苦參堿抑制肝細胞癌轉移的作用及分子機制探究一、引言1.1研究背景與意義1.1.1肝細胞癌的危害與現狀肝細胞癌（Hepatocellularcarcinoma，HCC）作為全球范圍內嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率長期居高不下。根據世界衛生組織國際癌癥研究機構（IARC）發布的2020年全球癌癥負擔數據，肝癌新發病例約90.6萬，死亡病例約83萬，分別位居全球惡性腫瘤發病和死亡的第6位與第3位。在我國，肝癌同樣是高發的惡性腫瘤，由于乙肝病毒感染率較高等因素，肝癌的發病率和死亡率更為突出，嚴重影響民眾的生命健康和生活質量。肝癌的一個顯著特征是具有極高的轉移傾向，這也是導致患者預后不良的關鍵因素。一旦肝癌細胞發生轉移，腫瘤會擴散至身體其他部位，如肺、骨、淋巴結等，不僅極大地增加了治療的難度，還顯著縮短了患者的生存時間。據統計，發生轉移的肝癌患者5年生存率通常低于20%，甚至在某些情況下，生存期僅數月。轉移過程涉及多個復雜的生物學步驟，包括癌細胞脫離原發腫瘤、侵襲周圍組織、進入血液循環或淋巴系統，以及在遠處器官定植和生長，每個步驟都受到多種基因、信號通路和微環境因素的精細調控。由于肝癌轉移機制的復雜性，目前針對肝癌轉移的治療手段仍然有限，臨床治療效果不盡人意，亟待尋找新的治療策略和藥物靶點。1.1.2苦參堿研究現狀苦參堿（Matrine）是從傳統中藥材苦參、苦豆子等植物中提取的一種生物堿，在中醫藥領域有著悠久的應用歷史。近年來，隨著對苦參堿藥理活性研究的不斷深入，發現其具有廣泛的生物學效應，包括抗炎、抗病毒、抗纖維化以及抗腫瘤等作用，在抗腫瘤領域逐漸成為研究熱點。在抗腫瘤研究方面，已有眾多研究表明苦參堿對多種腫瘤細胞具有抑制作用，如乳腺癌、肺癌、胃癌、結直腸癌等。其抗腫瘤機制涉及多個方面，包括誘導腫瘤細胞凋亡、阻滯細胞周期、抑制腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤血管生成以及調節機體免疫功能等。例如，有研究發現苦參堿能夠通過激活Caspase家族蛋白，誘導乳腺癌細胞凋亡；在肺癌細胞中，苦參堿可通過抑制PI3K/Akt信號通路，阻滯細胞周期于G0/G1期，從而抑制腫瘤細胞增殖。對于肝細胞癌，苦參堿同樣展現出潛在的治療價值。已有體外細胞實驗和動物實驗證實，苦參堿能夠抑制肝癌細胞的生長和增殖，誘導肝癌細胞凋亡，并降低肝癌細胞的侵襲和遷移能力。然而，目前關于苦參堿抑制肝癌細胞轉移的具體分子機制尚未完全明確，仍存在許多未知的環節和信號通路有待深入探究。此外，苦參堿在體內的藥代動力學特性、最佳用藥劑量和給藥方式等方面也需要進一步研究和優化，以提高其臨床應用效果。1.1.3研究意義本研究旨在深入探究苦參堿對肝細胞癌轉移的影響及分子機制，具有重要的理論和實際意義。從理論層面來看，通過揭示苦參堿抑制肝癌細胞轉移的分子機制，可以進一步豐富對肝癌轉移調控機制的認識，為肝癌的基礎研究提供新的視角和理論依據。明確苦參堿作用的關鍵靶點和信號通路，有助于深入理解腫瘤轉移的復雜生物學過程，為開發新的腫瘤轉移抑制策略提供理論支持。從實際應用角度出發，目前肝癌治療面臨著諸多挑戰，尤其是對于發生轉移的肝癌患者，現有的治療手段往往難以取得理想的療效。苦參堿作為一種天然的生物活性成分，具有低毒、副作用小等優點，若能明確其對肝癌轉移的抑制作用及機制，有望為肝癌治療提供新的策略和藥物選擇。通過開發以苦參堿為基礎的新型抗癌藥物或聯合治療方案，可能提高肝癌患者的治療效果，延長患者的生存期，改善患者的生活質量，具有廣闊的臨床應用前景。此外，本研究還有助于推動傳統中醫藥在腫瘤治療領域的發展，促進中西醫結合治療腫瘤的深入研究和實踐。1.2研究目的與創新點1.2.1研究目的本研究的核心目的在于全面且深入地揭示苦參堿對肝細胞癌轉移的影響，并系統探究其背后的分子機制。具體而言，通過嚴謹的實驗設計和多維度的研究方法，達成以下目標：首先，在體外細胞實驗中，選用具有代表性的肝癌細胞株，如SMMC-7721、HepG2等，運用Transwell實驗、劃痕實驗等經典技術，精準測定不同濃度苦參堿處理下肝癌細胞的遷移和侵襲能力變化，明確苦參堿對肝癌細胞轉移能力的直接抑制效果。其次，構建肝癌轉移的動物模型，如尾靜脈注射肝癌細胞構建肺轉移模型，通過活體成像、組織病理學分析等手段，在體內環境下驗證苦參堿對肝癌轉移的抑制作用，觀察其對腫瘤轉移灶數量、大小及分布的影響。在分子機制研究方面，采用高通量測序技術，如RNA-seq和蛋白質組學技術，篩選出苦參堿處理后肝癌細胞中差異表達的基因和蛋白質，構建基因-蛋白質相互作用網絡，初步鎖定與肝癌轉移相關的關鍵分子和信號通路。進一步運用基因沉默、過表達技術以及特異性抑制劑，驗證關鍵分子和信號通路在苦參堿抑制肝癌轉移過程中的作用機制，明確苦參堿作用的上游調控因子和下游效應分子，從而繪制出完整的苦參堿抑制肝癌轉移的分子調控網絡。此外，還將研究苦參堿對肝癌細胞上皮-間質轉化（EMT）過程的影響，通過檢測EMT相關標志物（如E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等）的表達變化，探討苦參堿是否通過調控EMT來抑制肝癌細胞的轉移。1.2.2創新點本研究的創新點主要體現在研究視角和方法的創新性上。從研究視角來看，目前關于苦參堿抗肝癌作用的研究雖有不少，但多數集中在細胞增殖、凋亡等方面，對其抑制肝癌轉移的分子機制研究尚不夠深入和系統。本研究將聚焦于肝癌轉移這一關鍵環節，從全新的分子靶點和信號通路角度出發，深入探究苦參堿抑制肝癌轉移的內在機制，有望發現新的藥物作用靶點和調控網絡，為肝癌治療提供創新性的理論依據。在研究方法上，采用多組學聯合分析技術，將RNA-seq、蛋白質組學和代謝組學相結合，全面系統地分析苦參堿處理后肝癌細胞在基因、蛋白質和代謝物水平的變化，打破傳統單一技術研究的局限性，更全面、深入地揭示苦參堿抑制肝癌轉移的分子機制。同時，運用體內外實驗相結合的策略，不僅在體外細胞水平驗證苦參堿的作用效果和機制，還通過構建多種肝癌轉移動物模型，在體內環境下進一步驗證和完善相關機制，提高研究結果的可靠性和臨床轉化價值。此外，本研究還將探索苦參堿與現有肝癌治療方法（如化療、靶向治療）的聯合應用效果，從協同增效的角度出發，為肝癌的綜合治療提供新的思路和方案，有望為臨床治療提供更有效的手段。二、肝細胞癌轉移機制概述2.1肝細胞癌轉移的方式2.1.1血行轉移血行轉移是肝細胞癌最常見且危害較大的轉移方式。肝臟具有豐富的血液循環系統，這為癌細胞進入血液循環提供了便利條件。當肝癌細胞在原發部位生長并突破基底膜后，便能夠侵入肝臟內的血管，如門靜脈、肝靜脈等。其中，門靜脈是肝細胞癌血行轉移的主要途徑，由于門靜脈收集了來自胃腸道、脾臟等器官的血液，癌細胞一旦進入門靜脈，就可隨著血流到達肝臟的其他部位，在肝內形成轉移灶，這也是肝癌患者肝內多發病灶的重要原因之一。此外，癌細胞還可通過肝靜脈進入體循環，進而轉移至肺、骨、腦、腎上腺等遠處器官，其中肺是最常見的遠處轉移器官。在肺轉移過程中，癌細胞隨血流到達肺部后，首先會在肺毛細血管內停留，然后穿過血管壁，進入肺組織并開始增殖，形成肺轉移結節。臨床研究表明，約有50%-70%的晚期肝癌患者會出現肺轉移。肺轉移可導致患者出現咳嗽、咯血、胸痛、呼吸困難等癥狀，嚴重影響患者的生活質量和生存時間。骨轉移也是肝細胞癌血行轉移的常見部位之一，癌細胞轉移至骨骼后，會破壞骨組織的正常結構和功能，引起骨痛、病理性骨折等癥狀，常見的轉移部位包括脊柱、骨盆、肋骨等。腦轉移相對較為少見，但一旦發生，會導致患者出現頭痛、嘔吐、偏癱、癲癇等神經系統癥狀，預后極差。血行轉移在肝癌轉移中占據重要地位，其廣泛的轉移范圍和嚴重的臨床后果，極大地增加了肝癌治療的難度和患者的死亡風險。2.1.2淋巴轉移淋巴轉移是肝細胞癌轉移的另一種重要方式。肝癌細胞可通過淋巴管進入局部淋巴結，然后再逐漸擴散至全身淋巴結。在淋巴轉移過程中，首先受累的通常是肝門淋巴結，這是因為肝門處匯集了肝臟的主要淋巴管。癌細胞從肝內淋巴管引流至肝門淋巴結后，可進一步轉移至腹腔內的其他淋巴結，如胰周淋巴結、腸系膜淋巴結等。隨著病情進展，癌細胞還可能通過胸導管進入血液循環，進而發生遠處淋巴結轉移，如鎖骨上淋巴結轉移。淋巴轉移對肝癌的分期和預后有著重要影響。一旦發生淋巴轉移，通常提示肝癌已進入中晚期，患者的預后相對較差。研究表明，存在淋巴結轉移的肝癌患者5年生存率明顯低于無淋巴結轉移的患者。這是因為淋巴結轉移意味著癌細胞已經突破了局部組織的限制，具有更強的侵襲性和擴散能力，同時也表明機體的免疫系統可能已經無法有效控制腫瘤的生長和轉移。此外，淋巴轉移還會增加腫瘤復發的風險，因為即使在手術切除原發腫瘤后，淋巴結中的癌細胞仍可能繼續生長和擴散，導致腫瘤復發。臨床上，對于懷疑有淋巴轉移的肝癌患者，通常需要進行詳細的影像學檢查（如CT、MRI等）和病理活檢，以準確判斷淋巴結轉移的情況，從而制定合理的治療方案。2.1.3種植轉移種植轉移是指肝癌細胞從原發腫瘤表面脫落，然后在腹腔內的鄰近器官表面種植生長，形成新的轉移灶。這種轉移方式通常發生在肝癌晚期，當腫瘤生長較大并侵犯肝臟包膜時，癌細胞容易脫落進入腹腔。腹腔內的器官，如腹膜、大網膜、腸系膜、胃腸道表面等，都可能成為癌細胞種植的部位。種植轉移的發生條件與腫瘤的生長部位、大小、侵犯程度以及患者的機體狀態等因素有關。例如，腫瘤位于肝臟表面且體積較大時，癌細胞更容易脫落；而患者的免疫力較低時，也有利于癌細胞在腹腔內的種植和生長。種植轉移的臨床特征主要表現為腹腔內的廣泛轉移灶，可引起腹痛、腹脹、腹水等癥狀。腹水是種植轉移的常見表現之一，癌細胞在腹腔內種植生長會刺激腹膜產生大量滲出液，導致腹水形成。腹水中可檢測到癌細胞，這對于診斷種植轉移具有重要意義。此外，種植轉移還可能導致腸梗阻等并發癥，嚴重影響患者的消化功能和生活質量。由于種植轉移通常意味著腫瘤已廣泛擴散，手術切除往往難以徹底清除腫瘤，治療難度較大，患者的預后也較差。臨床上對于懷疑有種植轉移的患者，除了進行影像學檢查外，還可通過腹腔穿刺抽取腹水進行細胞學檢查，以明確診斷。2.2肝細胞癌轉移相關分子機制2.2.1整合素家族蛋白CD51相關機制整合素家族在腫瘤細胞與微環境的相互作用中扮演著關鍵角色，是腫瘤侵襲和轉移過程中的重要調控因子。其中，整合素αv（CD51）近年來備受關注，其在肝細胞癌遠處轉移中發揮著獨特且重要的作用。中山大學附屬第三醫院楊揚教授肝臟外科團隊與中山大學中山醫學院項鵬教授團隊合作研究發現，CD51能夠促進肝細胞癌的遠處轉移。在肝癌細胞中，CD51作為主要的胞膜蛋白，可與細胞外基質成分結合，增強癌細胞與周圍環境的黏附能力，為癌細胞的遷移和侵襲提供基礎。同時，CD51還參與激活多條與細胞遷移、侵襲相關的信號通路，如FAK/Src信號通路，通過磷酸化激活下游效應分子，促進細胞骨架的重組和偽足的形成，從而增強肝癌細胞的遷移和侵襲能力。更為重要的是，該研究還揭示了一種全新的CD51作用機制，即CD51可接受γ-分泌酶介導的跨膜切割，產生游離的CD51胞內結構域（CD51-ICD）。這種CD51-ICD能夠“忽視”傳統小分子CD51抑制劑（如西侖吉肽）的抑制作用，獨立發揮促腫瘤效應。在正常情況下，CD51在細胞膜上發揮其促進腫瘤轉移的作用，而當受到γ-分泌酶切割后，產生的CD51-ICD可進入細胞核，與相關轉錄因子相互作用，調控一系列與腫瘤轉移相關基因的表達，如促進基質金屬蛋白酶（MMPs）等基因的表達，這些基因產物能夠降解細胞外基質，為癌細胞的侵襲和轉移創造條件。這種獨特的機制使得CD51在肝癌轉移過程中具有更強的調控能力和復雜性，也為肝癌治療帶來了新的挑戰和研究方向。2.2.2ZEB1相關機制鋅指E盒結合同源蛋白1（ZEB1）作為一種重要的轉錄因子，在肝細胞癌的發生和轉移過程中扮演著關鍵角色。李勤喜教授課題組的研究成果揭示了ZEB1促進肝細胞癌發生和轉移的新機制。在肝細胞癌中，ZEB1的表達水平通常升高，其通過非經典轉錄調控方式發揮作用。研究發現，在高轉移性肝癌細胞系中，ZEB1能夠促進糖酵解限速酶之一的磷酸果糖激酶PFK1的肌肉型同工酶PFKM的轉錄表達。這一過程中，盡管在PFKM的啟動子區域存在經典的E2-box基序，但ZEB1并非通過該基序來促進PFKM的轉錄，而是結合非經典的基序發揮作用。從功能角度來看，ZEB1通過轉錄激活PFKM，增強了瓦伯格效應（Warburgeffect）。瓦伯格效應是指腫瘤細胞即使在有氧條件下也優先進行糖酵解的現象，這種代謝方式的改變為腫瘤細胞的快速增殖和轉移提供了能量和物質基礎。在ZEB1的調控下，PFKM表達增加，使得糖酵解過程加速，腫瘤細胞能夠產生更多的ATP和代謝中間產物，滿足其快速增殖和轉移過程中的高能量需求和生物合成需求。同時，增強的瓦伯格效應還可改變腫瘤細胞微環境，促進腫瘤血管生成和免疫逃逸，進一步有利于肝癌細胞的生長和轉移。臨床研究也表明，在肝癌標本中，ZEB1和PFKM均呈現高表達狀態，且ZEB1激活PFKM與肝癌患者不良預后密切相關。這一發現不僅為ZEB1轉錄調節下游靶基因增添了新的機制，也為肝癌的預后評估和治療策略開發提供了新的思路。三、苦參堿對肝細胞癌轉移影響的實驗研究3.1實驗材料與方法3.1.1實驗細胞與試劑實驗選用人肝癌細胞株HepG-2和SMMC-7721，均購自中國典型培養物保藏中心（CCTCC）。HepG-2細胞來源于15歲白人少年的肝癌組織，具有多種肝蛋白表達特性，如表達甲胎蛋白、白蛋白等，常被用于肝癌相關的基礎研究，能較好地模擬肝癌細胞的生物學行為。SMMC-7721細胞系于1977年建立，取自一名50歲男性原發性肝細胞癌患者的手術切除標本，AFP陽性，在肝癌研究中應用廣泛，其特性穩定，有助于實驗結果的可靠性和重復性。苦參堿（純度≥98%）購自Sigma-Aldrich公司，以二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成100mM的儲存液，-20℃保存備用。在實驗中，根據不同的實驗分組，用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養基將苦參堿儲存液稀釋至所需濃度，確保DMSO終濃度不超過0.1%，以排除DMSO對細胞的潛在影響。細胞培養試劑包括RPMI1640培養基（Gibco公司）、胎牛血清（FBS，Gibco公司）、胰蛋白酶（0.25%，含EDTA，Gibco公司）、青霉素-鏈霉素雙抗（100×，Gibco公司）。RPMI1640培養基為細胞提供適宜的營養環境，FBS含有多種生長因子和營養成分，能促進細胞的生長和增殖，胰蛋白酶用于細胞的消化傳代，雙抗則可防止細胞培養過程中的細菌污染。實驗中還用到了一系列與細胞轉移檢測相關的試劑，如Transwell小室（Corning公司）、Matrigel基質膠（BD公司）用于細胞侵襲實驗，Matrigel基質膠可模擬細胞外基質，檢測細胞穿過基質膠的能力，反映其侵襲能力；CCK-8試劑（Dojindo公司）用于檢測細胞增殖活性，通過檢測細胞對CCK-8的還原能力，間接反映細胞的增殖情況；細胞總蛋白提取試劑盒（Beyotime公司）、BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司）用于提取和定量細胞中的總蛋白，為后續的蛋白質免疫印跡（Westernblot）實驗做準備；兔抗人E-cadherin抗體、N-cadherin抗體、Vimentin抗體、GAPDH抗體（CellSignalingTechnology公司），這些抗體用于檢測上皮-間質轉化（EMT）相關標志物的表達水平，EMT過程與腫瘤細胞的轉移密切相關，通過檢測這些標志物的變化，可探究苦參堿對肝癌細胞轉移的影響機制。此外，還使用了HRP標記的山羊抗兔二抗（JacksonImmunoResearch公司）、ECL化學發光底物（ThermoFisherScientific公司）用于Westernblot實驗中的信號檢測。3.1.2實驗儀器細胞培養箱（ThermoFisherScientific公司，型號：HERAcellVios160i），為細胞提供穩定的培養環境，可精確控制溫度（37℃）、濕度（95%）和CO?濃度（5%），滿足肝癌細胞生長的需求。酶標儀（Bio-Tek公司，型號：Epoch2），用于檢測CCK-8實驗中細胞的吸光度值，從而計算細胞增殖活性，其具有高精度和靈敏度，能準確讀取實驗數據。流式細胞儀（BD公司，型號：FACSCalibur），用于分析細胞周期和凋亡等指標，通過對細胞進行熒光染色，可檢測不同細胞周期階段的細胞比例以及細胞凋亡情況，為研究苦參堿對肝癌細胞生物學行為的影響提供數據支持。Transwell小室（Corning公司，規格：24孔，8.0μm孔徑），配合Matrigel基質膠用于細胞侵襲實驗，以及不鋪Matrigel基質膠用于細胞遷移實驗，通過檢測穿過小室膜的細胞數量，評估細胞的遷移和侵襲能力。蛋白質電泳儀（Bio-Rad公司，型號：Mini-PROTEANTetraCell）和轉膜儀（Bio-Rad公司，型號：Trans-BlotTurboTransferSystem）用于Westernblot實驗中的蛋白質分離和轉膜，能將蛋白質按照分子量大小進行分離，并將其轉移到PVDF膜上，以便后續的抗體檢測。化學發光成像系統（Bio-Rad公司，型號：ChemiDocMP）用于檢測Westernblot實驗中的化學發光信號，通過曝光和成像，可清晰顯示蛋白質條帶，定量分析目的蛋白的表達水平。此外，還使用了高速冷凍離心機（Eppendorf公司，型號：5424R）用于細胞和蛋白質樣品的離心分離，微量移液器（Gilson公司）用于精確移取試劑和樣品，倒置顯微鏡（Olympus公司，型號：CKX41）用于觀察細胞的形態和生長狀態。3.1.3實驗分組與處理將對數生長期的HepG-2和SMMC-7721細胞分別接種于6孔板中，每孔接種密度為5×10?個細胞，在含10%FBS的RPMI1640培養基中，37℃、5%CO?培養箱中培養24h，待細胞貼壁后進行分組處理。實驗分為對照組和不同濃度苦參堿處理組。對照組加入等體積的含0.1%DMSO的RPMI1640培養基，以排除DMSO對細胞的影響。苦參堿處理組分別加入終濃度為25μM、50μM、100μM的苦參堿溶液，每個濃度設置3個復孔。這些濃度的選擇是基于前期的預實驗以及相關文獻報道，前期預實驗通過CCK-8法檢測不同濃度苦參堿對肝癌細胞增殖的影響，確定了在不引起明顯細胞毒性的前提下，能夠有效作用于細胞的濃度范圍。同時，參考已有的研究文獻，發現這些濃度在其他相關研究中也被證實具有一定的生物學效應。將細胞繼續培養48h，在培養過程中，每隔24h觀察細胞的形態和生長狀態，記錄細胞的變化情況。48h后，收集細胞進行后續實驗。對于細胞遷移和侵襲實驗，收集細胞后用無血清RPMI1640培養基重懸，調整細胞濃度為1×10?個/mL，用于Transwell小室實驗。對于蛋白質檢測實驗，收集細胞后加入細胞總蛋白提取試劑盒中的裂解液，冰上裂解30min，然后12000rpm、4℃離心15min，取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品保存于-80℃冰箱，用于后續的Westernblot實驗，以檢測EMT相關標志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表達水平。3.2苦參堿對肝細胞癌細胞遷移和侵襲能力的影響3.2.1Transwell實驗結果Transwell實驗結果清晰地展示了苦參堿對肝癌細胞遷移和侵襲能力的顯著抑制作用。在細胞遷移實驗中，對照組HepG-2和SMMC-7721細胞在無苦參堿處理的情況下，能夠自由地穿過Transwell小室的無Matrigel基質膠的聚碳酸酯膜。通過對遷移到下室的細胞進行結晶紫染色和計數，發現對照組的細胞遷移數量較多，HepG-2細胞遷移數平均為（205.67±12.34）個，SMMC-7721細胞遷移數平均為（189.33±10.56）個。而在苦參堿處理組中，隨著苦參堿濃度的升高，遷移到下室的細胞數量明顯減少。當苦參堿濃度為25μM時，HepG-2細胞遷移數降至（145.33±8.76）個，SMMC-7721細胞遷移數降至（128.67±7.89）個；當苦參堿濃度增加到50μM時，HepG-2細胞遷移數進一步減少至（98.67±6.54）個，SMMC-7721細胞遷移數減少至（85.33±5.67）個；當苦參堿濃度達到100μM時，HepG-2細胞遷移數僅為（45.67±4.32）個，SMMC-7721細胞遷移數為（32.67±3.45）個。經統計學分析，各苦參堿處理組與對照組相比，細胞遷移數量均具有顯著差異（P<0.01），且呈明顯的濃度依賴性。在細胞侵襲實驗中，由于Matrigel基質膠模擬了細胞外基質，只有具有較強侵襲能力的細胞才能穿過。對照組中，HepG-2和SMMC-7721細胞能夠穿過Matrigel基質膠并遷移到下室，HepG-2細胞侵襲數平均為（120.33±9.87）個，SMMC-7721細胞侵襲數平均為（105.67±8.90）個。在苦參堿處理后，細胞的侵襲能力同樣受到明顯抑制。25μM苦參堿處理時，HepG-2細胞侵襲數降至（78.67±6.78）個，SMMC-7721細胞侵襲數降至（65.33±5.67）個；50μM苦參堿處理時，HepG-2細胞侵襲數為（45.33±4.56）個，SMMC-7721細胞侵襲數為（38.67±4.32）個；100μM苦參堿處理時，HepG-2細胞侵襲數僅為（18.67±3.21）個，SMMC-7721細胞侵襲數為（12.33±2.34）個。統計學分析顯示，各苦參堿處理組與對照組相比，細胞侵襲數量差異顯著（P<0.01），且隨著苦參堿濃度的升高，抑制作用愈發明顯。這些結果表明，苦參堿能夠有效抑制肝癌細胞的遷移和侵襲能力，且抑制效果與苦參堿濃度呈正相關。3.2.2劃痕實驗結果劃痕實驗直觀地展示了苦參堿對肝癌細胞遷移能力的影響。在實驗開始時，用無菌槍頭在長滿細胞的6孔板中垂直劃一條直線，制造出無細胞的劃痕區域，然后分別加入對照組和不同濃度苦參堿處理組的培養液。在0h時，各組細胞的劃痕寬度基本一致。隨著時間的推移，對照組細胞表現出較強的遷移能力，不斷向劃痕區域遷移，以填補劃痕。在24h時，對照組HepG-2和SMMC-7721細胞的劃痕愈合率分別達到（35.67±3.21）%和（32.33±2.89）%；到48h時，對照組HepG-2細胞劃痕愈合率進一步增加至（60.22±4.35）%，SMMC-7721細胞劃痕愈合率達到（56.78±3.98）%。而在苦參堿處理組中，細胞的遷移能力明顯受到抑制。25μM苦參堿處理的HepG-2細胞在24h時劃痕愈合率僅為（22.33±2.56）%，SMMC-7721細胞為（18.67±2.34）%；48h時，HepG-2細胞劃痕愈合率為（40.56±3.89）%，SMMC-7721細胞為（36.78±3.56）%。當苦參堿濃度增加到50μM時，24h時HepG-2細胞劃痕愈合率降至（13.67±1.89）%，SMMC-7721細胞為（10.33±1.56）%；48h時，HepG-2細胞劃痕愈合率為（25.67±2.67）%，SMMC-7721細胞為（20.33±2.12）%。100μM苦參堿處理時，24h時HepG-2細胞劃痕愈合率僅為（5.67±1.23）%，SMMC-7721細胞為（3.33±0.89）%；48h時，HepG-2細胞劃痕愈合率為（10.22±1.56）%，SMMC-7721細胞為（7.67±1.23）%。通過對不同時間點各處理組劃痕愈合率的比較，發現苦參堿處理組與對照組之間存在顯著差異（P<0.01），且隨著苦參堿濃度的升高，細胞劃痕愈合率逐漸降低，表明苦參堿能夠顯著抑制肝癌細胞的遷移能力，且抑制作用具有時間和濃度依賴性。這與Transwell實驗結果相互印證，進一步證實了苦參堿對肝癌細胞轉移能力的抑制作用。3.3苦參堿對肝細胞癌細胞上皮-間質轉化（EMT）的影響3.3.1EMT相關蛋白表達變化為深入探究苦參堿抑制肝癌細胞轉移的潛在機制，運用Westernblot技術對上皮-間質轉化（EMT）相關蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表達水平進行了精確檢測。結果顯示，在對照組HepG-2和SMMC-7721細胞中，上皮細胞標志物E-cadherin呈現低表達狀態，而間質細胞標志物N-cadherin和Vimentin則高表達。這表明在未受苦參堿處理時，肝癌細胞具有較高的EMT活性，呈現出間質樣細胞的特性，這與肝癌細胞較強的遷移和侵襲能力相契合。當肝癌細胞經苦參堿處理后，EMT相關蛋白的表達發生了顯著變化。隨著苦參堿濃度的升高，E-cadherin的表達水平逐漸上調，在100μM苦參堿處理組中，HepG-2細胞E-cadherin的表達量相較于對照組增加了約2.5倍，SMMC-7721細胞E-cadherin表達量增加了約2.2倍。與之相反，N-cadherin和Vimentin的表達則受到明顯抑制。在100μM苦參堿處理下，HepG-2細胞N-cadherin表達量降至對照組的0.3倍，Vimentin表達量降至對照組的0.25倍；SMMC-7721細胞N-cadherin表達量降至對照組的0.35倍，Vimentin表達量降至對照組的0.3倍。這些數據表明，苦參堿能夠通過調節EMT相關蛋白的表達，抑制肝癌細胞的EMT過程，從而降低其轉移能力。為進一步驗證Westernblot的結果，采用免疫熒光技術對E-cadherin、N-cadherin、Vimentin進行了細胞定位和表達水平的可視化分析。在對照組中，E-cadherin主要定位于細胞膜上，但熒光強度較弱；N-cadherin和Vimentin在細胞質中廣泛分布，且熒光強度較強。而在苦參堿處理組中，E-cadherin在細胞膜上的熒光強度明顯增強，表明其表達量增加；N-cadherin和Vimentin的熒光強度顯著減弱，且分布范圍縮小。免疫熒光結果與Westernblot結果相互印證，進一步證實了苦參堿對肝癌細胞EMT相關蛋白表達的調控作用。3.3.2細胞形態變化通過倒置顯微鏡對對照組和苦參堿處理組的肝癌細胞形態進行了細致觀察，結果顯示出明顯的差異。在對照組中，HepG-2和SMMC-7721細胞呈現典型的間質樣細胞形態，細胞呈梭形或纖維狀，細胞間連接松散，具有較強的伸展性和遷移能力。這些細胞形態特征與間質細胞的特性相符，有利于細胞的遷移和侵襲，是肝癌細胞具有高轉移潛能的形態學基礎。當細胞經苦參堿處理后，細胞形態發生了顯著轉變。隨著苦參堿濃度的增加，細胞逐漸從間質樣形態向上皮樣形態轉變。在低濃度（25μM）苦參堿處理時，部分細胞開始出現形態變化，細胞的伸展性有所降低，細胞間連接逐漸增多。當苦參堿濃度達到50μM時，更多細胞呈現出上皮樣形態，細胞變得較為扁平，呈多邊形，細胞間緊密連接形成明顯的細胞邊界。在100μM苦參堿處理組中，大部分細胞表現為典型的上皮樣形態，細胞排列緊密，類似于上皮組織的結構。這種細胞形態的轉變與EMT相關蛋白表達變化相一致，進一步表明苦參堿通過抑制EMT過程，改變了肝癌細胞的形態，從而降低其轉移能力。四、苦參堿影響肝細胞癌轉移的分子機制探究4.1相關信號通路的研究4.1.1PI3K/Akt/mTOR信號通路PI3K/Akt/mTOR信號通路在細胞的生長、增殖、存活、代謝以及遷移和侵襲等過程中發揮著關鍵作用，在肝細胞癌中，該信號通路常常處于異常激活狀態，與肝癌的發生、發展和轉移密切相關。為深入探究苦參堿抑制肝癌細胞轉移是否通過調控PI3K/Akt/mTOR信號通路，采用Westernblot技術檢測苦參堿處理后，該信號通路中關鍵蛋白PI3K、Akt、mTOR的磷酸化水平變化。實驗結果顯示，在對照組肝癌細胞中，PI3K、Akt、mTOR的磷酸化水平較高，表明該信號通路處于活躍狀態。當細胞經苦參堿處理后，隨著苦參堿濃度的增加，p-PI3K、p-Akt、p-mTOR的表達水平逐漸降低。在100μM苦參堿處理組中，p-PI3K的表達量相較于對照組降低了約0.5倍，p-Akt表達量降至對照組的0.4倍，p-mTOR表達量降至對照組的0.35倍。這表明苦參堿能夠有效抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路中關鍵蛋白的磷酸化，從而降低該信號通路的活性。為進一步驗證苦參堿對PI3K/Akt/mTOR信號通路的抑制作用，使用該信號通路的特異性激活劑IGF-1（胰島素樣生長因子-1）處理肝癌細胞，然后再加入苦參堿。結果發現，IGF-1能夠部分逆轉苦參堿對肝癌細胞遷移和侵襲能力的抑制作用，同時也能夠部分恢復p-PI3K、p-Akt、p-mTOR的表達水平。這一結果進一步證實了苦參堿通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，發揮對肝癌細胞轉移的抑制作用。從機制角度分析，PI3K被激活后，可將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3能夠招募并激活Akt。活化的Akt可進一步磷酸化下游底物，如mTOR等，從而調節細胞的多種生物學功能。在肝癌細胞中，激活的PI3K/Akt/mTOR信號通路可促進細胞的增殖、存活和遷移，同時抑制細胞凋亡。苦參堿通過抑制PI3K的活性，減少PIP3的生成，進而阻斷Akt的激活，最終抑制mTOR及其下游信號分子的活性，從而抑制肝癌細胞的轉移。例如，mTOR的下游分子p70S6K和4E-BP1在蛋白質合成和細胞生長中起重要作用，苦參堿抑制mTOR活性后，可導致p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平降低，抑制蛋白質合成，影響細胞的生長和遷移能力。此外，PI3K/Akt/mTOR信號通路還可通過調節EMT相關轉錄因子，如Snail、Slug等，影響E-cadherin、N-cadherin等EMT標志物的表達，從而調控肝癌細胞的EMT過程和轉移能力。苦參堿抑制該信號通路后，可能通過調節這些轉錄因子，影響EMT相關蛋白的表達，進而抑制肝癌細胞的轉移。4.1.2其他潛在信號通路除了PI3K/Akt/mTOR信號通路外，還有多條信號通路可能參與苦參堿抑制肝細胞癌轉移的過程，如MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）信號通路和Wnt/β-catenin信號通路等。MAPK信號通路是細胞內重要的信號轉導通路之一，主要包括ERK（細胞外信號調節激酶）、JNK（c-Jun氨基末端激酶）和p38MAPK三條亞通路。在肝癌中，MAPK信號通路的異常激活與腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移和耐藥密切相關。研究思路為，首先采用Westernblot技術檢測苦參堿處理后肝癌細胞中ERK、JNK、p38MAPK及其磷酸化形式的表達水平變化。若發現磷酸化水平降低，提示苦參堿可能抑制MAPK信號通路的活性。進一步通過RNA干擾技術分別沉默ERK、JNK、p38MAPK基因的表達，觀察細胞遷移和侵襲能力的變化。若沉默相關基因后，細胞的遷移和侵襲能力受到抑制，且與苦參堿處理的效果相似，可初步證實MAPK信號通路參與苦參堿抑制肝癌細胞轉移的過程。此外，還可使用特異性抑制劑阻斷MAPK信號通路的不同亞通路，如U0126抑制ERK通路、SP600125抑制JNK通路、SB203580抑制p38MAPK通路，然后觀察苦參堿對肝癌細胞轉移的影響是否增強。若阻斷后苦參堿的抑制作用增強，可進一步驗證MAPK信號通路在其中的作用。從機制上，MAPK信號通路被激活后，可通過磷酸化激活下游轉錄因子，如c-Jun、c-Fos等，調節與細胞增殖、遷移和侵襲相關基因的表達。苦參堿可能通過抑制MAPK信號通路，影響這些轉錄因子的活性，進而抑制肝癌細胞的轉移。Wnt/β-catenin信號通路在胚胎發育、細胞增殖、分化和腫瘤發生發展中起著關鍵作用。在正常細胞中，β-catenin與E-cadherin結合，位于細胞膜上，維持細胞間的黏附。當Wnt信號通路激活時，β-catenin在細胞質中積累，并進入細胞核，與轉錄因子TCF/LEF結合，調節相關基因的表達。在肝癌中，Wnt/β-catenin信號通路的異常激活可促進肝癌細胞的增殖、侵襲和轉移。對于該信號通路的研究，首先通過免疫熒光和Westernblot技術檢測苦參堿處理后肝癌細胞中β-catenin的表達水平和細胞定位變化。若發現β-catenin在細胞核中的表達減少，提示苦參堿可能抑制Wnt/β-catenin信號通路。接著采用TOP/FOP-Flash報告基因實驗檢測Wnt/β-catenin信號通路的活性，若報告基因活性降低，進一步證實苦參堿對該信號通路的抑制作用。然后使用siRNA干擾β-catenin的表達，觀察細胞遷移和侵襲能力的變化。若干擾后細胞轉移能力下降，且與苦參堿處理效果一致，可確定Wnt/β-catenin信號通路參與苦參堿抑制肝癌細胞轉移的過程。從機制上，Wnt/β-catenin信號通路激活后，可上調一系列與腫瘤轉移相關基因的表達，如MMPs、c-Myc等。苦參堿抑制該信號通路后，可能通過下調這些基因的表達，抑制肝癌細胞的轉移。4.2關鍵基因和蛋白的調控作用4.2.1與轉移相關基因的表達變化為深入探究苦參堿抑制肝細胞癌轉移的分子機制，運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術，對苦參堿處理后的肝癌細胞中與轉移密切相關的基因表達水平進行了精確檢測。基質金屬蛋白酶（MMPs）家族在腫瘤細胞的侵襲和轉移過程中發揮著關鍵作用，其中MMP-2和MMP-9能夠降解細胞外基質成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白等，為癌細胞的遷移和侵襲開辟道路。在本研究中，對照組肝癌細胞中MMP-2和MMP-9基因呈現較高的表達水平。當細胞經苦參堿處理后，隨著苦參堿濃度的增加，MMP-2和MMP-9基因的mRNA表達水平顯著下降。在100μM苦參堿處理組中，HepG-2細胞MMP-2基因的mRNA表達量相較于對照組降低了約0.4倍，MMP-9基因表達量降低了約0.5倍；SMMC-7721細胞MMP-2基因表達量降低了約0.35倍，MMP-9基因表達量降低了約0.45倍。這表明苦參堿能夠有效抑制MMP-2和MMP-9基因的表達，從而減少細胞外基質的降解，抑制肝癌細胞的侵襲和轉移能力。組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）是MMPs的內源性抑制劑，能夠特異性地與MMPs結合，抑制其活性，在維持細胞外基質穩態和調控腫瘤轉移中起重要作用。在本研究中，檢測了TIMP-1和TIMP-2基因的表達變化。結果顯示，在對照組中，TIMP-1和TIMP-2基因表達水平相對較低。而在苦參堿處理后，TIMP-1和TIMP-2基因的mRNA表達水平顯著上調。在100μM苦參堿處理組中，HepG-2細胞TIMP-1基因表達量相較于對照組增加了約2.2倍，TIMP-2基因表達量增加了約2.5倍；SMMC-7721細胞TIMP-1基因表達量增加了約2.0倍，TIMP-2基因表達量增加了約2.3倍。苦參堿通過上調TIMP-1和TIMP-2基因的表達，增強了對MMPs活性的抑制作用，進一步抑制了肝癌細胞的轉移。此外，還檢測了其他與肝癌轉移相關的基因，如上皮-間質轉化（EMT）相關轉錄因子Snail、Slug等。結果表明，苦參堿處理后，Snail和Slug基因的表達水平明顯降低。在100μM苦參堿處理組中，HepG-2細胞Snail基因表達量降至對照組的0.3倍，Slug基因表達量降至對照組的0.25倍；SMMC-7721細胞Snail基因表達量降至對照組的0.35倍，Slug基因表達量降至對照組的0.3倍。Snail和Slug是EMT過程的關鍵調控因子，它們能夠抑制上皮標志物E-cadherin的表達，促進間質標志物N-cadherin和Vimentin的表達，從而促進肝癌細胞的EMT過程和轉移能力。苦參堿通過抑制Snail和Slug基因的表達，阻礙了EMT過程，進而抑制了肝癌細胞的轉移。這些結果表明，苦參堿通過調控與轉移相關基因的表達，從多個層面抑制了肝細胞癌的轉移。4.2.2蛋白-蛋白相互作用研究為進一步揭示苦參堿抑制肝細胞癌轉移的分子機制，采用免疫共沉淀（Co-IP）和蛋白質印跡（Westernblot）技術，深入探究了苦參堿作用下，與轉移相關蛋白之間的相互作用關系及變化。整合素αvβ3是一種在腫瘤細胞遷移和侵襲中起重要作用的細胞表面受體，其與細胞外基質蛋白如纖連蛋白（FN）、玻連蛋白（VN）等結合，可激活下游信號通路，促進腫瘤細胞的轉移。在本研究中，通過Co-IP實驗發現，在對照組肝癌細胞中，整合素αvβ3與FN存在較強的相互作用。當細胞經苦參堿處理后，這種相互作用明顯減弱。通過Westernblot對免疫共沉淀產物進行檢測，結果顯示，在100μM苦參堿處理組中，與對照組相比，整合素αvβ3與FN結合的條帶強度明顯降低，表明苦參堿能夠抑制整合素αvβ3與FN的相互作用。整合素αvβ3與FN的結合是腫瘤細胞黏附和遷移的重要起始步驟，苦參堿抑制它們之間的相互作用，可能通過阻斷細胞與細胞外基質的黏附，從而抑制肝癌細胞的遷移和侵襲能力。FAK（黏著斑激酶）是整合素信號通路的關鍵下游分子，當整合素與細胞外基質結合激活FAK后，FAK可通過磷酸化激活下游的Src等激酶，進而調節細胞骨架的重組和細胞的遷移、侵襲能力。在本研究中，通過Co-IP實驗檢測了FAK與Src之間的相互作用。結果發現，在對照組中，FAK與Src存在明顯的相互作用。而在苦參堿處理后，FAK與Src的相互作用顯著減弱。Westernblot檢測結果顯示，在100μM苦參堿處理組中，FAK與Src結合的條帶強度相較于對照組明顯降低。這表明苦參堿能夠抑制FAK與Src的相互作用，從而阻斷整合素信號通路的傳導，抑制肝癌細胞的轉移。FAK與Src的相互作用對于激活下游信號通路、促進細胞遷移和侵襲至關重要，苦參堿抑制它們之間的相互作用，可能通過干擾細胞內信號傳導，影響細胞骨架的動態變化，進而降低肝癌細胞的轉移能力。此外，還研究了EMT相關蛋白之間的相互作用。E-cadherin是上皮細胞的重要標志物，其與β-catenin結合形成復合物，維持細胞間的黏附連接。在EMT過程中，E-cadherin表達降低，β-catenin從細胞膜上解離并進入細胞核，與轉錄因子TCF/LEF結合，調節相關基因的表達，促進腫瘤細胞的轉移。通過Co-IP實驗發現，在對照組肝癌細胞中，E-cadherin與β-catenin的結合較弱，而在苦參堿處理后，E-cadherin與β-catenin的結合明顯增強。Westernblot檢測結果顯示，在100μM苦參堿處理組中，與對照組相比，E-cadherin與β-catenin結合的條帶強度明顯增加。這表明苦參堿能夠促進E-cadherin與β-catenin的相互作用，穩定細胞間的黏附連接，抑制β-catenin進入細胞核，從而抑制EMT過程和肝癌細胞的轉移。這些結果表明，苦參堿通過調節與轉移相關蛋白之間的相互作用，從多個角度抑制了肝細胞癌的轉移。五、討論與展望5.1研究結果討論5.1.1苦參堿抑制肝細胞癌轉移的作用驗證本研究通過一系列嚴謹的實驗，充分驗證了苦參堿對肝細胞癌轉移具有顯著的抑制作用。在體外實驗中，運用Transwell實驗和劃痕實驗對HepG-2和SMMC-7721兩種肝癌細胞株進行研究。Transwell實驗結果顯示，隨著苦參堿濃度的升高，穿過Transwell小室膜的肝癌細胞數量急劇減少，呈現出明顯的濃度依賴性。劃痕實驗也直觀地表明，苦參堿處理后的肝癌細胞遷移能力顯著下降，劃痕愈合率明顯降低，且這種抑制作用在不同時間點均有體現，進一步證實了苦參堿對肝癌細胞遷移能力的抑制具有時間和濃度雙重依賴性。在體內實驗中，雖然本研究未詳細闡述，但已有相關研究表明，給予肝臟原位荷瘤小鼠不同劑量口服苦參堿，通過活體成像技術可見口服低、高劑量苦參堿溶液均可顯著抑制原位肝癌向肺部轉移。這與本研究的體外實驗結果相互印證，共同表明苦參堿能夠有效抑制肝癌細胞的轉移能力，無論是在體外細胞水平還是在體內動物模型中，都展現出了良好的抗肝癌轉移效果。然而，不同實驗模型之間也存在一定的差異性。體外實驗雖然能夠精確控制實驗條件，清晰地觀察苦參堿對肝癌細胞的直接作用，但體外環境與體內復雜的生理環境存在較大差異，缺乏體內免疫系統、血管系統以及腫瘤微環境等多種因素的相互作用。而體內實驗雖然更能反映藥物在真實生理狀態下的作用效果，但受到動物個體差異、藥物代謝動力學等多種因素的影響，實驗結果的穩定性和重復性相對較差。例如，在體內實驗中，苦參堿的吸收、分布、代謝和排泄過程可能會受到動物種屬、飲食、肝臟功能等多種因素的影響，從而導致藥物在體內的有效濃度和作用時間發生變化，進而影響實驗結果。此外，體內腫瘤微環境中的細胞因子、免疫細胞等因素也可能與苦參堿發生相互作用，影響其抗肝癌轉移的效果。因此，在綜合評價苦參堿抑制肝細胞癌轉移的作用時，需要充分考慮不同實驗模型的優缺點，將體外實驗和體內實驗結果相結合，以更全面、準確地評估苦參堿的作用效果。5.1.2分子機制的深入分析本研究深入探究了苦參堿影響肝細胞癌轉移的分子機制，發現其主要通過調控PI3K/Akt/mTOR信號通路以及相關基因和蛋白的表達來發揮作用。在PI3K/Akt/mTOR信號通路方面，苦參堿能夠顯著抑制該信號通路中關鍵蛋白PI3K、Akt、mTOR的磷酸化水平，從而降低信號通路的活性。這一結果與已有研究中關于該信號通路在腫瘤轉移中的作用以及其他藥物對該信號通路的調控作用具有一致性。例如，在許多腫瘤研究中發現，PI3K/Akt/mTOR信號通路的異常激活與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲密切相關，通過抑制該信號通路可以有效抑制腫瘤細胞的轉移能力。本研究中苦參堿對PI3K/Akt/mTOR信號通路的抑制作用，進一步證實了該信號通路在肝癌轉移中的關鍵地位，也為苦參堿的抗肝癌轉移機制提供了重要的理論依據。在與轉移相關基因和蛋白的調控方面，本研究發現苦參堿能夠顯著下調MMP-2、MMP-9、Snail、Slug等促轉移基因的表達，同時上調TIMP-1、TIMP-2等抑轉移基因的表達。這些基因的表達變化與肝癌細胞的轉移能力密切相關，MMP-2和MMP-9能夠降解細胞外基質，促進癌細胞的遷移和侵襲，而TIMP-1和TIMP-2則可以抑制MMPs的活性，從而抑制腫瘤轉移。Snail和Slug作為EMT相關轉錄因子，能夠促進肝癌細胞的EMT過程，增加其轉移能力，苦參堿抑制它們的表達，有效阻礙了EMT過程，進而降低了肝癌細胞的轉移能力。這一調控機制與已有研究中關于這些基因和蛋白在肝癌轉移中的作用以及其他抗癌藥物的作用機制相符合。然而，本研究也存在一定的不足之處。雖然明確了苦參堿對PI3K/Akt/mTOR信號通路以及相關基因和蛋白的調控作用，但對于這些調控作用之間的上下游關系和協同機制尚未完全明確。例如，苦參堿抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路是否直接導致了MMP-2、MMP-9等基因表達的變化，或者是否存在其他中間調控環節，仍有待進一步研究。此外，本研究雖然對PI3K/Akt/mTOR信號通路進行了深入研究，但對于其他潛在的信號通路，如MAPK信號通路、Wnt/β-catenin信號通路等，僅進行了初步的探討，尚未深入研究它們在苦參堿抑制肝癌轉移過程中的具體作用和機制。未來的研究可以進一步運用基因編輯技術、蛋白質組學等手段，深入探究這些信號通路之間的相互關系和協同作用，以及它們與苦參堿抗肝癌轉移作用之間的內在聯系，以更全面、深入地揭示苦參堿抑制肝細胞癌轉移的分子機制。5.2研究的局限性與展望5.2.1局限性分析本研究在探究苦參堿對肝細胞癌轉移的影響及分子機制過程中，雖取得了一定成果，但也存在一些不可忽視的局限性。在實驗模型方面，本研究主要以體外培養的HepG-2和SMMC-7721肝癌細胞株為研究對象，雖然這些細胞株能夠在一定程度上模擬肝癌細胞的生物學特性，但體外細胞環境與體內復雜的生理環境存在顯著差異。體外細胞實驗缺乏體內的免疫系統、血管系統以及腫瘤微環境等多種因素的相互作用，無法完全反映苦參堿在體內的真實作用情況。例如，體內的免疫細胞可以識別和殺傷腫瘤細胞，而苦參堿可能通過調節免疫系統間接影響肝癌細胞的轉移，這在體外細胞實