專題21基因工程考點1基因工程的工具及其操作步驟〖2023年高考真題〗1．（2023·浙江·統考高考真題）紫外線引發的DNA損傷，可通過“核苷酸切除修復（NER）”方式修復，機制如圖所示。著色性干皮癥（XP）患者的NER酶系統存在缺陷，受陽光照射后，皮膚出現炎癥等癥狀?；颊哂啄臧l病，20歲后開始發展成皮膚癌。下列敘述錯誤的是（）

A．修復過程需要限制酶和DNA聚合酶B．填補缺口時，新鏈合成以5’到3’的方向進行C．DNA有害損傷發生后，在細胞增殖后進行修復，對細胞最有利D．隨年齡增長，XP患者幾乎都會發生皮膚癌的原因，可用突變累積解釋【答案】C【詳解】A、由圖可知，修復過程中需要將損傷部位的序列切斷，因此需要限制酶的參與；同時修復過程中，單個的脫氧核苷酸需要依次連接，要借助DNA聚合酶，A正確；B、填補缺口時，新鏈即子鏈的延伸方向為5’到3’的方向進行，B正確；C、DNA有害損傷發生后，在細胞增殖中進行修復，保證DNA復制的正確進行，對細胞最有利，C錯誤；D、癌癥的發生是多個基因累積突變的結果，隨年齡增長，XP患者幾乎都會發生皮膚癌的原因，可用突變累積解釋，D正確。故選C。2．（2023·廣東·統考高考真題）中外科學家經多年合作研究，發現circDNMT1（一種RNA分子）通過與抑癌基因p53表達的蛋白結合誘發乳腺癌，為解決乳腺癌這一威脅全球女性健康的重大問題提供了新思路。下列敘述錯誤的是（

）A．p53基因突變可能引起細胞癌變B．p53蛋白能夠調控細胞的生長和增殖C．circDNMT1高表達會使乳腺癌細胞增殖變慢D．circDNMT1的基因編輯可用于乳腺癌的基礎研究【答案】C【詳解】A、p53基因是抑癌基因，這類基因突變可能引起細胞癌變，A正確；B、p53基因是抑癌基因，抑癌基因表達的蛋白質能抑制細胞的生長和增殖，或促進細胞凋亡，B正確；C、依據題意，circDNMT1通過與抑癌基因p53表達的蛋白結合誘發乳腺癌，則circDNMT1高表達會使乳腺癌細胞增殖變快，C錯誤；D、circDNMT1的基因編輯可用于乳腺癌的基礎研究，D正確。故選C。3．（2023·湖南·統考高考真題）鹽堿脅迫下植物應激反應產生的H2O2對細胞有毒害作用。禾本科農作物AT1蛋白通過調節細胞膜上PIP2s蛋白磷酸化水平，影響H2O2的跨膜轉運，如圖所示。下列敘述錯誤的是（

）

A．細胞膜上PIP2s蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的B．PIP2s蛋白磷酸化被抑制，促進H2O2外排，從而減輕其對細胞的毒害C．敲除AT1基因或降低其表達可提高禾本科農作物的耐鹽堿能力D．從特殊物種中發掘逆境脅迫相關基因是改良農作物抗逆性的有效途徑【答案】B【詳解】A、由題圖右側的信息可知，AT1蛋白缺陷，可以促進PIP2s蛋白的磷酸化，進而促進H2O2排出膜外，A正確；B、據題圖左側的信息可知，AT1蛋白能夠抑制PIP2s蛋白的磷酸化，減少了H2O2從細胞內輸出到細胞外的量，導致抗氧化脅迫能力弱，不能減輕其對細胞的毒害，B錯誤；C、結合對A選項的分析可推測，敲除AT1基因或降低其表達，可提高禾本科農作物抗氧化脅迫的能力，進而提高其成活率，C正確；D、從特殊物種中發掘逆境脅迫相關基因，可通過基因工程技術改良農作物抗逆性，D正確。故選B。4．（2023·廣東·統考高考真題）“DNA粗提取與鑒定”實驗的基本過程是：裂解→分離→沉淀→鑒定。下列敘述錯誤的是（

）A．裂解：使細胞破裂釋放出DNA等物質B．分離：可去除混合物中的多糖、蛋白質等C．沉淀：可反復多次以提高DNA的純度D．鑒定：加入二苯胺試劑后即呈現藍色【答案】D【詳解】A、裂解是加蒸餾水讓細胞吸水漲破，釋放出DNA等物質，A正確；B、DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L的NaCl溶液，將溶液過濾，即可將混合物中的多糖、蛋白質等與DNA分離，B正確；C、DNA不溶于酒精，而某些蛋白質溶于酒精，可以反復多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA純度，C正確；D、將DNA溶解于NaCl，加入二苯胺試劑，沸水浴五分鐘，待冷卻后，能呈現藍色，D錯誤。故選D。5．（2023·天津·統考高考真題）根據下圖，正確的是（

）

A．子代動物遺傳性狀和受體動物完全一致B．過程1需要MII期去核卵母細胞C．過程2可以大幅改良動物性狀D．過程2為過程3提供了量產方式，過程3為過程1、2提供了改良性狀的方式【答案】D【詳解】A、子代動物的遺傳性狀與供體基本一致，但與受體無關，A錯誤；B、核移植過程中需要處于MII中期的去核卵母細胞，而過程1是培育試管動物，需要培育到適宜時期（桑葚胚或囊胚等時期）進行胚胎移植，B錯誤；C、過程2得到的是克隆動物，是無性生殖的一種，不能大幅改良動物性狀，C錯誤；D、過程2克隆技術可得到大量同種個體，為過程3提供了量產方式；過程3是轉基因技術，轉基因可導入外源優良基因，為過程1、2提供了改良性狀的方式，D正確。故選D。6．（2023·湖北·統考高考真題）用氨芐青霉素抗性基因（AmpR）、四環素抗性基因（TetR）作為標記基因構建的質粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質粒，構建基因表達載體（重組質粒），并轉化到受體菌中。下列敘述錯誤的是（）

A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉錄的產物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四環素）培養基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術鑒定重組質粒構建成功與否D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨芐青霉素）和Tet的培養基中能形成菌落【答案】D【詳解】A、若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，轉錄的產物可能不同，A正確。B、若用PvuⅠ酶切，重組質粒和質粒中都有四環素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四環素）培養基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確；C、DNA凝膠電泳技術可以分離不同大小的DNA片段，重組質粒的大小與質粒不同，能夠鑒定重組質粒構建成功與否，C正確；D、SphⅠ的酶切位點位于四環素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重組質粒中含氨芐青霉素抗性基因（AmpR），因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨芐青霉素）的培養基中能形成菌落，在含Tet的培養基中不能形成菌落，D錯誤。故選D。7．（2023·浙江·統考高考真題）某研究小組利用轉基因技術，將綠色熒光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。實驗得到能正常表達兩種蛋白質的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得Gata3-GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設計了引物1和引物2用于PCR擴增，PCR產物電泳結果如圖乙所示。

下列敘述正確的是（）A．Gata3基因的啟動子無法控制GFP基因的表達B．翻譯時先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C．2號條帶的小鼠是野生型，4號條帶的小鼠是Gata3-GFP基因純合子D．若用引物1和引物3進行PCR，能更好地區分雜合子和純合子【答案】B【詳解】A、分析圖中可知，啟動子在左側，GFP基因整合Gata3基因的右側，啟動子啟動轉錄后，可以使GEP基因轉錄，Gata3基因的啟動子能控制GFP基因的表達，A錯誤；B、因啟動子在左側，轉錄的方向向右，合成的mRNA從左向右為5′→3′，剛好是翻譯的方向，所以翻譯時先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正確；C、整合GFP基因后，核酸片段變長，2號個體只有大片段，所以是Gata3-GFP基因純合子，4號個體只有小片段，是野生型，C錯誤；D、用引物1和引物3進行PCR擴增，擴增出的片段大小差異較小，無法較好的區分片段，D錯誤。故選B。8．（2023·山西·統考高考真題）某同學擬用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA連接酶為工具，將目的基因（兩端含相應限制酶的識別序列和切割位點）和質粒進行切割、連接，以構建重組表達載體。限制酶的切割位點如圖所示。

下列重組表達載體構建方案合理且效率最高的是（

）A．質粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B．質粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C．質粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D．質粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接【答案】C【詳解】A、酶3切割后得到的是平末端，應該用T4DNA連接酶連接，A錯誤；B、質粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能連接，B錯誤；C、質粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA連接酶連接后，還能保證目的基因在質粒上的連接方向，此重組表達載體的構建方案最合理且高效，C正確；D、若用酶2和酶4切割質粒和目的基因，會破壞質粒上的抗生素抗性基因，連接形成的基因表達載體缺少標記基因，無法進行后續的篩選，D錯誤。故選C。9．（2023·天津·統考高考真題）基因工程：制備新型酵母菌(1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉發酵，則應導入多步分解淀粉所需的多種酶，推測這些酶生效的場所應該是（填“細胞內”和“細胞外”）(2)同源切割是一種代替限制酶、DNA連接酶將目的基因導入基因表達載體的方法。當目的基因兩側的小段序列與基因表達載體上某序列相同時，就可以發生同源切割，將目的基因直接插入。研究人員，運用同源切割的方式，在目的基因兩端加上一組同源序列A．B，已知酵母菌體內DNA有許多A-B序列位點可以同源切割插入。構建完成的目的基因結構如圖，則應選擇圖中的引物對目的基因進行PCR。

(3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因（UGA）常用作標記基因，又知尿嘧啶可以使5-氟乳清酸轉化為對酵母菌有毒物質。（i）導入目的基因的酵母菌應在的培養基上篩選培養。由于需要導入多種酶基因，需要多次篩選，因此在導入一種目的基因后，要切除UGA基因，再重新導入。研究人員在UGA基因序列兩端加上酵母菌DNA中不存在的同源C．C’序列，以便對UGA基因進行切除。C．C’的序列方向將影響切割時同源序列的配對方式，進而決定DNA片段在切割后是否可以順利重連，如圖，則應選擇方式進行連接。

（ii）切去UGA基因的酵母菌應在的培養基上篩選培養。(4)綜上，目的基因、標記基因和同源序列在導入酵母菌的基因表達載體上的排列方式應該如圖。

【答案】(1)細胞外(2)P1和P6(3)缺乏尿嘧啶方式二含有5-氟乳清酸(4)圖3【詳解】（1）由于酵母菌不能吸收淀粉，所以導入分解淀粉的酶發揮作用的場所在細胞外。（2）根據題干信息“當目的基因兩側的小段序列與基因表達載體上某序列相同時，就可以發生同源切割，將目的基因直接插入”，要保證目的基因兩側的小段序列與基因表達載體上某序列相同，需要選擇P1和P6這對引物進行PCR。（3）（i）選擇了尿嘧啶合成基因（UGA）常用作標記基因，則應該將酵母菌放在缺乏尿嘧啶的培養基上培養，如果導入成功，則形成菌落；如果沒有導入，則缺乏尿嘧啶，不能生存；方式一，C和C'方向相反，如果切割，則末端在一條鏈上，不能連接，所以選擇方式二，連接方向相同，切割后形成末端，便于連接。（ii）由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸轉化為對酵母菌有毒物質，所以應該在含有5-氟乳清酸的培養基上，如果切割成功，則不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，則會產生有毒物質，不能形成菌落。（4）根據前面分析，C和C'的中間插入UGA，A和B之間插入的目的基因，所以圖3正確。10．（2023·湖南·統考高考真題）基因檢測是診斷和預防遺傳病的有效手段。研究人員采集到一遺傳病家系樣本，測序后發現此家系甲和乙兩個基因存在突變：甲突變可致先天性耳聾；乙基因位于常染色體上，編碼產物可將葉酸轉化為N5-甲基四氫葉酸，乙突變與胎兒神經管缺陷（NTDs）相關；甲和乙位于非同源染色體上。家系患病情況及基因檢測結果如圖所示。不考慮染色體互換，回答下列問題：

(1)此家系先天性耳聾的遺傳方式是。1-1和1-2生育育一個甲和乙突變基因雙純合體女兒的概率是。(2)此家系中甲基因突變如下圖所示：正常基因單鏈片段5'-ATTCCAGATC……（293個堿基）……CCATGCCCAG-3'突變基因單鏈片段5'-ATTCCATATC……（293個堿基）……CCATGCCCAG-3'研究人員擬用PCR擴增目的基因片段，再用某限制酶（識別序列及切割位點為

）酶切檢測甲基因突變情況，設計了一條引物為5′-GGCATG-3'，另一條引物為（寫出6個堿基即可）。用上述引物擴增出家系成員Ⅱ-1的目的基因片段后，其酶切產物長度應為bp（注：該酶切位點在目的基因片段中唯一）。(3)女性的乙基因純合突變會增加胎兒NTDs風險。葉酸在人體內不能合成，孕婦服用葉酸補充劑可降低NTDs的發生風險。建議從可能妊娠或孕前至少1個月開始補充葉酸，一般人群補充有效且安全劑量為0.4~1.0mg.d-1，NTDs生育史女性補充4mg.d-1。經基因檢測胎兒（Ⅲ-2）的乙基因型為-/-，據此推薦該孕婦（Ⅱ-1）葉酸補充劑量為mg.d-1。【答案】(1)常染色體隱性遺傳病1/32(2)5'-ATTCCA-3'8和302(3)4【詳解】（1）由遺傳系譜圖可知，由于I-1與I-2均表現正常，他們關于甲病的基因型均為+/-，而他們的女兒Ⅱ-4患病，因此可判斷甲基因突變導致的先天性耳聾是常染色體隱性遺傳病，由I-1、I-2和Ⅱ-3關于乙病的基因可以推出乙基因突變導致的遺傳病也是常染色體隱性遺傳病，所以I-1和I-2生出一個甲和乙突變基因雙純合體女兒的概率為1/4×1/4×1/2=1/32。（2）本題研究甲基因突變情況，二代1為雜合子，兼有正常甲基因和突變甲基因。目的基因為甲基因，擴增引物應與兩基因共有的TAAGGT片段結合，應為ATTCCA?？蓴U增出大量正常甲基因和突變甲基因供后續鑒定。此時酶切，正常甲基因酶切后片段為8和2+293+7=302bp,突變甲基因無法被酶切，故不寫。后續可通過電泳等手段區分開，達到檢測甲基因突變情況的目的。（3）Ⅲ-2關于乙的基因型為-/-，有患NTDs的可能，因此推薦該孕婦（Ⅱ-1）葉酸補充劑量為4mg·d-1。11．（2023·天津·統考高考真題）某植物四號染色體上面的A基因可以指導植酸合成，不能合成植酸的該種植物會死亡?，F有A3-和A25-兩種分別由A基因缺失3個和25個堿基對產生的基因，已知前者不影響植酸合成，后者效果未知。(1)現有基因型為AA25-的植物，這兩個基因是基因。該植物自交后代進行PCR，正向引物與A25-缺失的堿基配對，反向引物在其下游0．5kb處，PCR后進行電泳，發現植物全部后代PCR產物電泳結果均具有明亮條帶，原因是，其中明亮條帶分為較明亮和較暗兩種，其中較明亮條帶代表基因型為的植物，比例為。(2)將一個A基因導入基因型為A3-A25-的植物的6號染色體，構成基因型為A3-A25-A的植物、該植物自交子代中含有A25-A25-的比例是。(3)在某逆境中，基因型為A3-A3-的植物生存具有優勢，現有某基因型為A3-A的植物，若該種植物嚴格自交，且基因型為A3-A3-的植物每代數量增加10%，補齊下面的表格中，子一代基因頻率數據（保留一位小數）：代親代子一代子二代A基因頻率50%%46．9%A3-基因頻率50%%53．1%基因頻率改變，是的結果。【答案】(1)等位自交后代中基因型為A25-A25-的個體死亡，基因型為A25-A和AA的個體由于都至少含有一個A基因，因此可以與正向引物和反向引物結合進而完成PCR，獲得明亮條帶。AA1/3(2)1/5(3)48.8%51.2%自然選擇【詳解】（1）由題干可知，A25-基因是由A基因缺失25個堿基對產生的基因，即A基因通過基因突變產生A25-基因，因此二者屬于等位基因?；蛐蜑锳A25-的植物自交后代的基因型及其比例為AA：AA25-：A25-A25-=1:2:1。當對這些后代進行PCR時，正向引物與A25-缺失的堿基配對，反向引物在其下游0.5kb處，可推知缺失這25個堿基對的A25-基因無法與正向引物配對從而不能擴增，因此只含有A25-基因的個體（即A25-A25-）不具有條帶；含有這25個堿基對的A基因才能與正向引物和反向引物都進行堿基互補配對從而擴增出條帶，因此基因型為AA、AA25-的個體均具有條帶，且A基因個數越多，擴增產物越多，條帶越明亮，因此基因型為AA的個體具有較明亮的條帶，基因型為AA25-的個體具有較暗的條帶。由題干可知，該植物的全部后代都具有明亮條帶，說明基因型為A25-A25-的個體無法存活，只有基因型為AA和AA25-的個體能夠存活下來，并進行了PCR擴增產生了條帶，因此較明亮條帶代表基因型為AA，占比為1/3。（2）已知基因A3-和A25-都在4號染色體上，再導入一個A基因至6號染色體上，由于它們位于不同對染色體上，故該植物在減數分裂產生配子時，遵循基因自由組合定律，產生配子的基因型為A3-A、A25-A、A3-、A25-，比例各自占1/4；該植物自交后代中基因型為A25-A25-=1/4×1/4=1/16的個體死亡，存活個體占1-1/16=15/16，含有A25-A25-的后代個體基因型有2種，分別是AAA25-A25-=1/4×1/4=1/16，AA25-A25-=1/4×1/4×2=2/16，二者共占3/16，因此該植物自交子代中含有A25-A25-的比例是3/16÷15/16=1/5。（3）基因型為A3-A的植物自交產生子一代的基因型及比例為AA=1/4，A3-A=1/2，A3-A3-=1/4，由題干可知，基因型為A3-A3-的植物每代數量增加10%，則子一代中A3-A3-=1/4+1/4×10%=11/40，因此子一代中AA：A3-A：A3-A3-=1/4：1/2：11/40=10:20:11，可計算出三者的基因型頻率分別是AA=10÷（10+20+11）=10/41，A3-A=20÷（10+20+11）=20/41，A3-A3-=11÷（10+20+11）=11/41，可進一步計算出子一代中A基因頻率=10/41+1/2×20/41=48.8%，A3-基因頻率=11/41+1/2×20/41=51.2%。自然選擇導致具有有利變異的個體存活并由更大幾率產生更多后代，導致后代中決定有利變異的基因頻率增大，而具有不利變異的個體則會被自然選擇淘汰，因此決定不利變異的基因頻率減小，因此基因頻率的改變是自然選擇的結果。12．（2023·北京·統考高考真題）變胖過程中，胰島B細胞會增加。增加的B細胞可能源于自身分裂（途徑I），也可能來自胰島中干細胞的增殖、分化（途徑Ⅱ）?？茖W家采用胸腺嘧啶類似物標記的方法，研究了L基因缺失導致肥胖的模型小鼠IK中新增B細胞的來源。(1)EdU和BrdU都是胸腺嘧啶類似物，能很快進入細胞并摻入正在復制的DNA中，摻入DNA的EdU和BrdU均能與互補配對，并可以被分別檢測。未摻入的EdU和BrdU短時間內即被降解。(2)將處于細胞周期不同階段的細胞混合培養于多孔培養板中，各孔同時加入EdU，隨后每隔一定時間向一組培養孔加入BrdU，再培養十幾分鐘后收集該組孔內全部細胞，檢測雙標記細胞占EdU標記細胞的百分比（如圖）。圖中反映DNA復制所需時長的是從點到點。

(3)為研究變胖過程中B細胞的增殖，需使用一批同時變胖的小鼠。為此，本實驗使用誘導型基因敲除小鼠，即飼喂誘導物后小鼠的L基因才會被敲除，形成小鼠IK?？茖W家利用以下實驗材料制備小鼠IK：①純合小鼠Lx：小鼠L基因兩側已插入特異DNA序列（x），但L的功能正常；②Ce酶基因：源自噬菌體，其編碼的酶進入細胞核后作用于x，導致兩個x間的DNA片段丟失；③Er基因：編碼的Er蛋白位于細胞質，與Er蛋白相連的物質的定位由Er蛋白決定；④口服藥T：小分子化合物，可誘導Er蛋白進入細胞核。請完善制備小鼠IK的技術路線：→連接到表達載體→轉入小鼠Lx→篩選目標小鼠→→獲得小鼠IK。(4)各種細胞DNA復制所需時間基本相同，但途徑I的細胞周期時長（t1）是途徑Ⅱ細胞周期時長（t2）的三倍以上。據此，科學家先用EdU飼喂小鼠IK，t2時間后換用BrdU飼喂，再過t2時間后檢測B細胞被標記的情況。研究表明，變胖過程中增加的B細胞大多數來源于自身分裂，與之相應的檢測結果應是。【答案】(1)A/腺嘌呤(2)QR(3)將Ce酶基因和Er基因連接飼喂口服藥T(4)大多數B細胞沒有被BrdU標記【詳解】（1）分析題意可知，EdU和BrdU都是胸腺嘧啶（T）類似物，根據堿基互補配對的原則可知，摻入DNA的EdU和BrdU均能與A（腺嘌呤）互補配對，并可以被分別檢測。（2）DNA分子復制時會發生模板鏈與子鏈的堿基互補配對，據題可知，將處于細胞周期不同階段的細胞混合培養于多孔培養板中，各孔同時加入EdU，則EdU會與A結合，導致子鏈出現放射性，隨后每隔一定時間向一組培養孔加入BrdU，則BrdU也會與A結合，使放射性增強，最終實現雙標記，隨復制完成達到峰值，故結合題圖可知，圖中反映DNA復制所需時長的是從Q點到R點。（3）分析題意，要制備IK小鼠，需要用誘導型基因敲除小鼠，而飼喂誘導物后小鼠的L基因才會被敲除，結合所給實驗材料及藥物可知，制備小鼠IK的技術路線為：將Ce酶基因和Er基因連接（Ce酶可作用于x，導致兩個x間的DNA片段丟失）→連接到表達載體→轉入小鼠Lx→篩選目標小鼠→飼喂口服藥T（誘導Er蛋白進入細胞核）→獲得小鼠IK。（4）據題可知，變胖過程中增加的B細胞可能源于自身分裂（途徑I），也可能來自胰島中干細胞的增殖、分化（途徑Ⅱ），由于但途徑I的細胞周期時長（t1）是途徑Ⅱ細胞周期時長（t2）的三倍以上，若先用EdU飼喂小鼠IK，各種細胞DNA復制所需時間基本相同，t2時間已經經過一個細胞周期，所有的細胞應都含有EdU標記，實驗假設是變胖過程中增加的B細胞大多數來源于自身分裂，即來源于途徑I，該過程已經復制的B細胞直接分裂，不會再有DNA復制過程，故t2時間后用BrdU飼喂則不起作用，即大多數B細胞沒有被BrdU標記。13．（2023·北京·統考高考真題）二十大報告提出“種業振興行動”。油菜是重要的油料作物，篩選具有優良性狀的育種材料并探究相應遺傳機制，對創制高產優質新品種意義重大。(1)我國科學家用誘變劑處理野生型油菜（綠葉），獲得了新生葉黃化突變體（黃化葉）。突變體與野生型雜交，結果如圖甲，其中隱性性狀是。

(2)科學家克隆出導致新生葉黃化的基因，與野生型相比，它在DNA序列上有一個堿基對改變，導致突變基因上出現了一個限制酶B的酶切位點（如圖乙）。據此，檢測F2基因型的實驗步驟為：提取基因組DNA→PCR→回收擴增產物→→電泳。F2中雜合子電泳條帶數目應為條。

(3)油菜雄性不育品系A作為母本與可育品系R雜交，獲得雜交油菜種子S（雜合子），使雜交油菜的大規模種植成為可能。品系A1育性正常，其他性狀與A相同，A與A1雜交，子一代仍為品系A，由此可大量繁殖A。在大量繁殖A的過程中，會因其他品系花粉的污染而導致A不純，進而影響種子S的純度，導致油菜籽減產。油菜新生葉黃化表型易辨識，且對產量沒有顯著影響?？茖W家設想利用新生葉黃化性狀來提高種子S的純度。育種過程中首先通過一系列操作，獲得了新生葉黃化的A1，利用黃化A1生產種子S的育種流程見圖丙。

①圖丙中，A植株的綠葉雄性不育子代與黃化A1雜交，篩選出的黃化A植株占子一代總數的比例約為。②為減少因花粉污染導致的種子S純度下降，簡單易行的田間操作用?！敬鸢浮?1)黃化葉(2)用限制酶B處理3(3)50%在開花前把田間出現的綠葉植株除去【詳解】（1）野生型油菜進行自交，后代中既有野生型又有葉黃化，由此可以推測黃化葉是隱性性狀。（2）檢測F2基因型的實驗步驟為：：提取基因組DNA→PCR→回收擴增產物→用限制酶B處理→電泳。野生型基因電泳結果有一條帶，葉黃化的基因電泳結果有兩條帶，則F2中雜合子電泳條帶數目應為3條。（3）①油菜雄性不育品系A作為母本與可育品系R雜交，獲得雜交油菜種子S（雜合子），設育性基因為A、a，葉色基因為B、b，可判斷雄性不育品系A為顯性純合子（AA），R為隱性純合子（aa），A植株的綠葉雄性不育子代（AaBb）與黃化A1（aabb）雜交，后代中一半黃化，一半綠葉，篩選出的黃化A植株占子一代總數的比例約為50%。②A不純會影響種子S的純度，為減少因花粉污染導致的種子S純度下降，應在開花前把田間出現的綠葉植株除去。14．（2023·山東·高考真題）科研人員構建了可表達J-V5融合蛋白的重組質粒并進行了檢測，該質粒的部分結構如圖甲所示，其中V5編碼序列表達標簽短肽V5。

(1)與圖甲中啟動子結合的酶是。除圖甲中標出的結構外，作為載體，質粒還需具備的結構有（答出2個結構即可）。(2)構建重組質粒后，為了確定J基因連接到質粒中且插入方向正確，需進行PCR檢測，若僅用一對引物，應選擇圖甲中的引物。已知J基因轉錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的（填“a鏈”或“b鏈”）相應部分的序列相同。(3)重組質粒在受體細胞內正確表達后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測相應蛋白是否表達以及表達水平，結果如圖乙所示。其中，出現條帶1證明細胞內表達了，條帶2所檢出的蛋白（填“是”或“不是”）由重組質粒上的J基因表達的。【答案】(1)RNA聚合酶限制酶切割位點、標記基因、復制原點等(2)F2和R1或F1與R2a鏈(3)J-V5融合蛋白不是【詳解】（1）基因表達載體的構建啟動子是為了啟動下游基因的“表達”，表達首先需要轉錄，因此RNA聚合酶識別和結合的部位才是轉錄的起始。作為運載體必須具備的條件：①要具有限制酶的切割位點；②要有標記基因（如抗性基因），以便于重組后重組子的篩選；③能在宿主細胞中穩定存在并復制；④是安全的，對受體細胞無害，而且要易從供體細胞分離出來，圖中甲有啟動子和終止子等，因此質粒還需具備的結構有限制酶的切割位點、標記基因、復制原點等。（2）據圖甲可知，引物F2與R1或F1與R2結合部位包含J基因的堿基序列，因此推測為了確定J基因連接到質粒中且插入方向正確，進行PCR檢測時，若僅用一對引物，應選擇圖甲中的引物F2和R1或F1與R2。b是模板鏈，而根據圖上啟動子和終止子的位置可知轉錄方向是圖上從左向右，對應的模板鏈方向應該是3’-5'，非模板鏈（也就是a鏈）是5'-3'；考慮到DNA復制的方向是子鏈的5’-3'，引物基礎上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物結合的單鏈其方向是3'-5'；圖中F1是前引物，在左側，所以其配對的單鏈是3’-5'的b鏈，故其序列應該與a鏈相應部分的序列相同。（3）據圖乙可知，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測，均出現條帶1，說明條帶1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗體檢測出現條帶2，抗V5抗體檢測不出現條帶2，說明條帶2所檢出的蛋白不是由重組質粒上的J基因表達的。15．（2023·海南·高考真題）基因遞送是植物遺傳改良的重要技術之一，我國多個實驗室合作開發了一種新型基因遞送系統（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，簡稱CDB法）。圖1與圖2分別是利用常規轉化法和CDB法在某植物中遞送基因的示意圖。

回答下列問題。(1)圖1中，從外植體轉變成愈傷組織的過程屬于；從愈傷組織到幼苗的培養過程需要的激素有生長素和，該過程還需要光照，其作用是。(2)圖1中的愈傷組織，若不經過共培養環節，直接誘導培養得到的植株可以保持植株A的。圖1中，含有外源基因的轉化植株A若用于生產種子，其包裝需標注。(3)圖1與圖2中，農桿菌侵染植物細胞時，可將外源基因遞送到植物細胞中的原因是。(4)已知某酶（PDS）缺失會導致植株白化。某團隊構建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因編輯載體（含有綠色熒光蛋白標記基因），利用圖2中的CDB法將該重組載體導入植株B，長出毛狀根，成功獲得轉化植株B．據此分析，從毛狀根中獲得陽性毛狀根段的方法是，圖2中，鑒定導入幼苗中的基因編輯載體是否成功發揮作用的方法是，依據是。(5)與常規轉化法相比，采用CDB法進行基因遞送的優點是（答出2點即可）。【答案】(1)脫分化細胞分裂素誘導葉綠素的形成；滿足葉綠體利用光能制造有機物的需要(2)遺傳特性轉基因標識(3)Ti質粒中的T-DNA能將外源基因遞送到植物細胞中，并與植物細胞的染色體DNA整合到一起(4)熒光檢測選擇帶有綠色熒光標記的毛狀根觀察幼苗是否表現出白化特征PDS缺失會導致植株白化，白化苗的出現意味著通過基因編輯技術成功實現PDS基因的敲除(5)操作方法簡單，不需要借助植物組織培養技術進行操作，且培養周期較短。【詳解】（1）圖1中，從外植體轉變成愈傷組織的過程屬于脫分化過程，該過程的本質是使細胞失去原來特定的結構和功能；從愈傷組織到幼苗的培養過程需要的激素有生長素和細胞分裂素，這兩種激素的比值能調控愈傷組織的分化方向，該過程還需要光照，因為葉綠素的形成需要光；且葉綠體利用光能制造有機物，供試管苗生長發育。（2）圖1中的愈傷組織，若不經過共培養環節，直接誘導培養得到的植株可以保持植株A的遺傳特性。圖1中，含有外源基因的轉化植株A若用于生產種子，其包裝需標注轉基因種子，即進行轉基因標識。（3）圖1與圖2中，農桿菌侵染植物細胞時，利用了農桿菌含有的Ti質粒的作用，Ti質粒中的T-DNA能將外源基因遞送到植物細胞中，并與植物細胞的染色體DNA整合到一起。（4）已知某酶（PDS）缺失會導致植株白化。某團隊構建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因編輯載體（含有綠色熒光蛋白標記基因），利用圖2中的CDB法將該重組載體導入植株B，長出毛狀根，成功獲得轉化植株B，該過程中通過熒光檢測選擇帶有綠色熒光標記的毛狀根即為陽性毛狀根段，圖2中，鑒定導入幼苗中的基因編輯載體是否成功發揮作用的方法是觀察幼苗是否表現出白化特征，因為PDS缺失會導致植株白化，而白化苗的出現意味著通過基因編輯技術成功實現PDS基因的敲除。（5）與常規轉化法相比，采用CDB法進行基因遞送的優點主要表現在操作方法簡單，不需要借助植物組織培養技術進行操作，且培養周期較短。16．（2023·浙江·統考高考真題）賴氨酸是人體不能合成的必需氨基酸，而人類主要食物中的賴氨酸含量很低，利用生物技術可提高食物中賴氨酸含量?；卮鹣铝袉栴}：(1)植物細胞合成的賴氨酸達到一定濃度時，能抑制合成過程中兩種關鍵酶的活性，導致賴氨酸含量維持在一定濃度水平，這種調節方式屬于。根據這種調節方式，在培養基中添加，用于篩選經人工誘變的植物懸浮細胞，可得到抗賴氨酸類似物的細胞突變體，通過培養獲得再生植株。(2)隨著轉基因技術與動物細胞工程結合和發展，2011年我國首次利用轉基因和體細胞核移植技術成功培育了高產賴氨酸轉基因克隆奶牛。其基本流程為：①構建乳腺專一表達載體。隨著測序技術的發展，為獲取富含賴氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通過檢索獲取其編碼序列，用化學合成法制備得到。再將獲得的目的基因與含有乳腺特異性啟動子的相應載體連接，構建出乳腺專一表達載體。②表達載體轉入牛胚胎成纖維細胞（BEF）。將表達載體包裹到磷脂等構成的脂質體內，與BEF膜發生，表達載體最終進入細胞核，發生轉化。③核移植。將轉基因的BEF作為核供體細胞，從牛卵巢獲取卵母細胞，經體外培養及去核后作為。將兩種細胞進行電融合，電融合的作用除了促進細胞融合，同時起到了重組細胞發育的作用。④重組細胞的體外培養及胚胎移植。重組細胞體外培養至，植入代孕母牛子宮角，直至小牛出生。⑤檢測。DNA水平檢測：利用PCR技術，以非轉基因牛耳組織細胞作為陰性對照，以為陽性對照，檢測到轉基因牛耳組織細胞中存在目的基因。RNA水平檢測：從非轉基因牛乳汁中的脫落細胞、轉基因牛乳汁中的脫落細胞和轉基因牛耳組織細胞，提取總RNA，對總RNA進行處理，以去除DNA污染，再經逆轉錄形成cDNA，并以此為，利用特定引物擴增目的基因片段。結果顯示目的基因在轉基因牛乳汁中的脫落細胞內表達，而不在牛耳組織細胞內表達，原因是什么？?！敬鸢浮?1)負反饋調節過量賴氨酸類似物(2)基因數據庫融合核受體細胞激活早期囊胚轉基因BEFDNA酶PCR的模板構建的表達載體只含有乳腺特異性啟動子，只能在乳腺細胞中啟動轉錄，而在牛耳細胞中不能表達?！驹斀狻浚?）負反饋調節是指在一個系統中，系統工作的效果，反過來又作為信息調節該系統的工作，并且使系統工作的效果減弱或受到限制，有助于系統保持穩定。植物細胞合成的賴氨酸達到一定濃度時，能抑制合成過程中兩種關鍵酶的活性，導致賴氨酸含量維持在一定濃度水平，這種調節方式屬于負反饋調節。如果想得到抗賴氨酸類似物的細胞突變體可在培養基中添加過量賴氨酸類似物。（2）①從基因數據庫獲取獲取目的基因編碼序列，用化學合成法制備可得到目的基因。②表達載體包裹到磷脂等構成的脂質體內，根據細胞膜成分，其與BEF膜發生融合。③去核的卵母細胞作為受體細胞，其處于減數第二次分裂中期，因為卵母細胞中含有促使細胞核表達全能性的物質和營養條件。電融合的作用除了促進細胞融合，同時起到了激活重組細胞發育的作用。④胚胎發育到適宜階段可取出向受體移植。牛、羊一般要培養到桑椹胚或囊胚階段；植入代孕母牛子宮角，直至小牛出生。⑤陽性對照：按照當前實驗方案一定能得到正面預期結果的對照實驗。陽性對照是已知的對測量結果有影響的因素，目的是確定實驗程序無誤。陰性對照和陽性對照相反，按照當前的實驗方案一定不能得到正面預期結果的對照實驗。排除未知變量對實驗產生的不利影響。本實驗以非轉基因牛耳組織細胞作為陰性對照，為了檢測到轉基因牛耳組織細胞中存在目的基因。應該以含有目的基因的牛耳組織細胞為陽性對照。為了除去DNA污染，可以使用DNA酶使其水解。經逆轉錄形成cDNA，并以此為PCR的模板進行擴增。目的基因在轉基因牛乳汁中的脫落細胞內表達，而不在牛耳組織細胞內表達，原因是構建的表達載體只含有乳腺特異性啟動子，只能在乳腺細胞中啟動轉錄，而在牛耳細胞中不能表達。17．（2023·湖北·統考高考真題）某病毒對動物養殖業危害十分嚴重。我國學者擬以該病毒外殼蛋白A為抗原來制備單克隆抗體，以期快速檢測該病毒，其主要技術路線如圖所示。回答下列問題：(1)與小鼠骨髓瘤細胞融合前，已免疫的脾細胞（含漿細胞）（填“需要”或“不需要”）通過原代培養擴大細胞數量；添加脂溶性物質PEG可促進細胞融合，該過程中PEG對細胞膜的作用是。(2)在雜交瘤細胞篩選過程中，常使用特定的選擇培養基（如HAT培養基），該培養基對和生長具有抑制作用。(3)單克隆抗體篩選中，將抗體與該病毒外殼蛋白進行雜交，其目的是。(4)構建重組質粒需要使用DNA連接酶。下列屬于DNA連接酶底物的是?！敬鸢浮?1)不需要使細胞接觸處的磷脂分子重新排布，細胞膜打開，細胞發生融合(2)未融合的親本細胞融合的具有同種核的細胞(3)通過抗體檢測呈陽性來獲得分泌所需抗體的雜交瘤細胞(4)④【詳解】（1）漿細胞是高度分化的細胞，不能增殖，所以不需要通過原代培養擴大細胞數量。脂溶性物質PEG可使細胞接觸處的磷脂分子重新排布，細胞膜打開，細胞發生融合。（2）在雜交瘤細胞篩選過程中，用特定的選擇培養基進行篩選，在該培養基上，未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長。（3）單克隆抗體篩選中，將抗體與該病毒外殼蛋白進行雜交，是運用了抗原-抗體雜交技術，抗體檢測呈陽性的細胞，即為所需的雜交瘤細胞。（4）DNA連接酶能連接DNA片段，脫氧核苷酸的磷酸基團位于5'端，-OH位于3'端，①②③脫氧核苷酸鏈的兩端基團有誤；DNA連接酶能催化合成磷酸二酯鍵，即將一條脫氧核苷酸5'端的磷酸基團與另一條脫氧核苷酸鏈的3'端的-OH相連，④符合題意。故選④。18．（2023·浙江·統考高考真題）甲植物細胞核基因具有耐鹽堿效應，乙植物細胞質基因具有高產效應。某研究小組用甲、乙兩種植物細胞進行體細胞雜交相關研究，基本過程包括獲取原生質體、誘導原生質體融合、篩選融合細胞、雜種植株再生和鑒定，最終獲得高產耐鹽堿再生植株?；卮鹣铝袉栴}：(1)根據研究目標，在甲、乙兩種植物細胞進行體細胞雜交前，應檢驗兩種植物的原生質體是否具備的能力。為了便于觀察細胞融合的狀況，通常用不同顏色的原生質體進行融合，若甲植物原生質體采用幼苗的根為外植體，則乙植物可用幼苗的為外植體。(2)植物細胞壁的主要成分為和果膠，在獲取原生質體時，常采用相應的酶進行去壁處理。在原生質體融合前，需對原生質體進行處理，分別使甲原生質體和乙原生質體的失活。對處理后的原生質體在顯微鏡下用計數，確定原生質體密度。兩種原生質體1∶1混合后，通過添加適宜濃度的PEG進行融合；一定時間后，加入過量的培養基進行稀釋，稀釋的目的是。(3)將融合原生質體懸浮液和液態的瓊脂糖混合，在凝固前倒入培養皿，融合原生質體分散固定在平板中，并獨立生長、分裂形成愈傷組織。同一塊愈傷組織所有細胞源于。下列各項中能說明這些愈傷組織只能來自于雜種細胞的理由是哪幾項？A．甲、乙原生質體經處理后失活，無法正常生長、分裂B．同種融合的原生質體因甲或乙原生質體失活而不能生長、分裂C．培養基含有抑制物質，只有雜種細胞才能正常生長、分裂D．雜種細胞由于結構和功能完整可以生長、分裂(4)愈傷組織經可形成胚狀體或芽。胚狀體能長出，直接發育形成再生植株。(5)用PCR技術鑒定再生植株。已知甲植物細胞核具有特異性DNA序列a，乙植物細胞質具有特異性DNA序列b；M1、M2為序列a的特異性引物，N1、N2為序列b的特異性引物。完善實驗思路：Ⅰ．提取純化再生植株的總DNA，作為PCR擴增的。Ⅱ．將DNA提取物加入PCR反應體系，為特異性引物，擴增序列a；用同樣的方法擴增序列b。Ⅲ．得到的2個PCR擴增產物經后，若每個PCR擴增產物在凝膠中均出現了預期的個條帶，則可初步確定再生植株來自于雜種細胞?！敬鸢浮?1)再生葉(2)纖維素細胞質和細胞核血細胞計數板降低PEG濃度，使其失去融合作用(3)同一個雜種融合原生質體ABD(4)再分化根和芽(5)模板M1、M2凝膠電泳1【詳解】（1）在甲、乙兩種植物細胞進行體細胞雜交前，應檢驗兩種植物的原生質體是否具備再生的能力。為了便于觀察細胞融合的狀況，通常用不同顏色的原生質體進行融合，若甲植物原生質體采用幼苗的根為外植體，則乙植物可用幼苗的葉為外植體。（2）植物細胞壁的主要成分為纖維素和果膠，在獲取原生質體時，常采用相應的酶進行去壁處理。甲植物細胞核基因具有耐鹽堿效應，乙植物細胞質基因具有高產效應，在原生質體融合前，需對原生質體進行處理，分別使甲原生質體和乙原生質體的細胞質和細胞核失活，融合后具有甲植物的細胞核基因和乙植物的細胞質基因。對處理后的原生質體在顯微鏡下用血細胞計數板計數，確定原生質體密度。兩種原生質體1∶1混合后，通過添加適宜濃度的PEG進行融合；一定時間后，加入過量的培養基進行稀釋，稀釋的目的是降低PEG濃度,使其失去融合作用。（3）將融合原生質體懸浮液和液態的瓊脂糖混合，在凝固前倒入培養皿，融合原生質體分散固定在平板中，并獨立生長、分裂形成愈傷組織。同一塊愈傷組織所有細胞源于同一個雜種融合的原生質體。未融合的原生質體因為細胞質或細胞核的失活，無法正常生長、分裂；同種融合的原生質體也因為甲原生質體細胞質或乙原生質體細胞核失活而不能生長、分裂；只有雜種細胞才具備有活性的細胞質和細胞核，可以生長、分裂，因此這些愈傷組織只能來自于雜種細胞。故選ABD。（4）愈傷組織經再分化可形成胚狀體或芽。胚狀體能長出根和芽，直接發育形成再生植株。（5）Ⅰ．提取純化再生植株的總DNA，作為PCR擴增的模板。Ⅱ．將DNA提取物加入PCR反應體系，M1、M2為特異性引物，擴增序列a；用同樣的方法擴增序列b。Ⅲ．得到的2個PCR擴增產物經凝膠電泳后，若每個PCR擴增產物在凝膠中均出現了預期的1個條帶，則可初步確定再生植株來自于雜種細胞。19．（2023·廣東·統考高考真題）種子大小是作物重要的產量性狀。研究者對野生型擬南芥（2n=10）進行誘變篩選到一株種子增大的突變體。通過遺傳分析和測序，發現野生型DAI基因發生一個堿基G到A的替換，突變后的基因為隱性基因，據此推測突變體的表型與其有關，開展相關實驗?；卮鹣铝袉栴}：(1)擬采用農桿菌轉化法將野生型DAI基因轉入突變體植株，若突變體表型確由該突變造成，則轉基因植株的種子大小應與植株的種子大小相近。(2)用PCR反應擴增DAI基因，用限制性核酸內切酶對PCR產物和進行切割，用DNA連接酶將兩者連接。為確保插入的DAI基因可以正常表達，其上下游序列需具備。(3)轉化后，T-DNA（其內部基因在減數分裂時不發生交換）可在基因組單一位點插入也可以同時插入多個位點。在插入片段均遵循基因分離及自由組合定律的前提下，選出單一位點插入的植株，并進一步獲得目的基因穩定遺傳的植株（如圖），用于后續驗證突變基因與表型的關系。

①農桿菌轉化T0代植株并自交，將T1代種子播種在選擇培養基上，能夠萌發并生長的陽性個體即表示其基因組中插入了。②T1代陽性植株自交所得的T2代種子按單株收種并播種于選擇培養基，選擇陽性率約%的培養基中幼苗繼續培養。③將②中選出的T2代陽性植株（填“自交”、“與野生型雜交”或“與突變體雜交”）所得的T3代種子按單株收種并播種于選擇培養基，陽性率達到%的培養基中的幼苗即為目標轉基因植株。為便于在后續研究中檢測該突變，研究者利用PCR擴增野生型和突變型基因片段，再使用限制性核酸內切酶X切割產物，通過核酸電泳即可進行突變檢測，相關信息見下，在電泳圖中將酶切結果對應位置的條帶涂黑。

【答案】(1)野生型(2)運載體啟動子和終止子(3)DAI基因和卡那霉素抗性基因75自交100

【詳解】（1）根據題干信息可知，突變后的基因為隱性基因，則野生型DAI基因為顯性基因，因此采用農桿菌轉化法將野生型DAI基因轉入突變體植株，若突變體表型確由該突變造成，則轉基因植株的種子大小應與野生型植株的種子大小相近。（2）利用PCR技術擴增DAI基因后，應該用同種限制性核酸內切酶對DAI基因和運載體進行切割，再用DNA連接酶將兩者連接起來；在基因表達載體中，啟動子位于目的基因的首端，終止子位于目的基因的尾端，因此為確保插入的DAI基因可以正常表達，其上下游序列需具備啟動子和終止子。（3）①根據題干信息和圖形分析，將T0代植株的花序浸沒在農桿菌（T-DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因）液中轉化，再將獲得的T1代種子播種在選擇培養基（含有卡那霉素）上，若在選擇培養基上有能夠萌發并生長的陽性個體，則說明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因組中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。②T1代陽性植株都含有DAI基因，由于T-DNA（其內部基因在減數分裂時不發生交換）可在基因組單一位點插入也可以同時插入多個位點，所以不確定是單一位點插入還是多位點插入，若是單一位點插入，相當于一對等位基因的雜合子，其自交后代應該出現3∶1的性狀分離比，而題干要求選出單一位點插入的植株，因此應該選擇陽性率約75%的培養基中幼苗繼續培養。③將以上獲得的T2代陽性植株自交，再將得到的T3代種子按單株收種并播種于選擇培養基上，若某培養基上全部為具有卡那霉素抗性的植株即為需要選擇的植株，即陽性率達到100%的培養基中的幼苗即為目標轉基因植株。根據圖形分析，野生型和突變型基因片段的長度都是150bp，野生型的基因沒有限制酶X的切割位點，而突變型的基因有限制酶X的切割位點，結合圖中的數據分析可知電泳圖中，野生型只有150bp，突變型有50bp和100bp，如圖：

。20．（2023·全國·統考高考真題）GFP是水母體內存在的能發綠色熒光的一種蛋白?？蒲腥藛T以GFP基因為材料，利用基因工程技術獲得了能發其他顏色熒光的蛋白，豐富了熒光蛋白的顏色種類。回答下列問題。(1)構建突變基因文庫，科研人員將GFP基因的不同突變基因分別插入載體，并轉入大腸桿菌制備出GFP基因的突變基因文庫。通常，基因文庫是指。(2)構建目的基因表達載體?？蒲腥藛T從構建的GFP突變基因文庫中提取目的基因（均為突變基因）構建表達載體，其模式圖如下所示（箭頭為GFP突變基因的轉錄方向）。圖中①為；②為，其作用是；圖中氨芐青霉素抗性基因是一種標記基因，其作用是。

(3)目的基因的表達?？蒲腥藛T將構建好的表達載體導入大腸桿菌中進行表達，發現大腸桿菌有的發綠色熒光，有的發黃色熒光，有的不發熒光。請從密碼子特點的角度分析，發綠色熒光的可能原因是（答出1點即可）。(4)新蛋白與突變基因的關聯性分析。將上述發黃色熒光的大腸桿菌分離純化后，對其所含的GFP突變基因進行測序，發現其堿基序列與GFP基因的不同，將該GFP突變基因命名為YFP基因（黃色熒光蛋白基因）。若要通過基因工程的方法探究YFP基因能否在真核細胞中表達，實驗思路是?！敬鸢浮?1)將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因(2)終止子啟動子RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來(3)密碼子具有簡并性(4)將構建好的表達載體（含有目的基因YFP基因）導入酵母菌中進行表達【詳解】（1）將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。（2）一個基因表達載體的組成，除了目的基因外，還必須有啟動子，終止子以及標記基因等，且基因的轉錄方向為從啟動子到終止子，故圖中①為終止子，②為啟動子，啟動子是一段有特殊結構的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質。標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來，如抗生素基因就可以作為這種基因。（3）正常情況下，GFP突變基因應該不發綠色熒光，而大腸桿菌有的發綠色熒光，從密碼子特點的角度分析，原因是密碼子具有簡并性，即一種氨基酸可能由一種或多種密碼子決定。（4）基因工程研究中常用的真核表達系統有酵母表達系統、昆蟲細胞表達系統和哺乳動物細胞表達系統。要通過基因工程的方法探究YFP基因能否在真核細胞中表達，可將構建好的表達載體（含有目的基因YFP基因）導入酵母菌中進行表達，如果酵母菌發出黃色熒光，說明YFP基因能在真核細胞中表達，反之則不能在真核細胞中表達。21．（2023·全國·統考高考真題）接種疫苗是預防傳染病的一項重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的傳播，降低乙型肝炎發病率。乙肝病毒是一種DNA病毒。重組乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技術獲得的乙肝病毒表面抗原（一種病毒蛋白）?；卮鹣铝袉栴}。(1)接種上述重組乙肝疫苗不會在人體中產生乙肝病毒，原因是。(2)制備重組乙肝疫苗時，需要利用重組表達載體將乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）導入酵母細胞中表達。重組表達載體中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是。能識別載體中的啟動子并驅動目的基因轉錄的酶是。(3)目的基因導入酵母細胞后，若要檢測目的基因是否插入染色體中，需要從酵母細胞中提取進行DNA分子雜交，DNA分子雜交時應使用的探針是。(4)若要通過實驗檢測目的基因在酵母細胞中是否表達出目的蛋白，請簡要寫出實驗思路。【答案】(1)重組乙肝疫苗成分為蛋白質，無法獨立在宿主體內增殖(2)篩選RNA聚合酶(3)核染色體DNA被標記的目的基因的單鏈DNA片段(4)通過使用相應抗體，利用抗原-抗體雜交技術，檢測mRNA是否翻譯形成蛋白質【詳解】（1）重組乙肝疫苗的成分是乙肝病毒表面的一種病毒蛋白。蛋白質注入人體后，無法完成病毒遺傳物質的復制與蛋白質的合成，無法獨立增殖。（2）抗生素抗性基因作為標記基因，用于轉化細胞的篩選。RNA聚合酶結合目的基因啟動子并驅動轉錄。（3）檢測的對象是目的基因是否插入染色體中，故提取酵母細胞染色體進行目的基因鑒定?；蛱结樖且欢螏в袡z測標記，且順序已知的，與目的基因互補的核酸序列。（4）要檢測出目的基因是否表達，除了需要檢測目的基因是否插入染色體外，還需要檢查目的基因是否轉錄與表達。檢測是否轉錄，用核酸分子雜交技術，檢測是否翻譯用抗原-抗體雜交技術?！?022年高考真題〗22．（2022·重慶·統考高考真題）將人胰島素A鏈上1個天冬氨酸替換為甘氨酸，B鏈末端增加2個精氨酸，可制備出一種人工長效胰島素。下列關于該胰島素的敘述，錯誤的是（

）A．進入人體后需經高爾基體加工 B．比人胰島素多了2個肽鍵C．與人胰島素有相同的靶細胞 D．可通過基因工程方法生產【答案】A【詳解】A、胰島素作用于細胞表面的受體，不需要經高爾基體的加工，A錯誤；B、人工長效胰島素比人胰島素的B鏈上多了兩個精氨酸，氨基酸與氨基酸之間通過肽鍵連接，故多2個肽鍵，B正確；C、人工胰島素和人胰島素作用相同，都是降血糖的作用，故靶細胞相同，C正確；D、人工長效胰島素是對天然蛋白質的改造，需要通過基因工程生產，D正確。故選A。23．（2022·遼寧·統考高考真題）抗蟲和耐除草劑玉米雙抗12-5是我國自主研發的轉基因品種。為給監管轉基因生物安全提供依據，采用PCR方法進行目的基因監測，反應程序如圖所示。下列敘述正確的是（

）A．預變性過程可促進模板DNA邊解旋邊復制B．后延伸過程可使目的基因的擴增更加充分C．延伸過程無需引物參與即可完成半保留復制D．轉基因品種經檢測含有目的基因后即可上市【答案】B【詳解】A、預變性是使模板DNA充分變性，A錯誤；B、后延伸過程后延伸是為了讓引物延伸完全并讓單鏈產物完全退火形成雙鏈結構，可使目的基因的擴增更加充分，B正確；C、延伸過程需引物參與，C錯誤；D、轉基因品種不只需要檢測是否含有目的基因，還要檢測是否表達，還有安全性問題，D錯誤；故選B。24．（2022·北京·統考高考真題）下列高中生物學實驗中，對實驗結果不要求精確定量的是（）A．探究光照強度對光合作用強度的影響B．DNA的粗提取與鑒定C．探索生長素類調節劑促進插條生根的最適濃度D．模擬生物體維持pH的穩定【答案】B【詳解】A、探究光照強度對光合作用強度的影響，需要測定不同光照強度下光合作用強度，要求精確定量，A錯誤；B、DNA的粗提取與鑒定屬于物質提取與鑒定類的實驗，只需觀察是否有相關現象，不需要定量，故對實驗結果不要求精確定量，B正確；C、探索生長素類調節劑促進插條生根的最適濃度，需要明確不同生長素類調節劑濃度下根的生長情況，要求定量，C錯誤；D、模擬生物體維持pH的穩定，需要用pH試紙測定溶液pH值，需要定量，D錯誤。故選B。25．（2022·湖北·統考高考真題）滅菌、消毒、無菌操作是生物學實驗中常見的操作。下列敘述正確的是（）A．動、植物細胞DNA的提取必須在無菌條件下進行B．微生物、動物細胞培養基中需添加一定量的抗生素以防止污染C．為防止蛋白質變性，不能用濕熱滅菌法對牛肉膏蛋白胨培養基進行滅菌D．可用濕熱滅菌法對實驗中所使用的微量離心管、細胞培養瓶等進行滅菌【答案】D【詳解】A、動、植物細胞DNA的提取不需要在無菌條件下進行，A錯誤；B、動物細胞培養基中需添加一定量的抗生素以防止污染，保證無菌環境，而微生物的培養不能加入抗生素，B錯誤；C、一般用濕熱滅菌法對牛肉膏蛋白胨培養基進行滅菌，以防止雜菌污染，C錯誤；D、可用濕熱滅菌法對實驗中所使用的微量離心管、細胞培養瓶等進行滅菌，以防止雜菌污染，D正確。故選D。26．（2022·山東·高考真題）關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法錯誤的是（

）A．過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進行是為了防止DNA降解B．離心研磨液是為了加速DNA的沉淀C．在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現藍色D．粗提取的DNA中可能含有蛋白質【答案】B【詳解】A、低溫時DNA酶的活性較低，過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進行是為了防止DNA降解，A正確；B、離心研磨液是為了使細胞碎片沉淀，B錯誤；C、在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑呈現藍色，C正確；D、細胞中的某些蛋白質可以溶解于酒精，可能有蛋白質不溶于酒精，在95%的冷酒精中與DNA一塊兒析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白質，D正確。故選B。27．（2022·浙江·統考高考真題）羊瘙癢病是感染性蛋白粒子PrPSc引起的。某些羊體內存在蛋白質PrPc，但不發病。當羊感染了PrPSc后，PrPSc將PrPc不斷地轉變為PrPSc，導致PrPSc積累，從而發病。把患瘙癢病的羊組織勻漿接種到小鼠后，小鼠也會發病。下列分析合理的是（

）A．動物體內的PrPSc可全部被蛋白酶水解B．患病羊體內存在指導PrPSc合成的基因C．產物PrPSc對PrPc轉變為PrPSc具有反饋抑制作用D．給PrPc基因敲除小鼠接種PrPSc，小鼠不會發病【答案】D【詳解】A、由題干可知PrPSc可將PrPc不斷地轉變為PrPSc，導致PrPSc在羊體內積累，說明PrPSc不會被蛋白酶水解，A錯誤；B、患病羊體內不存在指導PrPSc合成的基因，但存在指導蛋白質PrPc合成的基因，PrPc合成后，PrPSc將PrPc不斷地轉變為PrPSc，導致PrPSc積累，從而使羊發病，B錯誤；C、由題干可知當羊感染了PrPSc后，PrPSc將PrPc不斷地轉變為PrPSc，導致PrPSc積累，從而使羊發病，說明產物PrPSc對PrPc轉變為PrPSc不具有反饋抑制作用，C錯誤；D、小鼠的PrPc基因敲除后，不會表達產生蛋白質PrPc，因此小鼠接種PrPSc后，不會出現PrPc轉變為PrPSc，也就不會導致PrPSc積累，因此小鼠不會發病，D正確。故選D。28．（2022·河北·統考高考真題）人染色體DNA中存在串聯重復序列，對這些序列進行體外擴增、電泳分離后可得到個體的DNA指紋圖譜。該技術可用于親子鑒定和法醫學分析。下列敘述錯誤的是（）A．DNA分子的多樣性、特異性及穩定性是DNA鑒定技術的基礎B．串聯重復序列在父母與子女之間的遺傳不遵循孟德爾遺傳定律C．指紋圖譜顯示的DNA片段屬于人體基礎代謝功能蛋白的編碼序列D．串聯重復序列突變可能會造成親子鑒定結論出現錯誤【答案】BC【詳解】A、DNA分子的多樣性、特異性及穩定性是DNA鑒定技術的基礎，A正確；B、串聯重復序列在染色體上，屬于核基因，在父母與子女之間的遺傳遵循孟德爾遺傳定律，B錯誤；C、指紋圖譜由串聯重復序列擴增獲得，串聯重復序列是廣泛分布于真核生物核基因組中的簡單重復非編碼序列，C錯誤；D、串聯重復序列突變后，分離得到的指紋圖譜可能會發生改變，可能會造成親子鑒定結論出現錯誤，D正確。故選BC。29．（2022·福建·統考高考真題）美西螈具有很強的再生能力。研究表明，美西螈的巨噬細胞在斷肢再生的早期起重要作用。為研究巨噬細胞的作用機制，科研人員制備了抗巨噬細胞表面標志蛋白CD14的單克隆抗體，具體方法如下?；卮鹣铝袉栴}：（一）基因工程抗原的制備(1)根據美西螈CD14基因的核苷酸序列，合成引物，利用PCR擴增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3’—OH與加入的脫氧核苷酸的5’—P形成磷酸二酯鍵，則新合成鏈的延伸方向是（填“5’→3’”或“3’→5’”）。

(2)載體和CD14片段的酶切位點及相應的酶切抗性基因序列如圖1所示。用XhoI和Sal1分別酶切CD14和載體后連接，CD14接入載體時會形成正向連接和反向連接的兩種重組DNA．可進一步用這兩種限制酶對CD14的連接方向進行鑒定，理由是。培養能表達CD14蛋白的大腸桿菌，分離純化目的蛋白。（二）抗CD14單克隆抗體的制備流程如圖2所示：

(3)步驟①和步驟⑤分別向小鼠注射和。(4)步驟②所用的SP2/0細胞的生長特點是。(5)吸?、壑械纳锨逡旱舰艿呐囵B孔中，根據抗原—抗體雜交原理，需加入①進行專一抗體檢測，檢測過程發現有些雜交瘤細胞不能分泌抗CD14抗體，原因是②。(6)步驟⑥從中提取到大量的抗CD14抗體，用于檢測巨噬細胞?！敬鸢浮?1)5'→3'(2)正向連接的重組DNA有這兩種酶切位點（限制酶的識別序列）；而反向連接的重組DNA會形成新的序列，沒有這兩種酶的酶切位點（沒有限制酶的識別序列）(3)CD14蛋白/CD14抗原分泌抗CD14抗體的雜交瘤細胞(4)能在體外無限增殖(5)CD14蛋白參與形成雜交瘤細胞的B淋巴細胞種類多，有的不能分泌抗CD14抗體(6)小鼠腹水【詳解】（1）PCR擴增時，DNA聚合酶催化引物的3'-OH與加入的脫氧核苷酸的5'-P形成磷酸二酯鍵，因此新鏈合成的方向是從5'→3'。（2）可進一步用限制酶XhoⅠ和SalⅠ對CD14的連接方向進行鑒定，是因為正向連接的重組DNA有這兩種酶切位點（限制酶的識別序列）；而反向連接的重組DNA會形成新的序列，沒有這兩種酶的酶切位點（沒有限制酶的識別序列）。（3）步驟①是注射特定抗原，針對本實驗目的可知，要獲得抗CD14單克隆抗體，故應該注射CD14蛋白/CD14抗原；步驟⑤是將分泌抗CD14抗體的雜交瘤細胞注入小鼠體內培養，以獲得大量單克隆抗體。（4）步驟②所用的SP2/0細胞是骨髓瘤細胞，特點是能在體外無限增殖。（5）根據抗原—抗體雜交原理，應該用CD14蛋白檢測其中是否含抗CD14蛋白的抗體。因為形成雜交瘤細胞的B淋巴細胞種類很多，因此有些雜交瘤細胞不能分泌抗CD14抗體。（6）從制備單克隆抗體的流程可知，將雜交瘤細胞注射到小鼠腹腔后，最終要從小鼠的腹水中提取抗CD14抗體。30．（2022·遼寧·統考高考真題）某抗膜蛋白治療性抗體藥物研發過程中，需要表達N蛋白胞外段，制備相應的單克隆抗體，增加其對N蛋白胞外段特異性結合的能力。Ⅰ．N蛋白胞外段抗原制備，流程如圖1(1)構建重組慢病毒質粒時，選用氨芐青霉素抗性基因作為標記基因，目的是。用脂質體將重組慢病毒質粒與輔助質粒導入病毒包裝細胞，質粒被包在脂質體（填“雙分子層中”或“兩層磷脂分子之間”）。(2)質粒在包裝細胞內組裝出由組成的慢病毒，用慢病毒感染海拉細胞進而表達并分離、純化N蛋白胞外段。Ⅱ．N蛋白胞外段單克隆抗體制備，流程如圖2(3)用N蛋白胞外段作為抗原對小鼠進行免疫后，取小鼠脾組織用酶處理，制成細胞懸液，置于含有混合氣體的中培養，離心收集小鼠的B淋巴細胞，與骨髓瘤細胞進行融合。(4)用選擇性培養基對融合后的細胞進行篩選，獲得雜交瘤細胞，將其接種到96孔板，進行培養。用技術檢測每孔中的抗體，篩選既能產生N蛋白胞外段抗體，又能大量增殖的單克隆雜交瘤細胞株，經體外擴大培養，收集，提取單克隆抗體。(5)利用N蛋白胞外段抗體與藥物結合，形成，實現特異性治療。【答案】(1)檢測目的基因是否成功導入受體細胞雙分子層中(2)蛋白質外殼和含N蛋白胞外段基因的核酸(3)胰蛋白酶或膠原蛋白CO2培養箱(4)克隆化抗原抗體雜交細胞培養液(5)抗體-藥物偶聯物/ADC【詳解】（1）構建重組慢病毒質粒時，為檢測目的基因是否成功導入受體細胞，常選用氨芐青霉素抗性基因作為標記基因。重組慢病毒質粒與輔助質粒導入病毒包裝細胞需要依賴膜融合，故質粒被包在脂質體雙分子層中（即磷脂雙分子層）。（2）由于目的基因為N蛋白胞外段基因，在包裝細胞內組裝出由蛋白質外殼和含有N蛋白胞外段基因的核酸組成的慢病毒，用慢病毒感染海拉細胞進而表達并分離、純化N蛋白胞外段。（3）進行動物細胞培養時，需要取小鼠脾組織用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理，制成細胞懸液，置于含有95%空氣和5%的CO2混合氣體的CO2培養箱中培養。（4）用選擇性培養基對融合后的細胞進行篩選，獲得雜交瘤細胞，將其接種到96孔板，進行克隆化培養和抗體檢測。用抗原抗體雜交技術檢測每孔中的抗體，篩選既能產生N蛋白胞外段抗體，又能大量增殖的單克隆雜交瘤細胞株，經體外擴大培養，收集細胞培養液，提取單克隆抗體。（5）利用N蛋白胞外段抗體與藥物結合，形成抗體-藥物偶聯物ADC，實現特異性治療。31．（2022·浙江·高考真題）回答下列（一）、（二）小題：（一）回答與產淀粉酶的枯草桿菌育種有關的問題：(1)為快速分離產淀粉酶的枯草桿菌，可將土樣用制成懸液，再將含有懸液的三角瓶置于80℃的中保溫一段時間，其目的是。(2)為提高篩選效率，可將菌種的過程與菌種的產酶性能測定一起進行：將上述懸液稀釋后涂布于淀粉為唯一碳源的固體培養基上培養，采用顯色方法，根據透明圈與菌落直徑比值的大小，可粗略估計出菌株是否產酶及產酶性能。(3)為了獲得高產淀粉酶的枯草桿菌，可利用現有菌種，通過后再篩選獲得，或利用轉基因、等技術獲得。（二）回答與植物轉基因和植物克隆有關的問題：(4)在用農桿菌侵染的方法進行植物轉基因過程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制生長，二是篩選轉化細胞。當選擇培養基中抗生素濃度時，通常會出現較多假陽性植株，因此在轉基因前需要對受體進行抗生素的檢測。(5)為提高培育轉基因植株的成功率，植物轉基因受體需具有較強的能力和遺傳穩定性。對培養的受體細胞遺傳穩定性的早期檢測，可通過觀察細胞內形態是否改變進行判斷，也可通過觀察分裂期染色體的，分析染色體組型是否改變進行判斷。(6)植物轉基因受體全能性表達程度的高低主要與受體的基因型、培養環境、繼代