第四節試管動物受精(fertilization)是指由雌、雄個體產生的卵子(ovum)和精子(sperm)相遇、融合以及它們的核質結合為合子的過程。體外受精(invitrofertilization,IVF)：是指把成熟的卵母細胞或把未成熟卵母細胞(oocyte)在人工創造的體外培養系統中體外成熟(invitromaturation,IVM)后，與體內或體外獲能(invitrocapacition)的精子在體外條件下完成受精過程，形成受精卵(合子)的過程。第7章第4節試管動物顯微受精(microferti1ization)：是指借助顯微操作儀將精子或精子細胞直接注入卵母細胞內來實現受精的過程。將精子注入卵母細胞胞質的顯微受精稱為卵胞質內受精（intracytoplasmicsperminjection，ICSI）將精子注入卵周隙中的顯微受精稱為帶下受精（subzonalinsemination，SUZI）。試管動物：是指利用卵子和精子的體外受精或顯微受精、受精卵體外培養(invitroculture,IVC)和移植獲得的各種動物。第7章第4節試管動物一、體外受精研究簡史及意義（一）體外受精的研究簡史哺乳動物體外受精的研究已經有l10多年的歷史。德國科學家Schenk.SL(1878)最早將家兔和豚鼠排卵前的卵母細胞與附睪精子放入子宮液中培養，發現可使卵丘細胞分散、第二極體排出。當進—步培養時，還注意到有卵裂發生。1951年，張民覺和Austin分別在兔子和大鼠同時發現了哺乳動物精子的獲能現象，由Austin定名為獲能，從此開創了哺乳類體外受精研究的新紀元。第7章第4節試管動物1954年，Thibault等用從母兔子宮內回收的精子，獲得了兔的體外受精成功，張民覺于1959把體外受精的兔卵裂卵移植給受體母兔，獲得了世界上第一胎體外受精的哺乳動物——“試管小兔”，從而拉開了人工制作“試管動物”的帷幕。顯微受精最早報道于日本的Hiramoto(1962)，他將海膽精子注射到海膽卵，但未能激活卵母細胞。在哺乳動物，精子注射試驗首先在嚙齒類中進行，1976年，Uehara等將倉鼠和人精子注入倉鼠卵母細胞質中，觀察到精核能夠去致密并可以發育形成雄原核，但未觀察到卵裂。第7章第4節試管動物1988年，Hosoi和Mann分別報道了兔單精子胞質內受精和小鼠單精子帶下受精成功，并獲得后代。該項技術已先后在多種動物取得成功。1990年，世界上首例ICSI(Lippi等)試管嬰兒和SUZI(Fishel等)試管嬰兒先后誕生。目前，人的顯微受精效率居動物顯微受精首位，人的ICSI的受精率高達60％～70％，胚胎的著床率也達到20％或更高。第7章第4節試管動物（二）體外受精的研究意義在基礎研究領域，體外受精能夠再現體內受精過程，有利于揭示受精的本質和機理，而且有助于研究胚胎的分化和發育。借助體外受精技術，還可以觀察到在體內難以看到的細胞融合現象，有利于闡明細胞膜融合的機理。體外受精可以作為生物模型而有助于發育生物學、遺傳學、分子生物學以及基礎醫學等相關學科的研究。第7章第4節試管動物在應用研究領域，體外受精可用于治療人類不孕癥，使患雙側輸卵管阻塞或排卵障礙等不孕癥的婦女,通過體外受精獲得自己的子女。在胚胎移植技術日益走向商業化和胚胎工程技術迅猛發展的今天，提供大量的良種胚胎己成為亟待解決的問題。通過成熟的誘導排卵、卵巢卵母細胞的體外培養、精子的體外獲能、成熟卵的體外受精和受精卵的體外培養與保存等一整套體外受精技術的開發利用和進一步完善，可以人工生產大量胚胎，為實現胚胎的工廠化生產提供了可能，從而為胚胎移植業開辟胚胎來源。第7章第4節試管動物體外受精技術同胚胎分割、胚胎嵌合、胚胎性別鑒定、胚胎克隆和基因導入等生物工程技術相結合，可以為家畜的部分遺傳性狀改進和培育出遺傳上全新的品種開辟道路。由于珍稀瀕危動物的繁殖力低下，體外受精可以使不同棲息環境的同種動物得到繁殖機會，還可以將體外受精后的胚胎移植給血緣關系相近的物種，可增加瀕危動物的個體數，將體外受精后的瀕危動物胚胎冷凍保存，可以起到保存種質資源的作用。第7章第4節試管動物此外，采用體外受精技術還可以早期利用優良幼齡母畜的卵子，從而縮短世代間隔，提高良種母畜的繁殖效率。顯微受精是借助顯微操作的體外受精技術，這一技術對于提高優良種公畜的利用率和治療男性不育癥方面具有重要的實踐意義，尤其在野生動物的遺傳資源保存和保護以及挽救繁殖力低下的珍稀動物方面具有重要的現實意義和應用前景。第7章第4節試管動物二、體外受精體外受精技術主要包括成熟或未成熟卵母細胞的采集，未成熟卵母細胞的體外成熟培養，精子的體外獲能，成熟卵母細胞與獲能精子的體外受精，受精卵的體外培養和移植等一系列步驟。顯微受精則需要借助顯微操作將精子或精子細胞直接注入卵母細胞內而完成體外受精過程。第7章第4節試管動物（一）卵母細胞采集1.卵巢卵母細胞的采集(1)離體卵巢卵母細胞的采集1)抽吸法2)切割法3)剝離法：取完整的圓形卵泡，放到加有培養掖的平皿中，切開卵泡，可見到卵泡液自卵泡中流出并帶有卵母細胞。此法程序麻煩，但對卵丘-卵母細胞復合體的損傷較小。第7章第4節試管動物(2)卵巢卵母細胞的活體采集主要用于非屠宰大、中動物重復進行卵母細胞的采集。包括手術法及超聲波和腹腔鏡引導下的卵巢卵母細胞活體采集。2.輸卵管卵母細胞回收進入輸卵管的卵母細胞為體內成熟的卵母細胞，回收后可直接用于進行體外受精。第7章第4節試管動物3.卵母細胞形態分類采集到卵母細胞，依據其卵丘細胞-卵母細胞復合體(cumulus-oocytecomplex,COC)的外形選出正常的卵母細胞并進行分類。A級：有三層以上完整而致密的卵丘細胞包繞的卵母細胞；B級：卵丘細胞三層以下，部分脫落的卵母細胞；C級：卵丘細胞擴展而松散；D級：卵丘細胞全部脫落的裸卵。A級和B級卵母細胞可用于成熟培養。第7章第4節試管動物(二)卵母細胞體外成熟培養體外受精研究中，獲取成熟卵母細胞主要通過以下兩條途徑：①體內成熟，經超排處理后，采取成熟卵泡內的卵母細胞或從輸卵管內回收剛剛排出的卵母細胞；②體外成熟，采集卵泡中未成熟的卵母細胞，經體外培養使之成熟。后一種方法可以充分利用母畜的卵巢，是解決卵子來源最有效的途徑，具有更大的實用價值。第7章第4節試管動物1.卵母細胞成熟的特征卵母細胞成熟是指充分生長卵母細胞向成熟卵母細胞轉化的過程。卵母細胞體外成熟主要包括減數分裂的恢復和完成，以及細胞質、細胞膜、透明帶、卵丘細胞的成熟變化。第一極體排出標志著卵母細胞已達到核成熟。排卵后，卵母細胞核的發育似乎出現短暫停滯狀態，并因受精而激活，也可因某些物理、化學、生物因素而激活，完成第二次減數分裂，放出第二極體，成為成熟卵子。第7章第4節試管動物2.卵母細胞體外成熟培養方法(1)卵母細胞成熟培養前的準備卵母細胞成熟培養前主要準備培養液，用于家畜卵母細胞體外成熟的基礎培養液很多，近年來，越來越多的研究者使用了合成培養液(如TCM-199,Ham’sF10和Ham’sF12),而以TCM-199的報道最多。牛、綿羊和豬的卵母細胞應用這種培養液體外成熟率達到80%以上。在基礎培養液中添加胎犢血清FCS和NCS比添加BSA可獲得更高的成熟率，近期研究資料表明，以添加發情牛血清（estruscowserum,ECS）或發情山羊血清(estrusgoatserum,EGS)代替FCS或NCS可獲得較高的成熟率。血清不僅能促進卵母細胞成熟，而且與成熟后的受精率和其后的發育率有關。第7章第4節試管動物在基礎培養液中添加促性腺激素，對家畜卵母細胞體外成熟亦具有十分重要的作用。常用于體外成熟的促性腺激素有hCG或PMSG，也有用LH+FSH者。促性腺激素能誘發卵丘細胞擴展，增加達到MⅡ期的比率，并有促進卵裂的作用。雌激素對家畜卵母細胞體外成熟的影響，尚存在分歧。許多學者認為雌二醇對卵母細胞完全成熟是有益的，還能有效地提高受精后胚胎的發育率。但在添加ECS或EGS的情況下，雌激素對牛卵母細胞體外成熟和胚胎發育并不重要。近期試驗表明，以添加ECS或EGS取代促性腺激素和雌激素，同樣可使牛卵母細胞成熟率達到90%以上，因而可以采用無激素培養法。第7章第4節試管動物(2)卵母細胞的培養牛卵母細胞成熟培養液為含10%FCS或ECS，10IU/mlPMSG和10IU/mlhCG的TCM199(Earle’s鹽液)；山羊卵母細胞成熟培養液為含10%FCS，20μg/mlhCG,120μg/ml17β-E2的TCM199(Hepes緩沖)；綿羊卵母細胞成熟培養液為含10%FCS的TCM199(Hepes緩沖)；豬卵母細胞成熟培養液為含10%FCS的TCM199(Earle’s鹽液)，并添加激素及生長因子等。卵母細胞成熟培養時，在培養皿底部制作0.05～0.2mL培養液微滴，上面覆蓋用5%CO295%空氣充分飽和的滅菌石蠟油，每個培養皿可作1～6微滴。選取A，B級卵母細胞，用成熟培養液洗滌2～3次，然后于每一微滴中移入10～15個卵母細胞，在5%CO2、飽和濕度條件下培養。培養溫度和時間因畜種不同而異，黃牛、奶牛為39℃為宜，水牛為37℃，綿羊和山羊為37～39℃，豬為39℃。牛、綿羊和山羊的培養時間以24～26h為宜，豬則以42～48h為宜。第7章第4節試管動物3.影響卵母細胞體外成熟的因素(1)動物種類(2)卵母細胞供體母畜年齡及性機能和卵巢狀態(3)卵母細胞類型(4)卵巢運輸、取卵方式和季節(5)培養系統(三)精子體外獲能1.精子體外獲能的主要途徑第7章第4節試管動物主要有高離子強度處理法、高pH處理法、IA(ionophoreA23187)處理法、肝素處理法、咖啡因處理法以及添加牛卵泡液、豬卵泡液、子宮液、輸卵管液等。2.獲能精子的特征及檢測(1)獲能精子的特征獲能精子在代謝、運動方式和頂體形態上均發生一系列明顯的變化，基本上與精子體內獲能相似。(2)獲能精子的檢測1)運動方式的測定吸取5μl獲能的浮游精子，滴到載玻片上，蓋以蓋玻片，周圍滴液體石蠟以防干固，置暗視野顯微鏡下觀察精子的活力、運動類型和運動速度，以判斷體外獲能效率。第7章第4節試管動物2)頂體反應的檢測伴隨著精子獲能，可以誘發頂體反應，這是精子入卵不可缺少的變化，觀察頂體反應是判斷精子獲能的有效方法之一。用電鏡技術觀察精子的超微結構，如果精子頭部質膜與頂體外膜泡狀化，或僅殘存頂體內膜，就能準確地判斷精子發生了頂體反應，但電鏡技木制片繁瑣，成本也高，一般實驗室尚難實施。另一種頂體反應的檢測方法是采用頂體三重染色技術(triple-staintechnique,TST)在光鏡下觀察進行鑒別。將精液用培養液或稀釋液，以1200～1500×g離心5min,洗滌3次；將精子懸浮與等量1％臺盼蘭混和，在離心管中于38℃培養10min，600×g離心7min，棄上清液，然后將精子重新懸浮于稀釋液中，反復洗滌兩次，直到上清液清亮或呈談蘭色為止；將精子滴于玻片上，涂片，風干，將用1mol/l二甲胂酸鹽緩沖液(pH7.4)配制的3%戊二醛溶液滴于玻片固定精子30min,然后用無離子水洗洗兩次；以0.8%的堿性棕Y水溶液染色5min,水洗；再以用1mol/lTris緩沖液(pH5.3)配制的0.8%孟加拉玫瑰紅染色12min,水洗；用酒精系列脫水、二甲苯透明，中性樹脂封片；以1500×鏡檢。第7章第4節試管動物TST可將精子頂體帽和頂體后區染成不同的顏色,當頂體后區呈蘭黑色時，說明該精子在染色前已經死亡；頂體后區呈棕色時，說明該精子在染色前是活精子；頂體帽呈品紅色時，說明從未發生過頂體反應；頂體帽呈白色者，說明精子發生過頂體反應。TST法雖然可以準確地將真假頂體反應的精子區分開來，也無需昂貴的設備，但其不足之處在于有可能將一部分固定染色前已死亡的真頂體反應精子誤判為假頂體反應精子。一般檢測只在試驗精子獲能方法時應用，一旦方法成熟，應用即可，不再進行檢測。第7章第4節試管動物(四)體外受精受精操作時，將經獲能處理的精子懸浮液5μl置于塑料培養皿或多孔培養板，將滅菌石蠟油慢慢注入培養皿，再將95μl精子懸浮液注入小滴，制成0.1mL的球狀液滴，將外形正常且卵丘細胞明顯擴展的體外培養成熟或回收的體內成熟卵母細胞，以10～15枚為一組緩緩移入精子懸浮液滴中，置CO2培養箱培養使精、卵完成體外受精。(五)顯微受精1.顯微受精操作顯微受精是借助于顯微操作的體外受精，分為ICSI和SUZI兩類。

第7章第4節試管動物第7章第4節試管動物第7章第4節試管動物第7章第4節試管動物2.影響顯微受精的因素影響顯微受精的因素很多，其中主要有精子注入到卵母細胞的注射部位，精子的狀態，精子發生，卵子狀態，顯微受精卵的激活和顯徽操作環境條件等。三、早期胚胎代謝及體外培養

（一）胚胎體外發育阻斷

胚胎發生體外發育阻斷的細胞階段與胚胎基因組活化時間有關，即卵源性基因控制向胚源性基因控制轉換的階段。第7章第4節試管動物（二）簡單化學限定培養系統簡單化學限定培養液是指用無機物和有機物，按一定要求配制而成，并在使用時添加一定比例的蛋白類物質、氨基酸和抗生素而組成的動物早期胚胎體外培養液。1.培養方法2.營養物質對早期胚胎體外發育的影響3.培養環境對早期胚胎體外發育的影響1)培養液的體積2)培養液滲透壓3)氧氣含量變化4)水5)培養液中的緩沖成分6)培養液中過氧化物對胚胎發育的影響7)培養液中胚胎數的影響第7章第4節試管動物(三)共同培養系統共同培養系統是將胚胎與其它組織細胞(體細胞)共同培養，組織細胞產生的物質供胚胎發育所需，從而有利于胚胎克服體外發育阻斷，改善胚胎發育。1.胚胎與體細胞共培養的方法1)輸卵管器官培養和離體輸卵管共培養2)胚胎與體細胞單層共培養先用培養液培養體細胞，形成貼壁細胞單層后與胚胎共培養。目前所用的細胞類型有：輸卵管上皮細胞(oviductepithelialcells)、子宮內膜上皮細胞(endometricalepithelialcells)、卵泡顆粒細胞(granulosacells)、卵丘細胞(cumulus)、胚泡滋養層囊泡(trophoblasticvesicles)、、成纖維細胞(fibroblasts)、羊膜囊細胞(amnioticsaccells)、禽卵黃膜腔(birdsvitellinecavity)和腎細胞(nephriccells)等。第7章第4節試管動物3)用體細胞培養制備的條件培養液培養胚胎先用培養液培養體細胞，隔一定時間收集培養液，離心后的上清液即為條件培養液(conditionmedium,CM),然后用條件培養液培養胚胎。2.體細胞共同培養系統對胚胎發育的作用共同培養系統中的體細胞叫援助細胞(helpercell)或飼養細胞(feedercell)。體細胞共培養系統對胚胎發育的作用主要可能有以下幾個方面。1)援助細胞產生促有絲分裂因子2)援助細胞產生促胚胎分化因子3)援助細胞可脫去培養液中胚胎毒性的物質的毒性第7章第4節試管動物(四)含有肽類生長因子的培養系統特殊的生長因子可能對附植前胚胎發育起作用。用反轉錄酶-聚合酶鏈式反應(reverse-transcriptase-polymerasechainreaction,RT-PCR)技術檢測胚胎中的mRNAs發現，生長因子或細胞分裂素和/或其受體存在于輸卵管、子宮和胚胎。第7章第4節試管動物分子生物學研究也證明大量生長因子存在于胚胎或胚胎周圍。生長因子對培養胚胎的作用極為重要的發現就是這些生長因子在妊娠的最初幾天在生殖道組織中的表達和