DBS13——高效液相色譜法河北省衛生和計劃生育委員會發布DBS13/009—2017本標準按照GB/T1.1-2009規定的格式編寫。本標準由河北省衛生和計劃生育委員會歸口。本標準于2017年11月8日首次發布。1DBS13/009—2017食品安全地方標準小麥粉中偶氮甲酰胺的測定—高效液相色譜法本標準規定了小麥粉中偶氮甲酰胺的高效液相色譜測定方法。本標準適用于小麥粉中偶氮甲酰胺含量的檢測。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。GB/T5009.1食品衛生檢驗方法理化部分總則GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法。3原理樣品中的偶氮甲酰胺用丙酮進行提取，經濃縮、脫脂、過濾后，高效液相色譜法測定，外標法定量。4試劑和材料除另有規定外，試劑均為分析純，實驗用水符合GB/T6682一級水要求。4.1乙腈：色譜純。4.2丙酮：色譜純。4.3正己烷：色譜純。4.4磷酸。4.5磷酸氫二鉀（K2HPO4·3H2O）。4.6辛烷磺酸鈉。4.7標準品：偶氮甲酰胺（C2H6N6O2，CAS號：123-77-3）純度大于或等于99%。4.8色譜柱1：C18柱，柱長250mm，內徑4.6mm，粒徑5μm，或相當者。4.9色譜柱2：氰基（CN）柱，柱長250mm，內徑4.6mm，粒徑5μm，或相當者。4.1010mmol/L辛烷磺酸鈉-5mmol/L磷酸氫二鉀溶液：稱取1.08g辛烷磺酸鈉（4.60.57g磷酸氫二鉀（4.5）加水溶解并定容至500mL，用磷酸（4.4）溶液調節pH至3.5。4.115mmol/L磷酸氫二鉀溶液：稱取0.57g磷酸氫二鉀（4.5）加水溶解并定容至500mL。DBS13/009—201724.12標準儲備液：準確稱取適量偶氮甲酰胺標準品（4.7），用5mmol/L磷酸氫二鉀溶液（4.11）或水溶解并配制成含偶氮甲酰胺100mg/L的標準儲備液，現用現配。注：使用色譜柱1用5mmol/L磷酸氫二鉀溶液（4.11）溶解，使用色譜柱2用水4.13基質標準工作液：準確移取一定體積的標準儲備溶液（4.12），用空白樣品處理液稀釋成濃度適當的標準工作液，現用現配。4.14微孔濾膜：0.45μm，水系。5儀器和設備5.1高效液相色譜儀：配有紫外檢測器或二極管陣列檢測器。5.2高速離心機。5.3超聲波振蕩器。5.4旋轉蒸發儀。%.1渦旋混合器。5.5離心管。5.6分析天平：感量分別為0.01g和0.1mg。6分析步驟6.1樣品制備試驗前應將獲取的樣品充分混勻，樣品制備方法按GB/T5009.1執行。6.2樣品處理稱取小麥粉樣品2g（精確至0.01g）于50mL具塞離心管中，加入15mL丙酮（4.2）超聲振蕩提取15min，在7000r/min下離心5min，將上清液轉移至50mL濃縮瓶中，再用10mL丙酮重復提取一次，合并提取液于濃縮瓶中，于常溫下減壓濃縮至干。殘渣用2mL5mmol/L磷酸氫二鉀溶液（4.11）或水超聲渦旋5min復溶。再加入3mL正己烷（4.3）脫脂，靜置分層后，取下層溶液過0.45μm水系微孔濾膜（4.14濾液供高效液相色譜儀分析。6.3高效液相色譜參考條件色譜條件可以參照以下用于任何一種色譜柱的測定。6.2.1用于色譜柱1測定的條件a)色譜柱：C18柱，柱長250mm，內徑4.6mm，粒徑5μm，或相當者；b)流動相：10mmol/L辛烷磺酸鈉-5mmol/L磷酸氫二鉀溶液（A4.10）-乙腈（B80+20，v+v；c)流速：0.5mL/min；DBS13/009—20173d)檢測波長：245nm；e)進樣量：20μL；f)柱溫：30℃。6.2.2用于色譜柱2測定的條件a)色譜柱：CN柱，柱長250mm，內徑4.6mm，粒徑5μm，或相當者；b)流動相：水（A）-乙腈（B80+20，v+v；c)流速：0.8mL/min；d)檢測波長：245nm；e)進樣量：20μL；f)柱溫：30℃。6.4空白試驗除不加樣品外，均按上述測定步驟進行。6.5測定在儀器最佳狀態下測定基質標準工作液和樣品溶液，保證所測樣品中待測物的響應值均在線性范圍內，如果超出標準曲線范圍，應用5mmol/L磷酸氫二鉀溶液（4.11）或水對樣品溶液進行適當稀釋。以待測物的峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線。以保留時間定性，外標法定量。基質標準工作液和樣品溶液的測定應在4h內完成。7結果計算樣品中偶氮甲酰胺的含量按式（1）計算，計算結果需扣除空白值：X…………….(1)式中：X–樣品中被測物含量，單位為毫克每千克（mg/kgC–由標準曲線得出的樣品溶液中被測物的濃度，單位為毫克每升（mg/LV–樣品溶液定容體積，單位為毫升（mL計算結果保留三位有效數字。8檢出限和定量限小麥粉中偶氮甲酰胺的檢出限為1.5mg/kg，定量限為5mg/kg。4附錄A(資料性附錄)0