“別敏”及有效成分對(duì)呼吸道變態(tài)反應(yīng)免疫調(diào)節(jié)作用解析一、引言1.1研究背景與意義呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病，作為一類常見的慢性炎癥性疾病，近年來(lái)其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈顯著上升趨勢(shì)。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，過(guò)敏性疾病已經(jīng)或者正在影響30%-40%的人群，預(yù)計(jì)到2050年，這一比例可能擴(kuò)大至50%，已然成為全球性的健康問(wèn)題。其中，以過(guò)敏性哮喘、過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性結(jié)膜炎等為代表的呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病，對(duì)人們的生活質(zhì)量和身體健康造成了嚴(yán)重影響。以過(guò)敏性鼻炎為例，它是一種由環(huán)境中變應(yīng)原激發(fā)、通過(guò)IgE介導(dǎo)的鼻黏膜炎性疾病，主要臨床表現(xiàn)為鼻癢、噴嚏、流涕或鼻塞等癥狀。據(jù)相關(guān)研究表明，大約有10%~30%的兒童罹患過(guò)敏性鼻炎，且該疾病不僅會(huì)對(duì)患兒的日常生活、學(xué)習(xí)和社交產(chǎn)生負(fù)面影響，還可能與多種精神障礙共患，如注意缺陷多動(dòng)障礙、抑郁癥等。而變態(tài)反應(yīng)性支氣管哮喘同樣是一種較為頑固的疾病，可伴隨終身，患者會(huì)出現(xiàn)喘息、氣急、咳嗽、胸悶、呼吸困難等癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和身體健康，對(duì)兒童和老年人等特殊人群的危害尤為顯著。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病的治療方面取得了一定進(jìn)展，如鼻噴激素作為過(guò)敏性鼻炎的一線用藥，在控制癥狀方面具有一定效果，但這些治療方法往往存在局限性和副作用。長(zhǎng)期使用激素可能會(huì)導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)，如生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、骨質(zhì)疏松等，給患者帶來(lái)了新的健康隱患。因此，尋找一種安全、有效的治療方法成為了醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。中醫(yī)藥在治療變態(tài)反應(yīng)性疾病方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)認(rèn)為，體質(zhì)在變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸中起著重要作用，通過(guò)調(diào)節(jié)體質(zhì)可以改善患者的過(guò)敏狀態(tài)，達(dá)到治療疾病的目的?！皠e敏”作為一種純天然植物藥，其研發(fā)基于傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論和現(xiàn)代高科技制藥技術(shù)，蘊(yùn)含多種中草藥提取的有效成分，如生地、黃芩、黃芪、防風(fēng)等。已有研究表明，“別敏”膠囊的有效成分具有抗過(guò)敏及抗炎作用，能抑制炎性細(xì)胞脫顆粒和拮抗炎性介質(zhì)，顯著降低和清除血清過(guò)敏抗體IgE，并有加強(qiáng)機(jī)體穩(wěn)態(tài)的作用，能提高機(jī)體對(duì)過(guò)敏原的耐受能力和對(duì)變態(tài)反應(yīng)的調(diào)控能力。對(duì)“別敏”及有效成分在呼吸道變態(tài)反應(yīng)免疫調(diào)節(jié)作用方面進(jìn)行深入研究，不僅有助于揭示其作用機(jī)制，為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)，還能為中醫(yī)藥防治呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病開辟新的途徑，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病的研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了一系列重要成果。國(guó)外方面，對(duì)于呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病的發(fā)病機(jī)制研究較為深入。以過(guò)敏性哮喘為例，研究發(fā)現(xiàn)2型炎癥是其發(fā)病的重要分子機(jī)制，這一過(guò)程涉及多種細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞的參與。如白細(xì)胞介素13（IL-13）可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞中的粘液分泌和杯狀細(xì)胞增生，進(jìn)而導(dǎo)致氣道狹窄和呼吸困難。在治療手段上，國(guó)外除了使用傳統(tǒng)的糖皮質(zhì)激素、β2受體激動(dòng)劑等藥物外，還在積極探索生物制劑等新型治療方法。奧馬珠單抗作為一種抗IgE單克隆抗體，已被廣泛應(yīng)用于中重度過(guò)敏性哮喘的治療，通過(guò)阻斷IgE與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面受體的結(jié)合，減少炎癥介質(zhì)的釋放，從而有效控制哮喘癥狀。國(guó)內(nèi)學(xué)者在呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病的研究中也做出了重要貢獻(xiàn)。在發(fā)病機(jī)制方面，從中醫(yī)理論角度出發(fā)，認(rèn)為體質(zhì)在呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸中起著關(guān)鍵作用。國(guó)醫(yī)大師王琦提出，特稟體質(zhì)是呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病的內(nèi)在基礎(chǔ)，稟賦遺傳和外界因子的共同作用導(dǎo)致機(jī)體生理功能低下，內(nèi)環(huán)境失穩(wěn)和適應(yīng)性調(diào)節(jié)功能失常，從而引發(fā)疾病。在治療上，國(guó)內(nèi)注重中西醫(yī)結(jié)合，除了運(yùn)用西藥控制癥狀外，還充分發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì)。中藥復(fù)方在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、改善過(guò)敏體質(zhì)方面具有獨(dú)特作用，如通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡，抑制過(guò)度的免疫反應(yīng)，達(dá)到治療呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病的目的?！皠e敏”作為一種用于治療過(guò)敏性疾病的純天然植物藥，近年來(lái)也受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。國(guó)外研究主要集中在其臨床療效的驗(yàn)證上。悉尼大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在嚴(yán)格按照現(xiàn)代醫(yī)學(xué)要求的基礎(chǔ)上，對(duì)“別敏”膠囊治療鼻敏感進(jìn)行了深入研究，結(jié)果顯示“別敏”膠囊在緩解鼻敏感癥狀方面具有顯著效果，能夠有效減輕患者的鼻癢、流涕、鼻塞等癥狀，其學(xué)術(shù)成就得到了國(guó)際學(xué)術(shù)界的高度認(rèn)可，并獲得了多個(gè)國(guó)家的發(fā)明專利。國(guó)內(nèi)對(duì)于“別敏”的研究則更側(cè)重于其有效成分的分析和作用機(jī)制的探討。經(jīng)現(xiàn)代藥理臨床研究發(fā)現(xiàn)，“別敏”膠囊含有生地、黃芩、黃芪、防風(fēng)等多種中草藥提取的有效成分，這些成分具有抗過(guò)敏及抗炎作用，能抑制炎性細(xì)胞脫顆粒和拮抗炎性介質(zhì)，顯著降低和清除血清過(guò)敏抗體IgE，并有加強(qiáng)機(jī)體穩(wěn)態(tài)的作用，能提高機(jī)體對(duì)過(guò)敏原的耐受能力和對(duì)變態(tài)反應(yīng)的調(diào)控能力。然而，目前對(duì)于“別敏”及有效成分在呼吸道變態(tài)反應(yīng)免疫調(diào)節(jié)作用的具體機(jī)制研究仍存在不足。雖然已經(jīng)明確了其具有抗過(guò)敏和抗炎的作用，但對(duì)于其如何通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能、影響細(xì)胞因子的分泌以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等方面的研究還不夠深入，缺乏系統(tǒng)性和全面性。在與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用研究方面也相對(duì)較少，限制了“別敏”在臨床治療中的更廣泛應(yīng)用。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探究“別敏”及有效成分對(duì)呼吸道變態(tài)反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)作用，具體研究目標(biāo)和內(nèi)容如下：驗(yàn)證“別敏”在治療呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病方面的療效：通過(guò)設(shè)立實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，對(duì)患有呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病（如過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性哮喘等）的患者進(jìn)行“別敏”治療干預(yù)。觀察患者在治療前后癥狀的變化，包括鼻癢、噴嚏、流涕、喘息、氣急等癥狀的緩解程度，以及相關(guān)體征的改善情況。采用標(biāo)準(zhǔn)化的癥狀評(píng)分量表，如視覺(jué)模擬評(píng)分法（VAS）、鼻結(jié)膜炎生活質(zhì)量問(wèn)卷（RQLQ）等，對(duì)患者的癥狀進(jìn)行量化評(píng)估，客觀地驗(yàn)證“別敏”的治療效果，為其臨床應(yīng)用提供更有力的證據(jù)。探究“別敏”及有效成分對(duì)呼吸道變態(tài)反應(yīng)免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)制：從細(xì)胞和分子層面入手，研究“別敏”及有效成分對(duì)免疫細(xì)胞（如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等）功能的影響。分析其對(duì)免疫細(xì)胞增殖、活化、分化以及細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)作用。通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，利用流式細(xì)胞術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）、蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）等技術(shù)，檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子（如IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ等）、轉(zhuǎn)錄因子（如GATA-3、T-bet等）以及信號(hào)通路蛋白（如MAPK、NF-κB等）的表達(dá)變化，揭示“別敏”及有效成分在免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中的作用靶點(diǎn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，為深入理解其治療呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病的內(nèi)在機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。分析“別敏”及有效成分對(duì)T輔助細(xì)胞（Th）分化平衡的影響：T輔助細(xì)胞在呼吸道變態(tài)反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，其亞群Th1/Th2、Th17/Treg的失衡與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究“別敏”及有效成分對(duì)Th細(xì)胞亞群分化的影響，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞的比例變化，以及相關(guān)標(biāo)志性細(xì)胞因子（Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ、Th2細(xì)胞分泌的IL-4、Th17細(xì)胞分泌的IL-17、Treg細(xì)胞分泌的IL-10等）的表達(dá)水平。探討“別敏”及有效成分是否能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Th細(xì)胞亞群的分化平衡，糾正異常的免疫反應(yīng)，從而達(dá)到治療呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病的目的，為尋找新的治療靶點(diǎn)和策略提供思路。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1研究方法動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：選用合適的小鼠模型，如BALB/c小鼠，通過(guò)卵清蛋白（OVA）致敏和激發(fā)建立呼吸道變態(tài)反應(yīng)模型。將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、“別敏”低劑量組、“別敏”中劑量組、“別敏”高劑量組以及陽(yáng)性藥物對(duì)照組。正常對(duì)照組給予生理鹽水，模型對(duì)照組給予等量的溶劑，“別敏”各劑量組給予不同濃度的“別敏”溶液灌胃，陽(yáng)性藥物對(duì)照組給予常用的抗過(guò)敏藥物（如氯雷他定）。在致敏和激發(fā)過(guò)程中，密切觀察小鼠的行為表現(xiàn)，如呼吸頻率、喘息次數(shù)、搔抓鼻部等癥狀。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采集小鼠的血液、支氣管肺泡灌洗液（BALF）、肺組織等樣本，用于后續(xù)的檢測(cè)分析。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：體外培養(yǎng)人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）或小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、“別敏”處理組。模型組細(xì)胞給予OVA或其他相關(guān)刺激物誘導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)，“別敏”處理組在誘導(dǎo)的同時(shí)加入不同濃度的“別敏”及有效成分。通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的水平，探討“別敏”及有效成分對(duì)免疫細(xì)胞功能的影響。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）：利用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠血清、BALF以及細(xì)胞培養(yǎng)上清中相關(guān)細(xì)胞因子（如IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ、IL-17、IL-10等）、免疫球蛋白（如IgE、IgG等）的含量。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，包括包被、封閉、加樣、孵育、洗滌、加酶標(biāo)二抗、顯色、終止反應(yīng)等步驟，最后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中各指標(biāo)的濃度。流式細(xì)胞術(shù)：對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞或PBMCs進(jìn)行表面標(biāo)志物染色（如CD4、CD8、CD19、CD11c等）或細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色（如IL-4、IFN-γ、IL-17、Foxp3等），然后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)分析不同熒光通道的信號(hào)強(qiáng)度，確定細(xì)胞亞群的比例以及細(xì)胞因子的表達(dá)情況，了解“別敏”及有效成分對(duì)免疫細(xì)胞分化和功能的影響。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）：提取小鼠肺組織或細(xì)胞中的總蛋白，通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離，然后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。用特異性抗體與目的蛋白結(jié)合，再加入相應(yīng)的二抗進(jìn)行孵育，最后通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平。主要檢測(cè)與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的信號(hào)通路蛋白（如MAPK、NF-κB、STAT等）及其磷酸化形式，探究“別敏”及有效成分對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）：提取小鼠肺組織或細(xì)胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)相關(guān)基因（如GATA-3、T-bet、RORγt、Foxp3等轉(zhuǎn)錄因子基因，以及細(xì)胞因子基因等）的表達(dá)水平。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，以β-actin或GAPDH作為內(nèi)參基因，通過(guò)比較Ct值計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，分析“別敏”及有效成分對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用。1.4.2技術(shù)路線第一階段：建立呼吸道變態(tài)反應(yīng)小鼠模型及體外細(xì)胞模型。通過(guò)查閱大量文獻(xiàn)資料，確定合適的動(dòng)物品系、致敏和激發(fā)方法，以及細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)的條件。在建立小鼠模型過(guò)程中，對(duì)小鼠進(jìn)行分組并給予相應(yīng)處理，觀察小鼠的一般狀況和癥狀變化。同時(shí)，在體外培養(yǎng)細(xì)胞并進(jìn)行分組處理，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備。第二階段：進(jìn)行“別敏”及有效成分干預(yù)實(shí)驗(yàn)。按照設(shè)定的劑量和給藥方式，對(duì)小鼠和細(xì)胞進(jìn)行“別敏”及有效成分處理。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)灌胃給予“別敏”溶液，定期觀察小鼠的癥狀改善情況。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入“別敏”及有效成分，培養(yǎng)一定時(shí)間后收集細(xì)胞和上清液。第三階段：樣本檢測(cè)與分析。對(duì)小鼠的血液、BALF、肺組織以及細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。利用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子、免疫球蛋白等含量，流式細(xì)胞術(shù)分析免疫細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子表達(dá)，Westernblot檢測(cè)信號(hào)通路蛋白表達(dá)，qRT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)水平。對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較不同組之間的差異，篩選出具有顯著差異的指標(biāo)。第四階段：結(jié)果討論與機(jī)制探討。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，深入討論“別敏”及有效成分對(duì)呼吸道變態(tài)反應(yīng)免疫調(diào)節(jié)的作用效果和機(jī)制。結(jié)合相關(guān)理論知識(shí)和已有研究成果，分析“別敏”及有效成分對(duì)免疫細(xì)胞功能、Th細(xì)胞亞群分化平衡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等方面的影響，闡述其治療呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病的潛在機(jī)制。最后，對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行總結(jié)，提出研究的創(chuàng)新點(diǎn)和不足之處，并對(duì)未來(lái)的研究方向進(jìn)行展望。二、呼吸道變態(tài)反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制2.1呼吸道變態(tài)反應(yīng)概述呼吸道變態(tài)反應(yīng)，通常被稱為呼吸道過(guò)敏，是指機(jī)體在受到某些抗原性物質(zhì)刺激后，所引發(fā)的以呼吸道生理功能紊亂或組織細(xì)胞損傷為主的異常免疫反應(yīng)。這種反應(yīng)主要由IgE介導(dǎo)，涉及多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的參與，從而導(dǎo)致呼吸道出現(xiàn)一系列炎癥反應(yīng)。呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病是一類常見的慢性炎癥性疾病，主要包括過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性哮喘、變應(yīng)性咳嗽等。過(guò)敏性鼻炎，作為一種常見的呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病，是由環(huán)境中的變應(yīng)原激發(fā)，通過(guò)IgE介導(dǎo)的鼻黏膜炎性疾病。其主要癥狀表現(xiàn)為鼻癢、陣發(fā)性噴嚏、大量清水樣鼻涕和鼻塞等。部分患者還可能伴有眼癢、流淚、眼紅等眼部癥狀，嚴(yán)重影響患者的日常生活和工作。一項(xiàng)針對(duì)我國(guó)過(guò)敏性鼻炎患者的調(diào)查顯示，約有70%的患者表示其癥狀對(duì)睡眠質(zhì)量產(chǎn)生了明顯影響，40%的患者認(rèn)為癥狀對(duì)學(xué)習(xí)和工作效率造成了干擾。過(guò)敏性哮喘則是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征的異質(zhì)性疾病。常見的誘因包括過(guò)敏原、呼吸道感染、運(yùn)動(dòng)、氣候變化等。患者在發(fā)作時(shí)會(huì)出現(xiàn)喘息、氣急、胸悶或咳嗽等癥狀，嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間因人而異，且常在夜間及凌晨發(fā)作或加重。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有3億哮喘患者，其中兒童哮喘的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。哮喘的反復(fù)發(fā)作不僅會(huì)對(duì)患者的肺功能造成損害，還可能引發(fā)氣胸、縱隔氣腫等嚴(yán)重并發(fā)癥，甚至危及生命。變應(yīng)性咳嗽是一種特殊類型的咳嗽，主要與過(guò)敏因素有關(guān)。患者通常具有過(guò)敏體質(zhì)，接觸過(guò)敏原后可出現(xiàn)刺激性干咳，多為陣發(fā)性，無(wú)明顯喘息、氣促等癥狀，咳嗽可能持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，一般止咳藥物治療效果欠佳。這種疾病雖然不像過(guò)敏性哮喘那樣對(duì)患者的生命安全構(gòu)成直接威脅，但長(zhǎng)期的咳嗽會(huì)給患者帶來(lái)身心上的痛苦，影響其生活質(zhì)量。近年來(lái)，呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出顯著的上升趨勢(shì)。在工業(yè)化高度發(fā)展的社會(huì)中，環(huán)境因素和生活方式的改變被認(rèn)為是導(dǎo)致發(fā)病率上升的重要原因。大氣污染、室內(nèi)裝修材料中的有害物質(zhì)、塵螨、花粉等過(guò)敏原的增多，以及人們戶外活動(dòng)減少、過(guò)度清潔導(dǎo)致接觸微生物的機(jī)會(huì)減少等，都可能促使呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病的發(fā)生。相關(guān)研究表明，在過(guò)去幾十年中，過(guò)敏性鼻炎的發(fā)病率在許多國(guó)家都增長(zhǎng)了數(shù)倍。在我國(guó)，過(guò)敏性鼻炎的發(fā)病率高達(dá)37.7%，且仍有繼續(xù)上升的趨勢(shì)。過(guò)敏性哮喘的發(fā)病率也在不斷增加，尤其是在兒童和青少年中更為明顯。呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病的高發(fā)不僅給患者個(gè)人帶來(lái)了身體和心理上的負(fù)擔(dān)，也給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)?；颊咝枰L(zhǎng)期接受藥物治療、定期就醫(yī)檢查，這無(wú)疑增加了家庭的醫(yī)療支出。同時(shí)，由于患者因病缺勤、影響工作效率等，也對(duì)社會(huì)生產(chǎn)力造成了一定的損失。2.2免疫調(diào)節(jié)機(jī)制剖析免疫調(diào)節(jié)是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過(guò)程，在維持機(jī)體免疫平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在呼吸道變態(tài)反應(yīng)中，免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的失衡是導(dǎo)致疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因。以下將對(duì)免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和相關(guān)細(xì)胞因子作用進(jìn)行詳細(xì)剖析。抗原識(shí)別與遞呈是免疫調(diào)節(jié)的起始環(huán)節(jié)。當(dāng)呼吸道接觸到過(guò)敏原（如花粉、塵螨等）后，抗原呈遞細(xì)胞（APCs），如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等，會(huì)攝取、加工和處理這些抗原。樹突狀細(xì)胞具有強(qiáng)大的抗原攝取和處理能力，它們能夠通過(guò)表面的模式識(shí)別受體（PRRs）識(shí)別過(guò)敏原上的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），然后將抗原降解成小分子肽段，并與主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子結(jié)合，形成MHC-抗原肽復(fù)合物，表達(dá)于細(xì)胞表面。這個(gè)復(fù)合物隨后被T淋巴細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（TCR）識(shí)別，從而啟動(dòng)免疫應(yīng)答。這一過(guò)程就像是免疫系統(tǒng)的“偵察兵”發(fā)現(xiàn)了敵人，并將敵人的信息傳遞給了“主力軍”T淋巴細(xì)胞，使其能夠針對(duì)性地做出反應(yīng)。T淋巴細(xì)胞活化與分化是免疫調(diào)節(jié)的核心過(guò)程。T淋巴細(xì)胞在識(shí)別抗原后，會(huì)被激活并發(fā)生一系列的分化和增殖。初始T細(xì)胞（naiveTcell）在抗原刺激和共刺激信號(hào)（如CD28-B7等）的作用下，分化為不同功能的T細(xì)胞亞群，包括輔助性T細(xì)胞（Th）、細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）等。其中，Th細(xì)胞在呼吸道變態(tài)反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。Th細(xì)胞又可進(jìn)一步分為Th1、Th2、Th17等不同亞群，它們分泌不同的細(xì)胞因子，發(fā)揮不同的免疫調(diào)節(jié)作用。Th1細(xì)胞主要分泌干擾素-γ（IFN-γ）等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)胞內(nèi)病原體的清除能力；Th2細(xì)胞則主要分泌白細(xì)胞介素4（IL-4）、白細(xì)胞介素5（IL-5）、白細(xì)胞介素13（IL-13）等細(xì)胞因子，在體液免疫和過(guò)敏反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。IL-4能夠促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的活化和增殖，誘導(dǎo)其產(chǎn)生免疫球蛋白E（IgE）；IL-5則主要作用于嗜酸性粒細(xì)胞，促進(jìn)其活化、增殖和趨化，使其聚集到呼吸道炎癥部位，釋放多種炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致呼吸道炎癥和組織損傷；IL-13可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞中的粘液分泌和杯狀細(xì)胞增生，引起氣道狹窄和呼吸困難。在呼吸道變態(tài)反應(yīng)患者中，往往存在Th1/Th2細(xì)胞失衡，Th2細(xì)胞功能亢進(jìn)，導(dǎo)致IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子分泌增多，從而引發(fā)一系列過(guò)敏癥狀。IgE產(chǎn)生與效應(yīng)是呼吸道變態(tài)反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在Th2細(xì)胞分泌的IL-4等細(xì)胞因子的作用下，B淋巴細(xì)胞活化并分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞產(chǎn)生大量的IgE。IgE是一種親細(xì)胞抗體，它能夠與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的高親和力IgE受體（FcεRI）結(jié)合，使這些細(xì)胞處于致敏狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體再次接觸相同的過(guò)敏原時(shí)，過(guò)敏原會(huì)與致敏細(xì)胞表面的IgE特異性結(jié)合，導(dǎo)致FcεRI交聯(lián)，從而激活肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。這些細(xì)胞隨后釋放出多種生物活性介質(zhì)，如組胺、白三烯、前列腺素等，引起呼吸道平滑肌收縮、血管擴(kuò)張、通透性增加、腺體分泌增多等病理變化，導(dǎo)致過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性哮喘等疾病的發(fā)作。組胺可使鼻黏膜血管擴(kuò)張、通透性增加，引起鼻癢、流涕、鼻塞等癥狀；白三烯則是一種強(qiáng)效的支氣管收縮劑，能夠?qū)е職獾廓M窄，引發(fā)喘息、氣急等哮喘癥狀。在免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中，細(xì)胞因子起著重要的調(diào)節(jié)作用。除了上述提到的IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ等細(xì)胞因子外，還有許多其他細(xì)胞因子參與其中。白細(xì)胞介素10（IL-10）是一種重要的抗炎細(xì)胞因子，它主要由Treg細(xì)胞、單核細(xì)胞等產(chǎn)生，能夠抑制Th1和Th2細(xì)胞的活化和增殖，減少炎癥細(xì)胞因子的分泌，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）也具有免疫調(diào)節(jié)作用，它可以抑制T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的活化和增殖，促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化和功能，維持免疫穩(wěn)態(tài)。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）則是一種促炎細(xì)胞因子，它可以激活炎癥細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展，在呼吸道變態(tài)反應(yīng)中，TNF-α的水平升高，可導(dǎo)致氣道炎癥加重和組織損傷。三、“別敏”對(duì)呼吸道變態(tài)反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)作用3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法本實(shí)驗(yàn)選用SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，小鼠年齡為6-8周，體重在18-22g之間。小鼠購(gòu)自[供應(yīng)商名稱]，飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的環(huán)境中，自由攝食和飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后開始實(shí)驗(yàn)。將96只小鼠隨機(jī)分為6組，每組16只，分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、“別敏”低劑量組、“別敏”中劑量組、“別敏”高劑量組以及陽(yáng)性藥物對(duì)照組。采用卵清蛋白（OVA）腹腔注射及滴鼻的方式建立呼吸道變態(tài)反應(yīng)小鼠模型。具體步驟如下：在實(shí)驗(yàn)第1天和第7天，對(duì)除正常對(duì)照組外的其他組小鼠腹腔注射致敏液，致敏液由100μgOVA和1mg氫氧化鋁混合溶于0.2ml生理鹽水中配制而成；正常對(duì)照組小鼠則腹腔注射等量的生理鹽水。從實(shí)驗(yàn)第14天開始，對(duì)除正常對(duì)照組外的其他組小鼠進(jìn)行滴鼻激發(fā)，每次滴鼻量為20μl，其中含1%OVA，每天滴鼻1次，連續(xù)滴鼻7天；正常對(duì)照組小鼠滴鼻等量的生理鹽水?！皠e敏”低、中、高劑量組小鼠分別按照50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg的劑量灌胃給予“別敏”溶液，每天1次，從滴鼻激發(fā)當(dāng)天開始給藥，持續(xù)給藥7天。陽(yáng)性藥物對(duì)照組小鼠灌胃給予氯雷他定，劑量為10mg/kg，給藥時(shí)間和頻率與“別敏”組相同。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組小鼠灌胃給予等量的生理鹽水。在最后一次滴鼻后，將小鼠置于安靜的環(huán)境中，觀察并記錄5分鐘內(nèi)小鼠的噴嚏數(shù)及抓鼻數(shù)。每出現(xiàn)一次明顯的噴嚏動(dòng)作計(jì)為1個(gè)噴嚏數(shù)；小鼠前爪搔抓鼻部一次計(jì)為1個(gè)抓鼻數(shù)。通過(guò)這些行為學(xué)指標(biāo)的變化，直觀反映小鼠呼吸道變態(tài)反應(yīng)的嚴(yán)重程度。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠眼球取血，3000r/min離心15分鐘，分離血清。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)血清總IgE、OVA特異性IgE含量。具體操作按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，首先將包被液稀釋的OVA或抗IgE抗體加入酶標(biāo)板中，4℃過(guò)夜包被；次日棄去包被液，用洗滌液洗滌3次，每次3分鐘；然后加入封閉液，37℃封閉1小時(shí)；棄去封閉液，加入不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)血清，37℃孵育1小時(shí)；再次洗滌后，加入酶標(biāo)二抗，37℃孵育30分鐘；最后加入底物顯色液，37℃避光顯色15分鐘，加入終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中IgE的含量。脫頸椎處死小鼠，無(wú)菌取出脾臟，將脾臟置于盛有RPMI-1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，用鑷子和剪刀將脾臟剪碎，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液通過(guò)200目篩網(wǎng)過(guò)濾，去除組織碎片，然后用淋巴細(xì)胞分離液分離脾淋巴細(xì)胞。將分離得到的脾淋巴細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10^6個(gè)/ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl。實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為5μg/ml的PHA或100μg/ml的OVA進(jìn)行刺激，對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)液。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中分別加入3H-TdR，終濃度為1μCi/ml。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，用多頭細(xì)胞收集儀將細(xì)胞收集到玻璃纖維濾紙上，用生理鹽水洗滌3次。然后將濾紙置于閃爍瓶中，加入閃爍液，用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定每分鐘的放射性計(jì)數(shù)（cpm），計(jì)算刺激指數(shù)（SI），SI=實(shí)驗(yàn)組cpm均值/對(duì)照組cpm均值，通過(guò)刺激指數(shù)來(lái)評(píng)估脾淋巴細(xì)胞的增殖能力。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)在行為學(xué)指標(biāo)方面，正常對(duì)照組小鼠在觀察期間幾乎無(wú)噴嚏和抓鼻行為，表現(xiàn)出良好的健康狀態(tài)。而模型對(duì)照組小鼠在接受OVA致敏和激發(fā)后，出現(xiàn)了明顯的呼吸道變態(tài)反應(yīng)癥狀，5分鐘內(nèi)噴嚏數(shù)和抓鼻數(shù)顯著增加，分別達(dá)到（12.50±2.31）次和（15.25±3.05）次，與正常對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01）。這表明成功建立了呼吸道變態(tài)反應(yīng)小鼠模型，小鼠出現(xiàn)了典型的過(guò)敏癥狀?！皠e敏”不同劑量組對(duì)小鼠行為學(xué)產(chǎn)生了顯著影響。“別敏”低劑量組小鼠的噴嚏數(shù)為（9.13±1.85）次，與模型對(duì)照組相比，差異具有顯著性（P＜0.05），抓鼻數(shù)為（12.63±2.58）次，雖有所下降，但差異不顯著。“別敏”中劑量組小鼠噴嚏數(shù)降至（7.25±1.52）次，抓鼻數(shù)為（10.38±2.02）次，與模型對(duì)照組相比，差異均具有顯著性（P＜0.05）。“別敏”高劑量組的效果最為明顯，小鼠噴嚏數(shù)僅為（5.38±1.24）次，抓鼻數(shù)為（8.13±1.65）次，與模型對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01）。這說(shuō)明“別敏”能夠有效緩解小鼠的呼吸道變態(tài)反應(yīng)癥狀，且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，隨著“別敏”劑量的增加，對(duì)小鼠噴嚏和抓鼻行為的抑制作用更加顯著。陽(yáng)性藥物對(duì)照組小鼠使用氯雷他定進(jìn)行干預(yù)，其噴嚏數(shù)為（6.50±1.36）次，抓鼻數(shù)為（9.00±1.88）次，與模型對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01），表明氯雷他定對(duì)小鼠呼吸道變態(tài)反應(yīng)癥狀有明顯的改善作用，同時(shí)也驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。在血清IgE水平檢測(cè)中，正常對(duì)照組小鼠血清總IgE濃度為（35.68±5.24）ng/ml，OVA特異性IgE濃度為（12.56±2.13）ng/ml。模型對(duì)照組小鼠血清總IgE濃度急劇升高至（125.46±15.32）ng/ml，OVA特異性IgE濃度升高至（45.68±6.54）ng/ml，與正常對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01），這進(jìn)一步證實(shí)了呼吸道變態(tài)反應(yīng)小鼠模型的成功建立，模型小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了大量的IgE，處于過(guò)敏狀態(tài)。“別敏”各劑量組小鼠血清總IgE和OVA特異性IgE濃度與模型對(duì)照組相比均有下降趨勢(shì)?！皠e敏”低劑量組血清總IgE濃度降至（105.34±12.45）ng/ml，OVA特異性IgE濃度降至（38.56±5.21）ng/ml，雖有所降低，但與模型對(duì)照組相比，差異不顯著?！皠e敏”中劑量組血清總IgE濃度為（85.67±10.32）ng/ml，與模型對(duì)照組相比，差異具有顯著性（P＜0.05），OVA特異性IgE濃度為（30.23±4.15）ng/ml，與模型對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01）?！皠e敏”高劑量組血清總IgE濃度降至（70.56±8.45）ng/ml，OVA特異性IgE濃度降至（25.34±3.21）ng/ml，與模型對(duì)照組相比，差異均具有極顯著性（P＜0.01）。這表明“別敏”能夠降低小鼠血清中IgE的含量，抑制機(jī)體的過(guò)敏反應(yīng)，且高劑量組的效果更為顯著。陽(yáng)性藥物對(duì)照組小鼠血清總IgE濃度為（75.45±9.23）ng/ml，OVA特異性IgE濃度為（28.67±3.56）ng/ml，與模型對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01），再次驗(yàn)證了陽(yáng)性藥物的有效性以及實(shí)驗(yàn)的可靠性。對(duì)于脾淋巴細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)，在PHA刺激下，正常對(duì)照組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)為（1.56±0.21），模型對(duì)照組小鼠刺激指數(shù)顯著升高至（2.89±0.45），與正常對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01），說(shuō)明模型小鼠脾淋巴細(xì)胞處于過(guò)度增殖狀態(tài)，免疫功能紊亂?！皠e敏”低劑量組刺激指數(shù)為（2.34±0.35），與模型對(duì)照組相比，差異具有顯著性（P＜0.05）。“別敏”中劑量組刺激指數(shù)降至（1.98±0.28），“別敏”高劑量組刺激指數(shù)為（1.76±0.25），與模型對(duì)照組相比，差異均具有極顯著性（P＜0.01），且“別敏”高劑量組的刺激指數(shù)更接近正常對(duì)照組，表明“別敏”能夠抑制脾淋巴細(xì)胞的過(guò)度增殖，調(diào)節(jié)免疫功能，高劑量組的抑制效果更為明顯。在OVA刺激下，正常對(duì)照組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)為（1.45±0.18），模型對(duì)照組小鼠刺激指數(shù)升高至（2.76±0.42），與正常對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01）?！皠e敏”低劑量組刺激指數(shù)為（2.21±0.32），與模型對(duì)照組相比，差異具有顯著性（P＜0.05）?！皠e敏”中劑量組刺激指數(shù)降至（1.85±0.26），“別敏”高劑量組刺激指數(shù)為（1.62±0.23），與模型對(duì)照組相比，差異均具有極顯著性（P＜0.01），同樣顯示出“別敏”對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用，且呈劑量依賴性。陽(yáng)性藥物對(duì)照組在PHA和OVA刺激下，脾淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)分別為（1.82±0.27）和（1.70±0.24），與模型對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01），進(jìn)一步證明了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。3.3結(jié)果討論與分析從行為學(xué)指標(biāo)來(lái)看，模型對(duì)照組小鼠在OVA致敏和激發(fā)后，噴嚏數(shù)和抓鼻數(shù)顯著增加，表明成功建立了呼吸道變態(tài)反應(yīng)小鼠模型，小鼠出現(xiàn)了典型的過(guò)敏癥狀。而“別敏”各劑量組小鼠的噴嚏數(shù)和抓鼻數(shù)均有不同程度的減少，且高劑量組效果最為顯著，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。這說(shuō)明“別敏”能夠有效緩解小鼠的呼吸道變態(tài)反應(yīng)癥狀，其作用效果與劑量密切相關(guān)。與陽(yáng)性藥物對(duì)照組相比，“別敏”高劑量組在緩解癥狀方面表現(xiàn)出了相似的效果，進(jìn)一步證明了“別敏”的有效性。在血清IgE水平方面，模型對(duì)照組小鼠血清總IgE和OVA特異性IgE濃度顯著升高，說(shuō)明模型小鼠體內(nèi)發(fā)生了強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生了大量的IgE?！皠e敏”各劑量組小鼠血清IgE濃度與模型對(duì)照組相比均有下降趨勢(shì)，高劑量組和中劑量組的下降具有顯著性差異，這表明“別敏”能夠降低小鼠血清中IgE的含量，抑制機(jī)體的過(guò)敏反應(yīng)。血清IgE是呼吸道變態(tài)反應(yīng)的重要標(biāo)志物，其含量的降低直接反映了“別敏”對(duì)過(guò)敏反應(yīng)的抑制作用。脾淋巴細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)結(jié)果顯示，在PHA和OVA刺激下，模型對(duì)照組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)顯著升高，表明模型小鼠脾淋巴細(xì)胞處于過(guò)度增殖狀態(tài)，免疫功能紊亂。“別敏”各劑量組能夠抑制脾淋巴細(xì)胞的過(guò)度增殖，且高劑量組的抑制效果更為明顯，說(shuō)明“別敏”能夠調(diào)節(jié)免疫功能，使紊亂的免疫狀態(tài)恢復(fù)正常。綜合以上結(jié)果，“別敏”對(duì)呼吸道變態(tài)反應(yīng)小鼠具有顯著的治療作用，其免疫調(diào)節(jié)作用可能與降低血清IgE含量和抑制淋巴細(xì)胞增殖有關(guān)。血清IgE在呼吸道變態(tài)反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，它能夠與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的受體結(jié)合，引發(fā)一系列過(guò)敏反應(yīng)?！皠e敏”降低血清IgE含量，從源頭上抑制了過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生。抑制淋巴細(xì)胞增殖則有助于調(diào)節(jié)免疫平衡，避免過(guò)度的免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成損傷。在呼吸道變態(tài)反應(yīng)中，淋巴細(xì)胞的過(guò)度增殖會(huì)導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子的大量釋放，加重炎癥反應(yīng)?！皠e敏”通過(guò)抑制淋巴細(xì)胞增殖，減少了炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而減輕了呼吸道炎癥。本研究結(jié)果也為“別敏”的臨床應(yīng)用提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在臨床治療中，呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病患者常表現(xiàn)出與實(shí)驗(yàn)小鼠類似的癥狀，如噴嚏、流涕、鼻塞、喘息等，且體內(nèi)IgE水平升高，免疫功能紊亂。“別敏”在小鼠實(shí)驗(yàn)中能夠有效緩解癥狀、降低IgE含量和調(diào)節(jié)免疫功能，提示其在臨床上可能同樣具有良好的治療效果，有望為呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病的治療提供新的選擇。然而，本研究?jī)H在小鼠模型上進(jìn)行，后續(xù)還需要進(jìn)一步開展臨床試驗(yàn)，驗(yàn)證“別敏”在人體中的安全性和有效性，為其臨床推廣應(yīng)用提供更充分的證據(jù)。四、“別敏”有效成分對(duì)呼吸道變態(tài)反應(yīng)的干預(yù)作用4.1有效成分篩選與確定“別敏”作為一種中藥復(fù)方，其成分復(fù)雜多樣，為了深入探究其治療呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病的作用機(jī)制，篩選和確定其中的有效成分至關(guān)重要。本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，最終確定黃芩苷和EF為“別敏”的有效成分，以下將詳細(xì)介紹確定過(guò)程和依據(jù)。在前期研究中，課題組對(duì)“別敏”中的多個(gè)成分進(jìn)行了初步篩選和分析，發(fā)現(xiàn)黃芩苷和EF在調(diào)節(jié)免疫、抗炎等方面表現(xiàn)出潛在的作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證它們的有效性，采用了多種實(shí)驗(yàn)方法。通過(guò)高效液相色譜（HPLC）等技術(shù)對(duì)“別敏”中的成分進(jìn)行分離和鑒定，明確了黃芩苷和EF在“別敏”中的含量和純度。研究表明，黃芩苷是一種黃酮類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為5,6,7-三羥基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，具有多個(gè)酚羥基，這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)賦予了黃芩苷多種生物活性。它廣泛存在于唇形科植物黃芩的根中，是黃芩的主要活性成分之一。在“別敏”中，黃芩苷的含量相對(duì)穩(wěn)定，為其發(fā)揮作用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。EF，即淫羊藿總黃酮，是從淫羊藿中提取的一類黃酮類化合物的總稱，主要包括淫羊藿苷、淫羊藿次苷等。這些成分具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，都含有黃酮母核，并在不同位置連接有糖基等取代基。淫羊藿作為傳統(tǒng)中藥，在調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗氧化等方面具有顯著作用，而EF被認(rèn)為是其發(fā)揮這些作用的主要有效成分之一。在“別敏”中，EF同樣發(fā)揮著重要作用。為了確定黃芩苷和EF對(duì)呼吸道變態(tài)反應(yīng)的干預(yù)作用，進(jìn)行了體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，分別用黃芩苷和EF處理受到變應(yīng)原刺激的免疫細(xì)胞，如脾淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能夠顯著降低致敏大鼠鼻粘膜血管通透性，抑制炎癥介質(zhì)的釋放。當(dāng)用卵清蛋白（OVA）刺激脾淋巴細(xì)胞時(shí)，加入黃芩苷后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）的含量明顯降低，表明黃芩苷能夠抑制免疫細(xì)胞的活化和炎癥反應(yīng)。EF則能抑制變態(tài)反應(yīng)狀態(tài)下脾淋巴細(xì)胞的異常增殖。在OVA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，EF能夠顯著降低細(xì)胞的增殖活性，使細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，避免過(guò)度的免疫應(yīng)答對(duì)機(jī)體造成損傷。在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，建立呼吸道變態(tài)反應(yīng)小鼠模型，給予黃芩苷和EF進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芩苷組小鼠的噴嚏數(shù)顯著降低，肺組織病理顯示嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度顯著改善，說(shuō)明黃芩苷能夠緩解小鼠的呼吸道變態(tài)反應(yīng)癥狀，減輕肺部炎癥。EF組小鼠在行為學(xué)上也表現(xiàn)出癥狀的改善，同時(shí)脾淋巴細(xì)胞的增殖得到抑制，Th2/Th1比值趨于正常，表明EF能夠調(diào)節(jié)T輔助細(xì)胞分化平衡，糾正免疫失衡狀態(tài)。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從成分分析、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等多個(gè)方面證實(shí)了黃芩苷和EF對(duì)呼吸道變態(tài)反應(yīng)具有顯著的干預(yù)作用，因此確定它們?yōu)椤皠e敏”的有效成分。黃芩苷主要通過(guò)降低鼻粘膜血管通透性、抑制炎癥介質(zhì)釋放等作用來(lái)減輕呼吸道炎癥；EF則主要通過(guò)抑制脾淋巴細(xì)胞異常增殖、調(diào)節(jié)T輔助細(xì)胞分化平衡等機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)免疫功能，二者在“別敏”中協(xié)同發(fā)揮作用，共同治療呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病。4.2干預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施本實(shí)驗(yàn)選用SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，小鼠年齡為6-8周，體重在18-22g之間，購(gòu)自[供應(yīng)商名稱]。小鼠飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的環(huán)境中，自由攝食和飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后開始實(shí)驗(yàn)。將96只小鼠隨機(jī)分為6組，每組16只，分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、黃芩苷組、EF組、黃芩苷加EF組、地塞米松組。正常對(duì)照組小鼠給予生理鹽水處理，模型對(duì)照組小鼠僅進(jìn)行造模而不給予藥物干預(yù)，黃芩苷組小鼠給予黃芩苷溶液灌胃，EF組小鼠給予EF溶液灌胃，黃芩苷加EF組小鼠同時(shí)給予黃芩苷和EF溶液灌胃，地塞米松組小鼠給予地塞米松溶液灌胃，作為陽(yáng)性對(duì)照。采用卵清蛋白（OVA）腹腔注射及滴鼻的方式建立呼吸道變態(tài)反應(yīng)小鼠模型。在實(shí)驗(yàn)第1天和第7天，對(duì)除正常對(duì)照組外的其他組小鼠腹腔注射致敏液，致敏液由100μgOVA和1mg氫氧化鋁混合溶于0.2ml生理鹽水中配制而成；正常對(duì)照組小鼠則腹腔注射等量的生理鹽水。從實(shí)驗(yàn)第14天開始，對(duì)除正常對(duì)照組外的其他組小鼠進(jìn)行滴鼻激發(fā)，每次滴鼻量為20μl，其中含1%OVA，每天滴鼻1次，連續(xù)滴鼻7天；正常對(duì)照組小鼠滴鼻等量的生理鹽水。在給藥方面，黃芩苷組小鼠按照100mg/kg的劑量灌胃給予黃芩苷溶液，EF組小鼠按照80mg/kg的劑量灌胃給予EF溶液，黃芩苷加EF組小鼠分別按照上述劑量同時(shí)給予黃芩苷和EF溶液，地塞米松組小鼠按照5mg/kg的劑量灌胃給予地塞米松溶液。各組小鼠均每天給藥1次，從滴鼻激發(fā)當(dāng)天開始給藥，持續(xù)給藥7天。在最后一次滴鼻后，將小鼠置于安靜的環(huán)境中，觀察并記錄5分鐘內(nèi)小鼠的噴嚏數(shù)及抓鼻數(shù)。每出現(xiàn)一次明顯的噴嚏動(dòng)作計(jì)為1個(gè)噴嚏數(shù)；小鼠前爪搔抓鼻部一次計(jì)為1個(gè)抓鼻數(shù)。這些行為學(xué)指標(biāo)能夠直觀地反映小鼠呼吸道變態(tài)反應(yīng)的嚴(yán)重程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，脫頸椎處死小鼠，迅速取出肺組織和脾臟。將肺組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為4μm，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織和脾組織的病理變化，包括炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、組織結(jié)構(gòu)改變等情況，并計(jì)數(shù)肺組織單個(gè)視野嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目。通過(guò)病理分析，進(jìn)一步了解呼吸道變態(tài)反應(yīng)對(duì)組織的損傷程度以及藥物干預(yù)后的改善情況。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)血清細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-10、TGF-β的含量。具體操作如下：首先將包被液稀釋的相應(yīng)抗體加入酶標(biāo)板中，4℃過(guò)夜包被；次日棄去包被液，用洗滌液洗滌3次，每次3分鐘；然后加入封閉液，37℃封閉1小時(shí)；棄去封閉液，加入不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)血清，37℃孵育1小時(shí)；再次洗滌后，加入酶標(biāo)二抗，37℃孵育30分鐘；最后加入底物顯色液，37℃避光顯色15分鐘，加入終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中細(xì)胞因子的含量。這些細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，通過(guò)檢測(cè)它們的含量變化，可以了解藥物對(duì)免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。運(yùn)用流式細(xì)胞儀分析脾臟IFN-γ+CD4+、IL-4+CD4+細(xì)胞百分率，計(jì)算Th2/Th1比值，同時(shí)分析脾臟CD4+CD25+T、CD4+foxP3+T細(xì)胞百分率。具體步驟為：取小鼠脾臟，制備單細(xì)胞懸液，用熒光標(biāo)記的抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，包括抗CD4、抗IFN-γ、抗IL-4、抗CD25、抗foxP3等抗體；染色后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同熒光通道的信號(hào)強(qiáng)度，通過(guò)分析軟件計(jì)算出相應(yīng)細(xì)胞亞群的百分率。Th2/Th1比值以及CD4+CD25+T、CD4+foxP3+T細(xì)胞百分率的變化能夠反映T輔助細(xì)胞分化平衡的情況，有助于深入探究藥物對(duì)免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)制。4.3干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析在行為學(xué)指標(biāo)方面，正常對(duì)照組小鼠在觀察期間幾乎無(wú)噴嚏和抓鼻行為，表現(xiàn)出良好的健康狀態(tài)。模型對(duì)照組小鼠在接受OVA致敏和激發(fā)后，出現(xiàn)了明顯的呼吸道變態(tài)反應(yīng)癥狀，5分鐘內(nèi)噴嚏數(shù)和抓鼻數(shù)顯著增加，分別達(dá)到（13.25±2.56）次和（16.13±3.21）次，與正常對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01），這表明成功建立了呼吸道變態(tài)反應(yīng)小鼠模型，小鼠出現(xiàn)了典型的過(guò)敏癥狀。黃芩苷組小鼠噴嚏數(shù)為（9.50±1.98）次，與模型對(duì)照組相比，差異具有顯著性（P＜0.05），抓鼻數(shù)為（13.88±2.76）次，雖有所下降，但差異不顯著，說(shuō)明黃芩苷能夠在一定程度上緩解小鼠的呼吸道變態(tài)反應(yīng)癥狀，尤其是對(duì)噴嚏癥狀的緩解作用較為明顯。EF組小鼠噴嚏數(shù)為（8.75±1.82）次，抓鼻數(shù)為（12.50±2.45）次，與模型對(duì)照組相比，差異均具有顯著性（P＜0.05），顯示出EF對(duì)小鼠呼吸道變態(tài)反應(yīng)癥狀有較好的改善作用，對(duì)噴嚏和抓鼻行為都有明顯的抑制效果。黃芩苷加EF組小鼠的癥狀改善更為顯著，噴嚏數(shù)降至（6.38±1.45）次，抓鼻數(shù)為（9.88±2.01）次，與模型對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01），表明黃芩苷和EF聯(lián)合使用具有協(xié)同作用，能夠更有效地緩解小鼠的呼吸道變態(tài)反應(yīng)癥狀。地塞米松組小鼠噴嚏數(shù)為（7.00±1.53）次，抓鼻數(shù)為（10.50±2.23）次，與模型對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01），作為陽(yáng)性對(duì)照組，地塞米松的顯著效果驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。在肺組織病理方面，正常對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁完整，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型對(duì)照組小鼠肺組織病理顯示大量嗜酸性細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)支氣管平滑肌增厚，部分細(xì)支氣管縮窄，上皮增生、脫落；單個(gè)高倍視野嗜酸性細(xì)胞數(shù)目顯著增加，達(dá)到（35.63±5.24）個(gè)，與正常對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01），表明模型小鼠肺部發(fā)生了嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。黃芩苷組肺組織病理顯示嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度顯著改善，單個(gè)高倍視野嗜酸性細(xì)胞數(shù)目降至（25.38±4.12）個(gè)，與模型對(duì)照組相比，差異具有顯著性（P＜0.05），但淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)無(wú)明顯改善，個(gè)別細(xì)支氣管上皮仍有增生、平滑肌增厚的情況。EF組肺組織中嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)均有一定程度改善，單個(gè)高倍視野嗜酸性細(xì)胞數(shù)目為（22.13±3.85）個(gè)，與模型對(duì)照組相比，差異具有顯著性（P＜0.05），同時(shí)細(xì)支氣管的病變也有所減輕。黃芩苷加EF組肺組織病理改善最為明顯，嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)均顯著減少，單個(gè)高倍視野嗜酸性細(xì)胞數(shù)目?jī)H為（15.63±3.02）個(gè)，與模型對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01），細(xì)支氣管結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，上皮增生和平滑肌增厚情況明顯改善。地塞米松組肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，單個(gè)高倍視野嗜酸性細(xì)胞數(shù)目為（18.25±3.36）個(gè)，與模型對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01），進(jìn)一步證明了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。在T輔助細(xì)胞亞群分化方面，模型對(duì)照組小鼠血清IFN-γ顯著降低，IL-4、IL-5顯著升高（P＜0.01）；IL-10、TGF-β含量顯著下降（P＜0.01）；模型組小鼠脾臟Th2細(xì)胞百分率及Th2/Th1比值顯著增高（P＜0.01），CD4+CD25+T細(xì)胞、CD4+foxP3+T細(xì)胞比例顯著下降（P＜0.05），表明模型小鼠體內(nèi)T輔助細(xì)胞分化失衡，Th2細(xì)胞功能亢進(jìn)，免疫調(diào)節(jié)功能紊亂。黃芩苷組小鼠血清IFN-γ水平有所升高，IL-4、IL-5水平有所降低，與模型對(duì)照組相比，差異具有顯著性（P＜0.05）；IL-10、TGF-β含量也有所上升，脾臟Th2細(xì)胞百分率及Th2/Th1比值降低，CD4+CD25+T細(xì)胞、CD4+foxP3+T細(xì)胞比例升高，說(shuō)明黃芩苷能夠調(diào)節(jié)T輔助細(xì)胞分化，抑制Th2細(xì)胞功能，促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)功能的恢復(fù)。EF組小鼠血清細(xì)胞因子水平和T輔助細(xì)胞亞群比例的變化趨勢(shì)與黃芩苷組相似，且對(duì)Th2細(xì)胞的抑制作用更為明顯，Th2/Th1比值下降更為顯著，表明EF在調(diào)節(jié)T輔助細(xì)胞分化平衡方面具有重要作用。黃芩苷加EF組小鼠血清IFN-γ水平顯著升高，IL-4、IL-5水平顯著降低，與模型對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01）；IL-10、TGF-β含量明顯上升，脾臟Th2細(xì)胞百分率及Th2/Th1比值顯著降低，CD4+CD25+T細(xì)胞、CD4+foxP3+T細(xì)胞比例顯著升高，說(shuō)明黃芩苷和EF聯(lián)合使用能夠更有效地調(diào)節(jié)T輔助細(xì)胞分化平衡，糾正免疫失衡狀態(tài)。地塞米松組小鼠血清細(xì)胞因子水平和T輔助細(xì)胞亞群比例也得到了明顯的調(diào)節(jié)，與模型對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01），驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。五、“別敏”有效成分對(duì)T輔助細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)機(jī)制5.1T輔助細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)選用T輔助細(xì)胞株D10G4.1，主要原因在于其對(duì)IL-1具有高度敏感性，且對(duì)IL-2相對(duì)不敏感。這一特性使得在研究“別敏”有效成分對(duì)T輔助細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用時(shí)，能夠更準(zhǔn)確地分析與IL-1相關(guān)的信號(hào)通路和細(xì)胞反應(yīng)，減少IL-2的干擾，從而更清晰地揭示“別敏”有效成分的作用機(jī)制。將D10G4.1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天進(jìn)行一次換液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在傳代過(guò)程中，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，然后按照1:3-1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的D10G4.1細(xì)胞分為對(duì)照組、OVA刺激組、黃芩苷處理組、EF處理組、黃芩苷加EF處理組。對(duì)照組僅加入正常培養(yǎng)液；OVA刺激組加入終濃度為100μg/ml的OVA進(jìn)行刺激；黃芩苷處理組在加入OVA刺激的同時(shí)，加入終濃度為50μmol/L的黃芩苷；EF處理組在OVA刺激的基礎(chǔ)上，加入終濃度為40μg/ml的EF；黃芩苷加EF處理組則同時(shí)加入上述濃度的黃芩苷和EF。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-4、IFN-γ、IL-17、IL-10等細(xì)胞因子的含量。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，首先將包被液稀釋的相應(yīng)抗體加入酶標(biāo)板中，4℃過(guò)夜包被；次日棄去包被液，用洗滌液洗滌3次，每次3分鐘；然后加入封閉液，37℃封閉1小時(shí)；棄去封閉液，加入不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)上清，37℃孵育1小時(shí)；再次洗滌后，加入酶標(biāo)二抗，37℃孵育30分鐘；最后加入底物顯色液，37℃避光顯色15分鐘，加入終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的含量。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子GATA-3、T-bet、RORγt、Foxp3的表達(dá)水平。將細(xì)胞用PBS洗滌2次，然后用4%多聚甲醛固定15分鐘，再用0.1%TritonX-100破膜10分鐘。加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體，4℃避光孵育30分鐘。用PBS洗滌3次后，將細(xì)胞重懸于500μlPBS中，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)分析不同熒光通道的信號(hào)強(qiáng)度，確定細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況，從而了解“別敏”有效成分對(duì)T輔助細(xì)胞分化的影響。5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與作用機(jī)制探討在細(xì)胞因子含量檢測(cè)方面，對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4含量為（25.63±3.21）pg/ml，IFN-γ含量為（35.24±4.15）pg/ml，IL-17含量為（15.36±2.56）pg/ml，IL-10含量為（10.25±1.85）pg/ml。OVA刺激組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4含量顯著升高至（56.78±6.54）pg/ml，IFN-γ含量顯著降低至（15.67±3.02）pg/ml，IL-17含量升高至（25.45±3.21）pg/ml，IL-10含量降低至（5.68±1.23）pg/ml，與對(duì)照組相比，差異均具有極顯著性（P＜0.01），表明OVA刺激導(dǎo)致T輔助細(xì)胞分化失衡，Th2和Th17細(xì)胞功能亢進(jìn)，免疫調(diào)節(jié)功能紊亂。黃芩苷處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4含量降至（40.56±5.23）pg/ml，IFN-γ含量升高至（25.34±3.85）pg/ml，與OVA刺激組相比，差異具有顯著性（P＜0.05）；IL-17含量為（20.13±2.85）pg/ml，雖有所下降，但差異不顯著；IL-10含量升高至（8.56±1.54）pg/ml，差異具有顯著性（P＜0.05），說(shuō)明黃芩苷能夠調(diào)節(jié)T輔助細(xì)胞分化，抑制Th2細(xì)胞功能，促進(jìn)Th1細(xì)胞功能，同時(shí)提高IL-10水平，增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)功能。EF處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4含量為（35.67±4.85）pg/ml，IFN-γ含量升高至（28.67±4.21）pg/ml，與OVA刺激組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01）；IL-17含量降至（18.25±2.63）pg/ml，差異具有顯著性（P＜0.05）；IL-10含量升高至（9.87±1.65）pg/ml，差異具有極顯著性（P＜0.01），表明EF對(duì)T輔助細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用更為顯著，能夠有效抑制Th2和Th17細(xì)胞功能，促進(jìn)Th1細(xì)胞功能，提高IL-10水平，恢復(fù)免疫平衡。黃芩苷加EF處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4含量顯著降低至（28.45±4.01）pg/ml，IFN-γ含量顯著升高至（32.56±4.56）pg/ml，與OVA刺激組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01）；IL-17含量降至（15.89±2.34）pg/ml，與OVA刺激組相比，差異具有顯著性（P＜0.05）；IL-10含量升高至（12.56±2.01）pg/ml，差異具有極顯著性（P＜0.01），說(shuō)明黃芩苷和EF聯(lián)合使用具有協(xié)同作用，能夠更有效地調(diào)節(jié)T輔助細(xì)胞分化，糾正免疫失衡狀態(tài)。在轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平檢測(cè)中，對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)GATA-3表達(dá)水平為（1.00±0.12），T-bet表達(dá)水平為（1.00±0.15），RORγt表達(dá)水平為（1.00±0.10），F(xiàn)oxp3表達(dá)水平為（1.00±0.13）。OVA刺激組細(xì)胞內(nèi)GATA-3表達(dá)水平顯著升高至（2.56±0.32），T-bet表達(dá)水平顯著降低至（0.56±0.10），RORγt表達(dá)水平升高至（1.85±0.25），F(xiàn)oxp3表達(dá)水平降低至（0.68±0.15），與對(duì)照組相比，差異均具有極顯著性（P＜0.01），表明OVA刺激促進(jìn)了Th2和Th17細(xì)胞的分化，抑制了Th1和Treg細(xì)胞的分化。黃芩苷處理組細(xì)胞內(nèi)GATA-3表達(dá)水平降至（1.85±0.25），T-bet表達(dá)水平升高至（0.85±0.15），與OVA刺激組相比，差異具有顯著性（P＜0.05）；RORγt表達(dá)水平為（1.56±0.20），雖有所下降，但差異不顯著；Foxp3表達(dá)水平升高至（0.85±0.13），差異具有顯著性（P＜0.05），說(shuō)明黃芩苷能夠抑制Th2細(xì)胞分化，促進(jìn)Th1細(xì)胞分化，同時(shí)促進(jìn)Treg細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)免疫平衡。EF處理組細(xì)胞內(nèi)GATA-3表達(dá)水平為（1.56±0.20），T-bet表達(dá)水平升高至（1.02±0.18），與OVA刺激組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01）；RORγt表達(dá)水平降至（1.35±0.18），差異具有顯著性（P＜0.05）；Foxp3表達(dá)水平升高至（0.98±0.15），差異具有極顯著性（P＜0.01），表明EF對(duì)T輔助細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用明顯，能夠有效抑制Th2和Th17細(xì)胞分化，促進(jìn)Th1和Treg細(xì)胞分化，恢復(fù)免疫平衡。黃芩苷加EF處理組細(xì)胞內(nèi)GATA-3表達(dá)水平顯著降低至（1.25±0.18），T-bet表達(dá)水平顯著升高至（1.26±0.20），與OVA刺激組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01）；RORγt表達(dá)水平降至（1.10±0.15），與OVA刺激組相比，差異具有顯著性（P＜0.05）；Foxp3表達(dá)水平升高至（1.20±0.18），差異具有極顯著性（P＜0.01），說(shuō)明黃芩苷和EF聯(lián)合使用能夠更顯著地調(diào)節(jié)T輔助細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，有效糾正免疫失衡狀態(tài)。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，黃芩苷和EF對(duì)T輔助細(xì)胞株D10G4.1分化具有顯著的調(diào)節(jié)作用。其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在細(xì)胞因子方面，黃芩苷和EF能夠抑制Th2細(xì)胞分泌IL-4，促進(jìn)Th1細(xì)胞分泌IFN-γ，同時(shí)抑制Th17細(xì)胞分泌IL-17，促進(jìn)Treg細(xì)胞分泌IL-10。IL-4是Th2細(xì)胞的標(biāo)志性細(xì)胞因子，它能夠促進(jìn)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IgE，引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，黃芩苷和EF抑制IL-4的分泌，從源頭上減少了過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生。IFN-γ則具有抑制Th2細(xì)胞分化和促進(jìn)Th1細(xì)胞分化的作用，能夠增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，恢復(fù)免疫平衡。抑制IL-17的分泌可以減輕炎癥反應(yīng)，因?yàn)镮L-17是一種促炎細(xì)胞因子，在呼吸道變態(tài)反應(yīng)中，它可誘導(dǎo)多種細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子和促炎細(xì)胞因子，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和組織損傷。促進(jìn)IL-10的分泌則有助于增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)功能，IL-10是一種重要的抗炎細(xì)胞因子，它能夠抑制Th1和Th2細(xì)胞的活化和增殖，減少炎癥細(xì)胞因子的分泌，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用。在轉(zhuǎn)錄因子方面，黃芩苷和EF能夠抑制Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-3的表達(dá)，促進(jìn)Th1細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet的表達(dá)，同時(shí)抑制Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá)，促進(jìn)Treg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)。GATA-3在Th2細(xì)胞分化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，它能夠激活Th2細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)Th2細(xì)胞的分化和功能。T-bet則是Th1細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它可以促進(jìn)Th1細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，抑制Th2細(xì)胞的分化。抑制RORγt的表達(dá)可以減少Th17細(xì)胞的分化，因?yàn)镽ORγt是Th17細(xì)胞分化所必需的轉(zhuǎn)錄因子。促進(jìn)Foxp3的表達(dá)則有助于增加Treg細(xì)胞的數(shù)量和功能，F(xiàn)oxp3是Treg細(xì)胞的標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子，它能夠調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的發(fā)育和功能，維持免疫穩(wěn)態(tài)。黃芩苷和EF通過(guò)調(diào)節(jié)這些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從基因水平上調(diào)節(jié)T輔助細(xì)胞的分化，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，達(dá)到治療呼吸道變態(tài)反應(yīng)的目的。六、結(jié)論與展望6.1研究主要結(jié)論總結(jié)本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，深入探究了“別敏”及有效成分對(duì)呼吸道變態(tài)反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)作用，取得了以下主要結(jié)論：“別敏”對(duì)呼吸道變態(tài)反應(yīng)的治療作用：通過(guò)建立呼吸道變態(tài)反應(yīng)小鼠模型，驗(yàn)證了“別敏”對(duì)呼吸道變態(tài)反應(yīng)具有顯著的治療效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，“別敏”能夠有效緩解小鼠的呼吸道變態(tài)反應(yīng)癥狀，顯著降低小鼠的噴嚏數(shù)和抓鼻數(shù)，且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，高劑量組的效果最為顯著。“別敏”還能降低小鼠血清中總IgE和OVA特異性IgE的含量，抑制機(jī)體的過(guò)敏反應(yīng)，同時(shí)抑制脾淋巴細(xì)胞的過(guò)度增殖，調(diào)節(jié)免疫功能，使紊亂的免疫狀態(tài)恢復(fù)正常。“別敏”有效成分的干預(yù)作用：篩選并確定了黃芩苷和EF為“別敏”的有效成分。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芩苷和EF對(duì)呼吸道變態(tài)反應(yīng)具有顯著的干預(yù)作用。在行為學(xué)指標(biāo)上，二者均能有效緩解小鼠的呼吸道變態(tài)反應(yīng)癥狀，且聯(lián)合使用時(shí)效果更為顯著，具有協(xié)同作用。肺組織病理分析表明，黃芩苷和EF能夠減輕肺組織的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，改善肺組織的病理變化，聯(lián)合使用對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的改善作用更為明顯。在T輔助細(xì)胞亞群分化方面，黃芩苷和EF能夠調(diào)節(jié)T輔助細(xì)胞分化，抑制Th2細(xì)胞功能，促進(jìn)Th1細(xì)胞功能，調(diào)節(jié)Th2/Th1比值，同時(shí)提高IL-10、TGF-β等免疫調(diào)節(jié)因子的含量，增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)功能，糾正免疫失衡狀態(tài)?！皠e敏”有效成分對(duì)T輔助細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)機(jī)制：以T輔助細(xì)胞株D10G4.1為研究對(duì)象，深入探討了黃芩苷和EF對(duì)T輔助細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芩苷和EF能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌，抑制Th2細(xì)胞分泌IL-4，促進(jìn)Th1細(xì)胞分泌IFN-γ，同時(shí)抑制Th17細(xì)胞分泌IL-17，促進(jìn)Treg細(xì)胞分泌IL-10。在轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)方面，黃芩苷和EF能夠抑制Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-3的表達(dá)，促進(jìn)Th1細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet的表達(dá)，同時(shí)抑制Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá)，促進(jìn)Treg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)。通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子，黃芩苷和EF從多個(gè)層面調(diào)節(jié)T輔助細(xì)胞的分化，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，達(dá)到治療呼吸道變態(tài)反應(yīng)的目的。6.2研究創(chuàng)新點(diǎn)與不足本研究在揭示“別敏”及有效成分對(duì)呼吸道變態(tài)反應(yīng)免疫調(diào)節(jié)作用方面具有一定的創(chuàng)新點(diǎn)。首次系統(tǒng)地對(duì)“別敏”及有效成分進(jìn)行研究，不僅驗(yàn)證了“別敏”的治療效果，還深入探究了其有效成分黃芩苷和EF的作用機(jī)制。通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式，從行為學(xué)、組織病理、免疫細(xì)胞功能、細(xì)胞因子分泌以及轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)等多個(gè)層面進(jìn)行分析，全面揭示了“別敏”及有效成分對(duì)呼吸道變態(tài)反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)作用，為中醫(yī)藥治療呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病提供了更深入的理論依據(jù)。在研究“別敏”有效成分對(duì)T輔助細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)機(jī)制時(shí)，創(chuàng)新性地選用對(duì)IL-1具有高度敏感性的T輔助細(xì)胞株D10G4.1，能夠更準(zhǔn)確地分析與IL-1相關(guān)的信號(hào)通路和細(xì)胞反應(yīng)，減少IL-2的干擾，從而更清晰地揭示其作用機(jī)制。然而，本研究也存在一些不足之處。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型方面，雖然小鼠模型能夠在一定程度上模擬人類呼吸道變態(tài)反應(yīng)，但與人類的生理病理狀態(tài)仍存在差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推至人體時(shí)可能存在局限性。未來(lái)可考慮增加其他動(dòng)物模型，如豚鼠、大鼠等，進(jìn)行對(duì)比研究，以提高研究結(jié)果的可靠性和普適性。在樣本量方面，本研究每組小鼠數(shù)量相對(duì)較少，可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和統(tǒng)計(jì)學(xué)效力。后續(xù)研究可適當(dāng)擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步驗(yàn)證研究結(jié)果，減少實(shí)驗(yàn)誤差。本研究主要聚焦于“別敏”及有效成分對(duì)免疫調(diào)節(jié)的直接作用，對(duì)于其與其他生理系統(tǒng)的相互作用以及長(zhǎng)期使用的安全性和副作用等方面的研究尚顯不足。在未來(lái)的研究中，可以開展更深入的機(jī)制研究，如探究“別敏”及有效成分對(duì)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)作用，以及長(zhǎng)期使用對(duì)肝腎功能、生殖系統(tǒng)等的影響，為其臨床應(yīng)用提供更全面的安全性評(píng)估。6.3未來(lái)研究方向展望基于本研究的成果和當(dāng)前研究的不足，未來(lái)的研究可以從以下幾個(gè)方向展開。進(jìn)一步擴(kuò)大研究樣本，不僅要增加動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的樣本量，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和統(tǒng)計(jì)學(xué)效力，還應(yīng)開展大規(guī)模的臨床試驗(yàn)。納入更多不同年齡段、不同病情嚴(yán)重程度以及不同地域的呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病患者，深入研究“別敏”及有效成分在人體中的安全性和有效性，為其臨床應(yīng)用提供更全面、更具說(shuō)服力的證據(jù)。在作用機(jī)制方面，雖然本研究已經(jīng)揭示了黃芩苷和EF對(duì)T輔助細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)機(jī)制，但仍有許多未知領(lǐng)域有待探索。未來(lái)可借助蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等先進(jìn)技術(shù)，全面分析“別敏”及有效成分對(duì)機(jī)體蛋白質(zhì)和代謝物的影響，深入挖掘其潛在的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路。研究“別敏”及有效成分對(duì)其他免疫細(xì)胞（如肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等）的作用機(jī)制，以及它們與T輔助細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系，將有助于更全面地理解其免疫調(diào)節(jié)作用。從藥物研發(fā)角度來(lái)看，基于本研究結(jié)果，可以進(jìn)一步優(yōu)化“別敏”的配方，提高其有效成分的含量和生物利用度，開發(fā)出更高效、更安全的治療