第第頁第1章發酵工程第2節微生物的培養技術及應用一微生物的基本培養技術教案一、教學目標1.了解有關培養基的基礎知識。（科學思維）2.掌握培養基的配制、無菌技術及微生物的純培養（科學思維、科學探究）二、教學重難點【教學重點】1.微生物純培養的基本操作要求。2.酵母菌的純培養。【教學難點】酵母菌的純培養。三、教學過程【新課導入】展示：問題探討及問題。向經過殺菌處理的牛奶中添加某些對人體有益的細菌，再經過發酵就可以制成酸奶，由于制作工藝并不復雜，一些人會在家里自制酸奶，自制酸奶雖然方便，但是食用自制酸奶導致腸胃不適的事件屢見不鮮，主要原因是在制作過程中有雜菌混入。那么，怎樣才能保證無處不在的雜菌不混入發酵物中呢？教師：組織學生閱讀、思考、討論，并回答問題。學生：思考、討論并回答問題。提示：首先酸奶制作所用的容器要進行消毒晾干后使用，避免酸奶制作過程中混入雜菌；其次，準備好菌種，最好是純的乳酸菌菌種；再有就是接種時要在無菌條件下操作，所用攪拌器要經過消毒滅菌等。回顧舊知1.微生物的概念：個體無法用肉眼觀察的微小生物。2.微生物的分類：【新課講授】（一）微生物的基本培養技術防止雜菌污染，獲得純凈的微生物培養物是研究和應用微生物的前提，也是發酵工程的重要基礎。實驗室培養微生物的條件：①要為人們需要的微生物提供合適的營養和環境條件；②要確保其他微生物無法混入，并將需要的微生物分離出來。1.培養基的配制教師：組織學生閱讀教材P9頁，引導學生說出培養基的概念、作用及類型，概括培養基的配制方法。學生：閱讀教材，自主學習，歸納概括。（1）培養基的概念：人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養基質——培養基，用以培養、分離、鑒定、保存微生物或積累其代謝物。（2）培養基的類型教師：組織學生以表格的形式總結培養基的種類、特點和作用。學生：小組合作，歸納總結，完成表格。注意說明：1.加入培養基中的凝固劑（如瓊脂），一般不能被微生物利用，只起到凝固作用。2.微生物在固體培養基表面生長，可以形成肉眼可見的菌落。3.擴大培養獲得大量菌種時，常用液體培養基。4.功能培養基選擇培養基：將某種類微生物從混雜的微生物群體中分離出來。例1，加入青霉素的培養基：分離酵母菌、霉菌等真菌；例2，不加氮源的無氮培養基：分離固氮菌；例3，不加含碳有機物的無碳培養基：分離自養型微生物鑒別培養基：用于鑒別不同類型的微生物。例1，加入伊紅美藍的培養基：鑒別大腸桿菌例2，加入剛果紅的培養基：鑒別纖維素分解菌3.營養組成各種培養基的配方不同，但一般都含有水、碳源（提供碳元素的物質）、氮源（提供氮元素的物質）和無機鹽等營養物質。教師：給出表格，引導學生通過表格的形式歸納概括培養基的營養要素、來源及其功能。學生：分組討論，完成表格。強調：（有機碳源、氮源：異養微生物）、（無機碳源、氮源：自養微生物）思考：為什么培養基需要氮源？提示：培養基中的氮元素是微生物合成蛋白質、核酸等物質所必需的。下面讓我們一起看一看某種常見的細菌微生物的營養構成，如下表所示：注意：牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。播放視頻《牛肉膏蛋白胨培養基》，讓學生更直觀的了解牛肉膏蛋白胨培養基的配制方法。4.培養基的特殊需求：在提供上述幾種主要營養物質的基礎上，培養基還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養物質以及O2的需求。例如，在培養乳酸桿菌時，需要在培養基中添加維生素；在培養霉菌時，需要將培養基調至酸性；在培養細菌時，需要將培養基調至中性或弱堿性；在培養厭氧微生物時，需要提供無氧條件。注意說明：關于微生物培養基中營養物質的三個注意點：（1）培養不同微生物所需要的營養物質可能不同：①自養型微生物的培養基主要以無機營養為主。②異養型微生物的培養基主要以有機營養為主。（2）培養某些微生物時需要補充生長因子，是由于這些微生物缺乏合成這些物質所需要的酶或合成能力有限。（3）微生物所需營養物質中，需要量最大的是碳源。能合成含碳有機物的是自養型，反之則為異養型。（二）無菌技術教師：組織學生閱讀教材P10頁和資料卡（常用的消毒和滅菌方法），引導學生歸納概括滅菌和消毒的概念和方法。學生：閱讀教材，自主學習，歸納概括，展示答案。1.獲得純凈的微生物培養物的關鍵是防止雜菌污染。2.防止雜菌污染的方法：（1）消毒：是指使用較為溫和的物理、化學或生物等方法殺死物體表面或內部一部分微生物（2）滅菌：是指使用強烈的理化方法殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子。芽孢和孢子的區別：芽孢是某些細菌（芽孢桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、芽孢乳酸菌屬等）在營養條件缺乏時，在菌體內形成的一個圓形或橢圓形、含水量低、抗逆性強的休眠體；孢子是脫離親本后能直接或間接發育成新個體的生殖細胞，它是有絲分裂或減數分裂的產物。3.無菌的范圍：（1）對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒。（2）將用于微生物培養的器皿、接種用具和培養基等進行滅菌。注意：避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品接觸。為了避免周圍環境中微生物的污染，操作都應在超凈工作臺并在酒精燈火焰附近進行。播放視頻《超凈工作臺的使用》，引導學生理解無菌技術的作用。教師引導學生思考：無菌技術除用來防止實驗室的培養物被其他外來微生物污染外，還有什么作用？提示：無菌技術還能有效避免操作者被微生物感染。資料卡：1.常用的消毒方法①煮沸消毒法：100℃煮沸5～6min，可以殺死微生物的營養細胞和一部分芽孢。②巴氏消毒法：62～65℃下消毒30min或80～90℃處理30s～1min，適合一些不耐高溫的液體，如牛奶。可以殺死牛奶中的絕大多數微生物，并且不破壞牛奶的營養成分。③化學藥劑消毒法：用70%酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等。④紫外線消毒法：接種室、接種箱或超凈工作臺在使用前可用紫外線照射30min。在照射前，適量噴灑石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加強消毒效果。2.常用的滅菌方法①濕熱滅菌：利用沸水、流通蒸汽或高壓蒸汽進行滅菌的方法。高壓蒸汽滅菌效果最好，100kPa、121℃下維持15～30min，常用于培養基、無菌水等的滅菌。②干熱滅菌：將滅菌物品放入密閉容器如干熱滅菌箱，在160～170℃的熱空氣中維持2～3h。常用于耐高溫的和需要保持干燥的物品（如玻璃器皿、金屬用具等）。③灼燒滅菌：將微生物的接種工具，如涂布器、接種環、接種針或其他金屬用具，直接在酒精燈火焰的充分燃燒層（外焰）灼燒，可以迅速徹底地滅菌。此外，在接種過程中，試管口、瓶口等容易被污染的部位，也可以通過火焰灼燒來滅菌。通過資料卡的學習，以表格的形式對常用滅菌與消毒方法進行比較。（三）微生物的純培養教師：組織學生閱讀教材P11頁下側文字部分以及P12-13頁的探究實踐，引導學生歸納概括微生物純培養的概念及操作步驟，理解并掌握酵母菌的純培養。學生：閱讀教材，自主學習，探究學習，歸納概括。在微生物學中，將接種于培養基內，在合適條件下形成的含特定種類微生物的群體稱為培養物。1.微生物的純培養（1）培養物：在微生物學中，將接種于培養基內，在合適條件下形成的含特定種類微生物的群體稱為培養物。（2）純培養物：由單一個體繁殖所獲得的微生物群體稱為純培養物。（3）純培養的概念：獲得純培養物的過程就是純培養。（4）微生物的純培養步驟：配置培養基→滅菌→接種→分離和培養。2.菌落（1）概念：分散的微生物在適宜的固體培養基表面或內部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態結構的子細胞群體，這就是菌落。（2）特征：大小、形狀、隆起程度、顏色等。（3）功能：鑒定菌種的重要依據。（4）獲得單菌落的方法：采用平板劃線法和稀釋涂布平板法將單個微生物分散在固體培養基上，之后得到的單菌落一般是由單個微生物形成的純培養物。3.制備培養基：配制培養基→滅菌→倒平板。倒平板的具體操作步驟：①拔出錐形瓶的棉塞→②將瓶口迅速通過火焰→③用拇指和食指將培養皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，將培養基（10～20mL）倒入培養皿，立即蓋上皿蓋→④等待培養基冷卻凝固后，將培養皿倒轉過來放置。倒平板既可以防止培養基表面的水分揮發；又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染。注意說明：關于制備培養基的四點提醒（1）如果需要調節培養基的pH，應該在定容完成后，滅菌之前進行操作。（2）滅菌之后，倒平板時培養基的溫度是50℃左右。因為凝固劑瓊脂在98℃以上熔化，在44℃以下凝固，倒平板時高于50℃則會燙手，低于50℃時，若不能及時操作，瓊脂會凝固。（3）倒平板的整個操作在酒精燈火焰旁進行，避免雜菌的污染。（4）倒平板時不要將培養基濺在皿蓋與皿底之間，否則此培養基不能用來培養微生物，因為空氣中的微生物可能會在皿蓋與皿底之間的培養基上滋生。4.接種和分離酵母菌：通過接種環在固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面。經數次劃線后培養，可以分離得到單菌落。平板劃線法的具體操作：①灼燒接種環，直至接種環金屬絲燒紅→②在火焰旁冷卻接種環，拔出酵母菌培養液試管的棉塞→③試管口通過火焰→④在火焰附近用接種環蘸取一環菌液→⑤試管口通過火焰，并塞上棉塞→⑥將皿蓋打開一條縫隙，用接種環在培養基表面迅速劃三至五條平行線，蓋上皿蓋→⑦灼燒接種環，待其冷卻后，從第一次劃線的末端開始作第二次劃線。重復以上操作，作第三、四、五次劃線。注意：①接種環只蘸一次菌液，但要在培養基不同位置連續劃線多次；②劃線首尾不能相接；③每次劃線前接種環進行滅菌；④劃線后，培養皿倒置培養。展示平板劃線的具體做法：思考：為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環嗎？為什么？歸納總結：灼燒時期目的取菌種前殺死接種環上原有微生物每次劃線前殺死上次劃線時殘留菌種，使下一次劃線的菌種直接來源上次劃線的末端，從而使每次劃線時菌種數目逐漸減少，直至得到單個細胞接種結束后殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者5.培養酵母菌完成平板劃線后，待菌液被培養基吸收，將接種后的平板和一個未接種的平板倒置，放入28℃左右（培養溫度因酵母菌種類的不同而稍有差異）的恒溫培養箱中培養24～48h。將接種后的平板和一個未接種的平板倒置：作對照，該培養皿無菌落說明培養基沒有污染平板倒置：既可以防止培養基表面的水分揮發；又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染。警示：在實驗室中，切不可吃東西、喝水；離開實驗室時一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培養基在丟棄前一定要進行滅菌處理，以免污染環境。6.結果分析與評價小組合作，問題探討：（1）在未接種的培養基表面是否有菌落生長？如果有，說明了什么？提示：在未接種的培養基表面應該沒有菌落生長，如果有，說明培養基被雜菌污染。（2）在接種酵母菌的培養基上，你是否觀察到了單菌落？這些菌落的顏色、形狀和大小是否一致？如果你觀察到了不同形態的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的嗎？提示：如果觀察到了不同形態的菌落，可能是接種的菌種不純或者無菌操作不規范等原因引起的。注意說明：1.灼燒接種環后，要等冷卻后才能進行操作，避免溫度太高殺死菌種。2.第二次及其以后的劃線操作總是在上一次劃線末端開始，能使微生物的數目隨著劃線次數的增加而逐漸減少，最終得到由單個細胞繁殖而來的菌落。3.劃線用力大小要適當，防止用力過大將培養基劃破。4.最后一次的劃線不要與第一次的劃線相連。（四）課堂小結（五）課堂作業1.下列有關微生物營養物質的敘述中，正確的是（D）A.是碳源的物質不可能同時是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無機物只提供無機鹽D.無機氮源也能提供能量2.下列關于滅菌和消毒的說法不正確的是（B）A.滅菌是指殺死環境中的所有微生物，包括芽孢和孢子B.滅菌和消毒實質上是相同的C.接種環用灼燒法滅菌D.常用的滅菌方法有灼燒滅菌、干熱滅菌、濕熱滅菌等3.養殖池中存在的有毒物質，主要是氨及亞硝酸，這兩種物質可被硝化細菌吸收利用。在“養殖池底泥中硝化細菌的分離與計數”實驗中，說法正確的是（B）A.需要配制添加一定濃度氨鹽的牛肉膏蛋白胨培養基，以篩選硝化細菌B.應對采集底泥使用的工具進行滅菌，全部接種過程均需在酒精燈火焰旁進行C.可以采用平板劃線法進行接種，