ICS65.020.20CCSB1622吉林省地方標準DB22/T3601—2023人參銹腐病菌分子檢測實時熒光定量PCR法DetectionofIlyonectriarobustacausingginsengrustyrootrotbyquantitativereal-timePCR吉林省市場監督管理廳發布DB22/T3601—2023前言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由吉林省農業農村廳提出并歸口。本文件起草單位：吉林農業大學、吉林參王植保科技有限公司。本文件主要起草人：陳長卿、姜云、高潔、徐懷友、盧寶慧、楊麗娜、姜伊琳。IDB22/T3601—2023人參銹腐病菌分子檢測實時熒光定量PCR法1范圍本文件確立了人參銹腐病菌實時熒光定量PCR分子檢測方法，給出了實時熒光定量PCR檢測原理，規定了試劑和材料、儀器設備、樣品采集與制備、分析步驟、結果判定、廢棄物處理和防止污染的措施。本文件適用于人參根和土壤中銹腐病菌的實時熒光定量PCR分子檢測。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB/T28067甘蔗黃葉病毒實時熒光RT-PCR檢測方法3術語和定義一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測定每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環后產物總量的方4根據人參銹腐病強壯土赤殼菌I.robusta組蛋白Histone基因的保守序列設計一對特異性引物進行PCR擴增反應。利用熒光信號伴隨目的PCR產物的增加而增強的原理，收集PCR擴增過程的熒光信號值。隨著PCR擴增反應的進行，Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系，根據Ct值判斷供試樣品是否含有人參銹腐病強壯土赤殼菌。51DB22/T3601—2023通用要求除另有規定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。試劑5.2.1水，GB/T6682，一級。5.2.2植物基因組DNA提取試劑盒。5.2.3土壤總DNA提取試劑盒。5.2.45.3.1實時熒光定量PCR試劑盒。引物引物序列上游引物：5′-CCGCCGACCTGACCTGACCGTCCGCC-3′，下游引物：5′-ATGATGTTTGATGCGAGACGTAA-3′。5.3.2引物配制引物用水稀釋成10μmol/L，-20℃保存備用。6儀器設備天平：感量0.001g。實時熒光定量PCR儀：激發/檢測波長范圍350nm～750nm，可用熒光染料（SYBRGreenⅠ）；升降溫速度≥3.0℃/s；均一性≤±0.5℃；準確性≤±0.3℃；溫度范圍4℃～100℃。離心機：離心轉速12000rpm以上。微量移液器：0.1μL～2.5μL，2μL～20μL，20μL～200μL，100μL～1000μL。核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計。恒溫水浴鍋。72DB22/T3601—2023無菌一級水。樣品采集與制備7.2.1人參采集新鮮人參根，裝入密封袋，置于冰盒中，在實驗室用研磨機將參根打碎，充分混合，4℃保存不超過12h，也可-80℃長期保存。7.2.2土壤每25m人參田塊采用梅花形采樣法，不少于5點，每個點取人參根際土壤樣品50g，裝入密2封袋，充分混合，置于冰盒中，4℃保存不超過12h，也可-80℃長期保存。8分析步驟基因組DNA提取準備人參根樣品和土壤樣品，參照基因組DNA提取試劑盒說明要求提取基因組DNA。采用核酸蛋白分析儀測定DNA濃度和純度。當DNA濃度為100ng/μL～200ng/μL，A260/A280比值為1.8～2.0之間時，DNA模板適宜熒光定量PCR擴增。用無菌一級水將模板DNA濃度稀釋成50ng/μL用于熒光定量PCR擴增。實時熒光定量PCR反應表1實時熒光定量PCR反應體系試劑2×SYBRGreenMix正向引物（10μmol/L）反向引物（10μmol/L）DNA模板擴增反應結束后，陽性對照出現典型的擴增曲線，空白對照和陰性對照的熒光曲線平直或低于陽性對照熒光值的15%，表明反應體系工作正常。否則，表明PCR反應體系不正常，應重新進行檢測。3DB22/T3601—20239結果判定與表述結果判定在PCR反應體系正常工作的前提下，Ct值＞30為陰性，≤30為