水產養殖硝化物污染的檢測技術與生物凈化劑研究關好變、林曉霞、陳衍韜、趙國珍、王林川（華南農業大學獸醫學院廣州510642）摘要在集約化養殖水體方面，氨氮污染已經成為制約水產養殖的主要環境脅迫因子。本項目針對水生動物養殖與疾病防治中最難克服的“水體中硝酸鹽、亞硝酸鹽的檢測與清除”這一難題，應用生物學、分析化學、微生物學的綜合技術，研究出快速檢測硝酸鹽、亞硝酸鹽的技術及開發出清除硝酸鹽、亞硝酸鹽的復合微生物制劑，以方便和指導水產養殖戶養好、高產漁類產品，增加農民、漁民的收入。國內外目前多以傳統的單一的化學物理方法進行測氮或者使用生物性的流程工藝來對養殖水體進行脫氮，這種方式耗資大，使用程序較為繁瑣，攜帶不便，只適用于大型的水產養殖，對小的養殖規模利益不大，存在很大的限制性；針對傳統脫氮技術的種種缺點，本項目進行養殖水體的有益菌群的研究，進行生物凈化劑研究。同時，本項目還從可持續發展方向出發，從綠色工藝出發，有針對性的利用微生物間的互生關系、輔代謝等生理特性將具有特定生物轉化能力的菌株經過篩選、擴增、放大培養制成菌劑；從而調節自然界生態平衡，減少自然生態環境污染，提高食品安全性，促使健康發展。關鍵詞：硝化菌、亞硝化菌與反硝化菌生物凈化劑目錄1.前言…………………42材料與方法…………42.1材料………………42.1.1硝化菌、反硝化菌、亞硝化菌等菌種………42.1.2儀器設備與其他材料…………42.2方法………………52.2.1硝酸鹽與亞硝酸鹽的檢測………………52.2.2生物凈化劑研究………………53結果…………53.1試劑盒……………53.2生物凈化劑………………………54討論…………………5致謝……………………7參考文獻………………81前言近些年來，水產養殖業的發展在數量上取得了巨大成功。由水產養殖生產出的魚占人們直接消費的魚類總量的1/4以上，隨著人口數量不斷增長，對作為人類蛋白質來源之一的水產養殖的依靠也將會增加。水產養殖業已經發展成為一種與農村種植業并存的農業活動，為擴大就業、增加收入和食品安全作出了巨大貢獻。然而，在漁業資源和可養水面有限的狀況下，漁業的可持續增長必然要在水產養殖方面以增加養殖密度，提高單位水體產量尋求發展；但在養殖密度增加的情況下不僅對養殖系統本身，還會對附近的水域產生負面的影響；常規水產養殖的特征是大量使用合成餌料、化學肥料、添加劑、農藥和生長調節劑等化學品，導致水體中氨氮濃度的上升，造成水體富營養化，也使自然界生態平衡遭受了巨大破壞，自然生態環境受到嚴重污染，生物多樣性減少，水產品中高化學殘留量嚴重影響著食品安全和人類健康。而氨氮的污染也即已經成為制約水產養殖的的主要環境脅迫因子。所有這些都使得人們對常規水產養殖系統的可持續性產生懷疑，對水產養殖產品的安全度產生懷疑。本項目針對水生動物養殖與疾病防治中最難克服的“水體中硝酸鹽、亞硝酸鹽的檢測與清除”這一難題，從多角度、新觀點出發，研究快速檢測養殖水體中硝酸鹽、亞硝酸鹽的技術以及開發出清除硝酸鹽、亞硝酸鹽的復合微生物劑，為養殖水體氮素的污染進行生物修復，降解水體中有害物質的含量，凈化水體，從而更好地指導水產養殖戶養好高產漁類產品，增加農民、漁民的收入。2材料與方法2.1材料2.1.1硝化菌、反硝化菌、亞硝化菌等菌種從水產養殖場從水體及污泥中分離培養2.1.2儀器設備與其他材料電熱培養箱：數顯隔水式303As－2，上海浦東榮豐科學儀器，上海浦東躍欣科學儀器廠

（NH4）2SO4、MgSO4.7H2O、KH2PO4、NaCL硝酸鹽、亞硝酸鹽標準液、蒸餾水、氫氧化鋁溶液標準管、燒杯、培養基、試劑盒、接種環等2.2方法2.2.1硝酸鹽與亞硝酸鹽的檢測（1）亞硝酸鹽的檢測：將標準管內小塑料管中的溶液全部轉移到標準管，用蒸餾水稀釋至刻度線，保留管內溶液至此試劑盒里的試劑用完為止。用待測水樣沖洗樣品管。將待測水樣加至樣品管的刻度線，撕開一小包A，把包內粉末倒入水樣中，蓋上蓋子，搖勻，5分鐘后再加入一小包B粉末，搖勻。10分鐘后將標準管和樣品管放在白色背景上由上而下目測比色。若樣品管溶液顏色比標準逛溶液顏色淺，則待測水樣中亞硝酸鹽含量合格；反之不合格。（2）硝酸鹽的檢測：方法同上，只是試劑不同注：若水樣混濁，需先進行水樣預處理：取水樣約200ml，加入試劑C，反復振蕩混合，靜置，取上層清液進行檢測。2.2.2生物凈化劑研究（1）采樣：樣品來自某水產養殖場；（2）分離純化：從水體及污泥中分離菌種，硝化菌、亞硝化菌與反硝化菌；（3）鑒定：鏡檢，試劑檢驗等;（4）富集培養；（5）菌株進的培養與繁殖；（6）已經初步進行菌株的性能測定；（7）接下來的工藝已有初步定案，現在還在進行中。3結果3.1制成了快速檢測水體中亞硝酸鹽與硝酸鹽是否超標的半成品3.2分離培養出了菌株，掌握了快速培養菌株的方法3.3初步測定菌株的性能4討論在項目研究的過程中，在亞硝酸鹽與硝酸鹽的檢測中，用密封性較高的塑料瓶裝硝酸鹽及亞硝酸鹽標準溶液時，易長時間放置，而且容易克服生產中腐蝕以及變性等等這個難題，從而為試劑盒的方便簡易提供了一定的條件。由于所要檢測的水體是養殖場中的水體，有時可能會比較混濁，若不進行凈化可能會影響檢測結果。故需要先進性凈化，取其上清液進行檢測，這樣能更加方便快速的檢測待測水體中的硝酸鹽與亞硝酸鹽是否超標。為生產中的調整提高依據并且容易攜帶。在生物凈化劑研究方面，其技術要求方面更高。因此，其中也是遇到了較多的困難。在從水體及淤泥中分離菌種后，必須經過鏡檢以及試劑檢驗才能確定是否為所需要的硝化菌、亞硝化菌及反硝化菌。在確定了菌種的成分后，其培養一開始花費了較長的時間，而且現在國內外對此菌種的特性研究還不是十分的透徹，所以進行初步培養時比較慢，需要不斷的更換條件，不斷地尋求新的元素來確定最佳的條件。通過一段時間的探索，終于找到了一種快速培養菌種的方法，大大的縮短了菌株培養的時間。現在也成熟的掌握了這種技術，把時間壓縮到了一個星期內，并在把此菌株初步進行性能測定時，取得了一定的效果。這就有利于生產中的大規模化的培養。但是由于時間及某些原因，現在還未能進行規模化生產及培養成品。本項研究為快速檢測凈化水體中的硝酸鹽與亞硝酸鹽奠定了基礎，同時由于該技術在我國只有零星的單個菌株的研究，尚存在很大的研究空間，因此本項目具有填補我國空白的創新之處，本項目還將從可持續發展方面著手，進行養殖水體氨氮污染生物修復。致謝本文是在指導老師王林川教授的全面指導和親切關懷下完成的，與此同時還得到了菅永峰、區德慶、龔中貴、何輝、徐昌領、董青、季艷菊等在本實驗過程中的熱心的幫助。謹對上述的和未提及的有關人士表示最衷心的感謝！參考文獻[1]J.S.阿拉巴斯特淡水魚類的水質標準北京：科普出版社，1986.4[2]王建龍,文湘華編著現代環境生物技術北京：清華大學出版社，2001[3]雷衍之主編養殖水環境化學北京：中國農業出版社，2004[4]王衍亮主編可持續水產養殖——資源環境質量：2003水產科技論壇北京：海洋出版社，2004[5]陳堅等編著環境生物技術應用與發展北京：中國輕工業出版社，2001[6]張玉芹劉開啟.反硝化細菌的篩選及培養條件的研究.農業環境科學學報2005年1期[7