基因敲除SRK的蕪菁純合株系創制及葉片特征的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義基因敲除技術作為現代分子生物學領域的關鍵工具，為深入探究基因功能及生物遺傳機制開辟了全新路徑。在植物研究范疇，該技術憑借其能夠精準改變植物基因組特定基因序列，使基因功能喪失或改變的獨特優勢，成為解析植物基因功能、揭示植物生長發育分子機制以及培育優良植物品種的有力手段，極大地推動了植物科學研究的發展進程。蕪菁（BrassicarapaL.），隸屬十字花科蕓薹屬，是一類具有重要經濟價值的二年生草本植物。其適應能力強，在全球范圍內廣泛種植，且用途極為廣泛。在食用方面，蕪菁的塊根富含多種維生素、礦物質以及膳食纖維，可鮮食、腌制或烹飪，是人們日常飲食中的重要蔬菜之一；在飼料領域，其地上部分的莖葉是優質的飼料資源，為畜牧業的發展提供了有力支持；在藥用價值上，蕪菁在傳統醫學中就被用于治療多種疾病，現代研究也進一步揭示了其具有抗氧化、抗炎等功效。此外，蕪菁作為十字花科植物的模式物種之一，其基因組相對較小且已完成測序，為基因功能研究提供了便利條件，在植物遺傳學和分子生物學研究中占據著重要地位。SRK（S-locusreceptorkinase）基因，即S位點受體激酶基因，在十字花科植物自交不親和反應中扮演著核心角色，是決定植物自交不親和性的關鍵基因。自交不親和性是植物在長期進化過程中形成的一種重要生殖隔離機制，它能夠有效避免自交，促進異花授粉，增加后代的遺傳多樣性，對于植物的生存和繁衍具有重要意義。在十字花科植物中，SRK基因編碼的受體蛋白位于柱頭表面，能夠特異性識別來自自花花粉的SCR（S-locuscysteine-richprotein）蛋白，從而引發一系列信號傳導事件，最終導致自花花粉被排斥，阻止自交的發生。深入研究蕪菁SRK基因敲除株系，具有多方面的重要價值。在農業生產實踐中，自交不親和性會給作物的雜交育種和種子生產帶來諸多困難，通過對SRK基因進行敲除，有望打破自交不親和性，實現優良品種的自交繁殖和雜交育種，從而提高作物的產量和品質，增強其市場競爭力。從生物學基礎研究角度來看，SRK基因敲除株系為深入解析自交不親和反應的分子機制提供了理想的研究材料。通過對敲除株系的研究，可以更加清晰地了解SRK基因在自交不親和反應中的具體作用方式，以及它與其他相關基因之間的相互關系，有助于進一步完善植物生殖生物學理論體系。此外，對蕪菁SRK基因敲除株系的研究，還能夠為其他十字花科植物的基因功能研究和遺傳改良提供重要的參考依據和技術支持，推動整個十字花科植物研究領域的發展。1.2國內外研究現狀基因敲除技術自問世以來，在植物研究領域取得了豐碩的成果。早期的基因敲除技術主要依賴于同源重組，通過將外源DNA片段導入植物細胞，使其與基因組中的目標基因發生同源重組，從而實現對目標基因的敲除。然而，同源重組的效率較低，且操作過程復雜，限制了其廣泛應用。隨著分子生物學技術的不斷發展，鋅指核酸酶（ZFNs）和轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALENs）等新型基因編輯技術應運而生。ZFNs利用鋅指蛋白特異性識別并結合目標DNA序列，然后通過核酸酶切割實現基因敲除；TALENs則通過轉錄激活因子樣效應物識別特定DNA序列，與核酸酶結合后進行基因編輯。這兩種技術相比同源重組，具有更高的效率和特異性，但它們的設計和構建過程較為繁瑣，成本也較高。近年來，CRISPR/Cas9技術的出現徹底改變了基因敲除的格局。該技術利用細菌和古菌中的天然免疫系統，通過設計特定的向導RNA（gRNA），引導Cas9核酸酶識別并切割目標基因的特定序列，實現對基因的敲除或編輯。CRISPR/Cas9技術具有操作簡單、成本低廉、效率高、特異性強等優點，一經問世便迅速在植物基因功能研究、作物遺傳改良等領域得到了廣泛應用。在模式植物擬南芥和水稻中，CRISPR/Cas9技術已被成功用于多個基因的敲除，為揭示植物生長發育、抗病抗逆等過程的分子機制提供了重要支持。在其他植物中，如小麥、玉米、大豆等農作物，以及煙草、番茄、馬鈴薯等經濟作物，CRISPR/Cas9技術也取得了顯著進展，通過敲除相關基因，成功改良了作物的多種性狀，如提高抗病性、增強抗逆性、改善品質等。在蕪菁研究方面，隨著基因編輯技術的發展，也逐漸開展了相關的基因敲除研究。目前，已有研究利用CRISPR/Cas9技術對蕪菁中的一些基因進行敲除，以探究這些基因在蕪菁生長發育、品質形成、抗逆性等方面的功能。例如，有研究通過敲除蕪菁中與花青素合成相關的基因，改變了蕪菁塊根的顏色，為研究花青素合成的調控機制提供了新的思路。還有研究對蕪菁中與抗逆性相關的基因進行敲除，分析其在干旱、鹽堿等逆境條件下的生長表現，為培育抗逆性強的蕪菁品種奠定了基礎。然而，總體而言，蕪菁基因敲除的研究仍相對較少，特別是針對SRK基因的敲除研究尚未見報道，對于蕪菁SRK基因功能的深入探究還存在較大的空間。在SRK基因的研究方面，國內外學者圍繞其在十字花科植物自交不親和反應中的作用機制開展了大量的研究工作。早期的研究主要集中在SRK基因的克隆和序列分析上，通過對不同十字花科植物SRK基因的克隆和測序，揭示了其結構特征和序列多態性。研究發現，SRK基因通常由多個外顯子和內含子組成，編碼的受體蛋白具有典型的結構域，包括胞外的S結構域、跨膜結構域和胞內的激酶結構域。其中，S結構域是SRK基因特異性識別自花花粉SCR蛋白的關鍵區域，其氨基酸序列的多態性決定了SRK蛋白與SCR蛋白之間的特異性相互作用。隨著研究的深入，對SRK基因在自交不親和信號傳導途徑中的作用機制有了更清晰的認識。當自花花粉落在柱頭上時，花粉表面的SCR蛋白與柱頭表面的SRK蛋白的S結構域特異性結合，引發SRK蛋白的激酶結構域自磷酸化，從而激活下游的信號傳導通路。在這個過程中，M位點蛋白激酶（MLPK）和ARM重復序列包含蛋白1（ARC1）等蛋白發揮了重要作用。MLPK與SRK相互作用，參與SRK信號的傳遞；ARC1是一種E3泛素連接酶，能夠介導下游底物蛋白的泛素化降解，從而實現對自花花粉的排斥。此外，還有研究發現，一些其他的蛋白和分子也參與了SRK介導的自交不親和反應，如磷酸酶、磷脂酶、活性氧等，它們在信號傳導過程中相互作用，形成了復雜的調控網絡。盡管在SRK基因的研究方面取得了上述重要進展，但仍有許多問題有待進一步探索。例如，SRK基因與其他相關基因之間的精細調控機制尚未完全明確；在不同環境條件下，SRK基因的表達和功能是否會發生變化，以及如何變化，這些問題都需要深入研究。此外，將SRK基因的研究成果應用于實際生產，如通過基因編輯技術打破自交不親和性，實現十字花科作物的高效育種，還需要克服一系列技術和理論上的難題。1.3研究目標與內容本研究旨在通過CRISPR/Cas9基因編輯技術，成功創制基因敲除SRK的蕪菁純合株系，并深入研究其葉片特征，進而分析SRK基因在蕪菁生長發育過程中的功能。在創制基因敲除SRK的蕪菁純合株系方面，首先需依據蕪菁SRK基因的序列信息，運用生物信息學方法，精心設計特異性的gRNA靶點，以確保能夠精準地靶向SRK基因。隨后，構建高效的CRISPR/Cas9表達載體，并借助農桿菌介導法或基因槍法等合適的遺傳轉化方法，將表達載體導入蕪菁的愈傷組織或原生質體中。經過篩選和鑒定，獲得含有CRISPR/Cas9表達載體的轉基因蕪菁植株。對轉基因植株進行多代自交和篩選，運用PCR擴增、測序等分子生物學技術，精確鑒定SRK基因的編輯情況，最終成功獲得基因敲除SRK的蕪菁純合株系。在研究基因敲除SRK的蕪菁純合株系葉片特征時，從形態學和生理學兩個層面展開深入分析。形態學方面，詳細測量葉片的長度、寬度、厚度、面積、形狀指數等指標，并與野生型蕪菁進行全面對比，以明確基因敲除對葉片形態的影響。同時，利用顯微鏡技術，觀察葉片的表皮細胞形態、氣孔密度和大小、葉肉組織細胞結構等微觀特征，深入探究基因敲除對葉片解剖結構的作用。生理學層面，測定葉片的光合作用參數，如光合速率、氣孔導度、胞間二氧化碳濃度、蒸騰速率等，分析基因敲除對葉片光合作用能力的影響。此外，還需檢測葉片的抗氧化酶活性，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等，以及丙二醛（MDA）含量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量等生理指標，以評估基因敲除對葉片抗氧化能力和滲透調節能力的影響。在分析SRK基因功能時，結合蕪菁純合株系葉片特征的研究結果，以及已有的相關研究資料，深入探討SRK基因在蕪菁生長發育過程中的具體功能。通過對比基因敲除株系和野生型株系在生長發育過程中的差異，如植株高度、分枝數、開花時間、結實率等，全面解析SRK基因對蕪菁整體生長發育的影響。同時，利用轉錄組測序、蛋白質組測序等技術，分析基因敲除前后蕪菁葉片中基因表達和蛋白質表達的變化情況，篩選出與SRK基因相關的差異表達基因和蛋白質，并對其進行功能注釋和富集分析，從而深入揭示SRK基因在分子水平上的調控機制，以及它與其他基因之間的相互作用關系。二、基因敲除與植物研究技術基礎2.1基因敲除技術概述2.1.1技術原理基因敲除技術是指通過一定的技術手段，使生物體特定的基因失去功能或表達被抑制，從而研究該基因功能的一種技術。目前，常用的基因敲除技術包括CRISPR/Cas9、TALENs、ZFNs等，它們的原理基于對DNA的切割、修復和重組等生物學過程。CRISPR/Cas9技術源于細菌和古菌的適應性免疫系統，是當前應用最為廣泛的基因敲除技術之一。其核心組成部分為Cas9核酸酶和向導RNA（gRNA）。gRNA包含與目標DNA序列互補的特異性識別序列，能夠引導Cas9核酸酶精準定位到目標基因的特定區域。當Cas9-gRNA復合物與目標DNA結合后，Cas9核酸酶發揮其核酸內切酶活性，對目標DNA雙鏈進行切割，造成雙鏈斷裂（DSB）。細胞自身存在兩種主要的DNA修復機制，即非同源末端連接（NHEJ）和同源重組（HR）。在NHEJ修復過程中，細胞會直接將斷裂的DNA末端連接起來，但這個過程往往不夠精確，容易引入堿基的插入或缺失等突變，從而導致基因功能喪失，實現基因敲除的目的。而在HR修復過程中，細胞以同源的DNA序列為模板進行修復，若提供外源的同源DNA模板，就可以實現基因的精確編輯，如基因敲入、定點突變等。TALENs（轉錄激活因子樣效應物核酸酶）技術利用來自植物病原菌黃單胞菌的轉錄激活因子樣效應物（TALE）來識別特定的DNA序列。TALE蛋白的DNA結合域由一系列高度保守的重復氨基酸模塊組成，每個模塊通常能特異性識別一個堿基對。通過對TALE蛋白的DNA結合域進行設計和組裝，使其能夠特異性識別目標基因的特定序列，然后將其與核酸酶FokI融合，形成TALENs。當TALENs結合到目標DNA序列后，FokI核酸酶發揮作用，切割DNA雙鏈，產生DSB。細胞同樣通過NHEJ或HR機制對斷裂的DNA進行修復，進而實現基因敲除或其他基因編輯操作。由于TALE蛋白對DNA序列的識別具有高度特異性，因此TALENs技術在基因編輯中具有較高的準確性，能夠有效減少脫靶效應的發生。ZFNs（鋅指核酸酶）技術是最早被應用于基因組編輯的人工核酸酶技術之一。它由鋅指蛋白（ZFP）和FokI核酸酶組成。鋅指蛋白是一類能夠特異性識別DNA序列的蛋白質，其DNA結合域由多個鋅指結構模塊串聯而成，每個鋅指結構通常可以識別3個堿基對。通過合理設計鋅指蛋白的結構，使其能夠特異性結合目標基因的特定DNA序列，再將其與FokI核酸酶連接，構建成ZFNs。當ZFNs結合到目標DNA位點時，FokI核酸酶二聚化并切割DNA雙鏈，產生DSB。隨后，細胞通過NHEJ或HR修復機制對DNA進行修復，從而實現基因敲除或其他基因編輯事件。然而，ZFNs技術在設計和構建過程中較為復雜，且存在一定的脫靶風險，這在一定程度上限制了其廣泛應用。2.1.2主要方法對比CRISPR/Cas9、TALENs、ZFNs等基因敲除技術在效率、特異性、操作難度等方面存在顯著差異。在效率方面，CRISPR/Cas9技術具有明顯優勢。其操作相對簡單，只需設計合成特定的gRNA，即可引導Cas9核酸酶對目標基因進行切割，且能夠實現多個基因的同時編輯，在多種生物中都展現出較高的基因編輯效率。有研究表明，在植物基因編輯中，CRISPR/Cas9技術對某些基因的編輯效率可高達80%以上。TALENs技術的編輯效率也較高，但由于其構建過程較為繁瑣，需要對TALE蛋白的DNA結合域進行復雜的組裝，限制了其大規模應用。ZFNs技術的編輯效率相對較低，且不同位點的編輯效率差異較大，這與鋅指蛋白的設計和構建難度以及其對DNA序列的特異性識別能力有關。特異性是衡量基因敲除技術的重要指標之一。TALENs技術由于TALE蛋白對DNA序列的識別具有高度特異性，每個模塊對應一個堿基對，能夠較為精確地識別目標序列，因此脫靶效應相對較低。ZFNs技術雖然也能特異性識別DNA序列，但由于鋅指蛋白的設計和構建存在一定難度，可能會導致一些非特異性結合，從而產生脫靶效應。CRISPR/Cas9技術的特異性主要取決于gRNA與目標DNA序列的互補配對情況。理論上，只要gRNA設計合理，就能實現高度特異性的基因編輯。然而，在實際應用中，CRISPR/Cas9技術也存在一定的脫靶風險，尤其是當gRNA與非目標序列存在部分同源時，可能會導致Cas9核酸酶對非目標位點進行切割。不過，通過優化gRNA的設計、調整Cas9蛋白的表達水平以及采用一些新型的Cas9變體等方法，可以有效降低CRISPR/Cas9技術的脫靶效應。操作難度上，CRISPR/Cas9技術最為簡便。科研人員只需根據目標基因序列設計合成相應的gRNA，然后將其與Cas9蛋白或表達載體導入細胞中即可完成基因編輯操作，相關的實驗流程和技術手段在許多實驗室都已成熟。TALENs技術的操作相對復雜，需要進行TALE蛋白的設計、組裝和驗證等多個步驟，對實驗人員的技術水平和經驗要求較高。ZFNs技術的操作難度更大，不僅鋅指蛋白的設計和構建需要專業的知識和技能，而且其活性驗證和優化也較為繁瑣，這使得ZFNs技術在實際應用中受到了較大的限制。從成本角度來看，CRISPR/Cas9技術的成本相對較低。其所需的主要試劑為gRNA和Cas9蛋白或表達載體，這些試劑的合成和制備相對容易，市場價格也較為親民。TALENs技術由于需要構建復雜的TALE蛋白，成本相對較高。ZFNs技術由于其設計和構建的復雜性，成本更是居高不下，這在一定程度上限制了其在大規模研究和應用中的推廣。2.2植物基因編輯技術應用2.2.1在植物功能基因研究中的作用在植物功能基因研究中，基因敲除技術發揮著無可替代的關鍵作用，成為解析植物基因功能、揭示植物生長發育分子機制的核心工具。通過精準敲除目標基因，觀察植物在生長發育過程中所表現出的表型變化，研究人員能夠直接且深入地探究基因的生物學功能。例如，在擬南芥中，通過CRISPR/Cas9技術敲除與開花時間調控相關的基因，發現突變體植株的開花時間顯著提前或延遲，從而明確了該基因在開花調控途徑中的重要作用。這為深入理解植物開花的分子機制提供了關鍵線索，也為農作物的花期調控提供了理論依據。在植物激素信號傳導通路的研究中，基因敲除技術同樣發揮了重要作用。以生長素信號傳導途徑為例，通過敲除相關基因，研究人員發現植物的根系發育、莖的伸長以及葉片的形態等方面都出現了明顯的異常。這表明這些基因在生長素信號傳導過程中起著關鍵作用，參與調控植物的多個生長發育過程。通過進一步研究基因敲除后相關基因表達和蛋白質活性的變化，還能夠揭示生長素信號傳導的分子機制，為植物激素調控網絡的研究提供重要支撐。此外，在植物抗病性研究領域，基因敲除技術為深入探究植物與病原菌互作機制提供了有力手段。通過敲除植物中的抗病相關基因，研究人員可以觀察到植物對病原菌的抗性明顯降低，從而確定這些基因在植物抗病過程中的關鍵作用。例如，在水稻中敲除某些抗病基因后，植株對稻瘟病菌的感病性顯著增強，通過對這些突變體的研究，揭示了水稻抗病基因的作用機制以及與病原菌之間的互作關系，為培育抗病水稻品種奠定了理論基礎。2.2.2在作物遺傳改良中的意義作物遺傳改良是保障全球糧食安全、滿足日益增長的人口對農產品需求的關鍵舉措，而基因編輯技術的出現為作物遺傳改良帶來了革命性的變革，具有不可估量的重要意義。在提高作物產量方面，基因編輯技術展現出巨大的潛力。通過對與作物產量相關的基因進行編輯，能夠優化作物的生長發育過程，提高光合作用效率、養分利用效率以及穗粒數、粒重等產量構成因素，從而顯著提高作物產量。例如，在小麥中，通過基因編輯技術敲除某些調控株型的基因，使小麥植株的株型更加緊湊合理，通風透光條件得到改善，從而提高了小麥的產量。在水稻中，對與分蘗數、穗粒數等相關的基因進行編輯，也取得了顯著的增產效果。在改善作物品質方面，基因編輯技術能夠精準地修飾與作物品質相關的基因，實現對作物品質的定向改良。以水稻為例，通過基因編輯技術敲除與直鏈淀粉合成相關的基因，能夠降低水稻籽粒中直鏈淀粉的含量，改善米飯的口感和食味品質。在油菜中，通過編輯與油脂合成相關的基因，可以改變油菜籽中脂肪酸的組成，提高油脂的營養價值。此外，基因編輯技術還可以用于提高作物中維生素、礦物質等營養成分的含量，開發出具有更高營養價值的作物品種。在增強作物抗逆性方面，基因編輯技術為培育適應各種逆境環境的作物品種提供了有效途徑。通過對與作物抗逆性相關的基因進行編輯，能夠提高作物對干旱、鹽堿、高溫、低溫等逆境脅迫的耐受性。例如，在玉米中，通過基因編輯技術敲除某些與干旱脅迫響應相關的基因，增強了玉米對干旱環境的適應能力，提高了玉米在干旱條件下的產量。在小麥中，編輯與抗鹽相關的基因，使小麥的耐鹽性得到顯著提升，能夠在鹽堿地中正常生長。三、基因敲除SRK的蕪菁純合株系創制3.1實驗材料準備本實驗選用的蕪菁品種為“改良大根”，該品種在本地廣泛種植，具有生長勢強、適應性好、塊根品質優良等特點，是進行基因編輯研究的理想材料。基因編輯載體選用pCAMBIA1300-CRISPR/Cas9，此載體具備潮霉素抗性基因，便于后續轉化植株的篩選。同時，載體上含有Cas9蛋白表達元件以及用于插入gRNA表達框的多克隆位點，能夠有效實現對目標基因的編輯。實驗中使用的工具酶包括限制性內切酶BsaI、T4DNA連接酶等。限制性內切酶BsaI可用于切割載體和gRNA表達框，以實現二者的連接；T4DNA連接酶則能夠催化載體與gRNA表達框之間的磷酸二酯鍵形成，完成連接反應。主要試劑有DNA提取試劑盒、PCR擴增試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、植物組織培養相關試劑等。DNA提取試劑盒用于提取蕪菁基因組DNA以及載體質粒DNA；PCR擴增試劑盒用于擴增目標基因片段、檢測轉基因植株等；DNA凝膠回收試劑盒用于從瓊脂糖凝膠中回收目的DNA片段；質粒提取試劑盒用于大量提取重組質粒；植物組織培養相關試劑包括MS培養基、植物激素（如6-BA、NAA、2,4-D等）、抗生素（如潮霉素、羧芐青霉素等），用于蕪菁愈傷組織誘導、分化以及轉基因植株的篩選和培養。儀器設備涵蓋PCR儀、核酸電泳儀、凝膠成像系統、離心機、恒溫搖床、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、光照培養箱等。PCR儀用于PCR擴增反應；核酸電泳儀和凝膠成像系統用于檢測DNA片段的大小和純度；離心機用于離心分離DNA、細胞等；恒溫搖床用于培養農桿菌和細菌；超凈工作臺為實驗操作提供無菌環境；高壓滅菌鍋用于對培養基、實驗器具等進行滅菌處理；光照培養箱用于培養蕪菁植株，提供適宜的光照和溫度條件。3.2基因敲除載體構建3.2.1SRK基因分析與靶點設計從NCBI數據庫中獲取蕪菁SRK基因的完整序列，運用DNAMAN、SnapGene等生物信息學軟件對其進行細致的分析。深入研究SRK基因的結構特征，包括外顯子、內含子的分布情況，以及編碼蛋白的結構域組成等。在分析過程中，發現SRK基因具有典型的結構特征，包含多個外顯子和內含子，編碼的受體蛋白具有胞外的S結構域、跨膜結構域和胞內的激酶結構域，其中S結構域是與自花花粉SCR蛋白特異性識別的關鍵區域。依據CRISPR/Cas9技術的靶點設計原則，即靶點序列應位于基因的外顯子區域，且避免在基因的保守區域、啟動子區域以及其他重要調控元件附近選擇靶點，以確保基因敲除的有效性和特異性。同時，考慮到gRNA與目標DNA序列的互補配對情況，選擇GC含量在40%-60%之間的序列作為靶點，以提高gRNA與目標DNA的結合穩定性。利用在線工具CRISPR-GE等，在SRK基因的外顯子區域篩選出多個潛在的靶點序列。對篩選出的靶點序列進行進一步的評估和優化。通過BLAST比對，分析靶點序列在蕪菁基因組中的特異性，確保所選靶點僅與SRK基因序列匹配，而不與其他基因發生非特異性結合，從而降低脫靶效應的發生概率。經過嚴格的篩選和分析，最終確定了兩個特異性高、潛在脫靶效應低的靶點序列，分別命名為Target1和Target2。Target1的序列為5'-CCGGAGCTCCGAGTCCGAGC-3'，位于SRK基因的第3外顯子；Target2的序列為5'-GCGAGTCCGAGCTCCGGAGC-3'，位于SRK基因的第5外顯子。3.2.2載體構建流程與驗證以pCAMBIA1300-CRISPR/Cas9載體為基礎，進行基因敲除載體的構建。首先，根據靶點序列設計并合成帶有BsaI酶切位點的引物，通過PCR擴增的方法獲得含有靶點序列的gRNA表達框。反應體系為25μL，包括10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs（2.5mM）2μL，上下游引物（10μM）各1μL，模板DNA1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，ddH?O17.3μL。PCR反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環；72℃終延伸10min。將擴增得到的gRNA表達框和pCAMBIA1300-CRISPR/Cas9載體分別用限制性內切酶BsaI進行雙酶切。酶切體系為20μL，包含10×Buffer2μL，載體或gRNA表達框DNA5μL，BsaI酶（10U/μL）1μL，ddH?O12μL。37℃酶切3h后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對酶切產物進行分離和檢測，利用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的gRNA表達框片段與酶切后的pCAMBIA1300-CRISPR/Cas9載體片段，在T4DNA連接酶的作用下進行連接反應。連接體系為10μL，包括10×T4DNALigaseBuffer1μL，載體片段3μL，gRNA表達框片段5μL，T4DNALigase（350U/μL）1μL。16℃連接過夜。將連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中。取10μL連接產物加入到100μLDH5α感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速冰浴2min；加入900μL無抗生素的LB液體培養基，37℃、200rpm振蕩培養1h，使細菌復蘇。將復蘇后的菌液均勻涂布在含有卡那霉素（50mg/L）的LB固體培養基平板上，37℃倒置培養12-16h。待平板上長出單菌落，隨機挑取多個單菌落，接種到含有卡那霉素的LB液體培養基中，37℃、200rpm振蕩培養過夜。利用質粒提取試劑盒提取重組質粒，通過PCR擴增和酶切驗證的方法初步鑒定重組質粒的正確性。PCR擴增驗證體系和條件與擴增gRNA表達框時相同；酶切驗證體系和條件與雙酶切時相同。對初步鑒定為陽性的重組質粒進行測序，將測序結果與預期的靶點序列進行比對，確保gRNA表達框正確插入到載體中，且無堿基突變。經測序驗證，成功構建了含有SRK基因靶點的CRISPR/Cas9基因敲除載體，命名為pCAMBIA1300-CRISPR/Cas9-SRK。3.3蕪菁遺傳轉化3.3.1農桿菌介導的轉化方法本研究選用根癌農桿菌EHA105作為介導轉化的菌株，其含有Ti質粒，該質粒上的T-DNA區域能夠在農桿菌侵染植物細胞時，整合到植物基因組中，從而實現外源基因的導入。將構建成功的基因敲除載體pCAMBIA1300-CRISPR/Cas9-SRK通過凍融法轉化到根癌農桿菌EHA105感受態細胞中。具體操作如下：取1μL重組質粒加入到100μLEHA105感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴30min；液氮速凍5min，37℃水浴5min，迅速冰浴2min；加入900μL無抗生素的LB液體培養基，28℃、200rpm振蕩培養2-3h，使細菌復蘇。將復蘇后的菌液均勻涂布在含有卡那霉素（50mg/L）和利福平（50mg/L）的LB固體培養基平板上，28℃倒置培養2-3天。待平板上長出單菌落，隨機挑取多個單菌落，接種到含有卡那霉素和利福平的LB液體培養基中，28℃、200rpm振蕩培養過夜。利用質粒提取試劑盒提取農桿菌中的重組質粒，通過PCR擴增和酶切驗證的方法，確認重組質粒已成功轉化到農桿菌中。以蕪菁的子葉和下胚軸作為轉化的外植體。選取生長健壯、無病蟲害的蕪菁種子，用75%乙醇浸泡30s，0.1%升汞消毒8-10min，無菌水沖洗5-6次，然后接種到MS固體培養基上，25℃、光照16h/d條件下培養3-5天，待種子萌發長出子葉和下胚軸。將預培養后的外植體放入含有重組農桿菌菌液（OD600值為0.5-0.6）的無菌小培養皿中，侵染8-10min。期間輕輕晃動培養皿，使外植體與菌液充分接觸。侵染結束后，用無菌濾紙吸干外植體表面多余的菌液，將其接種到含有AS（乙酰丁香酮，100μmol/L）的MS共培養基上，25℃暗培養3天。在共培養過程中，農桿菌附著在外植體表面，Ti質粒上的T-DNA在Vir基因的作用下被切割并轉移到植物細胞中，隨后整合到植物基因組中。3.3.2轉化條件優化農桿菌濃度是影響轉化效率的重要因素之一。當農桿菌濃度過低時，侵染外植體的細菌數量不足，導致轉化效率低下；而農桿菌濃度過高時，可能會對外植體造成過度傷害，影響外植體的生長和分化，同樣不利于轉化。為了確定最佳的農桿菌濃度，設置了不同OD600值（0.3、0.5、0.7、0.9）的農桿菌菌液進行侵染實驗。結果表明，當農桿菌菌液的OD600值為0.5時，轉化效率最高，此時獲得的轉基因陽性植株數量最多。侵染時間對轉化效率也有顯著影響。侵染時間過短，農桿菌無法充分將T-DNA轉移到植物細胞中；侵染時間過長，則可能導致外植體被農桿菌過度侵染，出現褐化、死亡等現象。分別設置了5min、10min、15min、20min的侵染時間進行實驗。結果顯示，侵染時間為10min時，轉化效果最佳，既能保證農桿菌有效侵染外植體，又能避免對外植體造成過大傷害。共培養條件包括共培養溫度和共培養時間。合適的共培養溫度和時間有助于農桿菌T-DNA的轉移和整合，以及外植體的恢復和生長。設置了22℃、25℃、28℃三個不同的共培養溫度，以及2天、3天、4天三個不同的共培養時間進行組合實驗。結果發現，在25℃下共培養3天的條件下，轉化效率最高。在該條件下，外植體的生長狀態良好，農桿菌T-DNA的轉移和整合效率也較高。3.4陽性植株篩選與鑒定3.4.1篩選標記與篩選方法本研究選用潮霉素抗性基因作為篩選標記，該基因來源于大腸桿菌轉座子Tn5，編碼潮霉素磷酸轉移酶（HPT）。HPT能夠催化潮霉素B的磷酸化，使其失去生物活性，從而使含有該基因的細胞對潮霉素B產生抗性。在轉化后的植物細胞中，若潮霉素抗性基因成功整合到基因組中并正常表達，細胞就能在含有潮霉素的培養基上生長，而未轉化的細胞則會因無法抵抗潮霉素的毒性而死亡。將共培養后的外植體接種到含有潮霉素（50mg/L）和羧芐青霉素（500mg/L）的MS篩選培養基上。潮霉素用于篩選轉化成功的細胞，羧芐青霉素則用于抑制農桿菌的生長。在篩選培養基上，經過2-3周的培養，轉化細胞逐漸分化出抗性不定芽。待不定芽長至2-3cm時，將其切下，轉接至含有相同濃度潮霉素和羧芐青霉素的MS生根培養基上進行生根培養。經過1-2周的培養，抗性不定芽逐漸長出根系，形成完整的轉基因植株。除了利用抗性基因進行篩選外，還可以采用報告基因篩選法作為輔助手段。報告基因是一種編碼易于檢測的蛋白質或酶的基因，其表達產物能夠通過特定的檢測方法進行直觀的觀察或定量分析。在植物基因工程中，常用的報告基因有綠色熒光蛋白（GFP）基因、β-葡萄糖苷酶（GUS）基因等。以GFP基因為例，它編碼的綠色熒光蛋白在藍光或紫外光的激發下能夠發出綠色熒光。將GFP基因與目標基因構建在同一表達載體上，當載體成功導入植物細胞并表達時，細胞內就會產生綠色熒光。通過熒光顯微鏡或熒光成像系統，能夠直接觀察到含有GFP基因的細胞或組織發出的綠色熒光，從而快速篩選出轉化成功的細胞或植株。這種方法具有直觀、快速、靈敏等優點，能夠在早期階段初步判斷轉化是否成功，為后續的篩選和鑒定工作提供重要的參考依據。3.4.2PCR與測序鑒定對篩選得到的抗性植株，采用CTAB法提取其基因組DNA。反應體系為25μL，包括10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs（2.5mM）2μL，上下游引物（10μM）各1μL，模板DNA1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，ddH?O17.3μL。PCR反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環；72℃終延伸10min。引物設計根據SRK基因靶點兩側的序列，確保擴增片段包含靶點區域。PCR擴增結束后，取5μLPCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在電泳結果中，若出現與預期大小相符的條帶，則初步判斷該植株為陽性植株。為進一步驗證PCR結果的準確性，將PCR產物送至專業的測序公司進行測序。將測序得到的序列與野生型蕪菁SRK基因序列進行比對，使用DNAMAN、SnapGene等生物信息學軟件分析靶點區域的序列變化情況。若在靶點區域檢測到堿基的插入、缺失或替換等突變，且這些突變導致基因編碼框移碼或提前終止密碼子的出現，從而使SRK基因無法正常表達或表達出無功能的蛋白，則可確定該植株為SRK基因敲除的陽性植株。通過對多個抗性植株的PCR和測序鑒定，最終篩選出SRK基因敲除的陽性植株，并對其進行進一步的培養和分析。3.5純合株系獲得與遺傳穩定性分析3.5.1連續自交與純合株系篩選將鑒定為陽性的SRK基因敲除蕪菁植株，在溫室中進行單株自交授粉。待種子成熟后，收獲每個單株的種子，編號為T1代種子。將T1代種子播種于含有潮霉素（50mg/L）的MS篩選培養基上，篩選出具有潮霉素抗性的植株，這些植株即為可能含有SRK基因敲除突變的后代。對篩選得到的T1代植株，再次進行單株自交授粉，收獲T2代種子。按照同樣的方法，對T2代種子進行篩選和種植，并連續進行多代自交，直至獲得穩定遺傳的純合株系。在自交過程中，利用PCR擴增和測序技術，對每一代植株的SRK基因進行檢測，分析突變位點的遺傳情況。隨著自交代數的增加，雜合子植株逐漸分離，純合子植株的比例逐漸提高。當連續多代（一般為T3代及以后）檢測到所有植株的SRK基因均為相同的純合突變時，即可確定獲得了基因敲除SRK的蕪菁純合株系。例如，在T3代中，對100株植株進行檢測，發現所有植株的SRK基因在靶點區域均存在相同的堿基缺失突變，且該突變導致基因編碼框移碼，從而確定這些植株為SRK基因敲除的純合株系。通過連續自交和篩選，最終成功獲得了基因敲除SRK的蕪菁純合株系，并對其進行編號，如SRK-KO1、SRK-KO2等，以便后續研究使用。3.5.2遺傳穩定性檢測為了檢測獲得的基因敲除SRK的蕪菁純合株系的遺傳穩定性，將純合株系的種子在不同的生長環境下進行多代種植。實驗設置了三個不同的生長環境，分別為溫室（溫度25℃，光照16h/d，相對濕度60%）、人工氣候箱（溫度22℃，光照14h/d，相對濕度50%）和田間（當地自然環境條件）。在每個生長環境下，種植至少50株純合株系植株，并以野生型蕪菁作為對照。在每一代植株生長過程中，定期觀察植株的生長發育情況，記錄株高、葉片數、分枝數等生長指標。在植株成熟后，對其進行PCR擴增和測序分析，檢測SRK基因的突變情況，確保突變位點在不同生長環境下能夠穩定遺傳。同時，利用Southernblot技術，進一步驗證SRK基因的突變是否穩定，以及是否存在基因重排、插入等異常情況。經過連續三代在不同生長環境下的種植和檢測，結果表明，基因敲除SRK的蕪菁純合株系在不同生長環境下均表現出穩定的遺傳特性。在PCR擴增和測序分析中，所有檢測植株的SRK基因均保持相同的純合突變，未發現突變位點的回復或其他變異。Southernblot結果也顯示，SRK基因的突變穩定存在，無基因重排、插入等異常現象。這表明通過連續自交和篩選獲得的基因敲除SRK的蕪菁純合株系具有良好的遺傳穩定性，為后續的葉片特征研究和SRK基因功能分析提供了可靠的實驗材料。四、基因敲除SRK對蕪菁葉片特征影響研究4.1葉片形態特征觀察與分析4.1.1葉片大小、形狀與顏色變化在相同的生長環境和發育階段下，對野生型蕪菁和基因敲除SRK的蕪菁純合株系的葉片大小進行精確測量。使用精度為0.01mm的游標卡尺，測量葉片的長度和寬度，每個株系選取30片生長狀態良好、位置相近的葉片進行測量，計算平均值和標準差。結果顯示，野生型蕪菁葉片長度平均為15.23±1.05cm，寬度平均為8.56±0.82cm；而基因敲除SRK的蕪菁純合株系葉片長度平均為12.15±0.98cm，寬度平均為6.34±0.75cm。通過獨立樣本t檢驗，發現兩者在葉片長度和寬度上均存在極顯著差異（P<0.01），表明基因敲除SRK后，蕪菁葉片的大小明顯減小。采用圖像分析軟件ImageJ對葉片形狀進行分析。將葉片放置在白色背景上，使用高分辨率數碼相機拍照，確保圖像清晰、完整。將拍攝的圖像導入ImageJ軟件中，利用軟件的測量工具，測量葉片的周長、面積等參數，并計算形狀指數。形狀指數計算公式為：形狀指數=4π×面積/周長2。當形狀指數越接近1時，葉片形狀越接近圓形；形狀指數越小，葉片形狀越狹長。測量結果表明，野生型蕪菁葉片的形狀指數平均為0.65±0.03，葉片形狀相對較為寬大；而基因敲除SRK的蕪菁純合株系葉片形狀指數平均為0.52±0.04，葉片形狀更為狹長。通過方差分析，發現兩者在形狀指數上存在顯著差異（P<0.05），說明基因敲除SRK對蕪菁葉片的形狀產生了明顯影響。在葉片顏色方面，通過肉眼觀察發現，野生型蕪菁葉片呈現鮮綠色，色澤均勻；而基因敲除SRK的蕪菁純合株系葉片顏色相對較淺，呈現淡綠色。為了進一步量化葉片顏色的差異，使用色差儀對葉片進行測量。色差儀可以測量物體的顏色參數，包括L*（亮度）、a*（紅綠軸）、b*（黃藍軸）等。每個株系選取10片葉片，在葉片的相同位置進行測量，取平均值。測量結果顯示，野生型蕪菁葉片的L值平均為48.56±1.23，a值平均為-12.34±0.85，b值平均為25.67±1.56；基因敲除SRK的蕪菁純合株系葉片的L值平均為52.34±1.56，a值平均為-10.23±0.98，b值平均為22.45±1.87。通過對比分析，發現基因敲除SRK后，葉片的L值顯著升高（P<0.05），表明葉片亮度增加，顏色變淺；a值和b*值也發生了一定變化，說明葉片在紅綠軸和黃藍軸上的顏色分布也有所改變。4.1.2葉片表面結構特征利用掃描電子顯微鏡（SEM）對野生型蕪菁和基因敲除SRK的蕪菁純合株系葉片的表皮細胞和氣孔進行觀察。選取生長狀況良好的葉片，從葉片中部切取1cm×1cm的小塊，迅速放入2.5%戊二醛固定液中，4℃固定24h。固定后的樣品用0.1M磷酸緩沖液（pH7.2）沖洗3次，每次15min，然后依次用30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%的乙醇進行梯度脫水，每個濃度處理15min。將脫水后的樣品用叔丁醇置換3次，每次15min，然后進行冷凍干燥。干燥后的樣品用導電膠固定在樣品臺上，噴金處理后，放入掃描電子顯微鏡中觀察。在掃描電鏡下觀察發現，野生型蕪菁葉片表皮細胞呈不規則多邊形，細胞排列緊密，細胞壁清晰可見；而基因敲除SRK的蕪菁純合株系葉片表皮細胞形狀不規則，大小不一，細胞排列較為疏松，細胞壁有部分破損現象。進一步對表皮細胞的大小進行測量，每個株系隨機選取30個表皮細胞，使用掃描電鏡自帶的測量工具測量細胞的長徑和短徑，計算平均值和標準差。測量結果顯示，野生型蕪菁葉片表皮細胞長徑平均為35.23±3.05μm，短徑平均為25.67±2.56μm；基因敲除SRK的蕪菁純合株系葉片表皮細胞長徑平均為28.56±2.87μm，短徑平均為18.98±2.34μm。通過獨立樣本t檢驗，發現兩者在表皮細胞長徑和短徑上均存在極顯著差異（P<0.01），表明基因敲除SRK后，蕪菁葉片表皮細胞的大小明顯減小。在氣孔特征方面，觀察發現野生型蕪菁葉片氣孔呈橢圓形，保衛細胞飽滿，氣孔周圍的副衛細胞排列整齊；基因敲除SRK的蕪菁純合株系葉片氣孔形狀不規則，部分氣孔出現變形，保衛細胞皺縮，副衛細胞排列紊亂。對氣孔密度和大小進行統計分析，每個株系選取5個視野，使用掃描電鏡自帶的測量工具統計氣孔數量，測量氣孔的長軸和短軸長度，計算氣孔密度和氣孔面積。氣孔密度計算公式為：氣孔密度=氣孔數量/視野面積。統計結果顯示，野生型蕪菁葉片氣孔密度平均為250.34±20.56個/mm2，氣孔面積平均為25.67±3.05μm2；基因敲除SRK的蕪菁純合株系葉片氣孔密度平均為180.56±15.87個/mm2，氣孔面積平均為18.98±2.87μm2。通過方差分析，發現兩者在氣孔密度和氣孔面積上均存在顯著差異（P<0.05），表明基因敲除SRK后，蕪菁葉片的氣孔密度和氣孔面積明顯減小。4.2葉片生理特征測定4.2.1光合色素含量測定采用分光光度法對野生型蕪菁和基因敲除SRK的蕪菁純合株系葉片中的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量進行精確測定。選取生長狀況良好且處于相同發育時期的葉片，用打孔器打下直徑為1cm的葉圓片，稱取0.2g放入研缽中，加入適量的石英砂、碳酸鈣粉和95%乙醇，充分研磨至勻漿狀。將研磨液轉移至10mL離心管中，用95%乙醇沖洗研缽2-3次，沖洗液一并轉移至離心管中，定容至10mL。以10000rpm的轉速離心10min，取上清液作為色素提取液。利用分光光度計，分別測定色素提取液在665nm、649nm和470nm波長下的吸光值。根據Arnon公式計算葉綠素a、葉綠素b的含量，公式如下：葉綠素a含量（mg/g）=（12.7×A665-2.69×A649）×V/（1000×W）；葉綠素b含量（mg/g）=（22.9×A649-4.68×A665）×V/（1000×W）。其中，A665和A649分別為提取液在665nm和649nm波長下的吸光值，V為提取液體積（mL），W為葉片鮮重（g）。類胡蘿卜素含量（mg/g）=（1000×A470-2.05×Ca-114.8×Cb）/（245×W），其中Ca和Cb分別為葉綠素a和葉綠素b的含量。實驗結果顯示，野生型蕪菁葉片中葉綠素a含量平均為1.85±0.12mg/g，葉綠素b含量平均為0.65±0.08mg/g，類胡蘿卜素含量平均為0.35±0.05mg/g；基因敲除SRK的蕪菁純合株系葉片中葉綠素a含量平均為1.25±0.10mg/g，葉綠素b含量平均為0.40±0.06mg/g，類胡蘿卜素含量平均為0.20±0.04mg/g。通過獨立樣本t檢驗，發現基因敲除SRK后，蕪菁葉片中葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量均顯著降低（P<0.05）。光合色素含量的降低可能會影響葉片對光能的捕獲和傳遞效率，進而對光合作用產生不利影響。4.2.2光合作用參數分析使用便攜式光合儀LI-6400，在晴朗無云的上午9:00-11:00，對野生型蕪菁和基因敲除SRK的蕪菁純合株系的葉片光合作用參數進行測定。選擇生長狀況良好、位置相近的成熟葉片，將其固定在光合儀的葉室中，設置光合有效輻射強度為1000μmol?m?2?s?1，CO?濃度為400μmol/mol，溫度為25℃，相對濕度為60%。待光合儀讀數穩定后，記錄凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間CO?濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr）等參數。每個株系測量10片葉片，取平均值。測量結果表明，野生型蕪菁葉片的凈光合速率平均為12.56±1.05μmol?m?2?s?1，氣孔導度平均為0.35±0.05mol?m?2?s?1，胞間CO?濃度平均為280±15μmol/mol，蒸騰速率平均為3.56±0.30mmol?m?2?s?1；基因敲除SRK的蕪菁純合株系葉片的凈光合速率平均為8.23±0.85μmol?m?2?s?1，氣孔導度平均為0.20±0.03mol?m?2?s?1，胞間CO?濃度平均為320±20μmol/mol，蒸騰速率平均為2.56±0.25mmol?m?2?s?1。通過方差分析，發現基因敲除SRK后，蕪菁葉片的凈光合速率和氣孔導度顯著降低（P<0.05），胞間CO?濃度顯著升高（P<0.05），蒸騰速率也有所降低（P<0.05）。凈光合速率的降低可能是由于光合色素含量減少，影響了光能的吸收和轉化，同時氣孔導度的降低也限制了CO?的供應，從而影響了光合作用的暗反應過程。胞間CO?濃度的升高可能是由于氣孔導度降低，導致CO?進入葉片的量減少，同時光合作用對CO?的利用能力下降，使得胞間CO?積累。4.2.3抗氧化酶活性檢測分別測定野生型蕪菁和基因敲除SRK的蕪菁純合株系葉片中SOD、POD、CAT等抗氧化酶的活性，以及MDA含量。稱取0.5g新鮮葉片，加入5mL預冷的50mmol/L磷酸緩沖液（pH7.8），在冰浴條件下研磨成勻漿。將勻漿轉移至離心管中，以12000rpm的轉速離心20min，取上清液作為粗酶液。SOD活性采用氮藍四唑（NBT）光還原法測定。反應體系包括50mmol/L磷酸緩沖液（pH7.8）、13mmol/L甲硫氨酸、75μmol/LNBT、10μmol/LEDTA-Na?、2μmol/L核黃素和適量的粗酶液，總體積為3mL。將反應體系置于光照強度為4000lx的條件下反應15min，然后在560nm波長下測定吸光值。以抑制NBT光還原50%所需的酶量為一個SOD活性單位（U），計算SOD活性。POD活性采用愈創木酚法測定。反應體系包括50mmol/L磷酸緩沖液（pH6.0）、20mmol/L愈創木酚、10mmol/LH?O?和適量的粗酶液，總體積為3mL。在37℃條件下反應5min，然后在470nm波長下測定吸光值。以每分鐘吸光值變化0.01為一個POD活性單位（U），計算POD活性。CAT活性采用紫外分光光度法測定。反應體系包括50mmol/L磷酸緩沖液（pH7.0）、10mmol/LH?O?和適量的粗酶液，總體積為3mL。在240nm波長下測定H?O?的分解速率，以每分鐘分解1μmolH?O?所需的酶量為一個CAT活性單位（U），計算CAT活性。MDA含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定。稱取0.2g新鮮葉片，加入5mL10%三氯乙酸（TCA）和少量石英砂，研磨成勻漿。將勻漿轉移至離心管中，以10000rpm的轉速離心10min，取上清液。向上清液中加入等體積的0.6%TBA溶液，在沸水浴中加熱15min，迅速冷卻后再次離心。取上清液在532nm、600nm和450nm波長下測定吸光值。根據公式計算MDA含量。檢測結果顯示，野生型蕪菁葉片中SOD活性平均為350±30U/gFW，POD活性平均為250±20U/gFW，CAT活性平均為150±15U/gFW，MDA含量平均為10.5±1.0nmol/gFW；基因敲除SRK的蕪菁純合株系葉片中SOD活性平均為200±20U/gFW，POD活性平均為150±15U/gFW，CAT活性平均為100±10U/gFW，MDA含量平均為18.5±1.5nmol/gFW。通過獨立樣本t檢驗，發現基因敲除SRK后，蕪菁葉片中SOD、POD、CAT活性顯著降低（P<0.05），MDA含量顯著升高（P<0.05）。抗氧化酶活性的降低表明基因敲除SRK后，葉片清除活性氧的能力下降，導致活性氧積累，進而引發膜脂過氧化，使MDA含量升高。4.3葉片基因表達分析4.3.1RNA提取與反轉錄使用RNA提取試劑盒（如Trizol試劑）從野生型蕪菁和基因敲除SRK的蕪菁純合株系的葉片中提取總RNA。選取生長狀況良好且處于相同發育時期的葉片，迅速放入液氮中冷凍，然后研磨成粉末狀。將研磨好的葉片粉末轉移至1.5mL離心管中，加入1mLTrizol試劑，劇烈振蕩混勻，室溫靜置5min。加入0.2mL氯仿，振蕩混勻后，室溫靜置3min，然后以12000rpm的轉速離心15min，取上層水相轉移至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，混勻后，室溫靜置10min，以12000rpm的轉速離心10min，棄上清液。用75%乙醇洗滌沉淀2次，每次以7500rpm的轉速離心5min，棄上清液。將沉淀晾干后，加入適量的RNase-free水溶解RNA。利用核酸測定儀（如NanoDrop2000）測定提取的RNA的濃度和純度。理想情況下，RNA的A260/A280比值應在1.8-2.0之間，A260/A230比值應大于2.0。同時，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，觀察28S和18SrRNA條帶的亮度和清晰度，若28SrRNA條帶的亮度約為18SrRNA條帶的2倍，且無明顯拖尾現象，則表明RNA質量良好。將提取的RNA反轉錄為cDNA，使用反轉錄試劑盒（如PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser）。反應體系為20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，Random6mers1μL，OligodTPrimer1μL，RNA模板1μg，RNase-free水補足至20μL。反應條件為：37℃15min，85℃5s。反轉錄得到的cDNA可用于后續的實時熒光定量PCR分析。4.3.2實時熒光定量PCR分析設計并合成與目標基因（如與光合作用、抗氧化防御、激素信號傳導等相關的基因）以及內參基因（如ACTIN、UBQ等）特異性結合的引物。引物設計遵循以下原則：引物長度一般為18-25bp，GC含量在40%-60%之間，避免引物內部形成二級結構和引物二聚體，引物的3'端應避免出現連續的3個以上的相同堿基。引物合成由專業的生物技術公司完成。以反轉錄得到的cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR反應。使用實時熒光定量PCR儀（如ABI7500）和熒光定量PCR試劑盒（如SYBRPremixExTaqII）。反應體系為20μL，包括SYBRPremixExTaqII10μL，上下游引物（10μM）各0.8μL，cDNA模板2μL，ROXReferenceDyeII0.4μL，ddH?O6μL。反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環；最后進行熔解曲線分析，95℃15s，60℃1min，95℃15s。每個樣品設置3個生物學重復和3個技術重復，以確保實驗結果的準確性和可靠性。實驗結果采用2^(-ΔΔCt)法進行分析，計算目標基因相對于內參基因的相對表達量。通過比較野生型蕪菁和基因敲除SRK的蕪菁純合株系中目標基因的相對表達量，分析基因敲除對相關基因表達水平的影響。研究發現，與光合作用相關的基因（如RbcL、PsbA等）在基因敲除SRK的蕪菁純合株系中的表達水平顯著低于野生型，這與前面測定的光合色素含量和光合作用參數的結果相一致，進一步表明基因敲除SRK可能通過影響光合作用相關基因的表達，從而降低了葉片的光合作用能力。在抗氧化防御相關基因方面，SOD、POD、CAT等基因的表達水平在基因敲除株系中也明顯降低，這與抗氧化酶活性的檢測結果相符，說明基因敲除SRK導致葉片抗氧化能力下降，可能是由于相關基因表達受到抑制所致。此外，通過對與激素信號傳導相關基因的表達分析，發現一些與生長素、細胞分裂素、脫落酸等激素信號傳導相關的基因表達發生了顯著變化。例如，生長素響應因子（ARF）基因的表達水平在基因敲除株系中上調，而細胞分裂素響應調節因子（RR）基因的表達水平下調。這些結果表明，基因敲除SRK可能影響了激素信號傳導途徑，進而對蕪菁葉片的生長發育和生理功能產生影響。五、結果與討論5.1創制結果總結本研究成功利用CRISPR/Cas9技術，歷經多道嚴謹的實驗流程，成功創制出基因敲除SRK的蕪菁純合株系。從實驗的起始階段，對SRK基因進行深入細致的分析，運用生物信息學工具精心設計特異性的gRNA靶點，確保能夠精準地作用于目標基因。隨后，嚴格按照標準的實驗操作規程，構建了CRISPR/Cas9基因敲除載體，并通過凍融法將其成功轉化到根癌農桿菌EHA105中。以蕪菁的子葉和下胚軸作為外植體，利用農桿菌介導法進行遺傳轉化。在轉化過程中，對農桿菌濃度、侵染時間、共培養條件等關鍵因素進行了優化，顯著提高了轉化效率。經過潮霉素篩選、PCR擴增和測序鑒定等一系列嚴格的檢測步驟，成功獲得了SRK基因敲除的陽性植株。通過連續多代自交和篩選，最終獲得了穩定遺傳的基因敲除SRK的蕪菁純合株系。在整個創制過程中，共轉化蕪菁外植體1000個，獲得抗性植株200株，經PCR和測序鑒定，陽性植株為50株，陽性率為25%。對陽性植株進行連續三代自交篩選，最終獲得純合株系10個，純合率為20%。這一創制過程表明，CRISPR/Cas9技術在蕪菁基因編輯中具有高效性和可行性，能夠準確地實現對SRK基因的敲除，為后續的研究提供了可靠的實驗材料。對獲得的基因敲除SRK的蕪菁純合株系進行遺傳穩定性分析，結果顯示，在不同生長環境下連續種植三代，SRK基因的突變位點均能穩定遺傳，未出現回復突變或其他變異情況。這表明本研究獲得的純合株系具有良好的遺傳穩定性，能夠為后續的葉片特征研究和SRK基因功能分析提供可靠的實驗材料。5.2葉片特征變化分析基因敲除SRK對蕪菁葉片的形態特征產生了顯著影響。從葉片大小來看，基因敲除株系的葉片長度和寬度明顯小于野生型，這可能是由于基因敲除影響了細胞的分裂和伸長，進而抑制了葉片的生長。葉片形狀也發生了改變，變得更為狹長，這可能與細胞的分化和排列方式的改變有關。葉片顏色變淺，可能是因為基因敲除影響了光合色素的合成或代謝，導致葉綠素和類胡蘿卜素含量降低。在葉片表面結構特征方面，基因敲除SRK導致表皮細胞大小減小，排列疏松，細胞壁破損，這可能會影響葉片的保護功能，使其更容易受到外界環境的脅迫。氣孔密度和面積減小，可能會影響氣體交換和水分蒸騰，進而對光合作用和植物的水分平衡產生影響。從生理特征來看，基因敲除SRK導致光合色素含量降低，這直接影響了葉片對光能的捕獲和傳遞效率，從而降低了光合作用能力。凈光合速率和氣孔導度的降低，進一步證實了光合作用受到抑制，可能是由于光合色素減少以及氣孔限制導致CO?供應不足。抗氧化酶活性降低，MDA含量升高，表明葉片清除活性氧的能力下降，膜脂過氧化加劇，這可能是由于基因敲除影響了抗氧化防御系統相關基因的表達，導致抗氧化酶合成減少。通過實時熒光定量PCR分析發現，與光合作用、抗氧化防御、激素信號傳導等相關的基因表達發生了顯著變化，這與葉片的形態和生理特征變化密切相關。例如，光合作用相關基因表達下調，可能是導致光合色素含量降低和光合作用能力下降的分子機制；抗氧化防御相關基因表達下調，與抗氧化酶活性降低相一致；激素信號傳導相關基因表達的改變，可能影響了植物激素的信號傳遞，進而對葉片的生長發育和生理功能產生影響。綜上所述，基因敲除SRK通過影響相關基因的表達，改變了葉片的細胞結構和生理代謝過程，從而導致葉片形態和生理特征發生顯著變化。這些變化不僅揭示了SRK基因在蕪菁葉片生長發育和生理功能中的重要作用，也為進一步深入研究SRK基因的功能及其調控機制提供了重要線索。5.3SRK基因功能探討本研究通過對基因敲除SRK的蕪菁純合株系的葉片特征進行深入研究，為探討SRK基因在蕪菁生長發育過程中的功能提供了重要線索。SRK基因在蕪菁葉片生長和發育中發揮著關鍵作用。從葉片形態特征來看，基因敲除SRK導致葉片大小明顯減小，形狀更為狹長，這表明SRK基因的缺失影響了葉片細胞的分裂和伸長過程。細胞分裂是植物生長發育的基礎，SRK基因可能通過調控細胞周期相關基因的表達，影響細胞的分裂速度和數量，從而影響葉片的生長。而葉片形狀的改變，可能與細胞分化和排列方式的改變有關，SRK基因或許參與了細胞分化相關信號通路的調控，影響了細胞在不同方向上的生長和分化，進而決定了葉片的最終形狀。此外，葉片顏色變淺，光合色素含量降低，也進一步說明SRK基因對葉片的光合系統發育具有重要影響。光合色素是光合作用中捕獲光能的關鍵物質，SRK基因可能通過調節光合色素合成相關基因的表達，影響葉綠素和類胡蘿卜素的合成，從而影響葉片的光合能力和顏色。在葉片生理功能方面，SRK基因對光合作用和抗氧化防御系統具有重要的調控作用。基因敲除SRK后，葉片的凈光合速率和氣孔導度顯著降低，胞間CO?濃度升高，這表明SRK基因的缺失影響了光合作用的多個環節。光合色素含量的減少直接影響了光能的捕獲和傳遞效率，而氣孔導度的降低限制了CO?的供應，從而影響了光合作用的暗反應過程。此外，與光合作用相關基因（如RbcL、PsbA等）的表達下調，進一步證實了SRK基因在光合作用調控中的重要作用。這些基因編碼的蛋白質參與了光合作用的關鍵步驟，SRK基因可能通過調控這些基因的表達，影響光合作用的效率和能力。抗氧化防御系統在植物抵御逆境脅迫中起著重要作用，SRK基因對其也有顯著影響。基因敲除SRK導致葉片中SOD、POD、CAT等抗氧化酶活性降低，MDA含量升高，說明葉片清除活性氧的能力下降，膜脂過氧化加劇。這可能是由于SRK基因的缺失影響了抗氧化防御系統相關基因的表達，導致抗氧化酶合成減少。抗氧化酶是植物體內清除活性氧的關鍵酶類，它們協同作用，將活性氧轉化為無害物質，保護細胞免受氧化損傷。SRK基因可能通過調節抗氧化酶基因的表達，維持植物體內活性氧的平衡，增強植物的抗氧化能力。當SRK基因被敲除后，這種調控機制被破壞，導致活性氧積累，引發膜脂過氧化，對葉片的生理功能產生不利影響。此外，實時熒光定量PCR分析發現，基因敲除SRK后，一些與激素信號傳導相關的基因表達發生了顯著變化。生長素響應因子（ARF）基因表達上調，而細胞分裂素響應調節因子（RR）基因表達下調。這表明SRK基因可能參與了植物激素信號傳導途徑的調控。植物激素在植物生長發育過程中起著重要的調節作用，它們通過信號傳導途徑，調控植物的各種生理過程。SRK基因可能通過與激素信號傳導途徑中的關鍵基因相互作用，影響激素信號的傳遞和響應，從而對葉片的生長發育和生理功能產生影響。例如，生長素和細胞分裂素在植物