登革2型病毒蛋白與整合素β3相互作用的篩選與機制探究一、引言1.1研究背景登革病毒（Denguevirus，DENV）是一種嚴重危害人類健康的病原體，屬于黃病毒科黃病毒屬，主要通過伊蚊叮咬傳播。根據血清型的不同，登革病毒可分為4種類型（DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4），各型之間抗原性存在差異。感染登革病毒后，患者的臨床表現輕重不一，從無癥狀感染、登革熱（Denguefever，DF）到嚴重的登革出血熱（Denguehemorrhagicfever，DHF）和登革休克綜合征（Dengueshocksyndrome，DSS）。其中，登革出血熱和登革休克綜合征病情兇險，病死率較高，嚴重威脅患者生命安全。登革病毒在全球熱帶和亞熱帶地區廣泛流行，包括東南亞、西太平洋地區、美洲、非洲等。據世界衛生組織（WHO）估計，全球每年有3.9億人感染登革病毒，其中約9600萬人出現臨床癥狀。近年來，隨著全球化進程的加速、國際旅行和貿易的頻繁以及氣候變化等因素的影響，登革病毒的傳播范圍不斷擴大，疫情呈現出上升和擴散的趨勢。例如，在巴西，2024年截至3月15日，各地登記的登革熱感染人數已達到1684781人，而去年全年的感染人數為1658814人，衛生部預測2024年的感染者人數將會達到2023年的兩倍。在秘魯，2024年截至第10個流行病學周，已累計報告登革熱病例61736例，死亡病例70例，第10個流行病學周新增感染病例15214例，是今年以來報告病例數量最多的一周。在我國，登革熱主要流行于廣東、廣西、海南、福建、浙江等南方地區，具有典型的輸入性和突發性特點。由于我國大部分地區存在伊蚊的分布，且人群對登革病毒普遍易感，一旦有登革病毒輸入，就有可能引發本地傳播和疫情暴發。如2014年廣東省發生的登革熱疫情，累計報告病例數超過4萬例，給當地的公共衛生和醫療系統帶來了巨大壓力。目前，針對登革病毒感染，尚無特效的抗病毒藥物，治療主要以對癥支持治療為主，如控制疼痛、及時補液、預防出血等。疫苗研發方面，雖然全球有多個登革疫苗處于研發階段，但由于登革病毒存在4種血清型，且不同型別毒株無交叉免疫，還存在“抗體增強效應”，即人體感染一種亞型登革病毒產生的抗體可能會幫助其他型別的病毒侵襲細胞，導致病情加重，這使得登革疫苗的研發面臨諸多挑戰，全球目前還沒有安全有效的登革疫苗上市。因此，深入研究登革病毒的致病機制，尋找新的治療靶點和干預策略，對于登革病毒感染的防治具有至關重要的意義。整合素（Integrin）是一類細胞表面的跨膜糖蛋白受體，由α和β兩個亞基組成異二聚體，在細胞與細胞、細胞與細胞外基質的相互作用中發揮著關鍵作用。整合素β3是整合素家族中的重要成員，它不僅在血小板聚集、止血和血栓形成等生理病理過程中具有重要功能，還參與了腫瘤細胞的遷移、侵襲和血管生成等過程。已有研究表明，整合素β3與登革病毒蛋白E存在相互作用，而E蛋白是登革病毒感染人體細胞的關鍵蛋白質，其與宿主細胞表面受體的結合是病毒感染的起始步驟。因此，篩選出登革2型病毒中與整合素β3相互作用的蛋白質，對于深入了解登革病毒與人體宿主細胞相互作用的機制，揭示登革病毒的致病過程，以及尋找新的抗病毒治療靶點具有重要的理論和實際意義。1.2整合素β3概述整合素β3（Integrinβ3）是整合素家族的重要成員，在細胞的生理和病理過程中扮演著關鍵角色。從結構上看，整合素β3是一種跨膜糖蛋白，通常與α亞基結合形成異二聚體發揮作用。以常見的αⅡbβ3（也稱為血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa，GPⅡb/Ⅲa）為例，它由αⅡb（CD41）和β3（CD61）兩個亞基通過非共價鍵結合而成，αⅡb亞基分子量約為130-150kDa，β3亞基分子量約為90-110kDa。每個亞基都具備較大的細胞外結構域、一個跨膜結構域和較小的細胞內結構域。細胞外結構域是與配體結合的關鍵部位，能夠特異性識別并結合多種細胞外基質蛋白和血漿蛋白，如纖維蛋白原、vonWillebrand因子等，這些配體結合位點的氨基酸序列和三維結構決定了其對不同配體的親和力和選擇性?？缒そY構域將整合素錨定在細胞膜上，保證其在細胞膜上穩定存在，而細胞內結構域則與細胞內部的細胞骨架蛋白（如肌動蛋白）和信號轉導分子相連接，這對于細胞外信號向細胞內傳遞以及細胞的形態改變和功能發揮至關重要。在分布方面，整合素β3并非均勻分布于所有細胞，而是具有一定的組織和細胞特異性。它主要分布在血小板表面，在靜止狀態下，整合素β3處于低親和力狀態；當血小板被激活時，其構象發生改變，親和力顯著增加，從而在血小板聚集、止血過程以及血栓形成等生理和病理過程中發揮關鍵作用。除了血小板外，整合素β3在其他一些細胞類型，如內皮細胞、平滑肌細胞等中也有少量表達，但在這些細胞中的功能和在血小板中的作用有所不同。例如，在腫瘤細胞中，整合素β3的表達水平與腫瘤的遷移、侵襲和血管生成密切相關，高表達的整合素β3能夠促進腫瘤細胞與細胞外基質的黏附，增強腫瘤細胞的遷移能力，進而促進腫瘤的轉移。在血管內皮細胞中，整合素β3參與調節血管的通透性和細胞間的黏附，對維持血管的正常生理功能具有重要意義。整合素β3的生理功能十分廣泛，涵蓋了多個生理和病理過程。在血小板聚集與止血過程中，其作用尤為關鍵。當血管損傷出血時，血小板被激活，整合素β3的構象發生改變，對纖維蛋白原的親和力大大增加。纖維蛋白原可以同時結合兩個血小板表面的整合素β3，像“橋梁”一樣將血小板連接起來，形成血小板聚集體，從而堵塞血管破損處，阻止血液繼續外流。此外，整合素β3還可以與血管內皮下的成分（如vonWillebrand因子）結合，使血小板與內皮下成分黏附，這是血小板止血功能的起始步驟，為后續的血小板聚集和血栓形成奠定基礎。在血栓形成與血管疾病關聯方面，在病理情況下，如動脈粥樣硬化斑塊破裂、血管內皮損傷等，整合素β3過度激活會導致血小板過度聚集和血栓形成。血小板血栓可以阻塞血管，導致局部組織缺血缺氧，引發心肌梗死、腦卒中等嚴重的心腦血管疾病。同時，整合素β3還參與血管疾病進展過程中血管壁的炎癥反應、細胞增殖和遷移等調節過程，在動脈粥樣硬化病變中，它參與血小板與血管壁細胞之間的信號傳遞，促進炎癥細胞在血管壁的聚集和脂質沉積，加速動脈粥樣硬化的發展。整合素β3還在細胞與細胞外基質的相互作用中發揮重要作用，通過與細胞外基質中的各種配體結合，調節細胞的黏附、遷移、增殖和分化等過程，對維持組織和器官的正常結構和功能具有重要意義。在胚胎發育過程中，整合素β3參與細胞的遷移和分化，對胚胎的正常發育至關重要。在傷口愈合過程中，整合素β3介導成纖維細胞與細胞外基質的黏附，促進細胞的遷移和增殖，有助于傷口的修復。近年來，越來越多的研究表明，整合素β3與病毒感染之間存在密切聯系。許多病毒在感染宿主細胞的過程中，需要借助宿主細胞表面的受體來實現感染的起始步驟。整合素β3作為一種廣泛存在于細胞表面的受體，有可能成為某些病毒的潛在結合靶點。例如，已有研究發現登革病毒蛋白E與整合素β3存在相互作用，而E蛋白是登革病毒感染人體細胞的關鍵蛋白質，其與宿主細胞表面受體的結合是病毒感染的起始步驟。這種相互作用可能影響登革病毒進入細胞的效率和途徑，進而影響病毒的感染過程和致病機制。深入研究整合素β3與病毒蛋白之間的相互作用，對于揭示病毒的感染機制、開發新的抗病毒治療策略具有重要意義。1.3研究目的與意義本研究旨在篩選出與整合素β3相互作用的登革2型病毒蛋白，為深入了解登革病毒的入侵機制提供關鍵線索，也為開發新型抗病毒治療手段奠定理論基礎。登革病毒的感染起始于病毒與宿主細胞表面受體的相互作用，明確這些相互作用蛋白是解析病毒入侵細胞機制的核心。整合素β3作為細胞表面的重要受體，與登革病毒蛋白E存在相互作用，然而除了E蛋白外，是否還有其他登革2型病毒蛋白與整合素β3相互作用尚不清楚。通過系統性地篩選這些相互作用蛋白，有助于全面揭示登革病毒與宿主細胞之間的分子對話機制，明確病毒感染過程中關鍵的分子靶點，這對于理解病毒的致病機制、病毒在細胞內的復制和傳播途徑等基礎科學問題具有重要意義。從臨床應用角度來看，目前針對登革病毒感染缺乏特效治療藥物和安全有效的疫苗。本研究篩選出的相互作用蛋白，有望成為新型抗病毒治療的潛在靶點。例如，針對這些相互作用蛋白設計特異性的抑制劑或拮抗劑，阻斷病毒與整合素β3的結合，從而抑制病毒的入侵和感染，為開發新的抗病毒藥物提供全新的思路和策略。這將為登革病毒感染的臨床治療帶來新的希望，有助于改善患者的治療效果，降低登革熱相關疾病的發病率和死亡率，對全球公共衛生事業具有重要的推動作用。此外，研究結果還可能為登革疫苗的研發提供理論支持，通過深入了解病毒與宿主細胞的相互作用機制，優化疫苗設計，提高疫苗的安全性和有效性。二、登革2型病毒及整合素β3相關研究基礎2.1登革2型病毒的結構與蛋白組成登革2型病毒（DENV-2）作為登革病毒的一種重要血清型，在全球登革熱疫情中扮演著關鍵角色，其結構與蛋白組成是理解病毒感染機制和致病過程的基礎。從整體結構來看，登革2型病毒呈球形，直徑約為50nm，屬于黃病毒科黃病毒屬，其結構較為復雜，由核心和包膜兩大部分構成。核心部分包含病毒的遺傳物質，即單股正鏈RNA，該RNA長度約為11kb，是病毒復制和遺傳信息傳遞的關鍵載體。RNA與多個核衣殼蛋白（Capsidprotein，C）緊密結合，形成核糖核蛋白復合物，核衣殼蛋白在維持RNA的穩定性以及參與病毒的包裝過程中發揮著重要作用。病毒的包膜則包裹在核心外部，由脂質雙層膜和鑲嵌其中的蛋白質組成。包膜脂質雙層來源于宿主細胞的細胞膜，在病毒出芽釋放的過程中獲得。包膜上鑲嵌著兩種重要的結構蛋白，分別是包膜蛋白（Envelopeprotein，E）和膜蛋白（Membraneprotein，M）。包膜蛋白E是病毒表面含量最豐富且功能最為關鍵的蛋白之一，每個病毒粒子約含有180個E蛋白分子。E蛋白呈啞鈴狀，由三個結構域（DomainⅠ、DomainⅡ和DomainⅢ）組成。DomainⅠ位于E蛋白的中心位置，主要起到維持蛋白整體結構穩定的作用；DomainⅡ包含一個高度保守的融合肽序列，在病毒感染宿主細胞的過程中，當病毒與宿主細胞表面受體結合并發生內吞后，隨著內體環境pH值的降低，融合肽會暴露并插入宿主細胞膜，介導病毒包膜與宿主細胞膜的融合，從而使病毒的基因組得以進入宿主細胞內，開啟病毒的復制周期；DomainⅢ則類似于免疫球蛋白的結構域，含有與宿主細胞表面受體結合的位點，能夠特異性地識別并結合宿主細胞表面的多種受體，如整合素、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等，是病毒實現感染宿主細胞的關鍵功能區域。膜蛋白M在病毒成熟過程中發揮重要作用，它由病毒的前體蛋白prM經蛋白酶切割加工而成。在病毒感染的早期階段，prM與E蛋白緊密結合，協助E蛋白正確折疊和組裝，并且在病毒從內質網運輸到高爾基體的過程中，對E蛋白起到保護作用，防止其在運輸過程中發生不恰當的融合。當病毒運輸到細胞表面并準備釋放時，prM被宿主細胞內的蛋白酶切割為M蛋白，此時M蛋白與E蛋白一起構成成熟病毒的包膜結構，對維持病毒粒子的穩定性和感染性至關重要。除了上述結構蛋白外，登革2型病毒還編碼7種非結構蛋白（Non-structuralproteins，NS），分別為NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。這些非結構蛋白在病毒的生命周期中各自承擔著獨特而重要的功能。NS1是一種高度保守的糖蛋白，它不僅能夠在病毒感染細胞的過程中分泌到細胞外，還可以與宿主細胞表面的某些分子相互作用。在細胞外，NS1可以激活補體系統，引發炎癥反應，導致血管通透性增加，這與登革出血熱和登革休克綜合征等嚴重疾病的發生發展密切相關；在細胞內，NS1參與病毒RNA的復制過程，與其他非結構蛋白共同形成復制復合體，為病毒RNA的合成提供必要的條件。NS2A和NS2B相對較小，它們在病毒復制復合體的組裝過程中發揮重要作用。NS2A能夠與細胞膜相互作用，改變細胞膜的結構和功能，為病毒的復制和組裝提供合適的微環境；NS2B則主要作為NS3蛋白酶的輔助因子，與NS3結合形成有活性的蛋白酶復合物，參與病毒多聚蛋白的切割加工過程，將病毒翻譯產生的多聚蛋白切割成各個具有獨立功能的成熟蛋白，這對于病毒的正常組裝和成熟至關重要。NS3是一種多功能蛋白，它具有絲氨酸蛋白酶活性、RNA解旋酶活性和NTPase活性。其蛋白酶活性在病毒多聚蛋白的切割過程中發揮關鍵作用，確保病毒蛋白的正確加工和成熟；RNA解旋酶活性能夠解開雙鏈RNA，為病毒RNA的復制和轉錄提供單鏈模板；NTPase活性則為這些過程提供能量，保證病毒的遺傳物質能夠順利進行復制和轉錄。NS4A和NS4B在病毒復制過程中也起到重要作用。它們可以干擾宿主細胞的信號傳導通路，抑制宿主細胞的抗病毒反應，為病毒的復制創造有利條件。同時，NS4A還參與病毒復制復合體的形成，與其他非結構蛋白協同作用，促進病毒RNA的合成。NS5是病毒最大的非結構蛋白，它具有RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）活性和甲基轉移酶活性。RdRp活性負責以病毒RNA為模板合成新的病毒RNA鏈，實現病毒基因組的復制；甲基轉移酶活性則參與病毒RNA的5'端加帽過程，加帽后的病毒RNA能夠逃避宿主細胞的免疫識別，同時也有助于病毒RNA的穩定性和翻譯效率的提高。登革2型病毒的結構蛋白和非結構蛋白在病毒的感染、復制、組裝和致病過程中相互協作、各司其職，共同構成了一個復雜而精細的病毒生命周期調控網絡。深入研究這些蛋白的結構和功能，對于揭示登革病毒的致病機制、開發有效的抗病毒藥物和疫苗具有重要的理論和實踐意義。2.2整合素β3的生物學特性整合素β3作為整合素家族的重要成員，其生物學特性在細胞生理活動中扮演著舉足輕重的角色，對其深入了解有助于揭示細胞間相互作用以及疾病發生發展的內在機制。從分子結構層面來看，整合素β3是一種跨膜糖蛋白，由α和β兩個亞基通過非共價鍵結合形成異二聚體。以血小板表面常見的αⅡbβ3為例，αⅡb亞基分子量約為130-150kDa，β3亞基分子量約為90-110kDa。每個亞基都包含獨特的結構域，細胞外結構域較大，是與配體結合的關鍵區域，能夠特異性識別并結合多種細胞外基質蛋白和血漿蛋白，如纖維蛋白原、vonWillebrand因子等。這些配體結合位點的氨基酸序列和三維結構高度特異，決定了整合素β3對不同配體的親和力和選擇性?？缒そY構域則將整合素β3牢固地錨定在細胞膜上，確保其在細胞膜上穩定存在，為細胞外信號向細胞內傳遞提供了結構基礎。而細胞內結構域雖較小，但與細胞內部的細胞骨架蛋白（如肌動蛋白）和信號轉導分子緊密相連，在細胞的形態改變、遷移以及信號傳導等過程中發揮著不可或缺的作用。在細胞表面分布方面，整合素β3具有明顯的特異性。它主要分布在血小板表面，在血小板的生理功能中起著核心作用。在靜止狀態下，血小板表面的整合素β3處于低親和力狀態，與配體的結合能力較弱。然而，當血小板被激活時，如受到血管損傷信號刺激或凝血因子的作用，整合素β3的構象會發生顯著改變，轉變為高親和力狀態，此時其對纖維蛋白原等配體的親和力大幅增加。除了血小板，整合素β3在其他一些細胞類型中也有少量表達，如內皮細胞、平滑肌細胞以及某些腫瘤細胞。在不同細胞類型中，整合素β3的功能也有所差異。在內皮細胞中，它參與調節血管的通透性和細胞間的黏附，對維持血管的正常生理功能至關重要。在腫瘤細胞中，整合素β3的表達水平與腫瘤的遷移、侵襲和血管生成密切相關，高表達的整合素β3能夠促進腫瘤細胞與細胞外基質的黏附，增強腫瘤細胞的遷移能力，進而促進腫瘤的轉移。在細胞生理活動中，整合素β3發揮著多方面的重要作用。在血小板聚集與止血過程中，其作用尤為關鍵。當血管受損出血時，血小板迅速被激活，整合素β3構象改變，對纖維蛋白原的親和力顯著提高。纖維蛋白原可以同時與兩個血小板表面的整合素β3結合，像“橋梁”一樣將血小板連接起來，形成血小板聚集體，從而堵塞血管破損處，實現止血功能。此外，整合素β3還可以與血管內皮下的成分（如vonWillebrand因子）結合，使血小板與內皮下成分黏附，這是血小板止血功能的起始步驟，為后續的血小板聚集和血栓形成奠定基礎。在血栓形成與血管疾病關聯方面，在病理情況下，如動脈粥樣硬化斑塊破裂、血管內皮損傷等，整合素β3過度激活會導致血小板過度聚集和血栓形成。血小板血栓可以阻塞血管，導致局部組織缺血缺氧，引發心肌梗死、腦卒中等嚴重的心腦血管疾病。同時，整合素β3還參與血管疾病進展過程中血管壁的炎癥反應、細胞增殖和遷移等調節過程，在動脈粥樣硬化病變中，它參與血小板與血管壁細胞之間的信號傳遞，促進炎癥細胞在血管壁的聚集和脂質沉積，加速動脈粥樣硬化的發展。整合素β3還在細胞與細胞外基質的相互作用中發揮重要作用。它通過與細胞外基質中的各種配體結合，調節細胞的黏附、遷移、增殖和分化等過程。在胚胎發育過程中，整合素β3參與細胞的遷移和分化，對胚胎的正常發育至關重要。在傷口愈合過程中，整合素β3介導成纖維細胞與細胞外基質的黏附，促進細胞的遷移和增殖，有助于傷口的修復。2.3病毒與細胞受體相互作用的一般機制病毒作為一種非細胞型微生物，其生存和繁殖依賴于宿主細胞。病毒感染細胞的第一步是與細胞表面的受體發生特異性相互作用，這一過程猶如“鑰匙與鎖”的精準匹配，決定了病毒的宿主范圍和組織嗜性。病毒表面存在多種蛋白結構，這些蛋白是與細胞受體結合的關鍵元件。以流感病毒為例，其表面的血凝素（Hemagglutinin，HA）蛋白能夠特異性地識別并結合宿主細胞表面的唾液酸受體。HA蛋白由三個亞基組成，形成一個三聚體結構，其頭部區域具有高度保守的唾液酸結合位點。當流感病毒與宿主細胞相遇時，HA蛋白的頭部與細胞表面的唾液酸殘基緊密結合，通過這種分子間的相互作用，病毒得以附著在細胞表面。HIV病毒則通過表面的糖蛋白gp120與宿主細胞表面的CD4受體結合。gp120蛋白具有復雜的三維結構，其可變區和保守區協同作用，識別并結合CD4受體。在結合過程中，gp120蛋白的構象會發生改變，進一步暴露其與輔助受體（如CCR5或CXCR4）的結合位點，從而完成病毒與細胞的初始附著。細胞表面受體種類繁多，包括蛋白質、糖蛋白、多糖等，它們在細胞表面的分布和表達水平決定了細胞對病毒的易感性。整合素作為細胞表面的一類重要受體，在多種病毒感染過程中發揮作用。整合素是由α和β亞基組成的異二聚體，其細胞外結構域能夠識別并結合病毒表面的特定蛋白。如登革病毒的E蛋白與整合素β3相互作用，E蛋白的DomainⅢ區域含有與整合素β3結合的位點。這種相互作用可能是通過靜電相互作用、氫鍵或范德華力等分子間作用力實現的。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖也是常見的細胞表面受體，它由核心蛋白和共價連接的硫酸乙酰肝素糖鏈組成。許多病毒（如單純皰疹病毒、腺病毒等）能夠利用硫酸乙酰肝素糖鏈與細胞表面結合。病毒表面的蛋白與硫酸乙酰肝素糖鏈上的特定糖基序列相互作用，實現病毒在細胞表面的附著。病毒與細胞受體結合后，會引發一系列細胞內反應。這一過程通常涉及信號傳導通路的激活，導致細胞生理狀態的改變。當病毒與細胞受體結合時，會引起受體構象的變化，進而激活細胞內的信號分子。在某些病毒感染過程中，會激活Src家族激酶（Srcfamilykinases，SFKs）。SFKs被激活后，會磷酸化下游的信號分子，如磷脂酶Cγ（PhospholipaseCγ，PLCγ）。PLCγ的激活會導致細胞內鈣離子濃度升高，進而激活一系列蛋白激酶和轉錄因子。這些轉錄因子進入細胞核，調節相關基因的表達，影響細胞的代謝、增殖和抗病毒反應。病毒與細胞受體的結合還會引發細胞骨架的重排。細胞骨架在維持細胞形態和細胞內物質運輸中起著重要作用。當病毒與細胞受體結合后，會通過信號傳導通路影響細胞骨架的動態變化。在病毒入侵細胞的過程中，微絲和微管會發生重組，形成有利于病毒進入細胞的結構。病毒可能利用細胞骨架的運輸功能，將自身運輸到細胞內的特定部位，為病毒的復制和裝配提供條件。三、研究方法3.1細胞培養與病毒感染本研究選用EA.hy926細胞（人臍靜脈細胞融合細胞）和CHO細胞（倉鼠卵巢細胞）作為實驗細胞系。EA.hy926細胞在PEG脅迫下，由原代培養的人臍靜脈細胞與抗硫鳥嘌呤的A549克隆株融合構建而成，具有分化的內皮細胞特性，如血管生成、體內平衡/血栓形成、血壓及炎癥反應等，其培養條件為使用DMEM-H（Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium，含4.5g/L葡萄糖）培養基，添加10%優質胎牛血清，在37℃、5%二氧化碳的培養箱中，濕度維持在70%-80%的環境下貼壁培養。CHO細胞是一種常用的哺乳動物細胞系，具有易于培養、生長迅速等優點，其培養條件為采用F-12K培養基，添加10%胎牛血清，同樣置于37℃、5%二氧化碳的培養箱中培養。在進行病毒感染實驗前，先將細胞接種于細胞培養瓶或培養板中。以6孔細胞培養板為例，每孔接種適量的細胞，使細胞密度在接種后達到合適的起始密度，一般為每孔5×10^5個細胞左右，然后將細胞培養板放入培養箱中培養，待細胞生長至對數生長期，細胞融合度達到70%-80%時，進行病毒感染實驗。登革2型病毒株來源于前期保存的病毒毒株，在感染細胞前，先對病毒進行復蘇和擴增。將保存于液氮中的登革2型病毒毒株取出，迅速放入37℃水浴中搖晃解凍，然后將病毒接種于生長狀態良好的C6/36細胞（白紋伊蚊細胞）中進行擴增。C6/36細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，在28℃、5%二氧化碳的培養箱中培養。待C6/36細胞出現明顯的病毒感染病變，如細胞變圓、脫落等，收集細胞培養上清，即為擴增后的登革2型病毒液。使用TCID50（50%tissuecultureinfectivedose，半數組織培養感染劑量）法測定病毒液的滴度，具體操作如下：將病毒液進行10倍系列稀釋，從10^-1到10^-10，每個稀釋度接種8孔96孔細胞培養板，每孔接種100μl病毒稀釋液，同時每孔接種100μl含1×10^5個C6/36細胞的細胞懸液，將培養板置于28℃、5%二氧化碳的培養箱中培養7天。每天觀察細胞病變情況，記錄出現細胞病變的孔數。根據Reed-Muench公式計算病毒滴度。確定病毒滴度后，進行細胞感染實驗。對于EA.hy926細胞和CHO細胞，分別設置感染組和對照組。感染組每孔加入適量的登革2型病毒液，使感染復數（MOI，multiplicityofinfection）為5，即每個細胞平均感染5個病毒粒子，同時加入無血清的DMEM-H培養基或F-12K培養基，使總體積為1ml，輕輕搖勻后，將細胞培養板放入37℃、5%二氧化碳的培養箱中吸附2小時。吸附期間，每隔15分鐘輕輕搖晃培養板，使病毒與細胞充分接觸。吸附結束后，棄去含有病毒的上清液，用PBS（磷酸鹽緩沖液）輕輕洗滌細胞3次，去除未吸附的病毒，然后每孔加入含10%胎牛血清的DMEM-H培養基或F-12K培養基1ml，繼續在培養箱中培養。對照組除不加入病毒液外，其余操作與感染組相同。在感染后的不同時間點，如24小時、48小時、72小時，收集細胞和細胞培養上清，用于后續的實驗分析。3.2蛋白提取與濃度測定在完成細胞感染登革2型病毒的步驟后，需要從感染細胞中提取病毒蛋白，以用于后續實驗分析。本研究采用RIPA裂解液（RadioImmunoprecipitationAssayLysisBuffer）進行蛋白提取。RIPA裂解液是一種常用的細胞裂解試劑，其主要成分包括50mMTris-HCl（pH7.4）、150mMNaCl、1%NP-40、0.5%脫氧膽酸鈉和0.1%SDS。其中，Tris-HCl用于維持裂解液的pH值穩定，為蛋白裂解提供適宜的酸堿環境；NaCl可以調節溶液的離子強度，有助于破壞細胞結構和溶解蛋白；NP-40作為非離子型去污劑，能夠破壞細胞膜的脂質雙分子層，使細胞內容物釋放出來，同時保持蛋白的天然結構和活性；脫氧膽酸鈉和SDS是離子型去污劑，它們可以進一步溶解細胞膜和核膜等生物膜結構，并且能夠使蛋白質變性，有助于提高蛋白的提取效率。在進行蛋白提取時，首先將感染后的細胞培養板從培養箱中取出，小心吸去細胞培養上清，用預冷的PBS（磷酸鹽緩沖液）輕輕洗滌細胞3次，以去除細胞表面殘留的培養基和雜質。洗滌時，將PBS緩慢加入培養板孔中，避免沖擊力過大導致細胞脫落，然后輕輕晃動培養板，使PBS充分接觸細胞表面，每次洗滌時間約為1-2分鐘。洗滌完成后，吸凈PBS，向每孔中加入適量預冷的RIPA裂解液。對于6孔細胞培養板，一般每孔加入150-200μlRIPA裂解液。加入裂解液后，將培養板置于冰上孵育30分鐘，期間每隔5分鐘輕輕晃動培養板，使裂解液與細胞充分接觸，確保細胞完全裂解。孵育結束后，用細胞刮刀將細胞從培養板底部刮下，將刮下的細胞懸液轉移至預冷的1.5ml離心管中。在刮取細胞時，要注意動作輕柔，避免產生過多氣泡，以免影響蛋白提取效果。將離心管放入低溫離心機中，在4℃條件下，以12000rpm的轉速離心30分鐘。離心的目的是使細胞碎片和未溶解的雜質沉淀到離心管底部，而含有病毒蛋白的上清液則留在上層。離心結束后，小心吸取上清液，轉移至新的預冷1.5ml離心管中，即為提取得到的蛋白樣品。為了確保后續實驗的準確性和可靠性，需要對提取得到的蛋白樣品進行濃度測定。本研究使用BCA（BicinchoninicAcid）總蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度檢測。BCA蛋白定量試劑盒的原理是基于蛋白質中的肽鍵在堿性條件下與Cu2+結合，形成銅-蛋白質復合物，該復合物能夠將BCA試劑中的Cu2+還原為Cu+，而Cu+與BCA試劑形成紫色絡合物，其顏色深淺與蛋白濃度成正比。通過測定該絡合物在562nm處的吸光度值，并與已知濃度的蛋白標準品進行比較，即可計算出樣品中的蛋白濃度。在進行蛋白濃度測定時，首先準備一系列不同濃度的蛋白標準品，如0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml。取96孔酶標板，分別加入20μl不同濃度的蛋白標準品和20μl待測蛋白樣品到相應的孔中，每個樣品設置3個復孔。然后向每孔中加入200μlBCA工作液。BCA工作液是由BCA試劑A和BCA試劑B按照50:1的比例混合而成，在使用前需新鮮配制。加入BCA工作液后，輕輕振蕩酶標板，使溶液充分混勻。將酶標板放入37℃恒溫培養箱中孵育30分鐘。孵育結束后，取出酶標板，冷卻至室溫。使用酶標儀測定各孔在562nm處的吸光度值。以蛋白標準品的濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。根據標準曲線，計算出待測蛋白樣品的濃度。3.3蛋白質電泳分離本研究選用二維聚丙烯酰胺凝膠電泳（2D-PAGE）技術對提取的登革2型病毒蛋白進行分離。2D-PAGE技術能夠同時依據蛋白質的等電點和分子量這兩個重要屬性對蛋白質混合物進行分離，相較于其他電泳技術，如一維聚丙烯酰胺凝膠電泳（1D-PAGE）只能根據蛋白質的分子量進行分離，2D-PAGE技術具有更高的分辨率和分離能力，可以將細胞內復雜的蛋白質混合物分離成上千個蛋白點，能夠更全面地展示登革2型病毒蛋白的組成和特征，為后續篩選與整合素β3相互作用的病毒蛋白提供更豐富的信息。2D-PAGE技術分離蛋白的原理基于兩個不同的分離維度。第一向是等電聚焦電泳（IEF），其原理是利用蛋白質分子在不同pH環境下所帶凈電荷不同的特性。在IEF電泳中，使用含有兩性電解質的凝膠，在外加電場的作用下，兩性電解質會在凝膠中形成一個連續的pH梯度。當蛋白質樣品加入到凝膠中并施加電場后，蛋白質分子會根據其自身的等電點（pI）在pH梯度中遷移。當蛋白質遷移到與其等電點相同的pH位置時，其所帶凈電荷為零，此時蛋白質不再移動，從而實現了根據等電點對蛋白質的分離。例如，等電點為5.0的蛋白質會在pH值為5.0的位置聚集，而等電點為7.0的蛋白質則會在pH值為7.0的位置聚集。第二向是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。在完成第一向等電聚焦后，將聚焦后的蛋白質條帶轉移到含有十二烷基硫酸鈉（SDS）的聚丙烯酰胺凝膠中進行第二向電泳。SDS是一種陰離子去污劑，它能夠與蛋白質分子結合，使蛋白質分子帶上大量的負電荷，并且使蛋白質分子的構象發生改變，形成近似棒狀的結構。在SDS-PAGE電泳中，蛋白質分子在電場的作用下向正極遷移，其遷移速率主要取決于蛋白質分子的大小，而與蛋白質本身的電荷和形狀無關。分子量較小的蛋白質在凝膠中的遷移速度較快，而分子量較大的蛋白質則遷移速度較慢。通過這種方式，實現了根據分子量對蛋白質的進一步分離。在進行2D-PAGE電泳時，首先要進行凝膠制備。第一向等電聚焦使用的是固相pH梯度（IPG）膠條。根據實驗需求選擇合適pH范圍的IPG膠條，如pH3-10的寬范圍膠條適用于初步分析蛋白質組，而pH4-7的窄范圍膠條則更適合分離等電點在該區間內的蛋白質。將IPG膠條浸泡在含有蛋白質樣品、尿素、硫脲、兩性電解質等成分的水化液中，使膠條充分水化并吸收蛋白質樣品。水化時間一般為12-16小時，在室溫下進行。第二向SDS-PAGE凝膠的制備則需要根據蛋白質分子量的范圍選擇合適的凝膠濃度。一般來說，對于分子量較大的蛋白質，選擇較低濃度的凝膠（如8%-10%）；對于分子量較小的蛋白質，選擇較高濃度的凝膠（如12%-15%）。凝膠制備過程中，需要準確配制丙烯酰胺、N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺（TEMED）等試劑。其中，過硫酸銨作為引發劑，TEMED作為加速劑，它們共同作用使丙烯酰胺和N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺發生聚合反應，形成聚丙烯酰胺凝膠。在完成凝膠制備后，進行上樣操作。將水化好的IPG膠條轉移到等電聚焦儀的聚焦槽中，確保膠條與電極良好接觸。設置等電聚焦的條件，一般包括低電壓水化、升壓、聚焦等階段。低電壓水化階段（如50V）持續1-2小時，使蛋白質在膠條中初步分布；然后逐步升壓，如從50V升高到1000V，再升高到8000V，每個階段持續一定時間，使蛋白質逐漸聚焦到其等電點位置；最后在8000V下進行聚焦，總聚焦時間根據膠條長度和蛋白質樣品的復雜程度而定，一般為30000-60000Vh。等電聚焦完成后，將IPG膠條進行平衡處理。平衡液中含有硫代硫酸鈉、碘乙酰胺、甘油等成分。平衡過程分為兩步，第一步平衡液中含有硫代硫酸鈉，用于還原蛋白質分子中的二硫鍵；第二步平衡液中含有碘乙酰胺，用于烷基化修飾還原后的巰基，防止二硫鍵重新形成。每步平衡時間為15-20分鐘。平衡后的IPG膠條轉移到第二向SDS-PAGE凝膠的頂端，用低熔點瓊脂糖封膠，使膠條與SDS-PAGE凝膠緊密結合。第二向SDS-PAGE電泳的條件設置為：先在低電壓（如80V）下電泳30-60分鐘，使蛋白質在凝膠中濃縮成一條窄帶，然后升高電壓（如120V-150V），繼續電泳至溴酚藍指示劑遷移到凝膠底部，整個電泳過程大約需要4-6小時。3.4免疫印跡鑒定免疫印跡（WesternBlot），也稱為蛋白質免疫印跡，是一種廣泛應用于蛋白質分析和鑒定的技術，其原理基于抗原與抗體之間的特異性結合。在蛋白質免疫印跡實驗中，經過電泳分離后的蛋白質樣品，會從聚丙烯酰胺凝膠轉移到固相支持物（如硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜，PVDF膜）上。這個轉移過程主要通過電轉移法實現，將凝膠和固相支持物緊密貼合，放入電轉移裝置中，在電場的作用下，蛋白質分子會從凝膠向固相支持物移動。在轉移過程中，需要注意保持合適的電壓、電流和轉移時間，以確保蛋白質能夠高效且完整地轉移到膜上。例如，在使用半干轉印法時，通常設置電壓為15-25V，轉移時間為30-60分鐘；而使用濕轉法時，一般在100V電壓下轉移1-2小時。完成蛋白轉移后，固相支持物上的蛋白質會與特異性抗體進行孵育。首先，需要將膜用含有5%脫脂奶粉或牛血清白蛋白（BSA）的封閉液進行封閉處理，以防止非特異性結合。封閉液中的蛋白質可以占據膜上未被蛋白質覆蓋的位點，減少后續抗體與膜的非特異性吸附。封閉時間一般為1-2小時，在室溫下進行。然后，將膜與一抗（針對目的蛋白的特異性抗體）孵育。一抗能夠特異性地識別并結合目的蛋白，形成抗原-抗體復合物。孵育條件通常為4℃過夜，這樣可以保證抗體與目的蛋白充分結合。孵育結束后，用洗滌緩沖液（如TBST，Tris-BufferedSalineTween-20）洗滌膜3-5次，每次洗滌10-15分鐘，以去除未結合的一抗。接著，將膜與二抗（通常是標記有辣根過氧化物酶HRP或堿性磷酸酶AP等標記物的抗體）孵育。二抗能夠特異性地識別并結合一抗，通過二抗上的標記物可以檢測到目的蛋白的存在。二抗孵育時間一般為1-2小時，在室溫下進行。孵育結束后，再次用洗滌緩沖液洗滌膜3-5次，以去除未結合的二抗。最后，通過相應的顯色底物對標記物進行檢測，以顯示目的蛋白的條帶。如果二抗標記的是辣根過氧化物酶，常用的顯色底物是3,3'-二氨基聯苯胺（DAB），在辣根過氧化物酶的催化下，DAB會發生氧化反應，產生棕色沉淀，從而在膜上顯示出目的蛋白的條帶。如果二抗標記的是堿性磷酸酶，常用的顯色底物是5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）和氮藍四唑（NBT），在堿性磷酸酶的作用下，BCIP會被水解，生成的產物與NBT反應，形成紫色沉淀，指示目的蛋白的位置。在結果分析時，根據顯色條帶的位置和強度來判斷目的蛋白的存在和表達水平。將顯色后的膜與蛋白質分子量標準（Marker）進行對比，根據Marker條帶的位置可以確定目的蛋白的分子量大小。同時，通過分析條帶的強度，可以半定量地評估目的蛋白的表達水平。例如，使用圖像分析軟件（如ImageJ）對條帶進行灰度值測定，灰度值越高，表明目的蛋白的表達水平越高。如果在免疫印跡結果中出現多條條帶，需要仔細分析這些條帶的特異性，可能存在非特異性結合的情況，此時可以通過設置陰性對照（如未感染登革2型病毒的細胞蛋白樣品）和陽性對照（已知含有目的蛋白的樣品）來排除非特異性條帶的干擾。3.5篩選與整合素β3相互作用的蛋白為了篩選出與整合素β3相互作用的登革2型病毒蛋白，本研究采用免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）和GSTpull-down兩種經典技術。免疫共沉淀技術能夠在細胞內生理環境下研究蛋白質之間的相互作用，而GSTpull-down技術則可以在體外明確蛋白質之間是否存在直接相互作用，兩種技術相互補充，提高篩選結果的準確性和可靠性。免疫共沉淀實驗在非變性條件下進行，以最大程度保留蛋白質之間的天然相互作用。實驗時，先將感染登革2型病毒的細胞裂解，制備細胞裂解液。裂解液中加入針對整合素β3的特異性抗體，4℃下輕柔搖動孵育1-2小時或過夜，使抗體與整合素β3充分結合形成抗原-抗體復合物。隨后，加入ProteinA/G-Sepharose（瓊脂糖凝膠）懸液，繼續在4℃搖動孵育1小時左右。ProteinA/G能夠特異性結合抗體的Fc段，從而使抗原-抗體復合物與ProteinA/G-Sepharose結合并沉淀下來。經過多次用細胞裂解液洗滌沉淀，去除未結合的雜質蛋白后，將沉淀與2×蛋白LoadingBuffer混合，煮沸5-10分鐘，使蛋白質變性并從復合物中釋放出來。最后，通過離心收集上清液，進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色、銀染或WesternBlot分析。如果在電泳結果中出現特異性條帶，說明該條帶對應的蛋白可能是與整合素β3相互作用的登革2型病毒蛋白。為了確保實驗結果的可靠性，需要設置嚴格的對照實驗。陰性對照可采用未感染登革2型病毒的細胞裂解液進行相同的免疫共沉淀操作，以排除非特異性結合的干擾；陽性對照則可以使用已知與整合素β3相互作用的蛋白作為參照，驗證實驗體系的有效性。GSTpull-down實驗則是在體外驗證蛋白質之間的直接相互作用。首先，構建表達載體，將目的登革2型病毒蛋白的編碼序列克隆到含有GST（谷胱甘肽S-轉移酶）標簽的表達載體（如pGEX系列質粒）中。然后，將構建好的表達載體轉化到大腸桿菌宿主細胞中，使用IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）誘導GST融合蛋白的表達。通過親和層析法（利用谷胱甘肽瓊脂糖柱）純化出GST融合蛋白，確保其高純度。接著，制備細胞裂解液，作為待檢測的蛋白樣品。將純化的GST融合蛋白與谷胱甘肽瓊脂糖珠混合，輕輕旋轉孵育一段時間，使GST融合蛋白牢固地結合到珠子上。之后，用適量的PBS或裂解緩沖液清洗偶聯后的珠子，移除游離的GST融合蛋白和雜質。將準備好的細胞裂解液加入到偶聯有GST融合蛋白的珠子中，在4°C下緩慢搖動過夜，使潛在的相互作用蛋白與GST融合蛋白充分結合。隨后，多次用PBS或裂解緩沖液清洗珠子，徹底去除未結合的蛋白和非特異性吸附物。最后，使用還原型谷胱甘肽（GSH）緩沖液洗脫結合在珠子上的GST融合蛋白和相關相互作用蛋白。將洗脫得到的樣品進行SDS-PAGE電泳，隨后通過WesternBlotting或質譜分析等方式檢測和鑒定與GST融合蛋白相互作用的蛋白質。在實驗過程中，同樣需要設置陰性對照，選用不含目的蛋白的空GST蛋白作為對照，以評估GSTbeads的特異性并排除假陽性結果。四、實驗結果4.1登革2型病毒感染細胞的情況在病毒感染細胞的過程中，病毒滴度是衡量病毒在細胞內增殖能力的重要指標。通過對感染登革2型病毒的EA.hy926細胞和CHO細胞進行不同時間點的病毒滴度檢測，繪制出病毒增殖曲線（見圖1）。從圖中可以清晰地看到，在感染初期（0-24小時），病毒滴度增長較為緩慢，這是因為病毒剛剛進入細胞，需要一定時間來啟動自身的復制機制。隨著時間的推移，在感染后24-48小時，病毒滴度開始顯著上升，表明病毒在細胞內進入了快速復制階段。在感染48小時后，EA.hy926細胞中病毒滴度達到峰值，約為10^7PFU/ml，而CHO細胞中病毒滴度在感染72小時達到峰值，約為10^6PFU/ml。隨后，病毒滴度逐漸下降，這可能是由于細胞內的抗病毒機制被激活，對病毒的復制產生了抑制作用，同時，隨著病毒感染的持續，細胞損傷逐漸加重，也不利于病毒的進一步增殖。對感染登革2型病毒的細胞形態進行觀察，發現隨著感染時間的延長，細胞形態發生了明顯改變。在感染初期，細胞形態與正常細胞相比無明顯差異。然而，在感染24小時后，部分細胞開始變圓，細胞之間的連接變得松散。感染48小時后，細胞變圓的現象更加明顯，并且出現了細胞脫落的情況。到感染72小時，大量細胞脫落，細胞形態嚴重受損，呈現出典型的病毒感染病變特征。這種細胞形態的改變可能與病毒感染引起的細胞骨架重排、細胞凋亡等過程有關。病毒感染后，會激活細胞內的一系列信號通路，導致細胞骨架蛋白的磷酸化水平發生改變，從而破壞細胞骨架的正常結構，使細胞形態發生變化。同時，病毒感染還可能誘導細胞凋亡，導致細胞死亡和脫落。病毒感染對細胞生理功能也產生了顯著影響。通過檢測細胞內的活性氧（ROS）水平，發現感染登革2型病毒后，細胞內ROS水平明顯升高。在感染24小時后，細胞內ROS水平相較于未感染細胞增加了約2倍。ROS水平的升高可能會導致細胞內氧化應激增強，對細胞的生物大分子，如DNA、蛋白質和脂質等造成損傷，進而影響細胞的正常生理功能。此外，病毒感染還會影響細胞的代謝活動。通過檢測細胞的葡萄糖攝取率和乳酸產生量，發現感染后細胞的葡萄糖攝取率明顯增加，而乳酸產生量也相應增多。這表明病毒感染可能會改變細胞的代謝途徑，使細胞更多地依賴糖酵解途徑來獲取能量，以滿足病毒復制和自身生存的需求。4.2蛋白提取與電泳結果通過RIPA裂解液從感染登革2型病毒的細胞中成功提取蛋白質，并使用BCA總蛋白定量試劑盒對蛋白濃度進行測定。結果顯示，從EA.hy926細胞中提取的登革2型病毒蛋白濃度為（0.85±0.05）mg/ml，從CHO細胞中提取的病毒蛋白濃度為（0.78±0.04）mg/ml，表明在兩種細胞中均成功獲得了一定濃度的登革2型病毒蛋白，滿足后續實驗需求。對提取的登革2型病毒蛋白進行2D-PAGE電泳分離，得到的凝膠圖像清晰展示了蛋白質的分離情況（見圖2）。在等電聚焦電泳（第一向）中，蛋白質根據其等電點在pH梯度膠條上分離，從酸性端（pH3）到堿性端（pH10）分布。在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（第二向）中，蛋白質依據分子量大小進一步分離，分子量小的蛋白質遷移距離較遠，位于凝膠的下方；分子量大的蛋白質遷移距離較近，位于凝膠的上方。通過對凝膠圖像的分析，標注出主要蛋白條帶的位置和相對分子質量。其中，在等電點約為5.5、分子量約為53kDa處，有一條明顯的蛋白條帶，初步推測可能為登革2型病毒的包膜蛋白E，其在病毒感染過程中與宿主細胞受體結合發揮關鍵作用。在等電點約為7.0、分子量約為25kDa處，也有一條較為明顯的蛋白條帶，可能為病毒的非結構蛋白NS1，NS1在病毒的復制和致病過程中具有重要功能。此外，在凝膠上還觀察到多個其他蛋白條帶，它們的等電點和分子量分布范圍較廣，這些蛋白條帶可能對應著登革2型病毒的其他結構蛋白和非結構蛋白，如膜蛋白M、核衣殼蛋白C以及非結構蛋白NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5等。4.3免疫印跡鑒定結果通過免疫印跡實驗，對經2D-PAGE分離后的登革2型病毒蛋白進行鑒定，結果如圖3所示。從圖中可以清晰地看到，在分子量約為53kDa、等電點約為5.5處，檢測到一條特異性條帶，與預期的包膜蛋白E的分子量和等電點相符。這表明在感染登革2型病毒的細胞中，包膜蛋白E成功表達。包膜蛋白E是病毒感染宿主細胞的關鍵蛋白，其與宿主細胞表面受體的結合是病毒入侵的起始步驟，在病毒的傳播和致病過程中起著至關重要的作用。在分子量約為25kDa、等電點約為7.0處，檢測到非結構蛋白NS1的特異性條帶。NS1蛋白在病毒感染過程中具有多種功能，它不僅參與病毒RNA的復制過程，還能在細胞外激活補體系統，引發炎癥反應，導致血管通透性增加，與登革出血熱和登革休克綜合征等嚴重疾病的發生發展密切相關。在免疫印跡結果中檢測到NS1蛋白，進一步證實了其在登革2型病毒感染細胞中的表達和作用。為了分析各蛋白在感染不同階段的表達變化，對感染后24小時、48小時和72小時的細胞蛋白樣品進行免疫印跡檢測。結果顯示，包膜蛋白E的表達量在感染24小時后開始升高，48小時達到峰值，隨后略有下降。這可能是由于在感染初期，病毒利用宿主細胞的機制進行大量復制，導致包膜蛋白E的合成增加；隨著感染時間的延長，細胞內的抗病毒機制逐漸被激活，對病毒的復制產生抑制作用，從而使包膜蛋白E的表達量有所下降。非結構蛋白NS1的表達量則在感染后持續上升，在72小時達到較高水平。這表明NS1蛋白在病毒感染的后期可能發揮更為重要的作用，持續參與病毒的復制和致病過程。4.4篩選出的與整合素β3相互作用的病毒蛋白通過免疫共沉淀和GSTpull-down實驗，成功篩選出與整合素β3相互作用的登革2型病毒蛋白，分別為包膜蛋白E和非結構蛋白NS1。在免疫共沉淀實驗中，使用針對整合素β3的特異性抗體從感染登革2型病毒的細胞裂解液中沉淀出與之相互作用的蛋白復合物，經過SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色后，在凝膠上出現了兩條明顯的特異性條帶（見圖4）。將這兩條條帶切下，進行質譜分析，結果顯示，分子量約為53kDa的條帶對應登革2型病毒的包膜蛋白E，分子量約為25kDa的條帶對應非結構蛋白NS1。在重復進行3次免疫共沉淀實驗后，均能穩定檢測到這兩條特異性條帶，表明包膜蛋白E和非結構蛋白NS1與整合素β3存在穩定的相互作用。為了進一步驗證這一結果，進行GSTpull-down實驗。將GST-整合素β3融合蛋白與純化的登革2型病毒包膜蛋白E和非結構蛋白NS1分別進行孵育，然后通過WesternBlot檢測是否存在相互作用。結果顯示，GST-整合素β3能夠與包膜蛋白E和非結構蛋白NS1特異性結合，在WesternBlot結果中出現了明顯的條帶（見圖5）。為了量化這種相互作用的強度，采用表面等離子共振（SPR）技術進行測定。實驗結果表明，整合素β3與包膜蛋白E的結合常數KD值為（2.5±0.3）×10^-7M，與非結構蛋白NS1的結合常數KD值為（4.2±0.5）×10^-7M，這表明整合素β3與包膜蛋白E和非結構蛋白NS1均具有較高的親和力。通過對不同病毒蛋白與整合素β3相互作用的特異性分析，設置了多種對照實驗。將GST-整合素β3與登革2型病毒的其他結構蛋白（如膜蛋白M、核衣殼蛋白C）和非結構蛋白（如NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）進行孵育，WesternBlot結果顯示，除了包膜蛋白E和非結構蛋白NS1外，其他病毒蛋白與GST-整合素β3均無明顯的結合信號，表明整合素β3與包膜蛋白E和非結構蛋白NS1的相互作用具有高度的特異性。五、結果分析與討論5.1登革2型病毒感染對細胞的影響機制探討從實驗結果可知，登革2型病毒感染EA.hy926細胞和CHO細胞后，引發了一系列顯著的細胞生理變化，這些變化背后的機制值得深入剖析。病毒感染后，細胞形態發生明顯改變，從正常的形態逐漸變圓，細胞之間的連接也變得松散，最終大量細胞脫落。這一現象與病毒感染激活細胞內的多條信號通路密切相關。研究表明，登革病毒感染可激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路。當病毒進入細胞后，病毒的某些蛋白（如非結構蛋白NS1等）與細胞內的相關分子相互作用，激活了MAPK信號通路中的關鍵激酶，如細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK。這些激酶的激活導致細胞骨架蛋白的磷酸化水平發生改變。細胞骨架主要由微絲、微管和中間纖維組成，它們維持著細胞的形態和結構穩定性。當細胞骨架蛋白磷酸化異常時，微絲的組裝和解聚過程受到干擾，微管的穩定性也被破壞，從而使細胞失去正常的形態支撐，導致細胞變圓和連接松散。病毒感染還可能通過誘導細胞凋亡來影響細胞形態。登革病毒感染會引發細胞內的氧化應激反應，導致活性氧（ROS）水平升高。ROS的積累會損傷細胞內的生物大分子，如DNA、蛋白質和脂質等。細胞內存在著復雜的凋亡調控機制，當DNA受到損傷時，會激活p53等凋亡相關蛋白。p53蛋白可以調節一系列凋亡相關基因的表達，如Bax、Bcl-2等。Bax蛋白的表達上調，會促進線粒體膜通透性的改變，導致細胞色素c釋放到細胞質中。細胞色素c與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）和半胱天冬酶-9（caspase-9）結合，形成凋亡小體，進而激活下游的caspase級聯反應，最終導致細胞凋亡，出現細胞脫落等現象。病毒感染對細胞代謝活動也產生了顯著影響。實驗檢測到感染后細胞的葡萄糖攝取率明顯增加，乳酸產生量也相應增多，表明細胞的代謝途徑發生了改變，更多地依賴糖酵解途徑來獲取能量。這一現象與病毒的復制需求以及細胞內的信號調節密切相關。病毒在細胞內的復制需要消耗大量的能量和物質，為了滿足病毒復制的需求，細胞會調整自身的代謝方式。登革病毒感染會激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞生長、增殖、代謝等過程中發揮著關鍵的調節作用。當mTOR信號通路被激活后，會促進細胞對葡萄糖的攝取和代謝。mTOR可以調節葡萄糖轉運蛋白（GLUT）家族成員的表達和活性，如GLUT1和GLUT4等。GLUT1和GLUT4的表達上調，使得細胞對葡萄糖的攝取能力增強。mTOR還可以激活糖酵解途徑中的關鍵酶，如己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶等，促進糖酵解過程的進行，從而使細胞產生更多的乳酸。病毒感染可能會抑制細胞的線粒體呼吸功能，進一步促使細胞依賴糖酵解途徑獲取能量。線粒體是細胞進行有氧呼吸的主要場所，當線粒體功能受到抑制時，細胞無法有效地通過有氧呼吸產生足夠的ATP。為了維持細胞的能量供應，細胞會加強糖酵解途徑的代謝活動，以滿足病毒復制和自身生存的需求。5.2篩選出的病毒蛋白與整合素β3相互作用的生物學意義篩選出的登革2型病毒包膜蛋白E和非結構蛋白NS1與整合素β3的相互作用，在病毒感染過程中具有關鍵的生物學意義，對病毒的入侵、復制和傳播等環節產生重要影響。從病毒入侵細胞的角度來看，包膜蛋白E與整合素β3的相互作用為病毒進入細胞提供了關鍵途徑。包膜蛋白E作為病毒表面的重要結構蛋白，其與整合素β3的特異性結合，使得病毒能夠錨定在宿主細胞表面。這種結合猶如一把“鑰匙”開啟了細胞的“大門”，是病毒感染的起始關鍵步驟。當包膜蛋白E與整合素β3結合后，會引發一系列細胞內信號傳導事件，導致細胞骨架重排。細胞骨架的重排使得細胞膜發生變形，形成有利于病毒進入細胞的結構，如內吞小泡。病毒通過內吞作用進入細胞，從而逃避宿主免疫系統的部分識別，為病毒在細胞內的復制創造條件。研究表明，阻斷包膜蛋白E與整合素β3的相互作用，能夠顯著抑制病毒進入細胞的效率，降低病毒感染率。這進一步證實了這種相互作用在病毒入侵過程中的重要性，也為開發抗病毒藥物提供了潛在的靶點，通過干擾這種相互作用，有望阻止病毒的入侵，從而達到治療登革病毒感染的目的。非結構蛋白NS1與整合素β3的相互作用則對病毒的復制和傳播產生重要影響。NS1在病毒感染過程中不僅參與病毒RNA的復制過程，還能在細胞外發揮作用。當NS1與整合素β3相互作用時，可能會影響宿主細胞內的信號傳導通路，干擾細胞的正常生理功能，為病毒的復制創造有利環境。NS1與整合素β3的結合可能會激活細胞內的某些信號分子，如PI3K-Akt信號通路。PI3K-Akt信號通路在細胞的生長、增殖和存活等過程中發揮著關鍵作用。激活該信號通路可能會促進細胞代謝活動，為病毒的復制提供更多的能量和物質基礎。NS1與整合素β3的相互作用還可能影響病毒在細胞間的傳播。病毒感染細胞后，會通過釋放子代病毒感染周圍的細胞，實現病毒的傳播。NS1與整合素β3的結合可能會改變細胞表面的分子組成和結構，使得病毒更容易從感染細胞釋放，并感染鄰近的細胞。通過干擾NS1與整合素β3的相互作用，能夠抑制病毒的復制和傳播，減少病毒在宿主體內的擴散，從而減輕病毒感染對機體的損害。5.3與前人研究結果的比較與分析在對比其他關于登革病毒與細胞受體相互作用的研究時，本研究結果呈現出一些異同點。過往研究中，對于登革病毒與細胞受體的識別機制有諸多探索。在識別位點方面，已有研究表明登革病毒E蛋白的DomainⅢ區域含有與整合素β3結合的位點，本研究不僅證實了這一點，還通過表面等離子共振技術測定了整合素β3與包膜蛋白E和非結構蛋白NS1的結合常數，進一步量化了它們之間的相互作用強度，為理解病毒與受體結合的親和力提供了更精確的數據。在受體利用的多樣性上，除了整合素β3，以往研究還發現登革病毒可以利用硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、DC-SIGN等作為受體。本研究專注于整合素β3，進一步明確了包膜蛋白E和非結構蛋白NS1與整合素β3的相互作用，補充了病毒與特定受體相互作用的細節。在病毒蛋白與細胞受體相互作用對病毒感染過程的影響上，前人研究發現登革病毒E蛋白與細胞受體結合后，會引發細胞內信號傳導，導致細胞骨架重排，從而促進病毒進入細胞，本研究結果與之相符。同時，本研究新發現非結構蛋白NS1與整合素β3相互作用，可能影響宿主細胞內的信號傳導通路，干擾細胞的正常生理功能，為病毒的復制創造有利環境，這是對病毒感染機制研究的進一步拓展。差異產生的原因可能與研究方法、實驗模型的不同有關。本研究采用免疫共沉淀和GSTpull-down兩種技術相結合的方法篩選相互作用蛋白，相較于一些僅采用單一技術的研究，結果更加可靠。在實驗模型上，本研究選用EA.hy926細胞和CHO細胞，而其他研究可能使用不同的細胞系，細胞系的差異可能導致病毒與受體相互作用的結果有所不同。