類情況也與最大似然樹基本相同。菱和烏菱依然緊密聚類，且貝葉斯分析得到的后驗概率為0.99，這表明兩者親緣關系密切的結論具有很高的可信度。格菱所在分支與其他大果分支物種的分化也在貝葉斯樹中得到了清晰體現，其后驗概率為0.90，進一步支持了其與其他大果分支物種親緣關系相對較遠的推斷。通過對兩種方法構建的系統發育樹的拓撲結構和分支支持率進行綜合分析，可以得出以下結論：基于葉綠體基因組數據構建的系統發育樹能夠準確地反映菱屬植物的種間親緣關系。小果分支和大果分支的劃分得到了兩種方法的一致支持，這表明這種分支結構是真實可靠的，反映了菱屬植物在進化過程中的分化情況。大果分支內部各物種依據果實形態和地理來源的聚類規律也在兩種方法構建的樹中得到了體現，進一步驗證了這些因素在菱屬植物種間親緣關系中的重要作用。同時，兩種方法得到的高分支支持率和后驗概率，也表明本研究構建的系統發育樹具有較高的可靠性和可信度，為深入研究菱屬植物的種間親緣關系和進化歷程提供了有力的證據。5.2親緣關系推斷與分析從基于最大似然法（ML）和貝葉斯法（BI）構建的系統發育樹來看，菱屬植物明顯分為小果分支和大果分支。小果分支僅包含細果野菱和四角刻葉菱，這表明它們在菱屬植物的進化歷程中處于相對基部的位置，可能是菱屬中較為古老的類群。從形態學上分析，細果野菱和四角刻葉菱的果實相對較小，與大果分支的物種存在明顯差異。這種形態上的差異在一定程度上反映了它們在進化過程中的分化。在地理分布上，細果野菱主要分布于黑龍江、吉林、遼寧、河北、河南、山東等地，四角刻葉菱主要分布于長江流域及以南地區。它們的分布區域相對較窄，且與大果分支物種的分布區域存在一定程度的隔離，這可能是導致它們獨立進化的重要因素之一。大果分支包含了其余的菱屬物種，在大果分支內部，各物種依據果實外部形態特征和地理來源呈現出一定的聚類規律。菱和烏菱在進化樹上緊密聚為一支，它們的果實形態相似，均具有兩個明顯的角，且在地理分布上，菱廣泛分布于全國各地的湖泊、河流等水域，烏菱主要分布于長江流域及其以南地區，兩者分布區域有部分重疊。這表明相似的果實形態和部分重疊的地理分布使得菱和烏菱具有較近的親緣關系。格菱在進化樹上形成了相對獨立的分支，其與其他大果分支物種在果實形態和地理分布上存在差異。格菱的果實具有4個較短的角，與菱和烏菱等物種的果實形態不同。在地理分布上，格菱主要分布于東北、華北及華東地區，與其他大果分支物種的分布區域有所不同。這種果實形態和地理分布的差異，使得格菱與其他大果分支物種的親緣關系相對較遠。丘角菱在系統發育樹中與其他一些大果分支物種聚類在一起。從形態學上看，丘角菱果實具4個角，兩角平伸，兩角向下彎曲，這種果實形態與部分大果分支物種有一定相似性。在地理分布上，丘角菱分布于東北、華北、華東、華中等地，與這些聚類在一起的物種在分布區域上有一定的重疊。這些形態和地理分布的因素，決定了丘角菱與這些物種具有較近的親緣關系。本研究基于葉綠體基因組數據構建的系統發育樹所推斷的菱屬植物種間親緣關系，與傳統基于形態學和少量分子標記的研究結果具有一定的一致性，但也存在一些差異。一致性體現在果實形態相似的物種在進化樹上往往聚在一起，說明果實形態仍然是判斷菱屬植物親緣關系的重要依據之一。差異之處在于，葉綠體基因組數據能夠提供更全面、準確的遺傳信息，揭示出一些傳統方法難以發現的親緣關系。例如，在以往基于形態學的研究中，可能由于某些物種形態特征的相似性，導致對它們親緣關系的判斷不夠準確，而葉綠體基因組分析能夠從遺傳層面更深入地揭示它們之間的真實關系。本研究通過對菱屬植物葉綠體基因組的分析，為菱屬植物種間親緣關系的研究提供了新的視角和更準確的證據，有助于進一步完善菱屬植物的分類和進化理論。5.3與傳統分類結果的比較將基于葉綠體基因組的親緣關系分析結果與傳統分類結果進行對比，發現兩者既有相同之處，也存在差異。在相同點方面，基于葉綠體基因組構建的系統發育樹中，大果分支和小果分支的劃分與傳統分類中依據果實大小對菱屬植物的分類具有一致性。傳統分類中，細果野菱和四角刻葉菱因果實相對較小被視為小果類型，在本研究的系統發育樹中，它們共同構成小果分支且位于基部。而其他果實較大的菱屬物種，如菱、烏菱、格菱等，在傳統分類和葉綠體基因組分析結果中，都屬于大果分支。這表明果實大小這一形態特征在菱屬植物的分類中具有重要的穩定性和可靠性，無論是傳統分類還是基于現代分子生物學技術的分類，都能反映出這一特征在種間親緣關系中的重要作用。在果實形態特征上，菱和烏菱在傳統分類中因果實均具兩個明顯的角且形態相似，被認為親緣關系較近。本研究基于葉綠體基因組的系統發育分析結果也顯示，菱和烏菱緊密聚為一支，兩者之間的分支支持率高達98%（最大似然法）和后驗概率為0.99（貝葉斯法）。這說明基于葉綠體基因組分析得到的親緣關系與傳統分類中依據果實形態判斷的親緣關系相符，進一步驗證了果實形態特征在菱屬植物分類中的有效性。然而，兩者也存在差異。傳統分類主要依據形態特征，而形態特征易受環境因素影響，存在一定的可塑性和變異性，導致分類結果存在一定的主觀性和不確定性。在某些菱屬植物中，由于環境差異，果實的大小、角的形狀等形態特征可能會發生變化，從而影響傳統分類的準確性。而葉綠體基因組分析基于遺傳信息，更加穩定和準確，能夠揭示一些傳統分類難以發現的親緣關系。例如，在傳統分類中，由于部分菱屬植物營養體相似，僅依據形態特征可能難以準確區分物種和判斷親緣關系。而基于葉綠體基因組的分析，通過比較基