Q/LB.□XXXXX-XXXXDB43/TXXXX—XXXX目次TOC\o"1-1"\h前言 II1范圍 12規范性引用文件 13術語和定義 14原理 15試劑和材料 26儀器和設備 27分析步驟 28結果計算及表示 39精密度 410其他 4附錄A 5前言本本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由湖南省市場監督管理局提出。本文件由湖南省食品標準化技術委員會歸口。本文件起草單位：湖南英氏營養食品有限公司、中南林業科技大學。本文件主要起草人:本文件為首次發布。粉狀食品中總肽含量的測定范圍本文件規定了粉狀食品中總肽含量測定的原理、試劑和材料、儀器和設備、分析步驟、結果計算和表示、精密度、檢出限和定量限等內容。本文件適用于粉狀食品中總肽含量的測定。規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB6682分析實驗室用水規格和試驗方法。術語和定義下列術語和定義適用于本文件。粉狀食品powderedfoods粉狀食品是指含有天然肽的粉末狀食品，以及利用動（植）物蛋白質為原料，通過酶解或者微生物發酵法加工后得到分子量小于6,000道爾頓降解肽的粉末狀食品。總肽含量totalcontentofpeptide粉狀食品中肽類物質的總量，以占試樣的質量分數來表示。原理利用中性磷酸鹽緩沖液超聲輔助法提取樣品中的可溶性蛋白質和多肽，酸沉法去除提取液中的蛋白質，通過雙縮脲試劑與酰胺鍵的顯色反應，采用紫外-可見光吸收光譜儀和標準曲線法測定樣品中總肽的含量。酸沉酸沉是利用調整溶液的pH值使蛋白質的溶解度降低，從而促使蛋白質從溶液中沉淀出來的過程。雙縮脲比色法在強堿性條件下，酰胺鍵與硫酸銅生成紫紅色絡合物，其吸光度與酰胺鍵的數量成正比，通過紫外-可見光吸收光譜分析法測定540nm波長下的吸光度值，計算總肽的含量。試劑和材料除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規定的一級水。試劑三氯乙酸（CCl3COOH）。氫氧化鈉（NaOH）。硫酸銅（CuSO4·5H2O）。酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6·4H2O）。磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）。磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）。牛血清白蛋白標準品（BSA）：純度≥99%。注：BSA濃度為1.0mg/ml時在280nm波長下的吸光度值為0.66來校正其純度。溶液配制10%氫氧化鈉溶液：準確稱取50.00g氫氧化鈉(5.1.2)，置入500mL容量瓶中，加煮沸后冷卻至室溫的水溶解，后定容至刻度。雙縮脲試劑：稱取1.5g硫酸銅(5.1.3)、6.0g酒石酸鉀鈉(5.1.4)，置入1,000mL燒杯中，加入500mL水溶解，在玻璃棒攪拌下緩慢加入300mL10%氫氧化鈉溶液（5.2.1），轉移至1000mL容量瓶中，加水定容至刻度，貯存于聚乙烯瓶中。三氯乙酸溶液（150g/L）：稱取150g三氯乙酸(5.1.1)，置入1,000mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度。磷酸鹽緩沖液（20mmol/L，pH=7.0）：準確稱取3.12g的磷酸二氫鈉（5.1.5）和7.16g的磷酸氫二鈉（5.1.6），分別置入1,000mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，得到0.2mol/L的磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉母液。分別量取39mL的磷酸二氫鈉和61mL的磷酸氫二鈉母液置入1,000mL容量瓶中，混勻，加水定容至刻度，即得到20mmol/L的磷酸緩沖液（pH=7.0））。牛血清白蛋白標準儲備液（10mg/mL）：準確稱取1.0g牛血清白蛋白標準品（5.1.7）（精確至0.0001g），置入100mL容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液（5.2.4）溶解并定容至刻度，4℃保存，有效期1個月。儀器和設備紫外-可見光吸收光譜儀（波長范圍190～900nm，配備1cm比色皿）。高速冷凍離心機（≥10,000r/min）。分析天平（感量0.0001g）。超聲波清洗器。渦旋振蕩器。分析步驟試樣溶液的制備提取準確稱取1.0g樣品（精確至0.0001g），置入25mL塑料離心管中，加入10mL磷酸鹽緩沖液（5.2.4），放入超聲波清洗器超聲提取15min，靜置10min，后10,000r/min離心10min，取上清液，即為可溶性蛋白質和多肽提取液。酸沉吸取5mL可溶性蛋白質和多肽提取液（7.1.1），置入15mL塑料離心管中，加入2.5mL三氯乙酸溶液（5.2.3），渦旋振蕩5min，靜置10min，后10,000r/min離心10min，取上清液，即為試樣溶液，備用。總肽含量測定牛血清白蛋白標準溶液的配制分別吸取2.0、4.0、6.0、8.0、和10mL的牛血清白蛋白標準儲備液（5.2.5），置入10mL容量瓶中，再用磷酸鹽緩沖液（5.2.4）稀釋至刻度，即得濃度為2.0～10.0mg/mL系列牛血清白蛋白標準溶液（每個濃度配制3份標準溶液）。標準曲線的繪制分別吸取2.0mL系列蛋白質標準溶液（7.2.1），置入15mL塑料離心管中，加入8.0mL雙縮脲試劑（5.2.2），混勻后室溫靜置20min進行顯色反應，吸取3.0mL反應后溶液移入1cm比色皿中，測定540nm波長處吸光度，用磷酸鹽緩沖液（5.2.4）代替蛋白質溶液作為空白對照液。每份標準溶液測定2次求平均值，以牛血清白蛋白標準溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線、計算線性方程和相關系數（示例見附錄A）。樣品測定吸取2.0mL試樣溶液（7.1.2），置入15mL塑料離心管中，加入8.0mL雙縮脲試劑（5.2.2），混勻后室溫靜置20min進行顯色反應，吸取3.0mL反應后溶液移入1cm比色皿中，測定540nm波長處吸光度，根據線性方程計算總肽含量結果計算和表示結果計算試樣中總肽含量以質量分數X計，數值以克每百克（g/100g）表示，結果按式（1）計算（1）式中：X———總肽含量（g/100g）；C———標準曲線計算的肽濃度（mg/mL）；V———試樣最終定容體積（mL）；M———試樣質量（g）。結果表示。測定結果用平行測定的算術平均值表示,當總肽含量大于或等于1.0g/100g時,結果保留兩位小數，當總肽含量小于1.0g/100g時,結果保留兩位有效數字。精密度精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。其他當試樣稱重量為