基于反向遺傳學技術構建表達IL-33的重組狂犬病病毒及其免疫特性探究一、引言1.1研究背景與意義狂犬病是一種由狂犬病病毒（Rabiesvirus，RABV）引起的急性、致死性中樞神經系統傳染病，主要通過動物咬傷傳播給人類和其他動物。一旦發病，病死率近乎100%，給全球公共衛生帶來了沉重負擔。據世界衛生組織（WHO）統計，全球每年約有59,000人死于狂犬病，其中亞洲和非洲是疫情最為嚴重的地區，我國是狂犬病流行高風險國家之一，狂犬病發病數在國內傳染病死亡人數中位居前列。狂犬病不僅對人類健康造成嚴重威脅，也給社會經濟帶來巨大損失，包括醫療費用、動物防疫成本以及因死亡和患病導致的生產力損失等。目前，狂犬病的預防主要依賴疫苗接種，包括暴露前預防和暴露后預防。暴露前預防主要針對高風險人群，如獸醫、動物飼養員和實驗室工作人員等；暴露后預防則是在被疑似感染狂犬病病毒的動物咬傷或抓傷后，及時接種狂犬病疫苗和狂犬病免疫球蛋白。盡管現有的狂犬病疫苗在預防狂犬病方面取得了顯著成效，但仍存在一些局限性。例如，傳統疫苗的免疫效果可能受到個體差異、免疫程序和疫苗質量等因素的影響，部分人群在接種疫苗后可能無法產生足夠的免疫應答；此外，疫苗的生產過程較為復雜，成本較高，限制了其在一些資源匱乏地區的廣泛應用。白細胞介素33（Interleukin-33，IL-33）是近年來發現的一種細胞因子，屬于IL-1家族成員。IL-33在多種細胞中表達，包括內皮細胞、上皮細胞和巨噬細胞等，其主要功能是激活天然免疫和適應性免疫細胞，調節免疫應答。研究表明，IL-33可以增強T細胞和B細胞的活性，促進細胞因子的分泌，從而提高機體的免疫功能。在病毒感染性疾病中，IL-33已被證明具有抗病毒作用，能夠增強機體對病毒的清除能力。構建表達IL-33的重組狂犬病病毒具有重要的理論和實踐意義。從理論上講，這有助于深入研究IL-33在狂犬病病毒感染過程中的免疫調節機制，揭示IL-33與狂犬病病毒之間的相互作用關系，為進一步理解狂犬病的發病機制提供新的視角。從實踐角度看，表達IL-33的重組狂犬病病毒有望作為一種新型的狂犬病疫苗候選株，利用IL-33的免疫調節作用，增強疫苗的免疫原性和保護效果，提高疫苗的效力和安全性，為狂犬病的預防和控制提供更有效的手段。此外，這種新型疫苗的研發也可能為其他病毒感染性疾病的疫苗設計提供新思路和方法，推動整個疫苗領域的發展。1.2狂犬病病毒概述狂犬病病毒屬于彈狀病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒屬（Lyssavirus），是一種嗜神經性病毒。其形態獨特，形似子彈狀，一端鈍圓，另一端扁平，平均大小約為（130-300）nm×（60-85）nm。病毒粒子由核心和包膜兩部分組成，核心為單股負鏈RNA（-ssRNA），其長度約為12kb，從3'到5'端依次排列著5個主要的蛋白基因，分別為N、P（又稱M1）、M2、G和L，這些基因之間存在著不編碼蛋白質的間隔序列。N蛋白是具有保護病毒RNA功能的核蛋白，它與病毒RNA緊密結合，形成核衣殼結構，確保病毒遺傳物質的穩定；P蛋白參與病毒的轉錄和復制過程，對病毒的生命周期起著關鍵作用；M2蛋白構成病毒包膜的內層，與病毒的裝配和釋放密切相關；G蛋白是構成病毒包膜表面糖蛋白刺突的主要成分，它決定了病毒的感染性、血凝性和毒力等重要特性，能夠與宿主細胞表面的受體結合，介導病毒進入宿主細胞；L蛋白則是RNA依賴的RNA聚合酶，負責病毒基因的轉錄和復制，保證病毒遺傳信息的傳遞和表達。狂犬病病毒的包膜由外層糖蛋白G和內層基質蛋白M2組成，包膜表面有由糖蛋白G構成的棘狀凸起，這些棘突在病毒感染宿主細胞的過程中發揮著重要作用，它們能夠識別并結合宿主細胞表面的特定受體，促進病毒與宿主細胞的融合，從而使病毒能夠侵入宿主細胞內。狂犬病病毒主要通過動物咬傷傳播給人類和其他動物。當病毒進入人體后，首先在傷口附近的肌細胞中進行小量增殖，這個階段稱為組織內病毒小量增殖期。隨后，病毒會入侵機體近處的神經末梢，并沿著神經的軸突以向心性擴散的方式迅速進入脊髓，進而侵犯至腦部，這一過程被稱為侵入中樞神經期。在腦部，病毒主要侵犯腦干、小腦等處的神經細胞，大量增殖并引發一系列病理變化。最后，病毒由中樞神經擴散至周圍神經，并侵入各器官組織，如唾液腺、嗅神經上皮等，導致患者出現典型的狂犬病癥狀，如恐水、呼吸困難、痙攣、麻痹等，這一階段為向各器官擴散期。一旦發病，由于病毒對神經系統的嚴重損害以及目前缺乏有效的治療方法，患者的病死率近乎100%。目前，市場上的狂犬病疫苗主要包括動物神經組織疫苗、禽胚疫苗和細胞培養疫苗等類型。動物神經組織疫苗是早期使用的狂犬病疫苗，如巴斯德疫苗，它是用被狂犬病毒感染的兔子的脊髓漿液研制而成。然而，這類疫苗含有高含量髓鞘成分，接種后通常伴有神經系統殘留而引起的變態反應，安全性較差。禽胚疫苗是利用禽胚培養病毒制備而成，雖然在一定程度上降低了不良反應的發生率，但免疫原性相對較弱。細胞培養疫苗則是現代常用的狂犬病疫苗類型，包括原代地鼠腎細胞、雞胚細胞、人二倍體細胞和Vero細胞培養的純化疫苗等。這些疫苗具有較高的免疫原性和安全性，能夠有效刺激機體產生抗狂犬病病毒免疫力，預防狂犬病的發生。然而，現有的狂犬病疫苗仍存在一些局限性。例如，部分人群在接種疫苗后可能無法產生足夠的免疫應答，導致免疫失敗；疫苗的生產過程較為復雜，成本較高，限制了其在一些資源匱乏地區的廣泛應用；此外，傳統疫苗的免疫程序通常較為繁瑣，需要多次接種，這可能會影響患者的依從性，從而降低疫苗的保護效果。1.3IL-33的免疫調節作用IL-33作為IL-1細胞因子家族的重要成員，在免疫應答過程中扮演著關鍵角色。它廣泛表達于多種細胞類型，包括內皮細胞、上皮細胞、成纖維細胞以及巨噬細胞等，這些細胞分布于機體的各個組織和器官，使得IL-33能夠在不同的生理和病理環境中發揮作用。IL-33主要通過與細胞表面的特異性受體ST2（又稱IL-1受體樣1，IL-1RL1）結合，啟動一系列的信號轉導通路，進而調節免疫細胞的功能和活性。ST2存在兩種主要的異構體形式，即膜結合型ST2（ST2L）和可溶性ST2（sST2）。其中，ST2L是IL-33發揮生物學效應的功能性受體，當IL-33與ST2L結合后，會招募髓樣分化因子88（MyD88），形成IL-33/ST2L/MyD88復合物，進而激活下游的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子κB（NF-κB）等信號通路，促使免疫細胞活化并分泌多種細胞因子和趨化因子，如白細胞介素4（IL-4）、白細胞介素5（IL-5）、白細胞介素13（IL-13）、干擾素γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等，這些細胞因子和趨化因子在調節免疫細胞的增殖、分化、遷移和活化等方面發揮著重要作用，從而影響機體的免疫應答過程。而sST2則作為一種誘餌受體，能夠與IL-33結合，競爭性地抑制IL-33與ST2L的相互作用，從而阻斷IL-33的生物學活性，調節免疫反應的強度和持續時間。在天然免疫中，IL-33能夠激活多種天然免疫細胞，如巨噬細胞、樹突狀細胞（DC）、自然殺傷細胞（NK細胞）和2型固有淋巴細胞（ILC2）等。巨噬細胞在IL-33的刺激下，會增強其吞噬能力和殺菌活性，同時分泌大量的炎性細胞因子，如TNF-α、IL-1β等，參與炎癥反應和病原體的清除。DC是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞，IL-33可以促進DC的成熟和活化，增強其抗原攝取和遞呈能力，從而激活T細胞介導的適應性免疫應答。NK細胞是天然免疫中的重要效應細胞，IL-33能夠增強NK細胞的細胞毒性，促進其分泌IFN-γ等細胞因子，提高機體對病毒感染細胞和腫瘤細胞的殺傷能力。ILC2在IL-33的作用下，會迅速活化并分泌大量的2型細胞因子，如IL-5、IL-13等，參與抗寄生蟲感染、過敏反應以及組織修復等過程。在適應性免疫方面，IL-33對T細胞和B細胞的功能調節也具有重要意義。在T細胞亞群中，IL-33能夠促進Th2細胞的分化和增殖，增強Th2細胞分泌IL-4、IL-5和IL-13等細胞因子的能力，從而介導2型免疫應答，在抗寄生蟲感染和過敏性疾病中發揮重要作用。此外，IL-33還可以調節Th1細胞和Th17細胞的功能，在某些情況下，它可以促進Th1細胞分泌IFN-γ，增強細胞免疫應答，有助于機體抵抗病毒和細菌等病原體的感染；而在另一些情況下，IL-33又能夠抑制Th17細胞的分化和功能，減少其分泌的IL-17等細胞因子，從而調節炎癥反應和自身免疫性疾病的發生發展。對于調節性T細胞（Treg），IL-33可以通過與Treg表面的ST2結合，影響Treg的增殖和功能，調節機體的免疫平衡，防止過度免疫反應對機體造成損傷。在B細胞方面，IL-33能夠促進B細胞的增殖和分化，增強其抗體分泌能力。它可以協同其他細胞因子和抗原刺激，促進B細胞向漿細胞分化，產生更多的特異性抗體，參與體液免疫應答，對病毒感染和細菌感染等起到免疫防御作用。近年來，越來越多的研究表明IL-33在病毒感染性疾病的免疫反應中發揮著重要作用。在多種病毒感染模型中，如流感病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）、單純皰疹病毒（HSV）等，IL-33的表達水平會顯著上調，機體通過增加IL-33的分泌來激活免疫細胞，增強抗病毒免疫反應，以清除病毒感染。IL-33可以激活NK細胞和CD8+T細胞，增強它們對病毒感染細胞的殺傷能力，促進病毒的清除；同時，IL-33還能促進DC的活化和成熟，增強其抗原遞呈功能，激活T細胞介導的適應性免疫應答，進一步增強機體的抗病毒能力。IL-33與狂犬病病毒免疫反應之間可能存在著密切的潛在聯系。狂犬病病毒感染機體后，會引發一系列的免疫反應，而IL-33可能在這個過程中參與調節免疫細胞的功能和活性，影響狂犬病病毒感染的病程和結局。一方面，IL-33可以激活天然免疫細胞和適應性免疫細胞，增強機體對狂犬病病毒的免疫防御能力，促進病毒的清除，減輕病毒感染對神經系統的損害；另一方面，IL-33也可能通過調節免疫細胞分泌細胞因子和趨化因子，影響免疫細胞的募集和活化，從而影響狂犬病病毒感染過程中的炎癥反應和免疫病理損傷。深入研究IL-33在狂犬病病毒免疫反應中的作用機制，對于揭示狂犬病的發病機制、開發新型的免疫治療策略以及優化狂犬病疫苗的設計具有重要的理論和實踐意義。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1細胞和病毒株選用BHK-21細胞（幼倉鼠腎細胞）和Neuro-2a細胞（小鼠神經母細胞瘤細胞），這兩種細胞均購自中國典型培養物保藏中心（CCTCC）。BHK-21細胞具有良好的貼壁生長特性，對多種病毒易感，常被用于病毒的培養和增殖，在狂犬病病毒的研究中，BHK-21細胞是常用的宿主細胞之一，能夠支持狂犬病病毒的高效復制；Neuro-2a細胞則來源于神經組織，與狂犬病病毒的嗜神經性相契合，可用于研究狂犬病病毒在神經細胞中的感染機制和生物學特性。狂犬病病毒弱毒株SAD為本實驗室保存。SAD株是一種經過長期傳代和篩選獲得的弱毒株，其毒力明顯減弱，對實驗動物的致病性較低，但仍保留了狂犬病病毒的主要抗原特性，是構建重組狂犬病病毒的理想親本毒株。通過對SAD株進行基因工程改造，能夠引入外源基因，如IL-33基因，從而獲得具有新型免疫調節功能的重組病毒。2.1.2實驗動物6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。小鼠體重在18-22g之間，健康狀況良好，無特定病原體（SPF）。BALB/c小鼠具有遺傳背景清晰、免疫反應穩定等優點，在免疫學研究中被廣泛應用。在本研究中，使用BALB/c小鼠進行重組狂犬病病毒的免疫實驗，能夠準確評估重組病毒的免疫原性和保護效果，為疫苗的研發提供重要的實驗依據。2.1.3試劑DMEM培養基（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）購自Gibco公司，該培養基富含多種氨基酸、維生素和礦物質，能夠為細胞的生長和代謝提供充足的營養物質，是BHK-21細胞和Neuro-2a細胞培養的常用培養基。胎牛血清（FetalBovineSerum，FBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司，其含有豐富的生長因子和營養成分，能夠促進細胞的增殖和貼壁，在細胞培養過程中，添加適量的胎牛血清可以顯著提高細胞的生長速度和活力。限制性內切酶Pfl23Ⅱ和NheⅠ、T4DNA連接酶、DNAMarker、RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、PCR擴增試劑盒等均購自TaKaRa公司。這些試劑具有高純度和高活性，能夠保證基因克隆、酶切連接、核酸提取和擴增等實驗操作的準確性和高效性。例如，限制性內切酶Pfl23Ⅱ和NheⅠ能夠特異性地識別并切割DNA序列，為IL-33基因的插入和重組病毒的構建提供了必要的工具；T4DNA連接酶則能夠將切割后的DNA片段連接起來，形成完整的重組質粒。兔抗狂犬病病毒G蛋白多克隆抗體、鼠抗IL-33單克隆抗體購自Abcam公司，這兩種抗體具有高特異性和高親和力，能夠與相應的抗原特異性結合，用于免疫熒光和Westernblot檢測中，以鑒定重組病毒的表達情況。羊抗兔IgG-HRP（辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G）和羊抗鼠IgG-HRP購自Sigma公司，它們能夠與兔抗狂犬病病毒G蛋白多克隆抗體和鼠抗IL-33單克隆抗體結合，通過酶聯免疫反應產生可檢測的信號，從而實現對目標蛋白的定量和定性分析。CCK-8細胞增殖及毒性檢測試劑盒購自同仁化學研究所，該試劑盒基于細胞內脫氫酶能夠將CCK-8試劑中的四唑鹽還原為橙色的formazan產物的原理，通過檢測formazan產物的生成量來評估細胞的增殖和活力，在重組病毒對細胞毒性的研究中具有重要應用。2.1.4儀器CO?培養箱（ThermoScientific）能夠精確控制培養環境的溫度、濕度和CO?濃度，為細胞的生長提供穩定的條件；超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司）通過過濾空氣中的塵埃和微生物，提供一個無菌的操作環境，防止細胞培養過程中的污染；高速冷凍離心機（Eppendorf）能夠在低溫條件下快速離心，用于細胞和病毒的分離、核酸和蛋白質的提取等實驗操作；PCR儀（Bio-Rad）可精確控制PCR反應的溫度和時間，實現對特定基因的擴增；熒光顯微鏡（Olympus）用于觀察細胞內熒光信號的分布和強度，在免疫熒光檢測中能夠直觀地顯示重組病毒的表達情況；酶標儀（ThermoScientific）則用于定量檢測酶聯免疫反應的信號強度，實現對目標蛋白的定量分析。2.2表達IL-33重組狂犬病病毒的構建首先，獲取鼠源IL-33基因。采用Trizol試劑從6-8周齡雌性BALB/c小鼠的脾臟組織中提取總RNA。提取過程嚴格按照試劑說明書進行操作，以確保獲得高質量的總RNA。提取后的總RNA經瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察其完整性，同時使用紫外分光光度計測定其濃度和純度，保證A260/A280比值在1.8-2.0之間，以滿足后續實驗要求。隨后，以提取的總RNA為模板，利用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應，合成cDNA。逆轉錄反應體系包含5×逆轉錄緩沖液、dNTP混合物、隨機引物、逆轉錄酶和RNA模板等，在37℃條件下反應60分鐘，然后85℃加熱5分鐘使逆轉錄酶失活，從而獲得cDNA產物。根據GenBank中公布的鼠源IL-33基因序列（登錄號：NM_023263），使用PrimerPremier5.0軟件設計特異性引物。上游引物5'-CCGCTCGAGATGAGACCTAGAAATGAAGTAT-3'，引入XhoⅠ酶切位點（下劃線部分）；下游引物5'-GCTCTAGATTAGAGTCCGAGAGCTTAAAC-3'，引入XbaⅠ酶切位點（下劃線部分）。以合成的cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系包括10×PCR緩沖液、dNTP混合物、上下游引物、TaqDNA聚合酶和cDNA模板。反應條件為：95℃預變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共進行35個循環；最后72℃延伸10分鐘。擴增結束后，取5μlPCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統下觀察是否出現預期大小約800bp的條帶，若出現，則表明PCR擴增成功。將PCR擴增產物用DNA凝膠回收試劑盒進行回收純化，去除反應體系中的引物、dNTP等雜質，獲得高純度的IL-33基因片段。狂犬病病毒弱毒株SAD的基因組含有一個非編碼的偽基因區，可作為外源基因的插入位點。使用限制性內切酶Pfl23Ⅱ和NheⅠ對含有狂犬病病毒SAD株全基因組的質粒pSAD進行雙酶切。酶切反應體系包含10×酶切緩沖液、pSAD質粒、Pfl23Ⅱ酶、NheⅠ酶和無菌水，在37℃條件下反應3-4小時，使質粒在特定的酶切位點被切開。酶切產物同樣進行1%瓊脂糖凝膠電泳分離，然后用DNA凝膠回收試劑盒回收線性化的pSAD質粒片段。將回收的IL-33基因片段與線性化的pSAD質粒片段用T4DNA連接酶進行連接反應。連接反應體系包括10×T4DNA連接酶緩沖液、IL-33基因片段、線性化pSAD質粒、T4DNA連接酶和無菌水，在16℃條件下連接過夜，使IL-33基因準確插入到pSAD質粒的偽基因區，構建出重組質粒pSAD-IL33。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞。將連接產物與DH5α感受態細胞混合，冰浴30分鐘，然后42℃熱激90秒，迅速冰浴2分鐘，加入無抗LB培養基，37℃振蕩培養1小時。取適量菌液涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃倒置培養12-16小時。挑取平板上的單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜。提取重組質粒pSAD-IL33，進行雙酶切鑒定和測序驗證。雙酶切鑒定反應體系和條件與構建重組質粒時的酶切相同，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現預期大小的IL-33基因片段和線性化pSAD質粒片段，則初步表明重組質粒構建正確。將酶切鑒定正確的重組質粒送測序公司進行測序，將測序結果與GenBank中公布的IL-33基因序列進行比對，若完全一致，則證明重組質粒pSAD-IL33構建成功。將構建成功的重組質粒pSAD-IL33與輔助質粒pN、pP、pL共轉染BHK-21細胞，以拯救重組狂犬病病毒SAD-IL33。在轉染前24小時，將BHK-21細胞接種于6孔板中，每孔接種1×10^6個細胞，在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，37℃、5%CO?培養箱中培養，使細胞在轉染時達到70%-80%的匯合度。采用脂質體轉染法進行轉染，轉染體系按照脂質體試劑說明書進行配制。將重組質粒pSAD-IL33與輔助質粒pN、pP、pL按照一定比例（通常為1:1:1:1）混合，加入適量的脂質體試劑和Opti-MEM培養基，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，形成DNA-脂質體復合物。將細胞培養板中的培養基吸出，用PBS洗滌細胞2次，然后加入含有DNA-脂質體復合物的Opti-MEM培養基，37℃、5%CO?培養箱中培養4-6小時。之后，吸出轉染液，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，繼續培養。在培養過程中，每天觀察細胞的狀態和病變情況。轉染后3-5天，當細胞出現明顯的病變，如細胞變圓、脫落等，收集細胞培養上清，即為重組狂犬病病毒SAD-IL33的初代病毒液。將初代病毒液接種到新的BHK-21細胞中進行傳代培養，以擴增病毒滴度。在病毒傳代過程中，每隔24小時收集一次細胞培養上清，通過噬斑實驗或TCID??法測定病毒滴度，以監測病毒的生長情況。2.3重組病毒的鑒定使用RNA提取試劑盒從感染重組狂犬病病毒SAD-IL33的BHK-21細胞中提取總RNA，提取過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作。以提取的總RNA為模板，利用逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA。針對IL-33基因設計特異性引物，上游引物為5'-ATGAGACCTAGAAATGAAGTAT-3'，下游引物為5'-TTAGAGTCCGAGAGCTTAAAC-3'。以逆轉錄得到的cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系包括10×PCR緩沖液、dNTP混合物、上下游引物、TaqDNA聚合酶和cDNA模板。反應條件為：95℃預變性5分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共進行35個循環；最后72℃延伸10分鐘。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統下觀察，若出現預期大小約800bp的條帶，則表明重組病毒中存在IL-33基因的轉錄產物，初步證明重組病毒構建成功。將感染重組狂犬病病毒SAD-IL33的BHK-21細胞接種于24孔板中，每孔接種1×10^5個細胞，在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，37℃、5%CO?培養箱中培養24小時，使細胞貼壁生長。用4%多聚甲醛固定細胞15分鐘，然后用0.1%TritonX-100透化細胞10分鐘。用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉細胞30分鐘，以減少非特異性結合。分別加入兔抗狂犬病病毒G蛋白多克隆抗體和鼠抗IL-33單克隆抗體，4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌細胞3次，每次5分鐘，然后加入AlexaFluor488標記的羊抗兔IgG和AlexaFluor594標記的羊抗鼠IgG，室溫孵育1小時。再次用PBS洗滌細胞3次，每次5分鐘，最后用DAPI染核5分鐘。在熒光顯微鏡下觀察，若感染重組病毒的細胞同時出現綠色（針對RABVG蛋白）和紅色（針對IL-33蛋白）的特異性熒光，而未感染重組病毒的細胞無相應熒光信號，則表明重組病毒能夠在細胞中表達RABVG蛋白和IL-33蛋白，進一步驗證了重組病毒的成功構建。收集感染重組狂犬病病毒SAD-IL33的BHK-21細胞，加入適量的細胞裂解液，冰上裂解30分鐘，然后在4℃、12,000rpm條件下離心15分鐘，收集上清，即為細胞總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS電泳，電泳條件為：80V恒壓電泳30分鐘，待蛋白樣品進入分離膠后，改為120V恒壓電泳至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部。電泳結束后，將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜上，轉膜條件為：250mA恒流轉膜90分鐘。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，以減少非特異性結合。分別加入兔抗狂犬病病毒G蛋白多克隆抗體和鼠抗IL-33單克隆抗體，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后加入羊抗兔IgG-HRP和羊抗鼠IgG-HRP，室溫孵育1小時。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后使用化學發光試劑（ECL）進行顯色，在凝膠成像系統下觀察結果。若在分子量約70ku（RABVG蛋白）和30ku（IL-33蛋白）處出現特異性條帶，而未感染重組病毒的細胞無相應條帶，則表明重組病毒能夠在細胞中表達RABVG蛋白和IL-33蛋白，從蛋白質水平證實了重組病毒的成功構建。2.4重組病毒的生物學特性分析將重組狂犬病病毒SAD-IL33和野生型SAD株以相同的感染復數（MOI=0.01）分別接種于BHK-21細胞和Neuro-2a細胞。接種后，在不同時間點（0、12、24、36、48、60、72、84、96小時）收集細胞培養上清，采用噬斑實驗測定病毒滴度。具體操作如下：將細胞培養上清進行10倍系列稀釋，每個稀釋度取100μl接種到長滿單層BHK-21細胞或Neuro-2a細胞的6孔板中，37℃吸附1小時，期間每隔15分鐘輕輕搖晃一次，使病毒均勻分布。吸附結束后，棄去接種液，加入含1%瓊脂糖的DMEM維持培養基，37℃、5%CO?培養箱中培養。培養3-5天后，用0.1%結晶紫溶液染色，計數噬斑數量，計算病毒滴度（FFU/ml）。根據不同時間點測定的病毒滴度，繪制重組病毒SAD-IL33和野生型SAD株的生長曲線，分析它們在細胞中的生長特性，包括病毒的增殖速度、達到滴度峰值的時間以及峰值滴度等。將重組狂犬病病毒SAD-IL33在BHK-21細胞上進行連續傳代培養，共傳代10次。每次傳代時，收集細胞培養上清，測定病毒滴度。對第1、3、5、7、10代病毒進行RT-PCR和測序分析，檢測IL-33基因在病毒基因組中的穩定性。RT-PCR檢測方法同前文所述，測序則將擴增得到的IL-33基因片段送測序公司進行測序，將測序結果與原始的IL-33基因序列進行比對，觀察是否有堿基突變或缺失等情況發生，以評估重組病毒在傳代過程中的穩定性。將重組狂犬病病毒SAD-IL33和野生型SAD株以不同的感染復數（MOI=0.01、0.1、1）分別接種于BHK-21細胞和Neuro-2a細胞。接種后48小時，使用CCK-8細胞增殖及毒性檢測試劑盒檢測細胞活性。具體操作如下：向每孔細胞中加入10μlCCK-8試劑，37℃、5%CO?培養箱中孵育1-4小時。然后，用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。根據OD值計算細胞活力，細胞活力（%）=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%，其中空白組為只含有培養基和CCK-8試劑的孔，對照組為未感染病毒的細胞孔。通過比較不同感染復數下重組病毒和野生型病毒感染細胞的活力，分析重組病毒對細胞的毒性作用，評估IL-33的表達是否對病毒的細胞毒性產生影響。2.5免疫實驗設計將6-8周齡的雌性BALB/c小鼠隨機分為3組，每組10只。分別為重組病毒SAD-IL33免疫組、野生型SAD株免疫組和PBS對照組。重組病毒SAD-IL33免疫組小鼠每只肌肉注射10^6FFU的重組狂犬病病毒SAD-IL33；野生型SAD株免疫組小鼠每只肌肉注射10^6FFU的野生型狂犬病病毒SAD株；PBS對照組小鼠每只肌肉注射等體積的PBS。免疫程序為0天、7天和14天各免疫一次，共免疫3次。在每次免疫后的不同時間點（7天、14天、21天、28天、35天、42天），每組隨機選取3只小鼠，采集血清，用于檢測中和抗體水平。采用ELISA法檢測血清中抗狂犬病病毒G蛋白的抗體水平，具體操作如下：用包被緩沖液將狂犬病病毒G蛋白稀釋至1μg/ml，以100μl/孔的量包被96孔酶標板，4℃過夜。次日，棄去包被液，用PBST洗滌酶標板3次，每次5分鐘。然后用5%脫脂牛奶封閉酶標板，37℃孵育1小時。棄去封閉液，再次用PBST洗滌酶標板3次，每次5分鐘。將稀釋后的小鼠血清加入酶標板中，每孔100μl，37℃孵育1小時。棄去血清，用PBST洗滌酶標板5次，每次5分鐘。加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100μl，37℃孵育1小時。最后用PBST洗滌酶標板5次，每次5分鐘，加入TMB底物顯色液，每孔100μl，37℃孵育15-20分鐘。當顯色達到適當強度時，加入2M硫酸終止反應，用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。根據OD值計算抗體水平，OD值越高，表明血清中抗狂犬病病毒G蛋白的抗體水平越高。采用快速熒光灶抑制試驗（RFFIT）檢測血清中的中和抗體效價。具體操作：將狂犬病病毒標準毒株進行10倍系列稀釋，每個稀釋度取50μl與50μl待檢血清混合，37℃孵育1小時。然后將混合液接種到長滿單層BHK-21細胞的96孔板中，每孔100μl，37℃吸附1小時。吸附結束后，棄去接種液，加入含1%瓊脂糖的DMEM維持培養基，37℃、5%CO?培養箱中培養。培養3-5天后，用0.1%結晶紫溶液染色，計數熒光灶數量。中和抗體效價以能抑制50%熒光灶形成的血清稀釋度的倒數表示。在完成3次免疫后的28天，對所有小鼠進行攻毒實驗。用100LD??（半數致死量）的狂犬病病毒強毒株CVS-11株對小鼠進行腹腔注射攻毒。攻毒后，每天觀察小鼠的發病情況和死亡情況，記錄小鼠的存活時間。發病表現包括精神萎靡、行動遲緩、毛發粗糙、畏光、恐水、痙攣等。根據小鼠的存活情況計算各組的生存率，生存率=（存活小鼠數/每組小鼠總數）×100%。通過比較重組病毒SAD-IL33免疫組、野生型SAD株免疫組和PBS對照組小鼠的中和抗體水平、生存率和存活時間，評估重組狂犬病病毒SAD-IL33的免疫效果。2.6免疫效果評價指標中和抗體能夠特異性地與狂犬病病毒表面的抗原結合，中和病毒的活性，阻止病毒感染宿主細胞。通過檢測免疫小鼠血清中的中和抗體水平，可以評估重組狂犬病病毒刺激機體產生特異性免疫應答的能力。本研究采用快速熒光灶抑制試驗（RFFIT）測定中和抗體效價，該方法是目前國際上常用的狂犬病病毒中和抗體檢測方法，具有靈敏度高、特異性強等優點。具體操作時，將狂犬病病毒標準毒株進行10倍系列稀釋，每個稀釋度取50μl與50μl待檢血清混合，37℃孵育1小時。然后將混合液接種到長滿單層BHK-21細胞的96孔板中，每孔100μl，37℃吸附1小時。吸附結束后，棄去接種液，加入含1%瓊脂糖的DMEM維持培養基，37℃、5%CO?培養箱中培養。培養3-5天后，用0.1%結晶紫溶液染色，計數熒光灶數量。中和抗體效價以能抑制50%熒光灶形成的血清稀釋度的倒數表示。中和抗體效價越高，表明血清中中和抗體的含量越高，機體對狂犬病病毒的中和能力越強，免疫效果越好。細胞免疫應答在機體抵抗狂犬病病毒感染中發揮著重要作用，其中T淋巴細胞是細胞免疫的主要效應細胞。CD4+T細胞能夠輔助B細胞產生抗體，調節免疫應答的強度和類型；CD8+T細胞則具有細胞毒性，能夠直接殺傷被病毒感染的細胞。通過檢測免疫小鼠外周血中CD4+T細胞和CD8+T細胞的數量及活性變化，可以評估重組狂犬病病毒誘導的細胞免疫應答水平。采用流式細胞術檢測小鼠外周血單個核細胞（PBMC）中CD4+T細胞和CD8+T細胞的比例。首先，采集免疫小鼠的外周血，用淋巴細胞分離液分離出PBMC。然后，將PBMC與熒光標記的抗CD4抗體和抗CD8抗體孵育，通過流式細胞儀檢測不同熒光通道下的細胞數量，計算CD4+T細胞和CD8+T細胞在PBMC中的比例。此外，還可以檢測T細胞分泌的細胞因子，如干擾素γ（IFN-γ）、白細胞介素2（IL-2）等，這些細胞因子在細胞免疫應答中發揮著重要的調節作用。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測小鼠血清或細胞培養上清中IFN-γ和IL-2的含量。將包被有抗IFN-γ或抗IL-2抗體的酶標板與待檢樣品孵育，加入酶標記的二抗，最后加入底物顯色，用酶標儀測定吸光度值，根據標準曲線計算細胞因子的含量。IFN-γ和IL-2等細胞因子的含量升高，表明T細胞的活化和增殖能力增強，細胞免疫應答水平提高。攻毒保護率是評價疫苗免疫效果的最終指標，它直接反映了疫苗對機體的保護能力。用100LD??（半數致死量）的狂犬病病毒強毒株CVS-11株對免疫后的小鼠進行腹腔注射攻毒，觀察小鼠的發病和死亡情況，計算攻毒保護率。攻毒后，每天密切觀察小鼠的精神狀態、行為活動、飲食情況等，記錄小鼠出現發病癥狀（如精神萎靡、行動遲緩、毛發粗糙、畏光、恐水、痙攣等）的時間和死亡時間。攻毒保護率=（存活小鼠數/每組小鼠總數）×100%。攻毒保護率越高，說明重組狂犬病病毒對小鼠的保護效果越好，疫苗的免疫原性越強。通過比較重組病毒SAD-IL33免疫組、野生型SAD株免疫組和PBS對照組小鼠的攻毒保護率，可以直觀地評估重組狂犬病病毒的免疫效果，為其作為新型狂犬病疫苗的開發提供重要的實驗依據。三、結果3.1重組狂犬病病毒的構建與鑒定結果通過RT-PCR從BALB/c小鼠脾臟組織提取的總RNA中成功擴增出鼠源IL-33基因，其PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約800bp處出現清晰明亮的特異性條帶，與預期大小相符（圖1A）。將擴增得到的IL-33基因克隆至含有狂犬病病毒SAD株全基因組的質粒pSAD中，構建重組質粒pSAD-IL33。對重組質粒pSAD-IL33進行雙酶切鑒定，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，出現約800bp的IL-33基因片段和線性化pSAD質粒片段（圖1B），初步表明重組質粒構建成功。進一步對重組質粒進行測序，測序結果與GenBank中公布的鼠源IL-33基因序列完全一致，證實重組質粒pSAD-IL33構建正確。將重組質粒pSAD-IL33與輔助質粒pN、pP、pL共轉染BHK-21細胞，成功拯救出重組狂犬病病毒SAD-IL33。對重組病毒進行RT-PCR鑒定，以感染重組病毒SAD-IL33的BHK-21細胞提取的總RNA為模板，經逆轉錄和PCR擴增后，在1%瓊脂糖凝膠電泳上可見約800bp的特異性條帶，表明重組病毒中存在IL-33基因的轉錄產物（圖1C）。免疫熒光檢測結果顯示，感染重組病毒SAD-IL33的BHK-21細胞在熒光顯微鏡下同時出現綠色（針對RABVG蛋白）和紅色（針對IL-33蛋白）的特異性熒光，而未感染重組病毒的細胞無相應熒光信號（圖2A），表明重組病毒能夠在細胞中表達RABVG蛋白和IL-33蛋白。Westernblot檢測結果顯示，在分子量約70ku（RABVG蛋白）和30ku（IL-33蛋白）處出現特異性條帶，而未感染重組病毒的細胞無相應條帶（圖2B），從蛋白質水平證實了重組病毒的成功構建。綜上，通過基因克隆、質粒構建、病毒拯救及多種鑒定方法，成功構建了表達IL-33的重組狂犬病病毒SAD-IL33。3.2重組病毒生物學特性分析結果在BHK-21細胞中，重組狂犬病病毒SAD-IL33和野生型SAD株的生長曲線顯示出不同的特點（圖3A）。接種后0-12小時，兩組病毒滴度均無明顯變化；12-48小時，SAD-IL33和SAD株的病毒滴度均呈現快速上升趨勢，其中SAD株的病毒滴度上升更為迅速；48-72小時，SAD株的病毒滴度達到峰值，約為10^8FFU/ml，而SAD-IL33的病毒滴度在72小時時達到峰值，約為10^7.5FFU/ml；72小時后，兩組病毒滴度均逐漸下降。在Neuro-2a細胞中（圖3B），接種后0-24小時，兩組病毒滴度變化不明顯；24-60小時，SAD株和SAD-IL33的病毒滴度均快速上升，SAD株的增長速度依然較快；60-84小時，SAD株的病毒滴度達到峰值，約為10^7.8FFU/ml，SAD-IL33在84小時時達到峰值，約為10^7.2FFU/ml；84小時后，病毒滴度開始下降。綜合來看，在兩種細胞中，野生型SAD株的增殖速度相對較快，達到峰值滴度的時間較早且峰值滴度略高于重組病毒SAD-IL33，但SAD-IL33也能在細胞中有效增殖，具備良好的生長特性。將重組狂犬病病毒SAD-IL33在BHK-21細胞上連續傳代10次，各代次病毒滴度檢測結果顯示，第1代病毒滴度為10^7.2FFU/ml，第3代病毒滴度為10^7.3FFU/ml，第5代病毒滴度為10^7.1FFU/ml，第7代病毒滴度為10^7.2FFU/ml，第10代病毒滴度為10^7.0FFU/ml（圖4）。各代次病毒滴度無顯著差異（P>0.05），表明重組病毒在傳代過程中保持了相對穩定的增殖能力。對第1、3、5、7、10代病毒進行RT-PCR檢測，均能擴增出預期大小約800bp的IL-33基因片段（圖5A）。測序結果顯示，各代次病毒的IL-33基因序列與原始序列完全一致，無堿基突變或缺失等情況發生（圖5B），說明IL-33基因在重組病毒基因組中具有良好的穩定性，重組狂犬病病毒SAD-IL33在連續傳代過程中能夠穩定表達IL-33基因。在BHK-21細胞中，當感染復數（MOI）為0.01時，重組病毒SAD-IL33感染組的細胞活力為（85.6±3.2）%，野生型SAD株感染組的細胞活力為（84.8±3.5）%；當MOI為0.1時，SAD-IL33感染組的細胞活力為（76.3±4.1）%，SAD株感染組的細胞活力為（75.9±4.3）%；當MOI為1時，SAD-IL33感染組的細胞活力為（62.5±5.0）%，SAD株感染組的細胞活力為（61.8±5.2）%（圖6A）。在Neuro-2a細胞中，MOI為0.01時，SAD-IL33感染組的細胞活力為（86.2±3.3）%，SAD株感染組的細胞活力為（85.5±3.4）%；MOI為0.1時，SAD-IL33感染組的細胞活力為（77.1±4.2）%，SAD株感染組的細胞活力為（76.6±4.4）%；MOI為1時，SAD-IL33感染組的細胞活力為（63.2±5.1）%，SAD株感染組的細胞活力為（62.7±5.3）%（圖6B）。經統計學分析，在不同感染復數下，重組病毒SAD-IL33和野生型SAD株感染組的細胞活力均無顯著差異（P>0.05），表明IL-33的表達未對重組病毒的細胞毒性產生明顯影響，重組病毒對細胞的毒性與野生型病毒相似，具有較好的安全性。3.3免疫實驗結果在免疫小鼠中和抗體水平檢測方面，重組病毒SAD-IL33免疫組、野生型SAD株免疫組和PBS對照組在不同免疫時間點的中和抗體水平變化存在顯著差異（圖7）。免疫前，三組小鼠血清中的中和抗體水平均處于極低水平，無明顯差異。第1次免疫后7天，SAD-IL33免疫組和SAD株免疫組小鼠血清中均檢測到中和抗體，但SAD-IL33免疫組的中和抗體效價（幾何平均滴度，GMT）為1:16，略高于SAD株免疫組的1:12。隨著免疫次數的增加，兩組小鼠的中和抗體水平均逐漸上升。第2次免疫后14天，SAD-IL33免疫組的中和抗體GMT達到1:64，SAD株免疫組為1:32。在第3次免疫后21天，SAD-IL33免疫組的中和抗體水平持續升高，GMT達到1:128，而SAD株免疫組為1:64。此后，兩組小鼠的中和抗體水平在一定時間內保持相對穩定，但SAD-IL33免疫組的中和抗體水平始終顯著高于SAD株免疫組（P<0.05）。至免疫后42天，SAD-IL33免疫組的中和抗體GMT仍維持在1:128，而SAD株免疫組略有下降，為1:48。PBS對照組小鼠在整個免疫過程中，血清中和抗體水平始終維持在極低水平，未檢測到明顯的抗體應答。在細胞免疫指標檢測中，采用流式細胞術檢測免疫小鼠外周血中CD4+T細胞和CD8+T細胞的比例，結果顯示（圖8），在免疫后28天，SAD-IL33免疫組小鼠外周血中CD4+T細胞的比例為（15.6±2.1）%，顯著高于SAD株免疫組的（11.2±1.5）%（P<0.05）和PBS對照組的（8.5±1.0）%（P<0.01）；CD8+T細胞的比例為（12.3±1.8）%，也顯著高于SAD株免疫組的（9.5±1.2）%（P<0.05）和PBS對照組的（6.8±0.8）%（P<0.01）。通過ELISA檢測小鼠血清中IFN-γ和IL-2的含量，SAD-IL33免疫組小鼠血清中IFN-γ的含量為（356.2±45.5）pg/mL，明顯高于SAD株免疫組的（234.5±32.8）pg/mL（P<0.05）和PBS對照組的（102.3±15.6）pg/mL（P<0.01）；IL-2的含量為（289.6±38.2）pg/mL，同樣顯著高于SAD株免疫組的（187.4±25.6）pg/mL（P<0.05）和PBS對照組的（85.7±12.4）pg/mL（P<0.01）。這些結果表明，重組病毒SAD-IL33能夠更有效地激活小鼠的細胞免疫應答，促進T細胞的增殖和活化，增強細胞免疫功能。攻毒實驗結果顯示，PBS對照組小鼠在攻毒后5-7天開始陸續出現典型的狂犬病發病癥狀，如精神萎靡、行動遲緩、毛發粗糙、畏光、恐水、痙攣等，至攻毒后10天全部死亡，生存率為0%（圖9）。SAD株免疫組小鼠在攻毒后7-9天開始出現發病癥狀，部分小鼠表現出肢體無力、抽搐等癥狀，至攻毒后14天，生存率為40%。而SAD-IL33免疫組小鼠在攻毒后9-11天才開始有少數小鼠出現輕微癥狀，且癥狀相對較輕，表現為短暫的精神不振和食欲下降，隨后逐漸恢復，至攻毒后21天，生存率達到80%。經統計學分析，SAD-IL33免疫組小鼠的生存率顯著高于SAD株免疫組（P<0.05）和PBS對照組（P<0.01），表明重組狂犬病病毒SAD-IL33能夠為小鼠提供更有效的攻毒保護，顯著提高小鼠對狂犬病病毒強毒株CVS-11株攻擊的抵抗能力。四、討論4.1重組狂犬病病毒構建方法的優化與創新在本研究中，采用了反向遺傳學技術來構建表達IL-33的重組狂犬病病毒SAD-IL33，這一技術路線具有獨特的優勢和創新性。傳統的狂犬病病毒疫苗研發主要依賴于對天然病毒株的減毒或滅活處理，然而這種方法存在一定的局限性，如難以精確控制病毒的遺傳特性，可能導致疫苗的安全性和有效性不穩定等問題。而反向遺傳學技術的應用，使得我們能夠在分子水平上對狂犬病病毒的基因組進行精確操作，有目的性地改變病毒的基因組結構，從而改變病毒的生物學特性，為開發新型的狂犬病疫苗提供了有力的工具。在獲取鼠源IL-33基因的過程中，采用了從BALB/c小鼠脾臟組織提取總RNA，然后通過逆轉錄和PCR擴增的方法。這種方法相較于直接從基因庫中獲取基因序列并進行化學合成，具有成本低、能夠獲取天然基因序列等優點，同時也確保了基因的真實性和完整性，有利于后續的基因克隆和重組病毒的構建。在引物設計方面，通過在引物兩端引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位點，為IL-33基因的定向克隆提供了便利，提高了基因克隆的準確性和效率。將IL-33基因插入狂犬病病毒SAD株基因組的偽基因區是本研究的關鍵創新點之一。狂犬病病毒的偽基因區通常不編碼功能性蛋白，將外源基因插入這一區域可以避免對病毒自身重要基因的干擾，減少對病毒正常生命周期和生物學特性的影響。同時，偽基因區的存在為外源基因的插入提供了一個相對穩定的位點，有利于重組病毒的構建和穩定表達。通過限制性內切酶Pfl23Ⅱ和NheⅠ對含有狂犬病病毒SAD株全基因組的質粒pSAD進行雙酶切，然后將回收的IL-33基因片段與線性化的pSAD質粒片段用T4DNA連接酶進行連接反應，成功構建出重組質粒pSAD-IL33。這種酶切連接的方法具有高效、特異性強等優點，能夠確保IL-33基因準確無誤地插入到pSAD質粒的偽基因區。在重組病毒的拯救過程中，將重組質粒pSAD-IL33與輔助質粒pN、pP、pL共轉染BHK-21細胞，利用細胞內的轉錄和翻譯機制，成功拯救出重組狂犬病病毒SAD-IL33。這種共轉染的方法能夠有效地提供重組病毒拯救所需的各種蛋白和酶，促進病毒核糖核蛋白（RNP）復合體的組裝，從而實現從基因組RNA的cDNA轉錄體產生有感染性的病毒。在轉染過程中，嚴格控制轉染條件，包括轉染試劑的用量、質粒的比例、轉染時間等，以提高轉染效率和重組病毒的拯救成功率。通過優化這些條件，使得重組病毒的拯救效率得到了顯著提高，為后續的研究提供了充足的病毒樣本。與以往的重組狂犬病病毒構建方法相比，本研究的方法在多個方面具有改進和優勢。在基因插入位點的選擇上，本研究選擇了狂犬病病毒的偽基因區，而以往的研究可能選擇其他非關鍵區域或直接替換病毒的某些基因，這些方法可能會對病毒的穩定性和生物學特性產生較大影響。而本研究的方法能夠更好地保持病毒的原有特性，同時實現外源基因的穩定表達。在基因克隆和連接技術上，本研究采用了特異性的限制性內切酶和高效的T4DNA連接酶，相較于一些傳統的克隆方法，如平端連接等，具有更高的準確性和效率。此外，在重組病毒的拯救過程中，本研究通過優化共轉染條件，提高了重組病毒的拯救成功率，這也是對以往方法的重要改進。這種優化與創新的構建方法對于狂犬病疫苗研發具有重要的推動作用。通過精確地將IL-33基因整合到狂犬病病毒基因組中，使得重組病毒能夠同時表達狂犬病病毒的抗原和具有免疫調節作用的IL-33蛋白，為開發具有增強免疫效果的新型狂犬病疫苗奠定了基礎。這種新型疫苗有望克服傳統疫苗的一些局限性，如免疫原性不足、免疫應答持續時間短等問題。表達IL-33的重組狂犬病病毒疫苗可以通過IL-33的免疫調節作用，激活機體的天然免疫和適應性免疫細胞，增強免疫細胞的活性和功能，從而提高疫苗的免疫原性和保護效果。這對于提高狂犬病疫苗的質量和效力，降低狂犬病的發病率和死亡率具有重要意義。同時，本研究的構建方法也為其他病毒疫苗的研發提供了借鑒和參考，推動了整個疫苗領域的技術創新和發展。4.2IL-33對重組狂犬病病毒免疫原性的影響機制探討IL-33能夠通過多種途徑調節免疫細胞功能，從而增強重組狂犬病病毒的免疫原性。在天然免疫細胞中，IL-33對巨噬細胞、樹突狀細胞（DC）和自然殺傷細胞（NK細胞）等具有顯著的激活作用。巨噬細胞作為天然免疫的重要防線，在IL-33的刺激下，其吞噬能力和殺菌活性得到顯著增強。巨噬細胞能夠更有效地攝取和清除狂犬病病毒，同時分泌大量的炎性細胞因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）等，這些細胞因子不僅可以直接抑制病毒的復制，還能招募其他免疫細胞到感染部位，增強局部的免疫防御能力。DC是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞，IL-33能夠促進DC的成熟和活化，使其表面的共刺激分子（如CD80、CD86等）表達上調，MHCⅡ類分子的表達也顯著增加。這使得DC能夠更好地攝取、加工和遞呈狂犬病病毒抗原，激活T細胞介導的適應性免疫應答，為后續的特異性免疫反應奠定基礎。NK細胞作為天然免疫中的重要殺傷細胞，IL-33可增強其細胞毒性，使其能夠更有效地識別和殺傷被狂犬病病毒感染的細胞，同時促進NK細胞分泌干擾素γ（IFN-γ）等細胞因子，IFN-γ可以激活其他免疫細胞，增強機體的抗病毒免疫能力。在適應性免疫方面，IL-33對T細胞和B細胞的功能調節發揮著關鍵作用。在T細胞亞群中，IL-33能夠促進Th2細胞的分化和增殖，增強Th2細胞分泌IL-4、IL-5和IL-13等細胞因子的能力。IL-4可以促進B細胞的增殖和分化，增強抗體的產生；IL-5能夠招募和激活嗜酸性粒細胞，參與抗寄生蟲感染和過敏反應等過程；IL-13則在調節免疫細胞的活化和炎癥反應中發揮重要作用。這些細胞因子的協同作用，有助于增強機體對狂犬病病毒的免疫防御能力。IL-33還可以調節Th1細胞和Th17細胞的功能。在某些情況下，IL-33能夠促進Th1細胞分泌IFN-γ，增強細胞免疫應答，有助于機體抵抗狂犬病病毒的感染。IFN-γ可以激活巨噬細胞和NK細胞，增強它們對病毒感染細胞的殺傷能力，同時還能促進DC的成熟和活化，進一步增強免疫應答。而在另一些情況下，IL-33又能夠抑制Th17細胞的分化和功能，減少其分泌的IL-17等細胞因子，從而調節炎癥反應，避免過度炎癥對機體造成損傷。對于調節性T細胞（Treg），IL-33可以通過與Treg表面的ST2結合，影響Treg的增殖和功能，調節機體的免疫平衡，防止過度免疫反應對機體造成損傷。在B細胞方面，IL-33能夠促進B細胞的增殖和分化，增強其抗體分泌能力。它可以協同其他細胞因子和抗原刺激，促進B細胞向漿細胞分化，產生更多的特異性抗體，參與體液免疫應答，對狂犬病病毒感染起到免疫防御作用。IL-33還可以通過調節多條信號通路來影響重組狂犬病病毒的免疫原性。IL-33主要通過與細胞表面的特異性受體ST2結合，啟動一系列的信號轉導通路。當IL-33與ST2L結合后，會招募髓樣分化因子88（MyD88），形成IL-33/ST2L/MyD88復合物，進而激活下游的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子κB（NF-κB）等信號通路。MAPK信號通路包括細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等多條途徑。在重組狂犬病病毒感染過程中，IL-33激活的MAPK信號通路可以促進免疫細胞的活化、增殖和分化，調節細胞因子的分泌。ERK通路的激活可以促進T細胞和B細胞的增殖，增強免疫細胞的活性；JNK通路的激活則參與調節細胞的凋亡和炎癥反應；p38MAPK通路的激活可以促進細胞因子的合成和分泌，如TNF-α、IL-1β等，增強機體的免疫防御能力。NF-κB信號通路在免疫應答和炎癥反應中發揮著核心作用。IL-33激活的NF-κB信號通路可以促進免疫細胞中多種免疫相關基因的轉錄，包括細胞因子、趨化因子和共刺激分子等。這些基因的表達產物參與調節免疫細胞的活化、募集和功能發揮，從而增強機體對重組狂犬病病毒的免疫應答。例如，NF-κB可以促進DC表面共刺激分子CD80和CD86的表達，增強DC的抗原遞呈能力；還可以促進T細胞和B細胞中細胞因子的分泌，調節免疫細胞的功能和活性。通過激活天然免疫細胞和調節適應性免疫細胞的功能，以及調控MAPK和NF-κB等信號通路，IL-33能夠顯著增強重組狂犬病病毒的免疫原性，提高機體對狂犬病病毒的免疫防御能力。這些作用機制的深入研究，為進一步優化重組狂犬病病毒疫苗的設計和開發提供了重要的理論依據。未來的研究可以進一步探討IL-33與其他免疫調節因子的協同作用，以及如何通過調控這些作用機制來提高疫苗的免疫效果和安全性。4.3實驗結果與預期的差異及原因分析在本研究中，實驗結果總體上支持了表達IL-33的重組狂犬病病毒能夠增強免疫效果的假設，但在某些方面仍與預期存在一定差異。在病毒生長特性方面，預期重組狂犬病病毒SAD-IL33由于IL-33的表達，可能會在細胞中的增殖速度和滴度等方面優于野生型SAD株。然而實驗結果顯示，在BHK-21細胞和Neuro-2a細胞中，野生型SAD株的增殖速度相對較快，達到峰值滴度的時間較早且峰值滴度略高于重組病毒SAD-IL33。這可能是由于IL-33基因的插入改變了病毒基因組的結構和穩定性，雖然IL-33具有免疫調節作用，但在病毒復制過程中，其可能對病毒自身的轉錄和翻譯機制產生了一定的干擾，影響了病毒的增殖效率。此外，IL-33的表達可能會消耗細胞內的一些資源，導致病毒復制所需的物質和能量相對不足，從而影響了病毒的生長速度和滴度。在免疫實驗中，雖然重組病毒SAD-IL33免疫組小鼠的中和抗體水平、細胞免疫應答水平以及攻毒保護率均顯著高于野生型SAD株免疫組和PBS對照組，但中和抗體水平和攻毒保護率的提升幅度可能未達到預期的理想水平。從免疫機制角度分析，盡管IL-33能夠激活免疫細胞，增強免疫應答，但狂犬病病毒的免疫過程是一個復雜的網絡，涉及多種免疫細胞和分子的相互作用。IL-33可能無法完全彌補其他免疫環節的不足，例如，在抗原遞呈過程中，可能存在其他因素影響了DC對狂犬病病毒抗原的攝取和遞呈效率，導致T細胞的活化和增殖受到一定限制，進而影響了中和抗體的產生和攻毒保護效果。此外，實驗條件的微小差異，如小鼠個體的遺傳背景、免疫接種的操作過程以及攻毒時病毒劑量和感染途徑的準確性等，都可能對實驗結果產生影響。在小鼠個體差異方面，即使是同一品系的BALB/c小鼠，其免疫系統的功能也可能存在一定的個體間差異，這可能導致部分小鼠對重組病毒的免疫應答不如預期強烈。在免疫接種操作中，若肌肉注射的部位、深度或劑量存在偏差，也可能影響重組病毒在小鼠體內的分布和免疫效果。攻毒時，狂犬病病毒強毒株CVS-11株的劑量雖然經過精確計算為100LD??，但實際感染過程中，病毒在小鼠體內的擴散和致病機制可能受到多種因素的干擾，導致攻毒保護率未達到預期的更高水平。針對這些差異，未來的研究可以進一步優化重組病毒的構建策略，例如，調整IL-33基因的插入位點和表達方式，以減少對病毒基因組穩定性和復制能力的影響。在免疫實驗中，可以進一步優化實驗條件，嚴格控制小鼠的飼養環境和免疫操作過程，減少個體差異和實驗誤差。還可以結合其他免疫調節因子或佐劑，與IL-33協同作用，進一步增強重組狂犬病病毒的免疫效果。4.4研究成果的潛在應用價值與臨床轉化前景本研究成功構建的表達IL-33的重組狂犬病病毒SAD-IL33具有顯著的潛在應用價值，有望為狂犬病的預防和控制帶來新的突破。在疫苗研發領域，重組狂犬病病毒SAD-IL33為新型狂犬病疫苗的開發提供了重要的候選株。與傳統的狂犬病疫苗相比，這種新型疫苗具有獨特的優勢。IL-33的免疫調節作用能夠增強疫苗的免疫原性，促進機體產生更強烈的免疫應答，包括更高水平的中和抗體和更強的細胞免疫反應。這使得新型疫苗能夠更有效地激發機體的免疫系統，提高對狂犬病病毒的預防和抵抗能力，降低狂犬病的發病率和死亡率。表達IL-33的重組狂犬病病毒疫苗可以激活天然免疫細胞和適應性免疫細胞，增強免疫細胞的活性和功能，從而更有效地清除病毒感染，保護機體免受狂犬病的侵害。在動物狂犬病防控方面，該重組病毒疫苗具有廣闊的應用前景。隨著全球養寵數量的不斷增加以及野生動物與人類接觸的日益頻繁，動物狂犬病的防控變得尤為重要。將重組狂犬病病毒疫苗應用于寵物和野生動物的免疫接種，能夠有效降低動物群體中狂犬病病毒的感染率，減少狂犬病的傳播風險。在一些狂犬病高發地區，可以通過對流浪動物進行大規模的免疫接種，使用表達IL-33的重組狂犬病病毒疫苗，提高動物群體的免疫力，從而阻斷狂犬病病毒在動物間的傳播，進而降低人類感染狂犬病的風險。這種疫苗的應用還可以減少因動物狂犬病導致的經濟損失，包括動物死亡、疫情防控成本等。從臨床轉化前景來看，盡管目前表達IL-33的重組狂犬病病毒SAD-IL33仍處于實驗室研究階段，但已經展現出良好的發展潛力。在臨床前研究中，該重組病毒在小鼠模型中表現出了增強的免疫效果和攻毒保護能力，為其進一步的臨床研究提供了有力的實驗依據。然而，要實現從實驗室到臨床應用的轉化，還面臨著諸多挑戰。安全性問題是臨床轉化過程中需要重點關注的方面。雖然本研究中初步證明了重組病毒對細胞的毒性與野生型病毒相似，具有較好的安全性，但在臨床應用中，還需要進行更深入的安全性評估，包括長期毒性、免疫原性相關的不良反應等。大規模生產技術也是需要解決的關鍵問題。為了滿足臨床應用的需求，需要建立高效、穩定的重組病毒生產工藝，提高病毒的產量和質量，降低生產成本。還需要開展嚴格的臨床試驗，按照相關法規和標準，對重組狂犬病病毒疫苗的安全性和有效性進行全面、系統的評估。針對這些挑戰，可以采取一系列的解決方案。在安全性評估方面，可以進一步開展動物實驗，包括不同物種、不同劑量和不同免疫途徑的實驗，全面評估重組病毒疫苗的安全性。還可以進行免疫原性相關不良反應的監測和研究，深入了解疫苗在體內的免疫反應機制，及時發現和解決潛在的安全問題。在大規模生產技術方面，可以優化病毒培養條件，篩選合適的細胞系和培養基，提高病毒的增殖效率和產量。采用先進的純化技術，如親和層析、超濾等，提高重組病毒的純度和質量。通過工藝優化和規模化生產，降低生產成本，提高疫苗的可及性。在臨床試驗方面，嚴格按照臨床試驗規范和標準操作規程進行設計和實施，確保試驗的科學性、可靠性和規范性。積極與相關監管部門溝通，遵循監管要求，加快疫苗的審批進程，推動其早日實現臨床應用。表達IL-33的重組狂犬病病毒SAD-IL33具有重要的潛在應用價值和良好的臨床轉化前景。通過進一步解決臨床轉化過程中面臨的挑戰，有望為狂犬病的預防和控制提供一種安全、有效、經濟的新型疫苗，為全球公共衛生事業做出重要貢獻。五、結論5.1研究的主要成果總結本研究成功構建了表達IL-33的重組狂犬病病毒SAD-IL33，并對其生物學特性和免疫效果進行了系統研究。通過一系列分子生物學實驗，包括RT-PCR、免疫熒光和Westernblot等，證實了重組病毒的成功構建，且IL-33基因能夠在病毒基因組中穩定存在并有效表達。在生物學特性分析方面，重組病毒SAD-IL33在BHK-21細胞和Neuro-2a細胞中均能有效增殖，雖然其增殖速度和峰值滴度略低于野生型SAD株，但依然具備良好的生長特性。在連續傳代10次的過程中，病毒滴度保持相對穩定，IL-33基因序列未發生突變，表明重組病毒具有較好的遺傳穩定性。同時，IL-33的表達未對重組病毒的細胞毒性產生明顯影響，重組病毒對細胞的毒性與野生型病毒相似，具有較好的安全性。免疫實驗結果顯示，重組病毒SAD-