SZDB/ZSZDB/Z51—2011動物甲型H1N1(2009)流感病毒實時熒光2011-12-29發(fā)布2012-01-01實施深圳市市場監(jiān)督管理局發(fā)布II 本文件起草單位：深圳市檢驗檢疫科學研究院、中華人民共和國深圳出入境檢強、曾少靈、詹愛軍、曹琛福、陳兵、林慶燕、陳書法，本標準以一步法為例規(guī)定各項操作，等效二步法可參見相動物甲型H1N1(2009)流感病毒實時熒光RT-PCR檢測方法本指導性技術文件適用于快速檢測咽拭子、鼻拭子、泄殖腔拭子、組織樣品等臨床樣品中甲型下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所Ct值Cyclethreshold，反應管的熒光信號達到設定閾值時所DEPCdiethylprocarbonate,二乙基焦FAM6-carboxy-flPBS磷酸鹽緩沖液pH1N1（2009）pandemicH1N1virusof2009，甲型H1N1(2009)流感病毒RT-PCRreversetranscriptionPolym——實時熒光PCR儀；12）；——混勻器；）；）；——離心管；——PCR光學反應管。上游引物pH1N1(2009)F序列為：5'列為：5'-GGAACCGATTCTTA(C/T)它熒光基團及其相應的淬滅基團。采用無DNA酶、無RNA酶水將每條引物與探針配制成100μmol/L儲存液，置-20℃或更低溫度凍存。使用時取適量配制成10μmol/L工作液，避免多次凍融。——三氯甲烷；——異丙醇；——無水乙醇；——70％乙醇（用新開啟的滅菌雙蒸水配制，-20℃預冷將滅菌的棉拭子插入豬鼻腔，輕輕擦拭3～5次并慢慢旋轉，然后取出拭子并放入盛有2mL滅菌的次并慢慢旋轉2～3次，取咽喉分泌液；再將另一個棉拭子插入該禽的泄殖腔內1.5cm～2cm輕輕擦拭3～5次并旋轉2～3次；將咽喉拭子和泄殖腔棉拭子一起放入盛有1mL滅菌的0.01moL/LpH7.0～7.4PBS(內含青霉素2000IU/mL，腔拭子容易造成傷害,可隨機采集5個新鮮糞便樣品，每個樣品1~2采集被采樣人員的咽拭子、口腔含漱液、鼻咽或氣管抽取物、痰等物品。樣品不得待檢樣品在2℃~8℃保存不應超過24h；-20℃保存將采集的樣品于旋渦振蕩器上振蕩混勻約5s后，b)每管加入600μL裂解液，分別加入被檢樣本、陰性對照、陽性對照各200μL，再加入200μL氯34配制的每個PCR反應試劑充分混勻，瞬時離心后8.2.2.1反應條件設定8.2.2.2通道選擇報告熒光（ReportDye）設定為FAM（或按探針實際標記的熒光基團設定淬滅熒光（QuenchDye）設定為None，校準熒光（Referencedye）設定為None。可根據不同品牌儀器說明等效設置參數(shù)。9分析條件設定和結果判定設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照樣品擴增曲線的最高點為準，具體還需根有明顯的對數(shù)增長期（典型擴增曲線的圖例見附錄C），才可判定試驗成立，否則試驗無效。9.3.1陽性反應結果判定在試驗成立的條件下，檢測結果呈現(xiàn)Ct值≤35且呈現(xiàn)典型擴增曲線，判為熒光PCR陽性反應，9.3.3可疑反應結果判定9.3.4可疑樣品處理檢測的Ct值<40，且呈現(xiàn)典型擴增曲線，判為陽性反應，表明pH1N1(2009)毒株核酸陽性。否則判為5A.10.01mol/LPBS(pH7.2～7.4)氯化鉀(KCl)