DBS13河北省衛生和計劃生育委員會發布DBS13/008—2017本標準按照GB/T1.1-2009規定的格式編寫。本標準由河北省衛生和計劃生育委員會歸口。本標準于2017年11月8日首次發布。2DBS13/008—2017食品安全地方標準肉及肉制品中沙門氏菌環介導等溫擴增（LAMP）檢測方法amplification，LAMP）檢測方法。本標準適用于肉及肉制品中沙門氏菌的快速篩選檢測。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.1食品安全國家標準食品微生物學檢測總則GB4789.4食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27403實驗室質量控制規范食品分子生物學檢測3原理根據沙門氏菌屬特有的靶序列invA基因設計的兩對特殊的內、外引物和一對環引物，特異性識別靶序列上的六個獨立區域，利用BstDNA聚合酶（BstDNApolymerase）啟動循環鏈置換反應，在invA基因序列啟動互補鏈合成，在同一鏈上互補序列周而復始形成有很多環的花椰菜結構的莖-環DNA混合物；加入SYBRGreenI染料，即可通過顏色變化觀察判定結果。疊氮溴化丙錠(propidiummonoazide，PMA)染料能夠嵌入細胞外DNA或者穿過非活性菌受損的細胞膜進入細胞進而嵌入其DNA內，但被阻隔在活性菌的完整細胞膜之外。嵌入非活性菌DNA的PMA染料能夠在強光照射下通過疊氮基團與DNA進一步形成牢固的共價結合，使其不能在后續的LAMP反應中擴增，因而可在LAMP反應中消除來自于非活性菌的DNA對LAMP檢測結果的影響。4儀器和設備除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：4.1冰箱：2℃~5℃,-20℃;4.3均質器；4.4振蕩器；4.5電子天平：感量0.1g；4.6二級生物安全柜；4.7高速臺式離心機：5000r/min~16000r/min；4.9微量移液器（0.1μL~2.5μL；0.5μL~10μL；20μL~200μL；100μL~1000μL）和吸頭；DBS13/008—201734.10無菌透明離心管：1.5mL；4.11PCR反應管（透明）；4.12水浴振蕩器：220r/min，37℃±1℃;4.13鹵素燈：500W。5試劑和材料除有特殊說明外，實驗所用試劑均為分析純或符合生化試劑標準；實驗用水應符合GB/T6682中一級水的要求。5.1緩沖蛋白胨水（BPW），見GB4789.4中A.1。5.2四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液，見GB4789.4中A.2。5.3亞硒酸胱氨酸（SC）增菌液，見GB4789.4中A.3。5.4引物：根據沙門氏菌屬特有的靶序列invA基因設計一套特異性引物，見表1。表1特異性引物序列5’-CGGCCCGATTTTCTCTGG-5’-CGGCAATAGCGTCACCTT-5’-GCGCGGCATCCGCATCAATA-TGCCCGGTAAACAGATGAGT-3’5’-GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCG5’-GGCCTTCAAATCGGCATCAAT-3’5’-GAAAGGGAAAGCCAGCTTTACG-5.510×BstDNA聚合酶緩沖液。5.6100mmol/LMgSO4。5.710mmol/LdNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）。5.8BstDNA聚合酶。5.9無菌去離子水。5.10PMA染料，20mM（1mgPMA添加98μL無菌去離子水制成溶液保存）。5.11SYBRGreenI染料，1000×（取1μL10000×SYBRGreenI染料，添加9μL無菌去離子水）。5.12本標準用做陽性對照的菌株為鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028標準菌株。6檢測程序檢測程序參見圖1。DBS13/008—20174 樣品處理 25g樣品+225mLBPW1mL+TTB10mL1mL+SC10mLPMA的處理DNA模板的提取LAMP反應結果觀察按照GB4789.4方法操作報告圖1檢驗程序7操作步驟7.1前增菌按GB4789.4中5.1操作。7.2增菌按GB4789.4中5.2操作。7.3PMA的處理吸取增菌后的1mLSC和1mLTTB分別加入1.5mL無菌透明離心管中，各加入100μLPMA溶液，220r/min振蕩，37℃±1℃避光保溫10min。然后將離心管進行冰浴，同時置于500W鹵素燈正下方，相距10cm~15cm，曝光10min。7.4DNA模板的制備根據實驗室實際情況，可采用方法一或方法二制備DNA模板：DBS13/008—20175a)方法一（熱裂解法從7.3中PMA處理過的SC和TTB增菌液中各取1mL分別放入另一1.5mL無菌透明離心管中，10000r/min離心2min，棄上清；加入滅菌生理鹽水1mL混勻，10000r/min離心2min，棄上清；然后加無菌去離子水100μL混勻，置100℃煮沸5min，10000r/min離心2min，取上清即為DNA模板，放置-20℃保存，備用。b)方法二（試劑盒法7.3中PMA處理過的SC和TTB增菌液分別參照商品化試劑盒產品操作程序提取DNA模板。7.5LAMP反應7.5.1反應體系配制：分別采用7.4中SC和TTB增菌液提取的DNA模板，將沙門氏菌LAMP檢測的反應體系中各試劑依次添加到PCR反應管中。反應體系中各試劑的量可根據具體情況或不同的反應總體積進行相應調整。反應體系見表2。表2沙門氏菌LAMP檢測的反應體系體積(μL）8000U/mLBstDNA聚合酶— 7.5.2反應程序：將反應管中的反應體系混勻，置于63℃擴增40min，再置于80℃保溫10min，終止反應。7.5.3對照：檢驗過程中分別設陽性對照、陰性對照和空白對照。以鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028純培養物提取的DNA模板為陽性對照，以非沙門氏菌純培養物提取的DNA模板為陰性對照，以無菌去離子水代替DNA模板為空白對照。7.6結果觀察LAMP反應結束后，應于2min內在反應管加入1000×SYBRGreenI染料lμL，輕輕混勻，立即觀察顏色變化。8結果判定和報告在空白對照和陰性對照反應管液體顯示為橙色，陽性對照反應管液體顯示為黃綠色的條件下：8.1陽性：若SC或TTB任一增菌液的反應結果顯示為黃綠色，則判定25g樣品中沙門氏菌初篩結果為陽性，應按照GB4789.4方法繼續進行5.3分離、5.4生化試驗和5.5血清學鑒定，必要時進行5