質量管理體系操作規程NK殺傷活力檢測標準操作規程文件編號版本號PAGE3of=NUMPAGES4-13質量管理體系操作規程NK殺傷活力檢測標準操作規程文件編號版本號文件變更更改前版本號變更內容摘要修改人/修改日期文件審核項目簽名日期起草人/修訂人審核人批準人受控狀態分發號生效日期目的規范NK的殺傷活力的檢測操作和結果判定。通過流式法檢測NK細胞對靶細胞的殺傷作用。范圍本標準操作規程適用于細胞免疫實驗室及GMP實驗室所制備NK細胞對靶細胞包括腫瘤細胞的殺傷作用。責任人質檢人員：嚴格按照本規程進行NK殺傷活力檢測。QA：負責監督操作人員嚴格按照本規程執行。定義與縮寫FBSFetalBovineSerum胎牛血清DPBSDulbecco'sPhosphateBufferSaline杜氏磷酸緩沖鹽溶液引用文件NA儀器試劑樣本：效應細胞：NK細胞靶細胞：K562-#5細胞主要儀器：離心機，A2生物安全柜，潮化5%二氧化碳細胞培養箱，酶標儀，血球計數板，搖床，50μl排槍，200μl排槍，流式細胞儀。試劑序號名稱品牌貨號備注1AIM-VGibcoA30210022-8℃2IMDMLonza12-722F2-8℃3FBSPAN≤-20℃496孔板（U形底）NUNC163320常溫51×DPBS--常溫流式法操作規程試劑準備請將所有相關試劑恢復到室溫再使用。細胞毒試驗培養液：AIMV+5%FBS，IMDM+5%FBS。流式緩沖液：DPBS+2%FBS靶細胞準備收獲K562-#5細胞，200g、10分鐘，并計數。將細胞沉淀按照2×105cells/mL重懸在IMDM+5%FBS培養液中。將靶細胞接種至96孔U形板，每孔100μl，至少18孔。在3個空孔中分別加入100μlIMDM+5%FBS培養液作為對照。將細胞放入37℃潮化5%二氧化碳培養箱中，孵育過夜。效應細胞準備第二日，收獲效應細胞，300g、10分鐘離心。將效應細胞重懸在AIMV+5%FBS培養液中，并將細胞數調整至4×106cells/mL，并標記“20”。另取4個1.5mLEP管，每管加入500μlAIMV+5%FBS培養液，并標記10，5，2.5，1.25。從4×106cells/mL的細胞懸液中取500μl加入標記有“10”的EP管中，充分混勻。再取出500μl細胞懸液加入標記有“5”的EP管中，充分混勻。以此類推，梯度稀釋至1.25倍。共孵育設計用于細胞毒試驗的96孔板（U形底），設立用于實驗組、靶細胞組和效應細胞組，3復孔。實驗組中效應細胞(E):靶細胞(T)比例設定為20:1，10:1，5:1，2.5:1，1.25:1。靶細胞組中只有靶細胞，效應細胞組中只有效應細胞。從不同密度的NK細胞懸液中分別取100μl加入前一日已加好靶細胞的對應孔中。效應細胞組中每孔加入100μl1.25倍的效應細胞。注意留出對照組只有K562-#5，加入100μlAIMV+5%FBS培養液，不加NK細胞。具體比例分配如下圖所示：將接種完成的96孔板放入潮化5%二氧化碳細胞培養箱，蓋一層鋁箔紙，孵育過夜。檢測孵育結束后，將96孔板離心500g、5分鐘。吸出每孔中的上清液并廢棄，將細胞沉淀重懸于100μlPBS+2%FBS中。用細胞流式儀以中速吸取20μl，在FSC-SSC圖中圈出細胞群所在位置，并在FL1-A-FSC途中圈出GFP陽性的K562-#5，記錄每20μl中的K562-#5數量。最終靶細胞殺傷計算公式殺傷注意事項在接種96孔板時，盡量不用邊緣一圈孔，邊緣一